Rats

305 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée à l'issue et le reste réutilisé ou transféré. Ils reçoivent par voie orale ou injectable des substances hallucinogènes présentes dans l'ayahuasca, la DMT et une β-carboline, subissent des prélèvements de sang et sont observés isolés pendant deux heures pour compter leurs secousses de type wet dog shakes. Le porteur indique que l'ayahuasca peut provoquer une anxiété aiguë et perturber le comportement des rats plusieurs heures durant. Selon les besoins du commanditaire en échantillons terminaux, chaque rat est tué pour prélèvement d'organes ou gardé vivant pour des formations internes.

Objectifs

Dans ce projet, les effets hallucinogènes de principes actifs pharmaceutiques seront étudiés. La N,N- diméthyltryptamine (DMT) et la β-Carboline, un alcaloïde, sont des substances psychotropes puissantes considérées comme des stupéfiants en France. Ils sont retrouvés dans la composition de l’Ayahuasca, boisson amazonienne psychédélique, ingérée traditionnellement dans un cadre chamanique, principalement à des fins thérapeutiques, d’apprentissage ou de divination. Cette boisson est produite à partir de la décoction de Banisteriopsis caapi et Psychotria viridis, des plantes contenant respectivement de la BC et de la DMT. Il existerait des bénéfices thérapeutiques de l’Ayahuasca pour les patients souffrant de dépression, d’idées suicidaires ou de graves problèmes de santé mentale. Cependant, l’Ayahuasca présente de nombreux effets indésirables en fonction de la dose utilisée (nausées, vomissements, diarrhées ou psychoses aigus conduisant même à la mort). L’objectif du présent projet est donc d’évaluer les effets hallucinogènes de plusieurs doses et compositions à partir du breuvage traditionnel de l’Ayahuasca en comparaison avec le 2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine (DOI) qui est une substance psychédélique et une amphétamine substituée. Le DOI est un agoniste sérotoninergique puissant. Le DMT a une activité pharmacologique similaire mais sa biodisponibilité orale est très faible sans les composants de l'Ayahuasca, comme la β-Carboline, qui empêchent son métabolisme dans l'intestin. En jouant sur les doses et le ratio des composants du breuvage, le sponsor souhaite obtenir un composé qu’il pourrait développer en clinique dans l’indication de troubles psychiques en limitant les risques d’effets secondaires. Les effets du DMT seul, de la β-Carboline seule et de différents ratios de DMT et β-Carbolines seront mesurés. Le sponsor souhaite ensuite étudier les effets secondaires de type nausées et vomissements chez le furet (dans le cadre d’une autorisation de projets différente). L'activité hallucinogène sera étudiée en utilisant le test de "secouement du chien mouillé" (WDS pour wet dog shake). De nombreuses substances hallucinogènes qui agissent comme agonistes des récepteurs sérotoninergiques, tel que le DOI, provoquent un mouvement rotatif paroxystique et rythmique chez les rongeurs. Pour ce projet, le nombre de WDS et de secousses isolées de la tête (HS pour head shake) chez le rat seront comptabilisés pendant un total de 120 minutes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser les effets hallucinogènes de l’Ayahuasca à différentes doses sur le modèle rongeur de WDS. L’Ayahuasca pourrait être prometteuse et être proposée comme nouvelle stratégie thérapeutique aux patients souffrant de dépression et troubles de santé mentale.

Procédures

Les rats seront traités par voie orale, par voie sous cutanée (ou par voie intrapéritonéale) avec une substance à tester ou son véhicule. Ces administrations seront réalisées sur animaux vigiles en contention et dureront moins d'une minute. Des prélèvements de sang seront réalisés pour l’étude du profil pharmacocinétique des substances. Un prélèvement sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (induction 4% pendant 4 minutes, entretien 2,5% mix air et oxygène) par ponction directe à la veine jugulaire sera réalisé. Le prélèvement de sang est très rapide (quelques minutes). Si le volume de sang souhaité par le sponsor est important, un prélèvement en intracardiaque avant la mise à mort est alors réalisé. L’effet hallucinogène des substances sera étudié avec le test du WDS qui consiste à observer les animaux sur une période de 2h et comptabiliser le nombre de WDS. Les animaux seront isolés pendant cette période et seront replacés dans leur cage d’hébergement avec leur paire dès le retour à un comportement normal. Dans le cas où le sponsor voudrait réaliser des analyses sur cerveau perfusé, alors une perfusion intracardiaque serait réalisée.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration de l’Ayahuasca et de DOI. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Ces molécules sont connues pour induire des effets indésirables et de forts effets hallucinogènes. Après administration de DOI, une activité locomotrice et exploratoire normale est décirt dans la littérature. Avec l'Ayahuasca, une anxiété aigue (diminution de l'exploration et de l'activité locomotrice) pourrait être observée. L’état comportemental des rats pourra donc être perturbé pendant les quelques heures qui suivront l’administration. L’observation des WDS nécessite d’isoler les animaux pendant 2h. Le stress de l’isolement est considéré comme aigu. Les animaux satellites subiront au maximum 3 prélèvements de sang par ponction de la veine jugulaire (technique faiblement invasive) sous anesthésie gazeuse de courte durée.

Devenir

Selon si le sponsor a besoin d’échantillons prélevés en terminal (volume de sang important et/ou organes) ou non, l’animal sera mis à mort ou gardé en vie. Les animaux maintenus en vie seront utilisés dans le cadre de formations internes ou d’améliorations de nos procédures (raffinement) ou bien seront réhabilités dans des centres de formation (université, formation d’expérimentation animale ou chirurgie).

Remplacement

Ce projet ayant pour but l’étude comportementale chez le rat de l’effet hallucinogène de préparations à tester, il est indispensable d’avoir recours à l’animal. De plus, même si les méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites pour caractériser le profil pharmacocinétique d'un composé (absorption, métabolisme et excrétion). L’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.

Réduction

L’étude est séquencée en plusieurs étapes afin de n’utiliser des animaux qu’après validation de chaque étape. Si l’induction avec le contrôle positif n’était pas concluante alors le projet serait interrompu. Un seul groupe contrôle négatif sera utilisé pour chaque étape afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les observations comportementales seront réalisées en aveugle, ce qui justifie de n'utiliser qu'un seul groupe contrôle négatif même si les voies d'administrations et les véhicules sont différents entre le contrôle positif et les préparations à tester. Le N a été déterminé en tenant compte de l'effet hallucinogène attendu du contrôle positif, décrit dans la littérature. Avec les premiers résultats obtenus au cours des études pilotes, un calcul de puissance sera réalisé.

Raffinement

L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. Une importance toute particulière sera portée au suivi des animaux afin de prévenir et de remédier au plus vite à toute apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites seront également fixés avant le début des expérimentations. Les administrations seront réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. Le matériel utilisé sera adapté à l’espèce (aiguille, canule de gavage, etc.). Si l’administration des substances entrainait l’apparition de diarrhées et/ou des difficultés à se nourrir alors des croquettes ou des gels pour la réhydratation seraient placés dans la cage de l’animal. Pendant, la semaine d’acclimatation, les animaux seront habitués au moins une fois à la pièce d’expérimentation où sera réalisée les tests de WDS. Si les secousses WDS se poursuivaient après les 2h d’observations et seraient assez intenses, alors l’isolement de l’animal serait prolongé jusqu’à un retour à un comportement normal. Les prélèvements de sang se feront sur tapis chauffant avec un rétrocontrôle afin de maintenir la température de l’animal à 37°C. Pour cela, une sonde rectale reliée au tapis chauffant sera placée dans l’animal pendant le prélèvement. Après chaque prélèvement de sang, un volume de sérum physiologique équivalent à 3 fois le volume prélevé sera injecté en sous cutanée afin de compenser la perte de volémie. Dans le cas où une incision est nécessaire, une injection d'un analgésique local au niveau du site de l'incision sera réalisée au moins 15 min avant. Une analgésie générale sera apportée avant la perfusion cardiaque.

Choix des espèces

L’activation des récepteurs sérotoninergiques est responsable des effets psychédéliques chez l’Homme et induit chez le rat une réponse comportementale caractéristique de WDS. Les hallucinogènes sérotoninergiques agissent via des mécanismes d’action similaires chez l’Homme et le rat. Ces résultats démontrent que le test de WDS chez le rat est un modèle préclinique intéressant pour l’étude pharmacologique des effets hallucinogènes. Des rats adultes de 5 à 8 semaines pourront être utilisés.

45 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau, puis des injections de nanoparticules et des séances d'imagerie IRM et scanner sous anesthésie, pour optimiser la dose à injecter. Le porteur qualifie la douleur chirurgicale de modérée, avançant que le cerveau n'est pas innervé et que seule l'incision du cuir chevelu fait mal. Il justifie le recours à l'animal par la complexité du développement tumoral, impossible selon lui à reproduire in vitro.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie guidée par l'image grâce à l’utilisation de nanoparticules. Une nanoparticule radiosensibilisante (en cours de développement clinique) a été développée pour permettre une imagerie bimodale par résonance magnétique (IRM) et tomodensitométrie (TDM). L’objectif principal de ce projet consiste à optimiser la dose de nanoparticule à injecter chez le rat pour visualiser la tumeur en IRM et en TDM. Nous avons préalablement évalué in vitro (sur cellules tumorales humaines) l’intérêt s de ces nanoparticules pour les 2 modalités d’imagerie, la toxicité des nanoparticules ainsi que l’efficacité thérapeutique en association avec la radiothérapie et avons ainsi pu démontrer leur pouvoir « radiosensibilisant » et leur intérêt pour de l’imagerie bimodalité. Nous souhaitons confirmer ces résultats très prometteurs sur un modèle de tumeur cérébrales chez le rat et optimiser les conditions d’imagerie.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.

Procédures

Chirurgie 1h sous anesthésie gazeuse. 1 fois Imagerie par bioluminescence : injection intra-péritonéale sur animal vigil (quelques secondes) puis15 min d'imagerie sous anesthésie gazeuse. 1 fois Injection de nanoparticule par voie intraveineuse dans la veine de la queue ( quelques secondes) : 2 fois à 3 jours d'intervalle. Imagerie par tomodensitométrie sous anesthésie gazeuse : 30 min; 2 fois Imagerie IRM sous anesthésie gazeuse : 20 min; 2fois

Impact sur les animaux

Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire . Malgré une opération invasive due à l’incision de la peau du crâne et à l’injection de cellules intracérébrale, la douleur engendrée par l’acte chirurgical est estimée modérée, car dès le lendemain le rat se laisse manipuler aisément, ne montre aucun signe de peur (cris, prostration, agressivité) lors du nettoyage de la plaie. Le cerveau n’étant pas innervé, la douleur principale engendrée par l’opération provient de l’incision de la peau du crâne que nous estimons légère. Utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Imageries non invasives réalisées sous anesthésie volatile.

Devenir

Animaux mis a mort à la fin de la procédure ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau ainsi que les organes seront prélevés pour analyse macroscopique et histologique.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus la distribution des nanoparticules in vivo est indispensable pour évaluer leur intérêt en imagerie. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance tumorale ainsi que la prise de contraste par les nanoparticules. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif de la procédure conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux depuis le site d’hébergement et de chirurgie vers les sites d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par les limitations de résolution offertes par l’imagerie. Les rats nude (dépourvus d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des rats mâles, sexe utilisé jusqu’à présent dans nos études antérieurs afin de pouvoir confronter nos résultats. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas sur lequel nous nous basons pour injecter les cellules tumorales dans un endroit précis du cerveau.

Pour le compte de clients de l'industrie pharmaceutique, 4 050 rongeurs, 3 600 souris et 450 rats, vont être utilisés afin de fournir des échantillons de sang où mesurer la concentration de candidats médicaments, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rongeurs reçoivent les composés par gavage, par injection, par voie nasale ou intratrachéale, une fois ou pendant plusieurs semaines, puis subissent jusqu'à huit prises de sang en 24 heures, parfois sous anesthésie répétée. Certains sont opérés pour l'implantation d'un cathéter ou d'une pompe sous la peau et peuvent être isolés dans leur cage, et les plus gros volumes de sang sont prélevés dans le cœur, avec ouverture du thorax chez la souris. Le prestataire indique fixer ses effectifs en tenant compte des "besoins de nos clients" et ne réaliser "pas de tests statistiques" sur les données.

Objectifs

Au cours du développement préclinique, un grand nombre d’études sont effectuées afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité des candidats médicaments. Les études pharmacocinétiques, qui sont menées en parallèle, permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant. Classiquement, il s’agit de caractériser son absorption, sa distribution dans l’organisme, son métabolisme et enfin son élimination. Les données collectées dans le cadre de ces études permettent notamment d’affiner les doses et par conséquent de contribuer à la détermination de fenêtres/marges thérapeutiques, qui matérialisent la zone de concentrations permettant d’observer une efficacité tout en limitant la survenue d’effets secondaires/toxiques. En tant que prestataire de services pour l’industrie pharmaceutique, nous proposons à nos clients de réaliser la phase expérimentale de leurs études pharmacocinétiques. Ce projet a donc pour objectif de fournir à nos clients des échantillons de sang prélevés chez le rongeur (rat ou souris) et dont l’analyse permettra de connaître les variations de concentration plasmatique des candidats médicaments au cours du temps après une administration unique ou répétée.

Bénéfices attendus

Les échantillons de sang collectés seront traités et les plasmas ou sérums obtenus seront analysés par nos clients afin d’établir le profil pharmacocinétique de leur candidat médicament et de déterminer les doses qui permettront d’obtenir un effet optimal avec des effets secondaires maitrisés.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations de composés soit par voie PO, IP, SC (durée inférieure à 1 minute) ou IV à la veine de la queue (durée inférieure à 5 minutes) ; soit par voie IN, IT, topique (durée inférieure à 1 minute) ou IV à la veine jugulaire sous anesthésie gazeuse (durée inférieure à 5 minutes). Dans la majorité des cas il s’agira d’une administration unique, mais elles pourront également être répétées sur plusieurs jours ou semaines. Des prélèvements répétés de sang seront réalisés soit sur animal vigile via un cathéter vasculaire, à la veine de la queue ou submandibulaire (souris uniquement), soit sur animal anesthésié par ponction directe de la veine jugulaire (durée: quleques minutes). Ces prélèvements seront réalisés le plus souvent pendant les 24 à 72h suivant l’administration avec un maximum de 8 prélèvements sur 24h, mais ils pourront également être étalés sur plusieurs semaines (2 prélèvements par semaine maximum). Certains animaux subiront des chirurgies d’implantation de cathéters vasculaires (durée de la chirurgie : environ 40 minutes) et/ou de pompes osmotiques en SC (durée de la chirurgie : environ 20 minutes) . Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être effectué en intra-cardiaque de façon terminale (durée inférieure à 1 minutes) sous anesthésie chez le rat, sous anesthésie et analgésie morphinique chez la souris.

Impact sur les animaux

Pour les administrations de composés, les animaux seront maintenus en contention, ce qui peut générer du stress. Un ou plusieurs gavages pourront être réalisés, ou des injections de composés impliquant l’introduction d’une aiguille. Certaines modalités d’administration nécessiteront d’avoir recours à l’anesthésie des animaux. Certains animaux subiront également une chirurgie d’implantation de pompe osmotique et/ou de cathéters qui pourra nécessiter de les isoler dans leur cage d’hébergement. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée. Dans le cadre de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés toutes les 24h sur 24 à 72h, ou encore 2 prélèvements maximum par semaine pendant plusieurs semaines. Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être réalisé en intracardiaque de façon terminale : dans ce cas les animaux seront anesthésiés et une thoracotomie sera réalisée pour les souris.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter différents organes.

Remplacement

Si des méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.

Réduction

Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (volumes de sang, nombre de points de prélèvements, de voies d’administrations et de doses à tester nécessaires). Chaque animal pourra être son propre contrôle, et le recours à des prélèvements répétés au cours du temps sur le même animal permet également de limiter le N total par étude. Nous ne réalisons pas de tests statistiques sur les données obtenues. Le nombre d'animaux par groupe (N=3 par dose ou par temps de prélèvement) a été déterminé sur la base de nos études précédentes où il est apparu qu'un nombre de 3 animaux est le nombre minimum permettant de conclure sur le profil pharmacocinétique d'un composé en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.

Raffinement

L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Des points limites précis et spécifiques à chaque procédure sont également préalablement établis afin de s’assurer que toute douleur/souffrance éventuelle des animaux pourra être détectée et prise en charge rapidement. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie et les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie appropriées. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention. Les prélèvements sanguins ainsi que les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. Lorsque qu’une chirurgie sera nécessaire pour l’implantation de pompe osmotique ou de cathéter, elle sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie.

Choix des espèces

Ces études de pharmacocinétique vont permettre de déterminer les doses qui seront ensuite utilisées pour les études d’efficacité et de pharmacologie de sécurité chez le rongeur, ce qui justifie le choix des espèces retenues pour ce projet. Le choix entre souris et rat sera ensuite conditionné notamment par l’historique des études déjà réalisées par nos clients, le choix du modèle de pathologie envisagé par la suite, et les volumes de sang requis pour les bioanalyses. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : - Des rats de tous âges soit environ 150 à 600g - Des souris de tous âges soit environ 20 à 40g L’âge des animaux dépendra du protocole à réaliser, des objectifs de l’étude et des candidats médicaments à tester

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une dystrophie musculaire proche de la maladie de Duchenne, ils reçoivent des injections répétées derrière l'œil ou dans le muscle de la patte pour déclencher une régénération musculaire et tester la forskoline. Le porteur décrit une perte de masse progressive et un comportement anxieux liés à la maladie, avec des injections d'opioïdes pour contenir la douleur. Il justifie le recours au rat par sa proximité phylogénétique et la fidélité de ce modèle à la maladie humaine, en complément du modèle canin.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire. Notre laboratoire vise à mieux caractériser les mécanismes de la maladie pour les contrer via des thérapies innovantes que nous testons sur un modèle de rat qui mime fidèlement la sévérité de la maladie de l'enfant. Contrairement à l'ensemble des muscles du corps incluant le diaphragme et le cœur, les muscles extra-oculaires assurant les mouvements des yeux dans toutes les directions sont épargnés. Nous avons en partie identifié la raison sous-jacente à ce mécanisme et proposons ici de traiter des rats malades avec un composé mimant l'activation du mécanisme protecteur identifié dont nous espérons qu'il améliorera le fonctionnement de l'ensemble des muscles du rat. Le présent projet vise également à comparer le comportement des cellules souches des muscules extra-oculaires et d'un muscle de la jambe du rat au cours du processus normal de la réparation musculaire. Nous projetons ainsi d'identifier d'autres facteurs de maintien de la capacité régénérative des cellules souches musculaires, ce qui permettra d'ouvrir de nouvelles pistes de traitement.

Bénéfices attendus

En comparant toutes ces situations à l'échelle moléculaire, nous comptons identifier les mécanismes protecteurs de la mort précoce des cellules souche pour promouvoir leur capacité de réparation du muscle. En comparant ces situations à l'échelle microscopique, nous comptons évaluer l'efficacité de ces processus dans la reconstruction musculaire. Au-delà, nous comptons identifier de nouvelles molécules déjà connues ou à découvrir pour moduler les mécanismes capables d'empêcher ou de retarder la mort précoce des cellules souches musculaires et ainsi, de promouvoir la réparation musculaire des patients atteints de DMD.

Procédures

Les animaux sont injectés deux fois par voie sous-cutanée pour induire l'anesthésie/analgésie et une fois en arrière de l'oeil ou dans le muscle tibial antérieur pour induire la régénération des muscles que nous souhaitons analyser en détail au cours du temps. Les rats sont préventivement injectés 3 fois par jours pendant 2-3 jours avec une molécule qui supprime la douleur, par voie sous-cutanée, en même temps que l'examen clinique pour éviter de les déranger inutilement. Certains animaux seront en plus injectés tous les deux jours dans le ventre pendant 30 jours avec une molécule que nous pensons protectrice vis-à-vis de la maladie. Cela correspond à une quinzaine d'injections. Chaque injection dure moins de 2 minutes, réalisée par une personne très expérimentée et soucieuse de réduire l'impact négatif pour l'animal. L'injection sera réalisée plutôt au début ou en fin de journée pour éviter de réveiller l'animal. Il n'y a pas de chirurgie prévue.

Impact sur les animaux

Physiologiquement, la mort des fibres musculaires induit une amplification de la douleur, via un processus d'origine inflammatoire que nous pouvons éviter. Nous connnaissons bien les conséquences de ce mécanisme temporaire et contrôlable. Nous avons anticipé toute forme de ressenti de la douleur par des injections d'une molécule opioïde à longue action très efficace. Les rats sur lesquels nous travaillons développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de la masse corporelle. On assiste par ailleurs à un comportement anxieux des animaux, par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une personne est dédiée à cette surveillance. Les procédures de ce projet incluent des animaux chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont limitées et sont facilement gérables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de récupérer les muscles étudiés pour analyse histologique et moléculaire approfondie.

Remplacement

L'efficacité de la forskoline sur le potentiel de régénération des cellules souches musculaires a déjà été confirmée in vitro (article en cours d'évaluation). Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à une question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : la forskoline conserve-t-elle sa capacité de stimulation efficace des cellules souches musculaires pour favoriser le processus de régénération musculaire dans les conditions du muscle dystrophique remodelé ?

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 5 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux non atteints et DMD traités avec l'excipient, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères non atteints. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux et en cas de mort de l'un d'eux, de ne pas le remplacer. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 5 animaux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils de modification du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, système immunitaire, influence de facteurs d'environnement communs, format). Les muscles des animaux âgés de 5-6 mois sont affectés par la maladie et leurs cellules souches, engagées dans le processus de mort précoce. Il est donc attendu qu'à ce stade, les différences entre animaux non atteints et DMD seront marquées et instructives, et que l'évaluation de l'efficacité de la forskoline sera pertinente. Nous utiliserons des animaux à l'âge de 5-6 mois. Notre étude de caractérisation ainsi que nos résultats in vitro montrent que la mort prématurée des cellules souches et par voie de conséquence l'anomalie du processus de réparation musculaire, sont significativement augmentées et quantifiables à cet âge. Six mois correspond par ailleurs à la limite au-delà de laquelle le phénotype dommageable des rats DMD évolue vers une perte de masse corporelle. Dans ce projet qui n'est pas une analyse de survie, il est inutile de maintenir en vie des animaux au-delà du stade auquel leurs activités quotidiennes sont compromises par une perte de poids. Le bon état général des animaux à l'âge visé et les mesures pour prévenir ou contrer la douleur pendant et après l'altération des muscles justifient notre suggestion de classer cette procédure en procédure modérée.

600 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent une ovariectomie, puis toutes reçoivent, sous anesthésie sans réveil, des molécules clientes dont le porteur reconnaît ignorer la nature et les effets secondaires, pendant l'enregistrement des contractions utérines induites par l'ocytocine. L'anesthésiant final étant irréversible, les rates sont mises à mort sans reprise de conscience. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut mimer la pathologie et juge le recours à l'animal "incontournable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de candidats médicaments sur la diminution ou l’inhibition des contractions utérines induites par l’ocytocine en mesurant la pression intra utérine chez la rate anesthésiée.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patientes atteintes de pathologies gynécologiques impliquant le muscle utérin.

Procédures

Dans ce projet, les animaux pourront subir une procédure chirurgicale courte (environ 30 minutes maximum) afin de réaliser une ovariectomie (procédure 2). Cette procédure se fera sur animal anesthésié avec utilisation de plaque chauffante thermorégulée et utilisation d’antalgiques post-opératoires pour diminuer la douleur. La procédure majeure de ce projet (procédure 1) se fait sur animal anesthésié sans réveil (utilisation de plaque thermorégulée lors de l’expérimentation, pose de cathéter intraveineux, intra-utérin et autre selon le mode d’administration des molécules à tester (intragastrique par exemple)). Selon la demande du client, un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours ou à la fin de la procédure expérimentale (1 ou 2 prélèvements de sang rapides (environ 2 min et faible volume) maximum entre les procédures 2 et 1). La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Les volumes et fréquences des prélèvements seront déterminés selon la publication internationale faisant référence (Diehl KH. et al., 2001). Un volume inférieur à 7.5% du volume sanguin circulant sera prélevé 1 fois par semaine ou un volume inférieur à 10% sera prélevé 1 fois tous les 15 jours. Un prélèvement sanguin plus important terminal pourra être réalisé sous anesthésie avant le sacrifice de l’animal.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Toutefois, les animaux subiront au maximum une ovariectomie (procédure 2) classée comme une procédure modérée et un enregistrement des contractions utérines induites par l’administration d’ocytocine avec l’évaluation de l’effet d’un candidat médicament, procédure classée sans réveil et étant réalisée sous anesthésie générale.

Devenir

L’anesthésiant utilisé pour les enregistrements finaux des contractions utérines est irréversible, les animaux sont donc mis à mort sans réveil à la fin des enregistrements

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des pathologies impliquant le muscle utérin (dysménorrhées, accouchement prématuré). Actuellement, aucun modèle in vitro ne peut mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Ce modèle se faisant sous anesthésie, cela permet de réduire la douleur et le stress chez l’animal.

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

L’utilisation de rats pour l’étude des contractions utérines est déjà décrite dans la littérature. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

192 jeunes rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès la naissance, le porteur leur fait ingérer par la bouche des bactéries, puis mesure leur comportement alimentaire lors d'isolements répétés et d'un test à deux bouteilles opposant eau et solution sucrée, avant de les décapiter sous anesthésie pour prélever cerveau et sang. Il décrit un protocole sans douleur mais reconnaît le stress lié à l'isolement des ratons. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico assez complexe n'existe et que le rat Fischer est "nécessaire" à la continuité du projet.

Objectifs

Ce projet repose sur la constatation qu’un enfant présente plus de risque de développer une obésité si sa mère était en surpoids ou présentait une obésité avant ou pendant la période périnatale. Etant donné que l’obésité modifie la composition du microbiote en faisant augmenter la présence de bactéries néfastes pour le métabolisme, la question est de savoir si le comportement alimentaire de l’enfant né par voie basse et allaité peut être influencé par le transfert du microbiote maternel. Selon cette hypothèse, le microbiote maternel modifierait, par l’intermédiaire de métabolites bactériens, le neurodéveloppement du petit dans les structures cérébrales liées au comportement alimentaire. Les deux premières parties du projet ont abouti aux résultats suivants : 1. Les ratons à qui l’on a fait ingurgiter par têtage dès la naissance un mélange de microbiotes vaginaux, laitier et fécaux provenant de rates obèses s’alimentent plus que des ratons ayant ingurgité un microbiote de mères non obèses (ingéré laitier doublé, par exemple) et développent une préférence pour les aliments gras et/ou sucrés jusqu’au stade jeune adulte. 2. L’analyse des microbiotes des mères et des ratons a mis en évidence la présence d’espèces bactériennes dont les abondances/absences étaient corrélées avec des caractéristiques du comportement alimentaire des petits. L’expérimentation décrite dans cette demande vise à déterminer si les supplémentations en 2 des espèces bactériennes identifiées, et supposées favorables (car abondantes chez les rates non obèses), peuvent effectivement modifier le comportement alimentaire des ratons en le modérant. Celui-ci sera examiné à 3 temps de leur croissance : pendant la lactation, à l’adolescence et au stade jeune adulte.

Bénéfices attendus

Si l’obésité est un des grands problèmes de santé des pays industrialisés, l’obésité des enfants est doublement préoccupante, car un enfant en surpoids a toutes les chances de souffrir de ce problème et/ou de diabète de type 2 dans sa vie d’adulte. Les traitements classiques –régimes, restriction alimentaire, activité physique etc- restent généralement en échec, car trop difficiles à poursuivre dans la durée. De nouvelles sources thérapeutiques doivent donc être envisagées. L’influence du microbiote dans les problèmes métaboliques est désormais bien reconnue. La question du projet validé par l’ANR était de savoir si le microbiote maternel, transmis lors de la naissance et de la lactation, pouvait influer sur le comportement alimentaire des petits. L’objectif était d’identifier des espèces bactériennes favorables ou néfastes, dans la perspective plus lointaine de modifier et corriger le microbiote défavorable. Nous avons mis en évidence, dans une première partie, des espèces bactériennes plus abondantes dans le microbiote des ratons résistant à l’obésité et nous allons ici déterminer leur impact sur le comportement alimentaire de jeunes rats. Si les bactéries étudiées dans cette expérimentation se révélaient bénéfiques en induisant une baisse de la prise alimentaire, cela pourrait contribuer à la mise en place de nouveaux traitements par supplémentation bactérienne

Procédures

Hormis la récupération de féces dans les pots de pesée des ratons, il n’y a pas de prélèvement sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Ce protocole n’engendrera aucune douleur, mais des isolements seront nécessaires, en raison de la mesure de l’ingéré alimentaire en différents points. Dès la naissance, les ratons nouveaux nés recevront par têtage de petits volumes (25µl) de liquide (eau salée) contenant ou non les bactéries étudiées. Cet acte est réalisé avec le plus grand soin possible par des intervenants expérimentés. La goutte de liquide est déposée sur la cavité orale des ratons, sans forcer l’introduction. A J15, les ratons seront isolés de leur mère pendant 2 heures, puis remis à têter pendant 1 heure. A J34, 8 ratons dans chaque isolateur seront placés dans des cages individuelles pendant 1 heure, le temps de consommer un aliment appétent (céréales chocolatées) puis remis dans leurs cages d’origine, et ce pendant 10 jours, puis ils seront euthanasiés le 11ème jour. A J62 les ratons restants seront placés dans des cages individuelles pour l’habituation à un test 2 bouteilles, l’une contenant de l’eau et l’autre une solution sucrée. La consommation de ces boissons sera mesurée pendant 3 jours et les ratons seront euthanasiés. Le stress dû à l’isolement sera donc limité autant que possible.

Devenir

Les animaux seront décapités après anesthésie profonde à l’isoflurane afin de récupérer le sang du tronc et le cerveau. Des analyses de peptides liés à l’alimentation seront effectuées.

Remplacement

Ce projet vise à déterminer l’effet de la supplémentation de 2 bactéries sur le comportement alimentaire du jeune. Ces bactéries ingérées sont susceptibles de générer des métabolites pouvant agir sur les structures cérébrales liées à l’alimentation, par voie nerveuse ou circulatoire. L’utilisation d’animaux est donc obligatoire, car il n’y a aucun modèle in vitro ou in silico suffisamment complexe qui existe et puisse être utilisé dans cet objectif.

Réduction

Le nombre d’animaux a été fixé au strict nécessaire, par un calcul statistique de puissance (n=8 par temps, traitement et sexe) .

Raffinement

Il n’y a pas douleur particulière liée à la réalisation de ce protocole. Les ratons seront conservés avec leur mère pendant la durée de la lactation. Lors de l’isolement pour la mesure de l’ingéré laitier, ils seront isolés par portée entière, dans une cage contenant de la litière de la cage d’origine, et du sopalin déchiqueté par la mère. L’ingéré alimentaire est mesuré de plusieurs façons, mais chaque fois sur des ratons différents qui sont euthanasiés après ces mesures. Par conséquent, l’isolement nécessaire pour la mesure sera le plus bref possible et n’interviendra qu’une seule fois dans la vie de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et pesés deux fois par semaine. Tout signe indiquant un mal-être est surveillé (prostration, perte de 10% de poids par rapport à la mesure précédente, dos vouté, pelage dégradé, blessure). Bien que peu probable, un incident d’expérimentation peut survenir. Dans le cas d’un animal en détresse, une surveillance de 24 h sera effectuée, et si l’état de l’animal reste non satisfaisant, il sera exclu de l’expérience et euthanasié.

Choix des espèces

C’est le comportement alimentaire du jeune qui nous intéresse, et nous utliserons donc des ratons âgés de 15 à 70 jours, des deux sexes. Le rat Fischer est un bon modèle pour les études nutrionnelles et métaboliques ; ce modèle a été utlisé dans la première partie de l’expérimentation, et il est nécessaire pour la continuité et la cohérence du projet.