Rats

5 440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des administrations répétées puis une injection intracérébrale sous anesthésie, avant d'être mis à mort par décapitation, y compris des nouveau-nés décapités à la guillotine ou après refroidissement, pour tester ex vivo des molécules candidates de laboratoires clients. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer stress, inflammations, infections et blessures de l'œsophage. Il décrit une activité de prestation pour l'industrie pharmaceutique et affirme que ces enregistrements sur tissu vivant constituent la "meilleure approche".

Objectifs

Les groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour traiter la douleur. D’autre part, pour une meilleure prédictibilité d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phases précliniques réglementaires, il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grandes quantités d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le développement de modèle rongeur génétiquement modifié. Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soient électrophysiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranches et/ou de cellules nerveuses de système nerveux central de rongeurs, traités par des molécules directement dans ce système nerveux central, permet une étude sur l'activité du composé et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur considéré. Pour ce faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique, le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec circuit imprimé d’électrodes et le Patch = un enregistrement à l'échelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécules.

Bénéfices attendus

Notre projet permet de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du système nerveux central. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aigüe, injectés directement dans le cerveau constitue la meilleure approche car elle permet : - de franchir la barrière hémato-encéphalique ; - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons) ; - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique et des problèmes de pharmacocinétique. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques couteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Les animaux seront administrés deux fois par jour avec une manipulation de 5 minutes maximum par animal, soit 10minutes da manipulation au total par jour. Ces injections pourront durer trois mois, mais durent en moyenne trois semaines au cours de nos études. Ces multiples manipulations et peuvent souffrir d’inflammation ou de blessure à l’œsophage en fonction des sites d’injections choisis. Tous les animaux subiront l’injection intracérébrale, durant 30-45 minutes sous anesthésie générale et analgésie. Les nuisances pouvant apparaitre sont des inflammations aigues, des infections et, en conséquence indirecte, un défaut de reconnaissance et de soin de la part des mères pour les individus entre 0 et 21 jours post naissance (c’est-à-dire non sevrés). Les temps de mise à mort varient en fonction du moyen utilisé mais n’excèdent pas dix minutes sous anesthésie et analgésie quand cela est nécessaire. Pour les Rats et Souris < P5 sont anesthésiés sur un bloc froid réfrigérant, sans contact direct, jusqu’à perte des réflexes au pincement d’une patte postérieure, puis décapités avec une paire de ciseaux adaptés, il temps entre l’anesthésie et la mise à mort est de 7 min ; Pour lesP5 < Rats et Souris P10 : les animaux seront anesthésiés par induction gazeuse à l’isoflurane (3.5% rat et 2.5% souris) puis décapités grâce à une guillotine adaptée, pour un temps de manipulation de maximum 7min. Si les animaux sont mis à mort par exsanguination, la totalité de l’intervention est de 12 minutes et passe par une anesthésie gazeuse, puis une analgésie sous masque anesthésique, 5 minutes d’attente et enfin exsanguination.

Impact sur les animaux

Nous avons une procédure qui peut amener à des effets indésirables. La procédure peut par : *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress ; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection comme des inflammations, des infections, de blessure de l’œsophage ; *- la mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse peut amener un stress premortem important ; *-la nature des animaux génétiquement modifiés, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper ; *-l’injection intra-cérébrale peut induire des problèmes de type opératoire et post-opératoire, comme des inflammations aigues, des infections et une conséquence indirecte : un défaut de reconnaissance et de soin de la part des mères pour les individus opérés entre 0 et 21 jours post naissance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour mesurer l’efficacité du traitement par la molécule à tester. Ces mises à mort seront nécessaires pour assurer l’évaluation d’efficacité et la détermination des mécanismes d’action de futurs candidats médicament, grâce aux modèles d’animaux mimant les pathologies neurodégénératives et à la maîtrise des protocoles d’enregistrement d’activité électrique cérébrale.

Remplacement

Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc plus physiologiques ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme ces tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé un nombre suffisant d’animaux nous permettant de valider nos enregistrements. Compte tenu des variations du taux de réussite attendu lors de l’injection intracérébrale au cours des études utilisant cette procédure, nous adapterons ce nombre grâce à une étude pilote qui sera réalisée avant d’introduire plusieurs conditions de test. Cette étude pilote ne sera pas réalisée si les données de notre client sont suffisantes pour garantir une significativité. Les enregistrements validés sont rassemblés par condition pour l’analyse. Nos analyses statistiques des résultats permettrons de déterminer l’efficacité du test. Lors de l’étude pilote, nous pourrons évaluer la significativité statistique et si elle n’est pas atteignable, l’étude sera suspendue. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en poursuivant par 4 conditions différentes au maximum.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes et 2 rats adultes/cage). Ils bénéficient d’enrichissement adaptés, deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire et l’information est conservée et partagée dans les documents de renseignement de la lignée. .Les animaux préalablement administrés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaires. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Un contrôle de l’apparition d’infection ou d’inflammation sera effectué. Si un animal infecté apparait, il sera sorti temporairement du projet et le vétérinaire sera consulté pour un traitement adapté jusqu’à récupération. Les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et un mois de temps d’hébergement, maximum. Il se fera en groupes sociaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée aura une documentation de suivi spécifique. Ces animaux seront asymptomatiques. L’injection intracérébrale sera précédée d’une prémédication et suivi par des soins antalgiques et enfin d’une couverture antalgique et de suivi clinique deux fois par jours. Les animaux seront mis à mort sous anesthésie gazeuse et analgésique pour assurer l’enregistrement des activités neuronales.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du système nerveux central des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leurs élevages, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de ces espèces, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous pouvons travailler aussi bien avec des animaux nouveaux nés, juvéniles, adultes ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée (maladies neurodégénératives le plus souvent). Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.

13 200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules ou de fragments tumoraux en sous-cutané, puis des administrations répétées de substances, pour tester l'efficacité d'anticancéreux pour le compte de clients industriels ou de laboratoires. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer perte de poids, hypothermie, épanchement abdominal et difficultés respiratoires. Il décrit une activité de prestation commerciale et affirme que ce modèle ne peut "pas être remplacé" par des méthodes in vitro.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé publique majeure et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles animaux de cancer humain et murin demeurent des éléments critiques dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments et la compréhension des mécanismes de résistance. Le modèle d’injection de cellules en sous-cutané, dit hétérotopique, permet d’examiner de larges cohortes de tumeurs dont la croissance et la réponse aux médicaments peuvent facilement être évaluées grâce à un suivi cinétique de la croissance tumorale par des mesures au pied à coulisse. Bien que la greffe de cellules ou de tissu cancéreux n’est pas réalisée dans l’organe d’origine dont est issue la tumeur, ce type de modèle a pu montrer un caractère prédictif satisfaisant afin d’identifier des molécules à activité thérapeutique pour la clinique humaine, qui en fait un modèle standard de la recherche en oncologie. La procédure décrite dans ce projet correspond à la création de différents modèles de tumeurs chez le rongeur (souris ou rat). L’objectif est d’administrer des cellules tumorales issues de différents types de tumeurs et de mesurer différents critères (taille de la tumeur, survie...) afin d’évaluer l'efficacité ou la toxicité de molécules aux propriétés anticancéreuses décrites ou potentielles. La création de ce type de modèle dans ce projet ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Bénéfices attendus

Le projet consistera à développer des modèles de tumeur chez le rongeur pour les différentes indications en oncologie, qui permettra de tester l'efficacité d'anticancéreux pour des clients du secteur industriel privé ou des laboratoires de recherche publique ou dans un contexte de recherche interne. De plus, il permettra aussi d'évaluer l'expression de certains biomarqueurs en amont d'une étude de pharmacologie ou de générer des modèles animaux pour des procédures de test dans un autre laboratoire dans le cas de collaboration. Dans ces buts, la procédure consistera à injecter des lignées cellulaires humaines (xénogreffes) ou murines (allogreffes), des cellules primaires obtenues à partir biopsies de patients ou d’explants tissulaires en sous cutané chez des animaux immunocompétents (souris ou rats), immunodéprimés (souris ou rats), transgéniques ou humanisés dépendant du modèle. Un suivi de la croissance du volume tumoral sera réalisé avec un pied à coulisse ou d’autres modalités d’imagerie par bioluminescence ou fluorescence (utilisant des cellules reportrices adaptées à ce type de modalité) mais aussi par rayons X ou échographie. De plus, le poids et l'état général des animaux seront suivis au cours du temps. Cependant les modèles de mélanome, aussi injectés en sous cutanés, ne seront pas considérés dans ce projet car induisent la formation de métastases agressives. Les animaux présentant une immunodéficience nécessitant un cloisonnement ou certains animaux transgéniques seront hébergés en condition Biosafety level 2 (BSL2) afin de maintenir leur statut Specific and Opportunistic Pathogen Free (SOPF) et éviter toutes contaminations chez ces animaux plus sensibles.

Procédures

Les animaux subiront une anesthésie d’environ 5 à 10 min pendant laquelle ils seront tatoués dans la pulpe de leurs doigts en utilisant une aiguille imbibée d’encre de tatouage pour animaux. Toujours sous anesthésie, les animaux subiront une injection rapide (

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables inhérents au développement tumoral pourront apparaître pendant une étude. - Une perte de poids corporel - Un comportement amorphe marqué pendant les périodes de vigilance. - Une hypothermie persistante - Une distension anormale de l’abdomen pouvant être le signe d’un épanchement - Des problèmes de respiration pour l’animal - Une incapacité de se nourrir ou boire L’ensemble de ces symptômes sera monitoré pendant l’étude afin d’appliquer des mesures pouvant amener à l'euthanasie de l’animal avant la fin de l’étude pour raison éthique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car les animaux présentent des tumeurs et ne permettent pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.

Réduction

Des analyses in-vitro pourront être réaliser en amont de l'étude permettent de sélectionner des lignées/types de cellules présentant une sensibilité à la substance d'essai afin de limiter le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une diminution du volume tumoral mesuré d'au moins 50%.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, …), permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et de chirurgie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères.... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation inclue une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie si nécessaire.

Choix des espèces

Les tumeurs présentent une accumulation de multiples aberrations génétiques qui transforment les cellules, entraînant une croissance anormale, une prolifération et des métastases des cellules. Des études de ces aberrations et la compréhension de leur contribution à la physiopathologie du cancer sont nécessaires pour améliorer le diagnostic et la thérapie. Aujourd’hui encore, les rongeurs rats et souris demeurent essentiel à étudier les tumeurs in vivo et à comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du cancer. Tous les animaux utilisés seront utilisés à partir de 5 semaines développement que ce soit des rats ou des souris.

360 souris et 360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie cérébrale leur implante des canules profondes, suivie de sessions de prélèvement de trois à quatre heures reliées par des câbles et d'un isolement post-opératoire. Le projet mesure l'effet de candidats médicaments sur l'activité cérébrale, le porteur qualifiant la technique de "translationnelle". Il affirme que les cultures de neurones ne suffisent pas et que le retrait de la canule laisserait des lésions "non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions".

Objectifs

La concentration de molécules (e.g. neurotransmetteurs) spécifiques dans des régions cérébrales précises est modifiée dans certaines conditions psychiatriques ou neurologiques ; étudier ces facteurs peut informer sur l'efficacité de candidats traitements dans le traitement de ces pathologies, ou sur leur mécanisme d'action. Le projet consiste à évaluer l'effet de nouveaux candidats médicaments sur l'activité métabolique cérébrale chez le rongeur. La méthode de microdialyse cérébrale peut être réalisée sur animal anesthésié ou vigile. Cette méthode consiste à recueillir et à analyser certaines substances chimiques présentes dans le milieu extra cellulaire interstitiel du parenchyme cérébral. Outre l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapies, la microdialyse cérébrale peut aider à la compréhension d’événements neurologiques.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de maladies neurologiques. La technique de microdialyse est une méthode translationnelle qui permet d'évaluer l'effet de nouvelles substances pharmacologiques sur les concentrations de substrats cérébraux telles que des neurotransmetteurs ou des acides aminés sans avoir recours à une extraction tissulaire. Cette méthode permet de mieux comprendre les relations entre neurotransmission et modifications comportementales chez le petit animal.

Procédures

La collecte de dialysats cérébraux nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (entre 1h et 1h30) afin de placer la ou les canules dans des régions cérébrales situées en profondeur. Lors de la collecte des microéchantillons ou dialysats, les animaux sont reliés à une seringue et un collecteur de fraction par l'intermédiaire de câbles/cathéters en polyéthylène (les durées de sessions de perfusion/prélèvement sont en général de l'ordre de 3 à 4 h). Les animaux recevront des administrations de candidats traitements en général par bolus (durée de l'ordre de la seconde), de manière aigue ou chronique.

Impact sur les animaux

Des douleurs peuvent être liées à l'implantation d'électrodes au niveau cérébral (ces animaux seront placés sous traitement analgésique qui sera adapté sous contrôle vétérinaire). Suite à la chirurgie, les animaux sont isolés pour protéger la canule de microdialyse (cependant, ils gardent un contact visuel, sonore et auditif avec leurs congénères). Les animaux peuvent perdre du poids ou une plaie peut se former au niveau de la zone d'implant en raison d'une infection post-chirurgicale. Lors du test, les animaux sont connectés pendant plusieurs heures à des cables pendant la diffusion du perfusat et la collecte du dialysat suite à l'administration d'une substance pharmacologique.

Devenir

Les rongeurs seront euthanasiés à la fin des expériences car des prélèvements de tissu (cerveau) seront réalisées, pour dosage de biomarqueurs ou pour vérifier le placement de la sonde. De même, le retrait de la canule implantée pourrait entraîner des lésions non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, des modèles alternatifs ont été développés au laboratoire mais ne permettent de mesurer que la présence de certaines molécules secrétées par des cultures primaires de neurones. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi d'évaluer l'effet de substances pharmacologiques sur l'activité métabolique cérébrale.

Réduction

Les analyses statistiques seront affinées pour utiliser le nombre minimum d'animaux; les tests qui seront appliqués ne sont pas encore connus (mise en place de la technique), des études de variabilité et d'homogénéité seront réalisées pour déterminer les analyses les plus pertinentes (paramétriques ou non paramétriques). Des prélèvements de sang ou d'organes peuvent être également ajoutés à la fin des expériences pour compléter les analyses et éviter l'utilisation d'autres animaux.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Les animaux reçoivent un traitement analgésique général au début de la chirurgie puis pendant 48 h et un traitement analgésique local supplémentaire pendant la chirurgie. Lors de la chirurgie, l'implantation d'une canule peut induire une hémorragie. Si cette dernière ne peut être maitrisée, l'animal sera euthanasié. Suite à la chirurgie, les animaux vont être pesés quotidiennement pendant 48 heures pour évaluer leur récupération. Un rat montrant une perte de poids supérieure à 15%, des signes de souffrance (poil hérissé, manque de toilettage) ou une atteinte locomotrice (démarche anormale, chutes...) sera euthanasié. Les conditions d'hébergement sont également optimisées avec la présence d'un enrichissement adapté (bois à ronger par exemple). Les animaux isolés sont hébergés dans des cages transparentes leur permettant de voir, sentir et entendre leurs congénères. Dans certains modèles, l'activité métabolique permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle. Il arrive que l’animal se gratte au niveau de l’implant, endommageant les tissus autour de l’implant. Dans ce cas, l’animal est désinfecté quotidiennement avec une solution antiseptique. Un antibiotique peut être administré, le cas échéant.

Choix des espèces

Les études de mesure de l'activité métabolique cérébrale sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études préalablement réalisées (études de pharmacocinétique par exemple) et à la disponibilité de la molécule. On utilisera de préférence la souris lorsque la molécule est en quantité limitée. Le choix de l'espèce peut aussi être lié au modèle expérimental choisi. Par exemple, certains modèles mimant la maladie de Parkinson ont été préférentiellement développés chez le rat. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique).

200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie créant un défaut osseux dans la boîte crânienne, où sont implantés des biomatériaux, puis des scanners répétés sous anesthésie avant une mise à mort au CO2 pour analyses histologiques. Le projet teste des biomatériaux à base de verre bioactif censés favoriser la réparation osseuse et visibles par imagerie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour ce modèle de défaut osseux du crâne chez le rat.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de confirmer la biocompatibilité, l’ostéoinduction/conduction et le potentiel de réparation de ces nouveaux biomatériaux in-vivo, et d'établir l’impact de la minéralisation sur les particules à luminescence persistante. Ce projet nous permettra d’établir le temps de survie des particules, mais aussi d’en analyser la potentielle migration.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer des biomatériaux qui présenteront des compétences ostéogéniques par la présence de verre bioactif et qui pourront être visualisables directement par imagerie.

Procédures

Procédure chirurgicale : 10 min, tous les animaux. Scanner Haute résolution sous anesthésie Isoflurane (Induction 3%, maintien 1.5%) : 15 min, J0 (200 animaux), J15 (160 animaux), J30 (120 animaux), J60 (80 animaux), J90 (40 animaux). Mise à mort par inhalation progressive au CO2 dans un système dédié : 10 min, tous les animaux, 40 animaux à chaque temps histologiques.

Impact sur les animaux

L'estimation de la souffrance de cette procédure est estimée "modérée" mais brève et bien tolérée. Au sein de cette procédure, seul l'acte chirurgicale peut mener à des suites douloureuses avec la présence d'hématome, oedeme ou désunions des sutures. Le CT-scan et la mise à mort n'ayant pas d'actions iatrogènes douloureuses. Le nombre d'animaux par groupe et par temps (10) est justifié en fonction des effets observés et permet d'envisager une étude adéquate sur le plan statistique.

Devenir

Mise à mort pour analyses histologiques

Remplacement

La régénération osseuse présente une biologie complexe impliquant la participation et l’intéraction de différents types cellulaires. Ces processus complexes ne peuvent être mimés en utilisant uniquement des cultures in vitro ou des modèles informatiques. Ces biomatériaux ont été préalablement étudiés in vitro et in vivo et ne présente aucune toxicité. Le modèle de défaut osseux de calvaria chez le rat est un modèle in vivo classiquement utilisé et il n’existe à ce jour aucune méthode alternative. A terme, ces travaux permettront de mettre au point des matériaux utilisables en clinique pour la réparation de défauts osseux de la sphère cranio-faciale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit par l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux (ici 10 animaux par groupe et par temps dû à l'implantation bilatérale des matériaux). Sur 3 ans un nombre maximum de 200 rats seront utilisés, des études par imagerie longitudinale seront effectuées à différents temps afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par temps d’analyse. Tous les matériaux sont préalablement sélectionnés sur leurs propriétés ostéogéniques démontrées in vitro et une veille bibliographique sera systématiquement effectuée pour éviter toute expérience redondante. Si nous n’observons pas de différence entre les groupes à la moitié du nombre requis d’animaux, l’expérience sera arrêtée et les matériaux repensés.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation d’anesthésie et d’analgésique adaptée durant les procédures avec une médication anti-douleur systématique en per et également post-opératoire, et l’établissement de points limites adéquats. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée. Les conditions d’élevage sont présentes pour le bien-être animal de façon à réduire le stress et l’anxiété dans un environnent enrichi au sein de groupes sociaux de plusieurs individus, avant et après les procédures.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de laboratoire appropriée et classiquement utilisée pour l’étude de l’inflammation et du tissu osseux. Elle permet une faisabilité technique et la biologie du tissu est proche de celle de l’homme. Notre laboratoire possède une expertise sur cette procédure. Les animaux seront âgés de 8 semaines, les animaux étant alors des jeunes adultes. Les adultes jeunes supportant mieux les chirurgies et ayant un potentiel de cicatrisation/régénération plus important. A 8 semaines, ils ont la taille minimale requise pour pouvoir créer chez le rat des défauts critique de 5mm bilatéral dans la calvaria.

600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une rectite leur est induite par instillation d'une solution irritante (TNBS), suivie de la création de fistules anales par introduction de fils de suture manipulés plusieurs fois par semaine, d'administrations de composés par de multiples voies et d'un suivi par IRM. Le porteur décrit des prestations menées pour des "clients", certains animaux étant tués à la suite des effets indésirables des produits testés. Il affirme que ce modèle de rat est le "seul" disponible et un "prérequis indispensable" à l'étude chez l'humain, les alternatives in vitro étant selon lui inexistantes ou insuffisantes.

Objectifs

Les lésions anopérinéales au cours de la maladie de Crohn sont fréquentes : 1 malade sur 2 présentera une lésion anopérinéale dans les 20 ans. Les lésions anopérinéales secondaires de la maladie de Crohn (fistules simples ou complexes +/- compliquées d'abcès) ont un impact important sur la qualité de vie quotidienne des patients. Les lésions anopérinéales secondaires sont le plus souvent traitées dans un premier temps par une chirurgie en urgence associée à un traitement antibiotique. Les traitements actuelles sont insuffisants et des récidives demeurent très fréquente à court/moyen terme (>50% dans la plupart des séries). A long terme, les lésions anopérinéales de la maladie de Crohn présentent des risques évolutifs mettant en jeu la survie et la qualité de vie des patients, incluant notamment la destruction du sphincter anal et un sur-risque de cancer. L'objectif de ce projet est de tester différents traitements innovants dans le but d'obtenir une cicatrisation complète et durable des fistules dans un modèle expérimental de fistules anale chez le rat.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les fistules anales. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

(1) Induction d'une rectite par instillation rectal avec une solution irritante (1 fois au démarrage des études - durée 5 min). (2) Génération des fistules par introduction de fils de suture (1 fois - durée 15 à 30 min). (3) Manipulation des fils pour permettre la génération des trajet fistuleux (2 à 3 fois par semaine pendant 1 à 4 semaines - durée 2-3 min). (4) Application d'un traitement par voie orale (gavage - 1 min par administration), intrapéritonéale (1 min), sous-cutanée (1 min), transdermique (1 min), intradermique (1 min), intramusculaire (1 min), intraveineuse (1 min), transrectale (1 min) ou transfituleuse (bolus (1-2 min) ou perfusion (2-10 min)). Le composé à tester pourra également être appliqué localement par application sous forme de crème (1-2 min par application). (5) Imagerie par IRM 1 à 2 fois par semaine pendant la durée de l'étude (15-30 min).

Impact sur les animaux

1) Induction d'une rectite par Instillation TNBS. 2) Création de fistules anale sous anesthésie. 3) Les anesthésies pour l'imagerie IRM 4) Les effets potentiellement indésirables du/des produits font l’objet d’échange avec nos clients pour adapter les outils d’observations des animaux afin d’anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux

Remplacement

Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (10 par groupe).

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses incluant les étapes d'anesthésies et d'analgésies nécessaires • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites (échelle de scoring), • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

Le modèle de LAP chez le rat que nous utilisons est le seul modèle disponible pour tester l'efficacité in situ de nouvelles approches thérapeutiques et est un prérequis indispensable à l'étude sur l'homme. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

400 rats et 100 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'implantation chirurgicale d'une prothèse crânienne sous anesthésie de 2 à 6 heures, puis jusqu'à une dizaine de sessions d'enregistrement, certaines en contention sur plateforme rotative, d'autres après une lésion vestibulaire provoquant des troubles de l'équilibre. Le porteur indique que la lésion vestibulaire entraîne des vertiges et une désorientation transitoires, et que les lignées modèles d'épilepsie-absence figent l'animal quelques secondes à minutes. Il affirme qu'aucune simulation ni organoïde ne reproduit ces interactions neuronales, l'euthanasie survenant entre 3 et 12 mois.

Objectifs

Le fonctionnement du cerveau est basé sur l'interaction réciproque entre les neurones, qui traitent l'information, et le réseau sanguin, qui répartit en permanence le soutien métabolique selon les contributions de différentes aires cérébrales. Ce couplage entre métabolisme et traitement cognitif sert de moyen d’exploration des processus cérébraux, grâce à l’imagerie des processus vasculaires et métaboliques pour identifier et comprendre les réseaux neuronaux associés à chaque comportement, activité physiologique ou pathologique. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment les différentes aires fonctionnelles du cerveau interagissent pour produire des processus cognitifs, des comportements, ou des anomalies handicapantes telles que les absences (brêves périodes de passivité associée à une perte de conscience). Ce projet associe trois axes d’analyse complémentaires : 1/Comment mesurer simultanément la dilatation des vaisseux sanguins et la charge en oxygène du sang pour estimer la charge métabolique des aires cérébrale à travers l’ensemble du cerveau ? On développe des méthodes pour la mesure du métabolisme tissulaire in vivo sur l’ensemble du cerveau de façon minimalement invasive, en combinant des moyens acoustiques et optiques. 2/L’orientation spatiale nécessite des repères visuels stables, i.e. dont le mouvement apparent est uniquement causé par les mouvements de l’animal. Comment le cerveau identifie et utilise de tels repères à partir des signaux visuels et vestibulaires ? On aborde une situation physiologique, la dynamique des réseaux impliqués dans des fonctions cognitives d’orientation spatiale, où des aires cérébrales spécialisées coopèrent pour produire une fonction intégrée. 3/Existe-t-il des marqueurs de l’activité cérébrale annonçant la survenue d’absence, et quels en sont les mécanismes déclencheurs? On explore une situation pathologique, l’épilepsie de type absence (non convulsive), où des réseaux distribués à travers le cerveau perturbent l’ensemble de l’activité jusqu’à interrompre le comportement et figer l’animal de façon transitoire (typiquement 3s à 3min).

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans ce projet apporteront une meilleure connaissance de mécanismes cérébraux physiologiques et pathologiques. D’un point de vue scientitifque on attend de mieux comprendre quelles aires cérébrales sont impliquées dans l’orientation et dans l’attention (interrompue par les absences) et globalement de mieux comprendre comment les différentes aires cérébrales spécialisées interagissent pour produire un effet de conscience. D’un point de vue technologique on développe des moyens d’observation donnant une vision étendue des liens entre mécanismes métaboliques et cognitifs. L’ensemble de ces progrès constitueront une base pour mieux comprendre et à terme traiter les pathologies impliquant l’orientation, les absences, ou les troubles métaboliques, dont l’impact sur la santé est significatif.

Procédures

Chaque animal est soumis à une unique procédure chirurgicale d'implantation d'une prothèse crânienne et d'un système d'attache permettant des mesures ultérieures non invasives (EEG, imagerie ultrasonore, imagerie optique). Cette étape est réalisée en une seule chirurgie sous anesthésie profonde d’une durée de 2-6h, suivie d’une période de récupération de 5-7 jours. Chaque animal participe ensuite à une campagne d’observation non invasive, composée au maximum d’une dizaine de sessions d’enregistrement espacées de 3 jours à 3 mois, étalée sur une durée totale maximale de 1 an. Chaque session nécessite une brêve anesthésie initiale, pour fixer le système d’enregistrement, pendant environ 30 minutes. Une fois le système attaché la session peut se dérouler de trois façons différentes : 1/L’animal est maintenu anesthésié pour la session de mesure, d’une durée maximale de 6h ; 2/L’animal réveillé reste en contention sur une plateforme rotative, pour évaluer des stimuli visuo-vestibulaires imposés, sur une durée maximale de 6h ; 3/L’animal est mobile, en restant attaché au système de mesure par un cordon léger, pour une durée d’enregistrement des mesures en continu de 6h à une semaine. Les animaux participant à l'étude de l'intégration visuo-vestibulaire sont soumis à une brève chirurgie de lésion vestibulaire (environ 30 minutes), sous anesthésie profonde, au milieu de la période d'observation. Les animaux sont euthanasiés à l'issue de la dernière session d'observation.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale d’implantation d’une prothèse crânienne est associée à un risque post-opératoire de douleur à traiter de façon préventive, d’infection ou de dégradation de la prothèse à surveiller. La procédure de lésion vestibulaire produit un stress lié à un défaut de sens de la verticale et des accélérations de la tête, se traduisant par des mouvements déséquilibrés de l’animal et/ou une immobilisation inhabituelle. Ce handicap est transitoire, grâce à compensation du système nerveux atteinte en une semaine environ. Les sessions d’observations avec l’animal en contention sur une plateforme rotative peuvent induire des vertiges brefs et du stress en cas de stimuli visuel et vestibulaire discordants. Les sessions d’observation sur animal éveillé peuvent produire un stress pendant la durée de la session, lié à la contention ou à la gêne occasionnée par le câble rattachant la tête au système de mesure. Les lignées établies comme modèles d’absence spontanée présentent des périodes de quelques secondes à quelques minutes pendant lesquelles l’animal est figé, interrompant son comportement pour le reprendre à la fin de l’absence. Bien que le comportement soit inhabituel pour des rongeurs il n’est pas dommageable dans le cadre sécurisé du laboratoire (notamment absence de prédateur). La rotation imposée sur une plateforme mobile, et la lésion vestibulaire provoquent des vertiges et perte d'équilibre. La récupération spontanée d'une lésion vestibulaire est de 3 jours.

Devenir

La qualité des mesures obtenues au moyen d'une prothèse crânienne permettant l'observation décroit avec le temps, ce qui ne permet pas de conserver les animaux pour obtenir plus de données. Les animaux sont gardés en vie durant au maximum 12 mois pour permettre d’obtenir des données suffisantes en qualité et quantité pour établir des observations répondant aux questions abordées par le projet. On prévoit une euthanasie entre un âge de 3 et 12 mois.

Remplacement

Les questions abordées dans ce projet concernent les propriétés émergentes des interactions entre assemblées de populations neuronales réparties à travers le système nerveux, en rapport avec des questions de physiologie et pathologies des mammifères. La diversité des types cellulaires, de leurs connexions, la richesse des intéractions moléculaires -d’ailleurs tous encore incomplètement décrits- font qu’il n’existe aucun moyen de simulation ou de remplacement par des organismes plus simples ou des organoïdes. En outre les mécanismes étudiés sont très dynamiques et propres aux animaux vivants, ce qui ne permet pas de les aborder sur des tissus fixés.

Réduction

On prévoit d’employer au maximum 400 rats et 100 souris sur 5 ans. Nos études déjà publiées ont montré que la bonne sensibilité des méthodes utilisées dans nos approches EEG-imagerie fonctionnelle permet typiquement de dresser un panorama de l’activité fonctionnelle et d’exhiber des variations statisiquement significatives avec un nombre limité d’animaux (par exemple sur la dynamique d’activation, la comparaison avec une situation contrôle). Ces animaux permettront d’aborder nos trois axes d’étude (méthode, orientation, absence). L’étude de méthode compare les variations temporelles des signaux cérébraux entre des activités de base et des activité induites pharmacologiquement sous anesthésie, suivant un protocol établi. L’étude sur l’orientation spatiale repose sur un groupe avec lésion vestibulaire et un groupe contrôle, tous deux soumis à des stimuli concordants ou discordants. L’étude sur les absences compare également deux groupes d’animaux, présentant des absences spontanées contre animaux contrôles. Pour réduire les effectifs, étant donné les similitudes techniques entre les procédures engagées pour ces 3 axes d’étude, des données pourront être partagées et le cas échéant des animaux pourront participer à plusieurs axes d’étude.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés pendant 5 jours suivant leur arrivée aux conditions de température et d'humidité de l'animalerie. Les conditions de stabulations sont conformes aux standards: taille des cages, nourriture et eau ad libitum, éclairage suivant un cycle régulier jour/nuit. L'environnement est enrichi par des buchettes. Les animaux sont hébergés par groupes sauf lorsque cela représente un risque post-opératoire (détérioration des prothèses par un congénère). Le projet n’a pas de finalité associée à la douleur et ne prévoit pas l’occurrence de situation douloureuse, en dehors d’un épisode d’intensité au maximum modérée, post-opératoire sur une durée de 3 jours, pris en charge de façon systématique et anticipée. La survenue éventuelle d’autres épisodes douloureux pourrait se produire en cas de complication chirurgicale, impliquant une vigilance quotidienne. Afin de minimiser les douleurs post-opératoires les animaux recevront un traitement antalgique initié dès le début de la chirurgie. Durant toute l'étude : les animaux seront évalués quotidiennement par les zootechniciens pour des comportements tels qu'une posture ou des mouvements anormaux. En cas de comportement anormal, les animaux seront isolés et feront l'objet de soins adaptés par les expérimentateurs pendant 72h. Les animaux seront euthanasiés s'ils présentent des signes de douleur persistants ou perdent 10% ou plus de leur poids pendant cette période, selon une grille standard. L'atteinte d'un point limite exige une ou plusieurs des actions suivantes : -l'isolation et la surveillance bi-quotidienne, injection de solution glucosée en sous-cutanée en cas de dénutrition - l'administration d'un analgésique -l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les rats et souris forment un modèle des activités cérébrales et du couplage neuro-vasculaire des mammifères. Ils forment des modèles particulièrement développés pour étudier les circuits cérébraux de l’orientation spatiale, des comportements cognitifs simple et du sommeil. De plus, des lignées spécifiques (WAG/Rij, GAERS) sont des modèles de référence pour les absences. Le projet repose sur des rats et souris adultes, dès la fin du sevrage, soit un âge compris entre 4 semaines et 1 an, poids d'un animal sain (souris 10-20g, rat 150-500g). Des animaux adultes présentent un référentiel stable des capacités cognitives et du couplage neurovasculaire. Les lignées WAG/Rij et GAERS présentent des absences spontanées qui émergent dans les 2-4 semaines suivant la naissance, ce qui en fait d'excellents modèles. Les modèles rats et souris sont complémentaires : la taille du cerveau de rat est particulièrement adaptée à la technique d'imagerie ultrasonore (résolution spatiale, masse de la sonde fixée sur le tête de l'animal), la souris offre une perspective de comparaison avec un corpus d’études plus diversifié.

231 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par gavage des substances de référence connues pour perturber la thyroïde, subissent des prélèvements sanguins répétés sans anesthésie puis une autopsie du foie, de la thyroïde et de l'hypophyse. Le porteur présente le projet comme relevant du remplacement et de la réduction, l'objectif affiché étant de valider des méthodes sans animaux (NAMs) par extrapolation des données in vitro. Il reconnaît que cette validation "nécessite" malgré tout des données obtenues chez le rat, un seul sexe étant testé pour limiter l'effectif.

Objectifs

Classiquement l’évaluation de la sécurité des produits chimiques implique le recours à des études animales pour ne soumettre à autorisation que des produits dont le profil toxicologique garantit l’absence d’effet néfaste sur la santé humaine. Or cette pratique de la toxicologie est remise en question par le développement de nouvelles approches méthodologiques (connues sous l’acronyme NAMs) qui, combinant des modélisations mathématiques par ordinateurs (études in silico) et des modèles cellulaires (tests in vitro), limiteront ainsi le plus possible voir totalement le recours aux modèles animaux (études in vivo). Ce développement est encouragé par les autorités de mise sur le marché européenne (EFSA) ou américaine (EPA). Dans ce contexte, l’objectif est de développer des modèles quantitatifs d’extrapolation des données in vitro aux données observées in vivo en se focalisant sur les baisses d'hormones thyroïdiennes induites par les interactions entre le foie et la thyroïde. En effet de nombreux produits chimiques y compris des substances ingérées au quotidien comme l'alcool, mais aussi médicamenteuses, sont métabolisées dans le foie et détoxifiées. L’induction d’enzymes de détoxification a comme effet collatéral une élimination plus rapide d’hormones thyroïdiennes, notamment chez le rat qui est connu pour être beaucoup plus réactif que l’homme. Cette connaissance est habituellement obtenue par des études de toxicologie sur l’animal. Mais aujourd’hui il est possible d’envisager d’étudier le potentiel d’activité d’un produit chimique pour cet Adverse Outcome Pathway (AOP) spécifique en utilisant des outils mathématiques et des données obtenues sur essais in vitro de foie et de thyroïde. C’est l’objectif de ce projet et plus spécifiquement de créer des modèles quantitatifs d’extrapolation des données obtenues in vitro aux effets observés in vivo. En accord avec le principe des 3Rs, ce projet a pour objectif de se passer à terme d'études chez l'animal quand un produit est identifié comme affectant la thyroïde in vitro.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est la création d'un modèle mathématique capable de prédire les changements d'hormones thyroïdiennes chez le rat à partir des résultats d’essais in vitro sans avoir la nécessité de conduire une étude sur l'animal. Elle s'inscrit donc à la fois dans les R=Réduction et R=Remplaçement de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Ce projet contribue à la mise au point de méthodes dites alternatives ou nouvelles approches méthodologiques (NAMs) en lieu et place de méthodes utilisant des animaux vivants, en utilisant ici des méthodes de culture cellulaire (hépatocytes et thyrocytes) combinées à des méthodes informatiques (in silico) qui nous permettront de prédire l’effet sur les hormones thyroïdiennes en fonction de l’impact des produits sur les enzymes hépatiques mesurées in vitro et sans recourir à l’animal.

Procédures

Les animaux seront exposés aux produits administrés oralement par gavage. Ils seront maintenus en hébergement collectif pendant 7 jours. Des prélèvements sanguins seront pratiqués de manière répétée sur des volumes très réduits (moins de 100 µl) sans anesthésie. Une autopsie sera pratiquée en fin d'étude conformément aux études de toxicologie pour de multiples analyses histopathologiques et moléculaires sur les tissus prélevés, notamment le foie, la thyroïde et l'hypophyse.

Impact sur les animaux

Les effets toxiques attendus seront modérés et connus car on utilisera dans ce projet 3 substances de référence, connus pour agir directement ou indirectement sur la thyroïde en induisant une diminution de la concentration circulante en hormones thyroïdiennes. De plus on sélectionnera des doses suffisamment basses (3 niveaux de doses études) dont la plus haute soit suffisamment tolérée pour que l’étude soit valide.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et autopsiés en fin d'étude conformément aux études de toxicologie pour la réalisation de multiples analyses histopathologiques et moléculaires sur les tissus prélevés, notamment le foie, la thyroïde et l'hypophyse.

Remplacement

Le projet s’inscrit totalement dans le R de Remplaçement de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Ce projet a justement pour objectif la mise au point de méthodes dites alternatives ou nouvelles approches méthodologiques (NAMs) pour remplacer les études utilisant des animaux par des méthodes de culture cellulaire (hépatocytes et thyrocytes) combinées à des méthodes informatiques (in silico). Elles contribueront à mettre en place un modèle prédictif pour évaluer l’effet d'un produit sur les hormones thyroïdiennes en fonction de ses effets testés in vitro sur les enzymes hépatiques. Pour valider ces nouvelles méthodes et cette extrapolation entre méthodes in vitro et méthodes in vivo, des données sont nécessaires in vitro mais aussi in vivo chez le rat d’où cette demande d’autorisation de projet.

Réduction

Le projet s’inscrit également dans le R de Réduction de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Le nombre d’animaux est réduit (231): pour le limiter au maximum, on ne testera le concept que sur un seul sexe (mâles) et rendre aussi la démonstration plus aisée en évitant l’influence des variations hormonales observées chez les femelles. Ce projet participe à l'effort de mise en place et de validation de méthodes alternatives pour réduire globalement le nombre d’animaux utilisés en Toxicologie. En effet, l’objectif est de promouvoir que les produits au profil le plus favorable et le moins risqué dans les phases avancés (celles qui nécessitent toujours l’utilisation d’animaux d’un point de vue réglementaire), en testant d’abord les produits à travers ces nouvelles méthodes alternatives. De ce fait, un nombre plus restreint de produits nécessiteront d’être testé chez l’animal et avec de plus grande chance de donner des résultats favorables, ce qui réduira de facto le nombre d’études nécessaires et donc d’animaux. Dans ce projet, le nombre d'animaux est réduit au strict minimum par type d'étude afin d'avoir une puissance statistique suffisante dans chaque procédure, à savoir 5 par groupe dans l'étude de toxicocinétique et 12 dans les études de toxicodynamie.

Raffinement

Le projet s’inscrit également dans le R de Raffinement de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Les paramètres étudiés sont beaucoup plus nombreux que ceux classiquement testés dans les lignes directrices de l’OCDE, notamment en incluant des biomarqueurs moléculaires à comparer à ceux qui seront mesurés in vitro. Ces études sont réalisés avec des produits de référence connus à des doses choisies pour perturber l'homéostasie de l'axe hypothalamo thyroidien tout en minimisant les nuisances sur le bien-être animal. Les points limites ne doivent pas être atteints et si c'était le cas, ont été définis avec précision, notamment en lien avec l'état général ici (consommation alimentaire, poids de l'animal, comportement) observé tous les jours.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet rentre dans le cadre des efforts entrepris afin de remplacer les études chez l’animal utilisé comme modèle en toxicologie, à savoir le rat, par de nouvelles méthodes alternatives. Pour comparer les données générées in vitro aux observations obtenues in vivo, et ainsi valider la pertinence de nos tests in vitro, il est important d’utiliser la même espèce animale et donc utiliser le rat dans ce projet. Toutes les études décrites dans ce projet utilisent de jeunes adultes (à partir de 6 semaines) conformément aux recommandations pour les études de toxicité réglementaire.

352 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie cérébrale pour injection de molécules ou implantation de fibres optiques et une chirurgie d'implantation d'un cathéter intraveineux, avant une autoadministration de cocaïne couplée à des chocs électriques de 0,5 mA que le porteur décrit comme "indolores". À la fin, le tissu cérébral est prélevé pour vérifier la précision des chirurgies. Le porteur affirme que l'addiction, "trouble du comportement", ne peut être reproduite in vitro ni in silico, le bénéfice annoncé restant une meilleure connaissance des bases neuronales de la prise de décision.

Objectifs

Le but de ce projet est d'étudier les circuits neuronaux qui traitent l'information relative aux conséquences négatives de la prise de cocaine. En effet, une hypothèses postule que la perte de contrôle de la prise de cocaine serait due au fait que certains individus ont des difficultés à associer leur prise de drogue aux conséquences néfastes sur la santé, car ces conséquences arrivent de manière retardée. Des études antérieures ont mis en lumière le circuit reliant le pallidum ventral (PV) au thalamus mediodorsal (TMD) dans les comportements de prise de cocaine. Selon les données de la littérature, ce circuit pourrait avoir un rôle clé dans la prise en compte des conséquences d'une action afin d'ajuster ses comportements futurs. L'objectif de ce projet sera donc d'évaluer le role de ce circuit dans la prise en compte des conséquences retardées de la prise de cocaïne.

Bénéfices attendus

Ces expériences fourniront des informations uniques sur les bases neuronales de la prise en compte des conséquences tardives de la prise de cocaine. De plus, elles mettront en lumière les spécificités neuronales et moléculaires présentes chez les individus à risque de perdre le contrôle de leur consommation de cocaine.

Procédures

Certains animaux seront soumis à une chirurgie cérébrale afin d'injecter les différentes molécules d'intérêt (272 sur 352 rats). Parmi eux, certains recevront également l'implantation de fibres optiques permettant l'enregistrements de l'activité neuronale (24 sur 352 rats). Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure entre 45 min et 1h. De plus, la majorité des rats sera soumise à une chirurgie intaveineuse pour l'implantation d'un cathéter intraveineux (328 sur 352 rats). Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 30 min. L'exposition au courant électrique ne dépasse pas le degré modéré. L'intensité choisie de 0,5mA durant 0,5 sec est considérée comme très faible. Il est également important de souligner que dans cette phase, les animaux ont le choix entre 2 leviers et auront donc la possibilité d’éviter le courant électrique.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances pouvant éventuellement être attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie cérébrale, c'est à dire : possible risque d'inflammation ou d'infection, apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée, perte des points de suture avant cicatrisation complète. Dans tous les cas nous veillerons à ce que ces nuisances soient réduites au maximum. Les courants électriques de 0,5mA sont indolores et n'engendreront pas d'effest indésirables.

Devenir

A la fin des expériences, il est nécessaire de vérifier la précision de nos chirurgies cérébrales mais également de prélever du tissu pour mesurer les niveaux de nos molécules d'intérêt. Aussi les animaux seront mis à mort afin de prélever le tissu cérébral.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal se justifie pour plusieurs raisons éthiques : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 2) l’addiction, contrairement à la dépendance physique, est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Ce projet s'intéresse à la présence d'un sous groupe d'animaux (estimé à 30 pourcents des individus selon les données publiées). De plus, étant donné que le pourcentage d’attrition est estimé à 20 pourcent en fin d’expérience, il faut démarrer l’expérience avec un groupe de 20 rats. En effet, pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique, il faut obtenir un effectif final minimum de 5 à 6 individus dans le sous groupe minoritaire. Enfin, les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques.

Raffinement

Les animaux sont logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie et anesthésie chimique ou gazeuse, sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et durent entre 30min et 1h. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection intraveineuse d'antibiotique ainsi qu’une injection sous-cutanée de solution saline, pour favoriser la réhydratation. Une période de récupération de 7 à 10 jours est observée durant laquelle les animaux sont sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Avant le début des expériences, les animaux sont manipulés tous les jours et habitués aux cages expérimentales (pendant 2 jours consécutifs à raison de 2h par jour) afin de limiter le niveau de stress et d’anxiété des animaux. Plusieurs critères sont pris en compte pour quantifier le niveau de souffrance de l’animal et décider de procéder à sa mise à mort. Ces manifestations éventuelles sont suivies quotidiennement par des méthodes non invasives (inspection et manipulation quotidiennes ; pesée régulière 3 fois par semaine).

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue un modèle établi pour l'étude de l'addiction avec lequel de nombreuses données ont été obtenues par la communauté scientifique. Les animaux utilisés sont tous de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., age moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.