Rats

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces rats porteurs de la dystrophie musculaire de Duchenne reçoivent 26 injections sur douze semaines et deux prélèvements de sang au sinus de l'œil sous anesthésie, et passent des mesures de force et de fonction cardiaque, pour tester un composé censé renforcer la membrane des fibres musculaires. Le porteur indique que la maladie provoque spontanément une perte de masse et un comportement de "freezing", une immobilité inhabituelle, et que tous les rats sont tués pour les analyses. Il affirme que cette question ne peut être tranchée que chez l'animal vivant, le rat reproduisant la maladie "beaucoup plus fidèlement" que la souris.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire, en raison de l'absence de la protéine dystrophine dans les muscles striés. La dystrophine connecte l’intérieur de la fibre musculaire à la matrice moléculaire à l’extérieur de la fibre. En l'absence de dystrophine, les fibres musculaires sont affaiblies et fragiles, au point de rompre lors d’une contraction musculaire qui agit comme un stress mécanique. Cela conduit à des cycles répétitifs de régénération et de dégénérescence des fibres, accompagnés d'une inflammation chronique douloureuse, d’une fibrose et d’une perte permanente des fibres musculaires par épuisement de la capacité régénérative des cellules souches. Dans les muscles squelettiques et cardiaque, la liaison à la matrice se fait essentiellement via une protéine appelée intégrine. En condition DMD, les intégrines sont surexprimées par un mécanisme compensatoire. La présence massive d'intégrines à la surface de la fibre musculaire favorise le relarguage de molécule de l’inflammation, à l’origine d’une boucle vicieuse favorisant la fibrose. La stratégie pharmacologique proposée ici consiste à exploiter la présence des nombreuses molécules d'intégrines à la surface des fibres musculaires DMD. L'objectif du projet est d'activer les molécules d'intégrines par une modification de leur forme induite par la fixation spécifique du composé testé. On sait que l'activation des intégrines promeut leur fixation aux molécules de la matrice extracellulaire. Nous posons l'hypothèse que sur notre modèle de DMD, la fragilité de la membrane cellulaire des fibres musculaires initialement induite par la déficience en dystrophine sera compensée par une stabilité renforcée de la membrane, résultant de sa connexion avec la matrice qui agit comme une gaine externe protectrice, avec pour conséquence de réduire la mort des fibres musculaires et pour conséquence fonctionnelle d'accroître le nombre de fibres musculaires actives et ainsi, la force du muscle.

Bénéfices attendus

Notre laboratoire vise à mieux caractériser les mécanismes de la DMD pour les contrer via des thérapies innovantes que nous testons sur un modèle de rat qui mime fidèlement la sévérité de la maladie de l'enfant. Nous proposons ici de traiter des rats malades avec un composé mimant l'activation d’un mécanisme protecteur de la membrane des fibres musculaires, dont nous espérons qu'il améliorera le fonctionnement de l'ensemble des muscles du rat. Ce composé agit en facilitant la résistance de la membrane protectrice qui entoure les fibres musculaires, réduisant ainsi leur mort qui est toujours accompagnée d’une inflammation douloureuse. Le composé réduit aussi la fibrose du muscle, accélérant la récupération motrice. Nous projetons ainsi d'identifier une piste innovante qui pourrait devenir un traitement utilisable chez l’enfant en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux vigiles sont injectés deux fois par voie sous-cutanée pour induire l'anesthésie/analgésie préalable au prélèvement sanguin (au démarrage de la procédure puis en fin de procédure). Ils sont injectés par voie sous-cutanée pour recevoir le traitement ou le contrôle 2 fois par semaine pendant 12 semaines. Au total, chaque rat recevra 26 injections, chacune d'une durée maximale de 2 minutes, réalisée par une personne très expérimentée et soucieuse de réduire l'impact négatif pour l'animal. L'injection sera réalisée plutôt au début ou en fin de journée pour éviter de réveiller l'animal. Les animaux seront également prélevés deux fois au sinus rétro-orbitaire pour obtenir du sang permettant d'évaluer le bénéfice espéré de la thérapie (biomarqueurs), sous anesthésie générale et locale. La séquence de prélèvement dure au total 1 heure (jusqu'au réveil). Le prélèvement lui-même dure moins de 30 secondes. La durée d'un enregistrement ECG est de 15 minutes. La durée d'un enregistrement pléthysmographie est de 30 minutes. La durée d'une séquence de grip test est de 20 minutes. La durée d'un enregistrement de force est de 90 minutes, anesthésie comprise. Il n'y a pas de chirurgie prévue.

Impact sur les animaux

Il a été montré que le produit administré à une dose 3 fois supérieure à celle que nous administrerons n’est pas toxique chez le rat. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvements chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Par expérience des derniers mois, nous n'avons pas à intervenir sur des animaux avant l'âge de 6 mois. La procédure de ce projet inclut des animaux chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont très limitées et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers, facilement gérables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques, cellulaires et moléculaires nécessaires. Tous les animaux, même morts précocement au cours de la procédure, pourront être inclus pour les analyses prévues.

Remplacement

L'efficacité du composé testé sur l’activation des intégrines a déjà été confirmée in vitro et sur des modèles de souris. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé permet-elle de protéger suffisamment la membrane de la fibre musculaire pour que la masse des muscles des rats DMD traités augmente, que cela confère un bénéfice fonctionnel quantifiable à l’échelle du cœur et des muscles squelettiques, associée à une diminution également quantifiable du remodelage délétère à l’échelle histologique ?

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Les muscles des animaux âgés d’un à 6 mois sont affectés par la maladie. Il est donc attendu que les différences entre animaux WT et DMD seront marquées et instructives, et que l'évaluation de l'efficacité du composé testé sera pertinente puisqu'intervenant à un moment où la déviation de la trajectoire fibrotique permettra une moindre myonécrose, facilement quantifiable.

2 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante des électrodes dans le cerveau, puis des stimulations électriques répétées de l'amygdale provoquent des crises d'épilepsie, pour tester des molécules antiépileptiques développées par des industriels du médicament. Le porteur indique que ces stimulations quotidiennes peuvent induire un stress accru et une absence de prise de poids, et que l'hébergement en cage individuelle peut aggraver ce stress. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit les circuits neuronaux impliqués et que les tests sur l'animal vivant sont "indispensables" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Les désordres épileptiques représentent l’une des atteintes cérébrales les plus importantes avec une incidence de 0.6 % de la population mondiale. Malgré le développement de plusieurs antiépileptiques ces 30 dernières années, plus de 30% des patients épileptiques n’ont pas leur épilepsie contrôlée par ces traitements qui provoquent de plus de nombreux effets secondaires. Il est donc critique de développer de nouvelles molécules antiépileptiques afin de traiter les patients résistants aux traitements déjà existants et d’améliorer le contrôle de la maladie et la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de tester, sélectionner et valider de nouvelles molécules développées par les professionnels du médicament dans un modèle de rat mimant une épilepsie chronique focale secondairement généralisée. Cette approche repose sur la stimulation électrique répétée afin de reproduire les principales caractéristiques électrophysiologiques d’une forme d’épilepsie humaine : l’épilepsie du lobe temporal. Des études pharmacologiques ont montré l’utilité de ce modèle reposant sur la méthode de l’embrasement, pour le criblage de molécules grâce à la bonne stabilité du modèle une fois établi . Il apparait donc comme un modèle pertinent pour la sélection et la validation de nouvelles molécules antiépileptiques. Ce projet facilitera le développement de nouvelles molécules antiépileptiques plus efficaces et ayant moins d’effets secondaires pour des patients souffrant d’épilepsies non contrôlées efficacement par les traitements actuels.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouvelles molécules antiépileptiques afin de palier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles. L’utilisation du modèle de rat embrasé pourrait également permettre d’identifier des cibles potentiellement impliquées dans la génération et/ou la propagation des crises d’épilepsie. Ce projet ajoute une analyse électrophysiologique (en sus de l’évaluation comportementale classiquement décrite) de l’effet sur ce modèle d’épilepsie des molécules testées en caractérisant notamment : les durées, latences d’apparition et amplitudes des crises, et les variations potentielles de seuil d’excitabilité des réseaux observés. Une attention particulière sera portée sur l’effet sur la généralisation ou non des crises induites par la stimulation. L’utilisation de ce modèle dans ce projet pourrait donc permettre d’identifier le potentiel thérapeutique de nouveaux traitements antiépileptiques ou bien leur capacité à ralentir voire arrêter la phase d’épileptogénèse.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une chirurgie d’implantation d’électrodes corticales et sous-corticales, procédure réalisée sous anesthésie générale. Puis des stimulations électriques amygdaliennes de faible intensité et de courte durée (1s) seront réalisées sur l’animal vigile. Une stimulation quotidienne (5 jours sur 7) sera appliquée pendant la phase d’établissement du modèle (2 à 4 semaines). Lors des tests pharmacologiques en aïgu, une administration sur animal vigile maintenu en contention précèdera la stimulation. Ces administrations seront espacées de 72h minimum et ne pourront pas excéder le nombre de 20. Lors des tests pharmacologiques en administration chronique, les injections peuvent être réalisées jusqu’à trois fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Quatre lots de 25 animaux pourront être implantés avec une pompe osmotique sous anesthésie générale, permettant une administration continue des molécules testées. Lors des protocoles de tests pharmacologiques, 4 stimulations électriques maximum auront lieu dans la même journée, deux fois par semaine maximum. En fin d’étude, selon la demande des clients, les animaux subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Ce modèle animal implique l’utilisation de stimulations électriques répétées permettant d’abaisser progressivement le seuil d’excitabilité cérébrale. L’intensité de stimulation est progressivement augmentée jusqu’à générer les premières crises épileptiques détectées sur le signal électroencéphalographique. Une fois cette intensité fixée par animal, elle est maintenue pour l’ensemble des stimulations appliquées par la suite. L’animal va présenter à chaque stimulation un ou plusieurs des signes décrits par l’échelle d’évaluation comportementale (échelle de Racine) : ces effets sont observés sur un cours laps de temps uniquement dans les minutes post-stimulation (maximum 2 minutes). En dehors de cette courte période, les animaux ne présentent pas de crises ni de comportements anormaux observables. L’amygdale basolatérale est impliquée dans les mécanismes de défense et les comportements de fuite chez les rongeurs, il est donc envisageable que la stimulation de cette zone aie un impact émotionnel sur l’animal, même si ce potentiel effet n’est pas décrit dans la littérature sur ce modèle. Au cours de la phase de génération du modèle (~15 jours), ces stimulations quotidiennes peuvent induire un stress accru et une absence de prise de poids. De plus, la nécessité d’hébergement en cage individuelle des animaux (afin de préserver l’intégrité des systèmes d’enregistrement) peut potentiellement exacerber ce stress. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une myorelaxation, une sommnolence ou à l’inverse des myoclonies du fait des mécanismes d’action des molécules testées.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs de stimulation et d’enregistrement de signaux électroenécephalographiques et la mise en place d’un modèle pathologique. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Ce projet a pour but de démontrer l’efficacité de molécules à la fois sur l’épileptogénèse et sur la génération de crises épileptiques. Actuellement, il n’existe aucune alternative in vitro ou modèle computationnel reproduisant les circuits neuronaux impliqués dans leur globalité et pouvant se substituer à ce modèle. De plus, toute demande de mise sur le marché nécessite de prouver l’innocuité et l’efficacité de la molécule testée, les tests in vivo préalables aux essais cliniques sont dans ce contexte indispensables. L’utilisation d’un organisme vivant est donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées. Les protocoles d’études sont basés sur des procédures d’études cliniques en utilisant un plan d’étude croisé permettant de réduire le nombre d’animaux et d’augmenter la puissance statistique puisque chaque animal est son propre contrôle. Un nombre minimum final de 16 animaux pour les protocoles pharmacologiques est nécessaire pour obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur avec une stimulation électrique répétée de classe modérée. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et l’état général de l’animal. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soins sont optimisées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Le poids des animaux est également contrôlé de manière continue et hebdomadaire. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles contenant un enrichissement composé de briquettes en bois, de nichoirs en papier kraft et de bâtonets en nylon dédiés spécifiquement aux rongeurs. Afin de minimiser la détresse sociale liée à l’isolement, les animaux sont régulièrement regroupés dans une grande enceinte avec différents éléments (tunnels, briquettes en bois, objets divers). Cette étape d’enrichissement social est réalisée au moins une fois par semaine sous la supervision d’un membre du laboratoire afin d’éviter tout endomagement des dispositifs d’enregistrement.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont indispensables pour avancer la compréhension des épilepsies. De précédentes études ont montré la très bonne sensibilité des rats vis-à-vis des protocoles d’embrasement afin de modéliser l’épilepsie humaine. Les activités neurologiques visibles sur les signaux électroencéphalographiques ont des profils similaires à ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie- : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues : suppression ou réduction des crises avec le valproate, le diazepam et l’éthosuximide. Des rats adultes de 5 à 7 semaines seront utilisés dans ce projet. Les procédures seront réalisées au minimum une semaine après l’arrivée des animaux dans notre établissement. L’implantation des électrodes corticales et profondes impose l’utilisation d’un cerveau mature afin que le positionnement des électrodes soit correct, que les connections neuronales soient bien établies et que les animaux puissent récupérer facilement de la chirurgie.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

12 rats vont être utilisés, tous tués sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après un jeûne de 24 heures, chaque rat subit une chirurgie de pose de trois cathéters dans une veine, une artère et la veine mésentérique, puis reçoit du malate radiomarqué au carbone 14 pendant près de trois heures d'anesthésie avant la mise à mort, pour mesurer la production de sucre par l'intestin. Le porteur indique des risques d'hypoglycémie, de saignements, de détresse respiratoire et d'hypothermie. Il affirme que cette mesure n'est pas réalisable sur des cellules ou des organoïdes en culture et que seul le rat convient à la technique.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique qui est un facteur de risque majeur du développement de nombreuses complications. Dans ce contexte, la production intestinale de glucose (PIG) (qui correspond à la capacité qu’à l’intestin de produire du sucre (glucose) en dehors des périodes de repas), est une fonction qui exerce des effets anti-obésité et anti-diabète. De plus, les régimes riches en protéines et en fibres, sont responsables d’effets bénéfiques impliquant la PIG. De plus, les fibres alimentaires peuvent être digérées par l’intestin et les bactéries intestinales en différentes molécules, susceptibles d’activer la PIG. De ce fait, dans un projet précédent, nous avons émis l’hypothèse que d’autres molécules issues de la digestion des aliments pourraient induire la PIG. Les résultats issus de ce projet ont permis d’identifier le malate comme un activateur de la PIG (molécule qui active la production de glucose par l’intestin). En effet, l’apport de 5% de malate à une alimentation riche en gras et en sucres de souris contrôles pendant 4 semaines, limite la prise de poids alors que la prise alimentaire reste inchangée. De plus, nous observons également des effets bénéfiques protecteurs du malate sur la glycémie (taux de sucre dans le sang) et l’accumulation de graisses dans le foie (stéatose hépatique). De façon intéressante, l’ensemble de ces effets bénéfiques ont déjà été décrits lors d’une activation génétique de la PIG chez la souris. Enfin, alors que le niveau d’expression des protéines clés dans la production de glucose est augmentée, ces effets ne prennent pas place chez des souris où la PIG est non fonctionnelle. Montrant ainsi le rôle crucial de la PIG dans l’obtention des effets bénéfiques du malate. Néanmoins, ces travaux ne nous permettent pas de comprendre comment le malate active la PIG, et donc la production de glucose (sucre) par l’intestin. Ainsi, l’objectif de ce projet est donc de déterminer si le malate agit en tant que substrat de la PIG (s’il est directement transformé en glucose). Plus précisément, nous souhaitons déterminer si les carbones du malate sont intégrés dans le glucose produit par l’intestin. Grâce à ces résultats, le malate pourra alors être envisagé comme une nouvelle cible de traitement de l’obésité et ses complications.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet nous permettrons de compléter nos travaux sur les capacités de molécules à activer la PIG et ses effets bénéfiques. En effet, nos travaux issus d’un projet précédent ont permis de montrer que le malate exerce des effets bénéfiques sur l’obésité, le diabète (trop de sucre dans le sang) et la stéatose hépatique (trop de graisses dans le foie). De façon intéressante, ces effets bénéfiques ne prennent pas place chez des ayant une PIG non fonctionnelle. Néanmoins ces travaux n’ont pas permis de montrer précisément les mécanismes impliqués. Plus précisément, nous ne savons pas si le malate est directement transformé en glucose (sucre) par l’intestin. Ce projet, qui viendra finaliser notre projet précédent, nous permettra de comprendre les mécanismes mis en jeu dans l’activation de la PIG par le malate. Ainsi, grâce à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, l’activation de la PIG par le malate pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique intéressante pour lutter contre l’obésité et ses complications.

Procédures

Les rats seront soumis à une mise à jeun pendant 24h, puis recevront un traitement antidouleur adapté 30 minutes avant le début de la chirurgie. Ensuite ils seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) afin de mesurer l’incorporation du malate [qui a été modifié pour contenir du carbone 14 (C14), qui est une forme radioactive du carbone], dans le glucose (sucre produit par l’intestin). Lors de la privation de nourriture de 24h, les rats conserveront un accès à l’eau, leur enrichissement et l’hébergement en groupe. Les nuisances causées par la mise à jeun chez le rat sont limitées car très rapidement, le foie, les reins et l’intestin vont produire du glucose et maintenir un taux de sucre dans le sang stable. La mise à jeun est effectuée à 9h du matin, soit 3h après la fin de la phase nocturne, qui est la phase pendant laquelle les animaux consomment 80% de leur ration quotidienne. La mesure de l’incorporation du malate radiomarqué (C14) dans le glucose produit par l’intestin de rats nécessite une chirurgie d’environ 45 min afin d’insérer 2 cathéters dans une veine (jugulaire) et une artère (carotide). Ensuite, le malate C14 est perfusé en veine pendant 90 minutes, puis un cathéter est introduit dans la veine mésentérique supérieure (point de convergence du sang provenant des différentes veines de l’intestin) afin de collecter simultanément du sang provenant de l’intestin et de la circulation sanguine générale. Au total, le temps d’anesthésie par rat est d’environ 2h45 à 3h. A la fin de la procédure, les rats sont mis à mort par injection intraveineuse d’une dose létale d’un euthanasiant chimique (sans réveil de l’animal).

Impact sur les animaux

Ce projet nécessite une mise à jeun (privation de nourriture, mais pas de l’eau de boisson) des rats pendant 24h avant la chirurgie et la perfusion de malate radiomarqué (C14) pour la mesure de la production de sucre par l’intestin. Pendant cette phase de privation de nourriture, les rats peuvent avoir des épisodes d’hypoglycémie (taux de sucre trop bas), une modification de leur comportement (absence de déplacement dans la cage, absence de toilettage, grimaces). Néanmoins, les nuisances causées par la mise à jeun chez le rat sont limitées car très rapidement, l’activation de la production de sucre par le foie, les reins et l’intestin, va permettre de maintenir un niveau de sucre dans le sang suffisant (glycémie). De plus, la participation de l’intestin et du rein au maintien de la glycémie augmente lorsque la privation alimentaire se prolonge. A l’issu de ces 24h de privation alimentaire, les animaux recevront un traitement anti-douleur adapté à la chirurgie et seront anesthésiés (anesthésie gazeuse). Lors de la pose des cathéters, il est possible de provoquer des saignements. De plus, l’anesthésie est susceptible de provoquer une détresse respiratoire ou une hypothermie. Des moyens seront mis en place afin de prévenir ces nuisances.

Devenir

Dans ce projet, la procédure comporte une chirurgie et une injection de traceurs radioactifs (malate C14). La chirurgie doit permettre l’implantation de 3 cathéters (en veine jugulaire, en artère carotide et en veine mésentérique supérieure). Il n’est pas possible, ni nécessaire de réveiller les rats ayant subi l’implantation de 3 cathéters et l’injection de composés radioactifs. D’autre part, à l’issu de la procédure (tout de suite après la mise à mort des rats), le contenu intestinal sera prélevé. Ces prélèvements nous permettrons de déterminer si une partie du glucose-C14 produit par l’intestin (qui est issu du malate-C14) a pu être libéré dans la lumière intestinale (et non dans la circulation sanguine).

Remplacement

La PIG exerce un contrôle sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. La mesure de l’incorporation des carbones radioactifs du malate (C14) dans le sucre (glucose) produit par l’intestin dépend de plusieurs paramètres, dont le déstockage du glucose, la production de glucose par le rein, et la consommation de glucose par l’ensemble des tissus de l’organisme. Ainsi, cette mesure nécessite de reproduire les conditions physiologiques d’un jeûne de 24h (nécessaire à l’activation de la PIG) et une circulation sanguine préservée. En effet, la mesure de la production de glucose à partir du malate nécessite des prélèvements de sang simultanés dans l’artère carotide et la veine porte. Cette mesure n’est donc pas réalisable avec des cellules ou des organoïdes d’intestin en culture (groupement de cellules en culture qui modélise un tissu et donc les interactions entre cellules).

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dont nous avons besoin, nous avons calculé le nombre de rats au plus juste à partir de notre connaissance de la technique utilisée, soit au maximum 12 rats. Néanmoins, pour limiter au maximum le nombre de rats nécessaires, l’étude sera menée avec une première cohorte de 6 rats, et en fonction des résultats obtenus, nous augmenteront l’effectif pour atteindre 12 rats au maximum. Ainsi, cette étude nécessitera au minimum 6, et au maximum 12 rats. D’autre part, le principe de réduction a été appliqué dès la conception de ce projet. En effet, nous avions choisi de réaliser ce projet en plusieurs étapes (les 2 premières faisant partie d’un projet précédent, actuellement terminé): - Etape 1 : Afin de déterminer si les molécules d’intérêt (dont le malate) exercent des effets bénéfiques chez des souris sauvages/contrôles, nous les avons ajoutés à l’alimentation des souris. - Etape 2 : Seulement pour les molécules ayant montré des effets bénéfiques chez les souris sauvages, nous avons cherché à déterminer si ces effets étaient médiés par la PIG. Pour cela, les métabolites ont été ajoutés à l’alimentation de souris chez lesquelles la PIG est non fonctionnelle . L’absence d’effets, traduisait alors de l’importance de la PIG dans ces effets bénéfiques. - Etape 3 : Lors des étapes 1 et 2, nous avons montré que le malate est capable d’induire des effets bénéfiques via la PIG. Dans ce projet, nous souhaitons comprendre les mécanismes impliqués. Plus précisément, nous souhaitons déterminer si le malate est transformé en glucose par l’intestin. Grâce à cette stratégie, l’étude de molécules qui paraissaient intéressants au départ, mais qui n’ont pas induits d’effets bénéfiques lors de l’étape 1, a été abandonné et a donc limité le recours à l’animal lors des étapes 2 et/ou 3. D’autre part, à l’issu de la procédure (tout de suite après la mise à mort des rats), le contenu intestinal sera prélevé. Ces prélèvements nous permettrons de déterminer si une partie du glucose-C14 (radioactif) produit par l’intestin (issu du malate-C14) a pu être libéré dans la lumière intestinale (et non dans la circulation sanguine). Dans ce cas, nos travaux montreraient pour la première fois que la PIG est capable de fournir du sucre/glucose aux bactéries du microbiote intestinal. Enfin, il n’est malheureusement pas possible de constituer une banque de tissus radioactifs pour une utilisation ultérieure.

Raffinement

Les rats seront commandés à l’âge de 5 semaines et une phase d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début de la procédure. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisés et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. Les rats seront hébergés par groupe de 2, dans des cages adaptées et avec un enrichissement adapté dans la cage. Lors de la mise à jeun (pour 24h), les rats conserveront un accès à l’eau, leur enrichissement et l’hébergement en groupe. La surveillance des animaux et de leur comportement permettra de déceler toute souffrance de façon précoce. Néanmoins, les nuisances causées par la mise à jeun chez le rat sont limitées car très rapidement, l’activation de la production de sucre par le foie, les reins et l’intestin, va permettre de maintenir un niveau de sucre dans le sang suffisant (glycémie). De plus, la participation de l’intestin et du rein au maintien de la glycémie augmente lorsque la privation alimentaire se prolonge. Concernant la mesure de la production de glucose à partir du malate C14, les animaux recevront une analgésie adaptée 30minutes avant la chirurgie. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Au cours de l’opération, nous surveillerons les paramètres cardio-respiratoires et la température de l’animal (maintenue stable par une couverture chauffante thermorégulée). Les chirurgies seront réalisées par des personnes qualifiées, et l‘intérieur des cathéters seront recouverts d’un anticoagulant pour éviter la formation d’un caillot sanguin. Les cathéters utilisés sont en matériaux biocompatibles et de diamètre adapté. A la fin de l’anesthésie ou en cas d’arrêt de la procédure pour souffrance (ils ne seront pas réveillés à l’issu de la procédure), les rats seront mis à mort par injection par injection d’une dose léthale d’un euthanasiant chimique.

Choix des espèces

Le rat, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de sa taille, il s’agit d’un animal où la chirurgie est facile et adaptée à la pose de cathéters. De plus, la mesure de l’incorporation du malate radioactif C14 dans le sucre produit par l’intestin est une technique qui n’est fiable que chez le rat. En effet, contrairement à la souris, le rat est peu sensible à la perturbation des flux de glucose qui peut intervenir lors du prélèvement de sang en simultané dans 2 cathéters. Sachant que la perturbation des flux de glucose est susceptible de moduler la fiabilité de la mesure. Les rats (mâles) seront commandés à l’âge de 5 semaines (environ 200-220g) et la procédure sera réalisée 2 semaines plus tard, soit à l’âge de 7 semaines (environ 300g). Les rats adultes sont sevrés et ont donc une alimentation indépendante, ce qui justifie leur utilisation comme modèle en nutrition humaine.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

132 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d’implantation d’un capteur de pression dans l’aorte, un gavage quotidien et deux prélèvements de sang, avant le prélèvement de ses tissus, pour évaluer des associations d’extraits de plantes contre l’hypertension. Le porteur indique qu’une perte de poids suit la chirurgie et qu’un gavage prolongé peut irriter l’œsophage. Il affirme que la pression artérielle ne peut être étudiée que sur un organisme complexe et écarte le recours à un modèle in vitro.

Objectifs

D’après l’OMS 2 milliards de personnes dans le monde sont en surpoids, 650 millions sont obèses et 1 adulte sur 3 est atteint d’hypertension artérielle (HTA). Dans l’hypertension, les vaisseaux sanguins subissent en permanence une pression élevée (pression diastolique ≥90mmHg et pression systolique ≥ 140mmHg), ce qui peut les endommager. Plus l’hypertension est élevée, plus les risques associés sont importants et peuvent entrainer des complications graves (AVC, insuffisance cardiaque, insuffisance rénale, infarctus de myocarde…). L’utilisation d’extraits végétaux en complément des mesures hygiéno-diététiques est une piste sérieuse pour prévenir l’évolution de l’HTA. Certains extraits végétaux issus de la pharmacopée européenne ont déjà montré des effets bénéfiques et protecteurs. L’objectif de ce projet et d’étudier les bénéfices apportés par différentes formulations innovantes d’extraits végétaux sur la prévention du développement de l’HTA dans différents modèles murins et de mieux comprendre les mécanismes d’action mis en jeu dans cette prévention. Chez les rongeurs (rats, souris), il est possible d’induire un état d’hypertension en nourrissant les animaux avec un régime riche en gras et en sel (HF -HS) (mimant les mauvaises habitudes alimentaires impliquées en partie dans le développement de l’hypertension chez l’homme) durant plusieurs semaines. Une hypertension peut également être obtenue en ayant recours à des animaux naturellement hypertendus comme le rat SHR ou en ayant recours à l’administration de composés pharmacologiques. Au cours de ce projet, les animaux seront placés dans un environnement adapté à leurs besoins physiologiques et observés quotidiennement sur la base de critères comportementaux (posture, appétit, interaction avec l’environnement…) et morphologiques (croissance, prise de poids, état général des dents, du poil…) pour prévenir au plus vite de la diminution de leur état de bien-être (raffinement). Les différents tissus obtenus au cours de ce projet seront stockés pour permettre des analyses ultérieures et éviter de devoir recourir à un projet similaire dans le temps. L’ensemble de ces dispositions répond aux principes fondamentaux des 3Rs (réduction, raffinement, remplacement) dans le cadre de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont d’identifier des nouvelles associations d’extraits végétaux susceptibles d’améliorer la pression artérielle dans un contexte d’hypertension. Ces nouveaux extraits pourraient à terme, aider les personnes souffrant d’hypertension à réguler leur pression artérielle. Ce projet pourrait également permettre d’identifier et de caractériser des mécanismes d’action liés aux effets bénéfiques de ces extraits.

Procédures

Les animaux seront soumis aux actes suivants au cours du projet : - Une implantation d'un capteur de pression artérielle via l'aorte abdominale (chirurgie sous anesthésie générale) d'une durée totale d'environ 45 minutes. - Un gavage quotidien (administration de composés à raison de 8ml/kg) sur la durée de l'étude. L'acte a une durée inférieure à 10 secondes, contention comprise. - 2 prélèvements de sang de 500 µl (début et fin d'étude) compris dans les recommandations du NC3R. L'acte a une durée inférieure à 1 minute, contention comprise.

Impact sur les animaux

Ce projet nécessite de recourir à une chirurgie pour l’implantation d’outil de télémétrie. Comme pour toute chirurgie, un risque de perte dans le temps chirurgical est envisagé. Également, durant les 2 à 3 premiers jours après la chirurgie, une perte de poids est attendue. Cette perte de poids devrait cependant être compensée les jours suivants. Pour les animaux recevant une administration chronique de produit par gavage quotidien, une irritation de l’oesophage peut apparaitre (rare). Cet effet indésirable est réduit par la réalisation de l’acte par du personnel entrainé et qualifié.

Devenir

A la fin de chaque procédure des tissus seront prélevés pour réaliser des analyses complémentaires au laboratoire. Les animaux seront donc euthanasiés.

Remplacement

L’aspect hémodynamique de la pression artérielle et la complexité des mécanismes qui la régule ne peuvent être évalués qu’en ayant recours à des un organisme complexe présentant des similitudes avec L’Homme. Les rongeurs sont des modèles adaptés d’études ne peuvent pas se substituer à un modèle in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à son minimum pour permettre de répondre à la question scientifique tout en préservant la bonne puissance statistique. L’utilisation de la technique de télémétrie pour l’évaluation de la pression artérielle correspond au gold standard et permet de réduire la variabilité de mesures rencontrées dans d’autres techniques (exemple tail cuff). La diminution de cette variabilité permet de réduire davantage le nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées, et conformes aux besoins de l’espèce avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et avec un enrichissement du milieu (matériel de nidification + tube en plexiglas rouge). Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale et la douleur sera prise en charge par l’utilisation d’analgésique (kétoprohène). Le recours à la télémétrie pour l’évaluation de la pression artérielle constitue un gold standard et permet d’enregistrer la pression artérielle en continu sans avoir recours à la manipulation de l’animal (pas de contention, diminution du stress…)

Choix des espèces

La souris C57BL/6 est une lignée polyvalente largement utilisée dans la recherche sur le métabolisme et la nutrition. Cette lignée lorsqu’elle est soumise à un régime DIO développe une obésité au cours du temps. Cet état d’obésité peut être accompagné d’HTA en ajoutant un composé pharmacologique comme le L-Name dans l’eau de boisson. Le rat SHR est naturellement hypertendu et est également un modèle de choix pour l’étude de l’HTA. Les 2 modèles utilisés dans ce projet sont complémentaires et adaptés à nos objectifs. Le rat SHR dérive du rat Wistar, ce dernier sert de référence ne développant pas d’hypertension. En se basant sur nos précédents projets, les animaux utilisés seront âgés de 8 - 12 semaines à l’initiation du traitement / chirurgie ce qui correspond à un état de jeunes adultes (maturité du système immunitaire et sexuel). Pour les rats SHR la PA progresse au cours du temps et il est préférable d'utiliser des animaux jeunes pour observés un ralentissement du developpement de l'hypertention.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime gras qui les rend obèses et diabétiques, des mises à jeun de douze heures, des gavages de glucose et, pour la moitié d’entre eux, un traitement antibiotique destiné à perturber leur flore intestinale, avant le prélèvement de leurs organes, pour étudier le lien entre microbiote et diabète. Le porteur indique que le gavage et la contention constituent un stress modéré et que les antibiotiques peuvent provoquer des diarrhées. Il affirme qu’aucun modèle in vitro ou in silico ne rend compte des liens entre alimentation, microbiote et régulation de la glycémie.

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte et une grande diversité de microorganismes. Les bactéries y jouent un rôle crucial pour le développement et le maintien d'un système immunitaire sain. Ainsi un déséquilibre de la composition du microbiote a été montré chez les patients atteints de maladies métaboliques comme l’obésité dont l’une des principales conséquences est le diabète. Ces 35 dernières années la prévalence du diabète a été multipliée par quatre avec 9.3% de la population mondiale souffrant de cette pathologie. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et le rôle que ces interactions pourraient avoir dans des maladies métaboliques telles que le diabète. En cas d'obésité, de nombreux changements se produisent dans l’intestin. Ces modifications intestinales sont maintenant reconnues comme participant à l'auto-aggravation de l'obésité. Parmi les changements qui s’opèrent, la densité des cellules de l'immunité, qui sont nombreuses dans l’intestin, augmentent chez les personnes obèses et leur activation va notamment modifier la régulation de la glycémie. Les mêmes mécanismes sont à l’œuvre dans les modèle de rats rendus obèses par l’alimentation. De nombreuses études suggèrent que les bactéries de l’intestin, dont la composition est perturbée par l‘obésité, sont en partie responsables des changements de fonction des cellules immunitaires. Cette triade (microbiote-cellules immunitaires intestinales-régulation de la glycémie) constitue donc une cible intéressante pour mieux comprendre la mise en place du diabète. Nous souhaitons dans un premier temps caractériser les populations de cellules immunitaires et leurs (dys)-fonctions dans différentes régions de l’intestin chez des rats obèses en comparaison avec des rats non obèses et ceci en présence ou non d’une perturbation majeure du microbiote intestinal. Sur les mêmes animaux un suivi de la glycémie sera réalisé ainsi qu’une analyse fine du microbiote intestinal et des populations et fonction de l’intestin. Des outils de bio-informatique nous permettant de faire des études de corrélation entre ces différents paramètres seront par la suite utilisés dans les analyses.

Bénéfices attendus

Les perspectives de ce travail sont d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques intestinales, donc accessibles par voie orale afin de prévenir ou limiter les effets néfastes de l’obésité sur le diabète. Le diabète est une maladie évolutive qui se caractérise par une hyperglycémie chronique liée à une réponse altérée à l’insuline. Ce déséquilibre du métabolisme glucidique est notamment lié aux déséquilibres nutritionnels et à l’obésité. Le système immunitaire a aussi un rôle dans la mise en place du diabète qui est souvent associé à une inflammation élevée chez les sujets obèses. Le diabète entraine des complications vasculaires graves à long terme et une surmortalité. Son impact sur le budget santé, qui peut atteindre 5 à 20% des dépenses de santé de nombreux pays, est évalué à la hausse pour les décennies à venir. Il est donc important de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette pathologie.

Procédures

Les animaux recevront un régime riche graisses induisant une prise poids et un diabète. Les animaux seront mis à jeun deux fois pour une durée de 12h durant l'ensemble de la procédure. Ils recevront également un gavage de glucose (entrainant une contention de 10 secondes). Un test de tolérance au glucose (appelé OGTT) visant à mesurer la glycémie (via une seule petite piqure à la queue) sera réalisé sur l'ensemble des animaux. Ce test sera réalisé deux fois à 3 semaines d’intervalle durant la procédure. La moitié des animaux recevra un traitement antibiotique pendant deux semaines afin de perturber la flore intestinale. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine en étant placés durant quelques secondes dans un pot individuel. Deux pesés sur l'ensemble du projet nécessiteront une pesée plus longue (de quelques minutes) afin de laisser le temps aux rats d'expulser une crotte qui sera ensuite récoltée dans le pot.

Impact sur les animaux

Le gavage lors de l’OGTT constitue un stress modéré notamment dû à la contention (d'une durée < 10 secondes). La contention et le gavage seront réalisés par un experimentateur expérimenté. Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. la procédure de prélèvement de sang nécessaire à la lecture de la glycémie ne présente qu’une douleur très faible car il est réalisé via une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'espérimentateur lors du premier prélèvement du test. Par la suite un simple massage permet de prélever du sang sans avoir à recouper la queue. Le traitement antibiotique pourra éventuellement entrainer des diarrhées.

Devenir

Dans ce projet la mise à mort est nécessaire pour le prélèvement des organes.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les liens entre l’alimentation, la composition du microbiote, les fonctions immunitaires de l’intestin et la régulation de la glycémie.

Réduction

D’après les études déjà menées, nous estimons que 15 rats par groupe expérimental sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux hébergés 2 par cage bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront entrainés à la manipulation (notamment à la contention). Afin de limiter le stress lors des mesures de glycémie qui se feront dans une autre salle que la salle d'hébergement, les animaux seront transférés dans la salle expérimentale 1h avant. Un anesthésique local sera appliqué sur la queue avant les prélèvements de sang réalisés pour les mesures de glycémie. Des points limites, décrits dans les procédures expérimentales, seront également mis en place.

Choix des espèces

Les rats utilisés seront des rats wistar RjHan:WI. Cette espèce est choisie car cette étude fait partie d’un projet collaboratif réunissant 2 autres équipes de recherche et nécessitant une harmonisation du modèle rongeur. De plus ce projet repose sur de nombreux travaux préliminaires ayant utilisé des rats wistar RjHan:WI. Ce projet étudie le rôle du microbiote sur le développement du diabète chez l’adulte. Le modèle de rat utilisé est donc un modèle adulte qui aura 7 semaines en début d’expérimentation (le microbiote des rats est stabilisé à partir de 5-7 semaines) et 21 semaines en fin d’expérimentation. 3 mois de régime riche en graisses correspond au temps nécessaire pour rendre les animaux obèses avec une perturbation des fonctions immunitaires et de la régulation de la glycémie.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une polyarthrite leur est provoquée par une injection de collagène, puis ils reçoivent un anticorps trois fois par semaine pendant deux semaines, avant d'être tués pour prélever sang, rate, ganglions et une patte, afin de tester une immunothérapie contre la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que ce modèle entraîne une inflammation des articulations puis une atteinte du cartilage et des os. Il affirme que le produit n'a jamais provoqué d'effet dommageable chez le rat et que la phase préclinique sur l'animal est nécessaire avant un essai clinique.

Objectifs

L'objectif du projet est, dans un premier temps, d'identifier une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde ; puis de tester l'efficacité d'un traitement par injection d'anticorps anti-CD45RC et enfin d'optimiser ce protocle de traitement dans l'objectif finale de réaliser une étude pré-clinique chez le rat pouvant aboutir sur un essai clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait mettre en évidence le potentiel d'un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde et découler sur un essai clinique dont un grand nombre de patients pourrait bénéficier.

Procédures

Les animaux vont d'abord subir sous anesthésie une injection sous-cutanée au niveau de la base de la queue pour induire l'arthrite (10min de procédure de l'endormissement au réveil). Par la suite, les rats (vigiles) receveront un traitement par injection intrapéritonéale 3 fois par semaines pendant 2 semaines (pour chaque injection, 2min de procédure de la prise en contention à la fin de l'injection) . Deux fois au cours de la procédure, les animaux seront anesthésiés pour effectuer le prélèvement d'une petite quantité de sang dans la veine caudale après anesthésie locale (10min de procédure de l'endormissement au réveil).

Impact sur les animaux

Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat est déjà utilisé depuis plusieurs années. Celui-ci se caractérise par une inflammation des articulations avec, sur le long terme, une atteinte du cartilage, des os et l'installation d'une fibrose.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvement (sang, rate, ganglions et patte) et réaliser une analyse immunologique et anatomopathologique.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'étude pré-clinique réalisée chez l'animal lorsque le modèle expérimental existe. Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. L'utilisation de celui-ci est nécessaire pour évaluer de manière exhaustive les effets ciblés, et potentiellement systémiques, du traitement sur les différents organes et fonctions de l'organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été détermineé de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur l'efficacité ou non du traitement. Par ailleurs, la réalisation d'une première étude pilote sur un faible nombre d'animaux permettra de s'assurer de l'intérêt et de la bio-sécurité du projet avant de faire entrer un plus grand nombre d'individus dans la procédure.

Raffinement

Avant même le début de la procédure les animaux seront entrainés à la contention de manière à ce que les injections répétés de traitement puissent se dérouler sans créer de stress supplémentaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et les symptômes seront évalués 3 fois par semaine par les personnes responsables de la procédure. Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (rouleau en carton, batôn de bois,...).

Choix des espèces

Le rat a été choisi car il est utilisé dans le modèle d'arthrite induite par injection de collagène depuis de nombreuses années. Ce modèle animal s'avère pertinent car il reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. De plus, nous avons déjà testé notre traitement dans d'autres modèles expérimentaux chez le rat, ainsi nous savons que notre produit n'a jamais induit d'effets dommageable chez cette espèce. Les rats seront utilisés au stade adulte (environ 8 semaines) qui est le stade le plus couramment utilisé pour le modèle d'arthrite induite par injection de collagène.

2040 rongeurs, 1440 souris et 600 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une intoxication au paracétamol leur est provoquée pour léser le foie, puis ils reçoivent un candidat médicament et jusqu'à cinq prélèvements de sang en une journée, avant d'être tués pour prélever leurs organes, afin de tester des traitements de l'insuffisance hépatique aiguë. Le porteur affirme que ces lésions du foie ne sont pas douloureuses et décrit une baisse d'activité et de température pendant au moins vingt-quatre heures. Il indique qu'aucune méthode de substitution ne modélise cette atteinte multi-organes et que l'animal est un passage obligatoire avant l'humain.

Objectifs

L’intoxication au paracétamol est la première cause d’insuffisance hépatique aigue (IHA) dans les pays industrialisés. Elle se traduit par une attaque brusque et massive du foie chez les patients. Il s’agit de situations d’urgence qui peuvent nécessiter une transplantation du foie dans les plus brefs délais. Le paracétamol est un composé chimique utilisé comme antalgique (anti-douleur) et antipyrétique (anti-fièvre), qui figure parmi les médicaments les plus utilisés et prescrits au monde. En cas de surdose, le paracétamol provoque une sévère toxicité pour le foie par la production d’une molécule toxique pouvant entrainer la mort des cellules du foie et donc une insuffisance hépatique aïgue (IHA). Aucun traitement efficace n'est actuellement disponible. Le but de ce projet est de tester le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules sur l'intoxication au paracétamol. Ainsi, la capacité de candidats médicaments à stopper ou ralentir l'atteinte du foie et/ou à favoriser sa guérison sera évaluée. Pour cela, le modèle d’hépatite induite par une exposition aigue au paracétamol chez le rongeur (souris et rat) sera utilisé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la mise au point de nouveaux médicaments pour traiter l'insuffisance hépatique aïgue due une intoxication au paracétamol pour laquelle il n’existe pas de réelles solutions thérapeutiques, hormis chirurgicales à ce jour.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront : -Une administration d'acetaminophène (APAP) à dose contrôlée par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou orale (1 fois/animal) -Une administration du candidat médicament en une ou plusieurs administrations (1 fois /animal) -Une série de prélèvement de sang (maximum 5 prélèvements /24h) en respectant les recommandations du NC3R’s pour les volumes. -La mise à mort avec ou sans anesthésie préalable en fonction des prélèvements terminaux à effectuer. Ces interventions auront toutes une durée maximum de 2 min.

Impact sur les animaux

L'administration d'APAP entraine des lésions du foie chez l'animal. Ces lésions du foie ne sont pas douloureuses (pas de signes de douleur chez l'animal et documenté chez l'Homme). Une hypoactivité associée à une hypothermie pourra être observée dans les 2h suivant l'administration d'APAP et se poursuivre pendant au moins 24h. Ces signes cliniques sont la conséquence des effets antipyrétique (anti-fièvre) et analgésique (anti-douleur) de l'APAP. Les candidats médicaments qui seront testés devraient théoriquement améliorer l'état de santé des animaux. Toutefois, les effets potentiellement indésirables du/des candidats médicament font l’objet d’échange avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Mise à mort des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'hépatite aigüe due à une intoxication au paracétamol. Cette pathologie est un processus complexe faisant intervenir différents organes de l'organisme et n'est donc pas modélisable in vitro ou in silico. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques adaptées. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 7-12 par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi régulier de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

Le rongeur (souris et rat) est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur l'insuffisance hépatique aigüe due à une intoxication au paracétamol. Cette espèce permet en effet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cette espèce. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de candidats médicaments sur la prévention et/ou la thérapie de la pathologie. Les études sont réalisées sur des animaux adultes car elles nécessitent des animaux avec une fonction hépatique normale (mature) et ont pour but de traiter une pathologie qui affecte surtout des adultes.