Rats
Défaut diaphysaire fémoral chez le rat : un modèle orthopédique pour l’étude de biomatériaux destinés à la régénération osseuse
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
220 rats vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie créant un défaut osseux au fémur, puis un suivi par micro-scanner sous anesthésie toutes les deux semaines pendant deux mois, avant l'euthanasie pour analyses histologiques. Le porteur revendique un modèle déjà maîtrisé et reproductible dans son unité, et affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'évaluer les biomatériaux au regard de la réglementation. Les retombées annoncées, de nouveaux dispositifs de comblement osseux pour les patients, restent formulées au conditionnel.
Objectifs
Si les greffes de tissus osseux sont désormais courantes pour réparer un os à la suite d’une fracture ou d’autres lésions, cette stratégie présente des limites. C’est pourquoi notre équipe travaille sur le développement de fragments d’os synthétiques ou hybrides (incluant des cellules souches) qui sont nommés des biomatériaux. Ces biomatériaux doivent être à la fois souples et résistants, mais aussi poreux afin qu’ils puissent être colonisés par des cellules. Pour étudier le potentiel ostéogénique du biomatériau (c'est à dire sa capacité à reformer de l'os) nous souhaiterions avoir recours à un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité. Ce modèle est facile à mettre en œuvre et reproductible. Le modèle étudié est un défaut osseux au niveau du fémur du rat afin d'évaluer le pouvoir régénérant des biomatériaux implantés. La formation de l'os sera suivie dans le temps grâce à une technique d'imagerie de pointe, indolore et non invasie : un système de tomographie préclinique micro scanner X. L'objectif étant à terme de pouvoir proposer aux patients des matériaux implantables efficaces et adaptés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement ou membranes pour la régénération osseuse guidée) qui pourraient être proposés aux patients atteints de pathologie osseuses ou accidentés (fracture...).
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie au niveau du fémur (création d'un défaut). Cette intervention dure environ 30 min par animal. Elle est réalisée sous anesthésie générale et le suivi des animaux durant la phase de récupération est renforcé. Suite à l'opération, le suivi par micro scanner de la régénération osseuse pour chaque rat sera réalisé à des intervalles de temps espacés (toutes les 2 semaines). Lors de cette procédure d'imagerie non invasive, les rats seront anesthésiés à l'isoflurane (et maintenu au masque dans l'enceinte du scanner). L'acquisition du microscanner dure environ 15 min. Il est envisagé de réaliser 5 fois cette acquisition sur chaque rat (suivi longitudinal sur 2 mois, avec une acquisition à: T0, 2, 4, 6 et 8 semaines).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une intervention chirurgicale sur un site orthopédique, cette intervention ne nécessite pas de fixation interne de l'os. Toutefois, la chirurgie pourra engendrer une douleur modérée pour les animaux et leur mobilité sera atteinte lors des premiers jours post-opératoires. Les signes de douleur et de récupération des animaux représente ceux communément observés pour une telle intervention chez l'Homme suite à une reconstruction osseuse suite à un accident par exemple. Une surveillance rigoureuse sera établie afin de pallier à ces inconvénients et de mettre toutes les mesures en place afin de prendre en charge les animaux.
Devenir
Suite à la chirurgie, les animaux seront suivi par microscanner sur 2 mois (examen d'imagerie non invasive). Après le dernier temps d'acquisition (2 mois après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider le pouvoir ostéogénique du biomatériau étudié.
Remplacement
Les produits destinés a être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux pour répondre à l'objectif du projet et à la réglementation en vigueur dans le cadre de l'évaluation des dispositifs médicaux implantables chez l'Homme.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi longitudinal par analyse au micro scanner sera réalisé.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse, une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. Les examen d'imagerie par micro-scanner sont réalisés sous anesthésie générale, avec un suivi des paramêtres tout au lon de l'exeman. Le raffinement des conditions d’hébergement est réalisé notamment par l'enrichissement de l’environnement d’hébergement (la litière en copeaux, jouets, bâtons à ronger mis à disposition) et suivi quotidien des animaux par le personnel qualilié et attentif au bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau du fémur. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit, étape primordial dans le cadre du processus de validation d'un disposition médical à destinée humaine. Des rats adultes de 10 semaines, d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.
Validation des méthodes d’évaluation de l’ototoxicité à l’aide d’une molécule de référence: 3, 3′ iminodipropionitrile
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
84 rats vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance modérée à sévère. Ils subissent une chirurgie crânienne pour la pose d'un dispositif de contention, puis reçoivent pendant trois jours un composé neurotoxique de référence, le 3,3'-iminodipropionitrile, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur indique que ce toxique provoque une dépression du système nerveux, une faiblesse musculaire, une hypothermie et des troubles de l'équilibre qui persistent dans le temps, et décrit deux tests comportementaux, le retournement et la suspension par la queue. L'objectif affiché est de valider les méthodes du laboratoire pour évaluer plus tard la toxicité de produits industriels sur l'oreille interne.
Objectifs
Ce projet consiste à valider des méthodes qui seront utilisées pour évaluer la toxicité de produits industriels, rencontrés dans le monde de travail, sur les récepteurs de l’audition et de l’équilibre, tous deux situés dans l’oreille interne à l'aide d'une molécule de référence: 3, 3' iminodipropionitrile. Cette étude permettra au laboratoire de poursuivre l'investigation de molécules suspectées toxiques pour l'oreille interne et d’informer les préventeurs sur des risques potentiels de certains produits industriels en renseignant notamment les fiches toxicologiques.
Bénéfices attendus
Les tests mis en oeuvre dans cette pré-étude avec le 3, 3' iminodipropionitrile, molécule de référence connue pour altérer l'audition et l'équilibre chez l’animal, permettront de valider les méthodes expérimentales qui seront déployées afin d'évaluer la toxicité de produits industriels sur la cochlée et le vestibule, récepteurs de l'audition et de l'équilibre.
Procédures
Chirurgie crânienne: Les animaux (42 rates) sont équipées d’un dispositif de contention au niveau de leur crâne, dans le but d'enregistrer leur mouvement oculaire (nystagmus post-rotatoire) après stimulation du système vestibulaire par rotation. Cette intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie gazeuse et n’excèdera pas une heure par animal. Elle sera réalisée 1 seule fois. Mesures du nystagmus post-rotatoire : Ces mesures seront effectuées sur les 42 rates ayant subi une chirurgie cranienne, au moins 21 jours auparavant. Elles seront réalisées avant administration du 3, 3' iminodipropionitrile ou de NaCl 0,9% (T0) et 1 mois après traitement (T1). Cette mesure nécessite une contention. La durée de cette procédure est estimée à 10 minutes par animal. Tests comportementaux : A T0 et T1, 42 rates seront soumises à 2 tests comportementaux permettant une mesure de la fonction vestibulaire : le test de retournement et la suspension par la queue. Moins de 10 minutes par animal sont requis pour effectuer ces 2 tests comportementaux. Une fois ces mesures effectuées, les rates sont soumises aux mesures des produits de distorsion acoustique. Mesure des produits de distorsion acoustique : 42 rates seront soumises à une anesthésie légère (kétamine / xylazine, 45 / 5 mg/kg) afin d’enregistrer les produits de distorsion acoustique après avoir positionné une sonde au niveau de l’oreille gauche. Ces mesures seront effectuées avant traitement au 3, 3' iminodipropionitrile (T0) puis 1 mois (T1) après traitement. Quinze minutes par animal sont nécessaires. Traitement par voie intrapéritonéale avec le 3, 3' iminodipropionitrile ou NaCl 0,9% : Les rates seront traitées pendant 3 jours successifs par voie intrapéritonéale (2mL/kg) soit au NaCl 0,9% (20 rates), soit à une des trois doses de 3, 3' iminodipropionitrile : 150, 200 ou 300mg/kg (64 rates). Au terme des expérimentations, les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque afin de réaliser l’histologie de l’oreille interne.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus dans ce projet sont ceux résultant du traitement des rats avec le 3, 3’ iminodipropionitrile, décrit dans la littérature comme un toxique engendrant des dommages au niveau des récepteurs de l’audition et de l’équilibre. Il est rapporté une apparition rapide d’un effet dépresseur sur le système nerveux central, ainsi qu’une faiblesse musculaire et une hypothermie. Des troubles de l'équilibre et des effets sur le système locomoteur apparaissent dans les jours qui suivent la fin du traitement et persistent dans le temps. Des pertes de poids reversible sont attendues pendant la semaine du traitement. L’utilisation de ce toxique nous permettra de valider les outils mis au point au laboratoire pour évaluer la toxicité de produits chimiques rencontrés par les salariés au niveau de leur poste de travail.
Devenir
Tous les animaux de la procédure 1 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates traitées au 3, 3’ iminodipropionitrile) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 2 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates contrôles) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 3 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique chez des rats traités au 3, 3’iminodipropionitrile) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 4 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique chez des rates contrôles) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus biologiques.
Remplacement
La toxicité de certains solvants industriels sur la cochlée a été démontrée par de nombreuses études expérimentales (rat, cobaye) mais aussi par des études épidémiologiques en entreprise. A l’inverse, les effets de ces substances sur le vestibule qui partage de nombreuses similitudes avec la cochlée n’ont jamais été étudiés in vivo. Il est à noter, cependant, qu'un modèle in vitro de culture d’explants vestibulaires, développé au laboratoire, a suggéré une toxicité de ces solvants sur le vestibule. Ces données devront être confirmées par une étude sur l’animal avant d’alerter les services de santé au travail de la dangerosité de ces substances sur cet organe. L’étude prévue s’appuiera sur des mesures fonctionnelles, comportementales et histologiques qui devront permettre une comparaison fiable et objective des effets cochleotoxiques et vestibulotoxiques. Etant donné l’absence de recul sur ces techniques appliquées au vestibule, il s’averait nécessaire de valider et calibrer nos méthodes à l’aide d’une molécule toxique à la fois pour la cochlée et le vestibule. Le choix s’est porté sur le 3, 3’ iminodipropionitrile. Les méthodes utilisées dans le cadre de cette étude évaluent les fonctionnements physiologiques de ces deux systèmes sensoriels ainsi que diverses réponses réflexes. Ces méthodes ne peuvent être testées que sur des organismes vivants. Ces tests sont des mesures de produits de distorsion acoustique pour l'audition et la mesure du nystagmus post-rotatoire ainsi que deux tests comportementaux pour l'équilibre (retournement et suspension par la queue). Des analyses histologiques seront également réalisées. D’autre part, pour évaluer la toxicité de ces agents chimiques, il est nécessaire que ces derniers soient métabolisés par des organismes vivants.
Réduction
Tous les efforts ont été faits pour limiter le nombre d’animaux utilisés afin de répondre à la question scientifique. Trois doses différentes de 3, 3’ iminodipropionitrile sont nécessaires pour encadrer le seuil de toxicité qui doit se trouver vers 3 x 200 mg/kg. Le dispositif crânien des rates destinées aux mesures du nystagmus post-rotatoire ne permettant pas les mesures de produits de distorsion acoustique, des lots de rates dédiés spécifiquement à ces tests seront donc prévus. Ainsi pour chaque dose de 3, 3’ iminodipropionitrile, 2 groupes expérimentaux seront programmés, l’un pour la mesure du nystagmus post-rotatoire et le second pour les mesures de comportement suivies des mesures de produits de distorsion acoustique. De la même manière, 2 groupes contrôles seront également prévus. Le nombre d’animaux par groupe expérimental a été déterminé en réalisant un calcul de puissance statistique (logiciel G-Power) en se basant sur un test de comparaison de moyennes à partir de données obtenues dans une étude antérieure avec un autre toxique où des variations de 25 % du nombre de saccades du nystagmus post-rotatoire sont attendues (contrôle : 100 ± 10, traités 75 ± 15, p
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront placés en cycle inversé jour-nuit de 12h / 12 h, à une température de 22 ± 2°C et une hygrométrie de 55 ± 15%. Ils seront stabulés à 2 ou 3 animaux par cage dans des cages de polycarbonate ayant une surface au sol de 1032 cm2, et une hauteur conforme aux critères habituels pour leur espèce. Seuls les animaux ayant subi une intervention chirurgicale, afin de les équiper du dispositif crânien, seront hébergés seuls pendant deux semaines afin d’assurer une bonne cicatrisation. L’utilisation de cages ouvertes et transparentes leur permettra de créer des liens sociaux et des contacts visuels, olfactifs et auditifs nécessaires à leur bien-être. La litière utilisée sera constituée de carrés de cellulose irradiée. Leur environnement sera enrichi par des tunnels en carton. Selon les procédures du projet, les animaux seront habitués à être manipulés dans un premier temps puis à la contention.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études de toxicologie et, est un modèle sélectionné dans les lignes directrices de l’OCDE portant sur les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. Par ailleurs, le métabolisme des solvants par le rat est proche de celui de l'Homme. De plus, les expérimentations doivent être menées sur des souches de rat pigmentées comme les rats Long Evans puisque la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne, comme chez l'Homme. Les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants. Par ailleurs, la plupart des études expérimentales portant sur les systèmes sensoriels de l'audition et de l'équilibre ainsi que les études comportementales ont été menées avec cette souche de rat ce qui facilitera la comparaison avec nos résultats obtenus au sein du laboratoire. Les rates seront utilisées, pour les mesures fonctionnelles, à l'âge adulte entre 16 et 18 semaines car l'oreille interne ainsi que les cytochromes intervenant dans le métabolisme des toxiques doivent être matures.
Etude des effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue par asphyxie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés en cage métabolique puis mis à jeun seize heures, avant la mise à mort et le prélèvement d'organes, pour comparer des farines de quatre insectes destinées à l'alimentation humaine. Le porteur reconnaît que l'environnement appauvri et la privation de nourriture induisent une angoisse et un stress modérés. Il affirme que ces effets nutritionnels ne peuvent être évalués in vitro ni maîtrisés directement chez l'homme.
Objectifs
Pour nourrir la population mondiale de demain, il y a un enjeu majeur à trouver d'autres sources de protéines riches en composés nutritionnel d'intérêt pour pallier la consommation de poissons (dont la disponibilité diminue) et de viandes. Les insectes riches en protéines de haute qualité sont considérés comme une alternative durable aux protéines animales face à̀ la raréfaction des ressources naturelles et à l’augmentation de la population mondiale. Actuellement, 2/3 des terres agricoles dans le monde sont consacrées à l’élevage ou à la production d’aliments pour le bétail. Ce mode de production a des répercussions négatives sur notre environnement, notamment sur l’émission de gaz à effet de serre, sur l’eau potable et sur les surfaces agricoles. L’élevage des insectes, plus vertueux, utilise des déchets organiques et nécessite en moyenne quatre fois moins de nourriture qu’un élevage conventionnel. Suite aux résultats obtenus dans une étude préliminaire précédemment autorisée, il a été identifié une première farine d’insectes, source de protéines et enrichie en certains oligo-éléments (fer). Dans ce contexte, cette étude a pour objectif d’approfondir les effets observés en évaluant les impacts sur d’autres nutriments (fibres, acides gras, acides aminés) mais aussi en évaluant des impacts physiologiques (activité anti-inflammatoire, effet prébiotique, effet sur l’immunité). De plus, 3 autres types de farines provenant d’autres insectes seront étudiées et comparées.
Bénéfices attendus
Nous pensons que le statut nutritionnel en minéraux, oligo-éléments, vitamines, acides aminés, acides gras essentiels et le statut antioxydant de ces farines d'insectes seront supérieur à une alimentation standard, ce qui mettra en évidence un potentiel bénéfice nutritionnel à la consommation de ces farines dont il est envisagé qu'elles puissent être utilisées en alimentation humaine en substitut aux protéines d'origine animale.
Procédures
Les rats seront placés en cage métabolique pendant 40 heures au total. Durant les 24 premières heures, les rats recoivent eau et aliments spéciaux sans restriction. Ensuite, les rats seront placés à jeun pendant 16 heures toujours en cage métabolique, l'eau sera accessible sans restriction durant cette période. A l'issue de la procédure expérimentale, les rats seront mis à mort par asphyxie.
Impact sur les animaux
Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole et la mise à jeun pendant 16h, ceci classe la procédure en classe gravité modérée selon les recommandations réglementaires (https://www.legifrance.gouv.fr/loda/id/LEGITEXT000027038877/2020-09-23/) : en effet, l'environnement apauvri (pendant 2 jours) et la privation alimentaire (pendant une journée) induisent une angoisse et un stress modérés.
Devenir
Les rats seront mis à mort par asphyxie afin de recueillir tissus et organes qui doivent être analysés pour obtenir les résultats scientifiques escomptés.
Remplacement
L'étude des effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes ne peut pas être évaluée in vitro. De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports et les consommations en nourriture enrichie en farines d’insectes sur la durée totale du projet (42 jours) ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres, ce qui ne serait pas possible si l’étude était réalisée directement chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux s’appuie sur une étude statistique de l’effectif nécessaire basée sur des données de la littérature qui permet chez un groupe ayant consommé des protéines d’insectes de mesurer des modifications des statuts nutritionnels statistiquement différentes d’un groupe témoin. De plus, nous souhaitons tester des farines issues de quatre insectes qui présentent des propriétés nutritionnelles différentes afin d’identifier celle qui sera la plus pertinente à proposer pour l'alimentation humaine.
Raffinement
Les rats seront nourris avec un régime standard auquel sera ajouté au maximum 30 % de farines d’insectes. La formulation finale des aliments permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels, caloriques et physiologique des rats (aliments sous forme de croquettes à ronger). Les animaux seront hébergés dans des cages individuelle, dans un environnement adapté et contrôlé dépourvu de pathogènes. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies sans restriction excepté pendant les heures de jeun. Le milieu sera enrichi pour pallier l'isolement. Les rats seront traités selon les règles éthiques de l’expérimentation animale. L’ensemble du projet est mené par un personnel compétent en expérimentation animale qui maîtrise parfaitement les gestes techniques nécessaires. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.
Choix des espèces
Le modèle animal a été choisi en tenant compte de la littérature récente. En effet, les études sur le sujet ont pour la plupart été réalisées sur des rats. Nous nous appuyerons sur les données décrites dans ces études pour l’analyse de nos résultats. De plus, ce projet s’inscrit dans la continuité de l’étude préliminaire précédemment autorisée réalisée sur des rats. Nous utiliserons de jeunes rats âgés de 6 semaines au démarrage de l’étude. Notre étude cible une population de jeunes adultes plus disposée à consommer des protéines issues d’insectes. Nous souhaitons donc adapter notre modèle animal à cette tranche d'âge.
Effets d’un régime supplémenté en vitamine D associé à un programme de marche sur tapis roulant dans la prévention des altérations ostéo-articulaires associées à l’obésité chez le rat
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils sont rendus obèses par un régime riche en graisses pendant vingt-huit semaines, soumis à une heure de tapis roulant cinq jours par semaine, à des tests de tolérance au glucose et au test comportemental du catwalk, puis euthanasiés par exsanguination de l'aorte. Le porteur affirme n'attendre aucun dommage majeur du régime seul et vise à prévenir les atteintes ostéo-articulaires par la vitamine D et la marche. Il affirme l'absence de méthode "in silico ou in vitro" pour reproduire ces lésions.
Objectifs
L’obésité est une affection très répandue aussi bien chez l’Homme que chez les animaux de compagnie. Cette maladie correspond à un déséquilibre entre les apports et les dépenses énergétiques de l’individu et se caractérise par un excès de masse grasse corporelle et une altération de la qualité de vie conduisant à de nombreuses complications. Des altérations ostéo-articulaires résultent de la surcharge pondérale et de l’inflammation associées à cette obésité. La prise en charge des complications ostéo-articulaires, comme l’arthrose, passe souvent par l’utilisation de médicaments visant seulement à soulager les douleurs engendrées. Très peu de composés sont destinés à limiter la propagation des lésions, à l’exception de traitements chirurgicaux lourds et coûteux. Malgré une prévalence élevée de l’obésité, aussi bien chez les animaux de compagnie que chez l’Homme, et des nombreuses complications ostéo-articulaires qui en découlent, l’association d’une intervention nutritionnelle à la vitamine D avec une activité de marche sur tapis roulant n’a jamais fait l’objet de travaux expérimentaux visant la prévention tertiaire (traitement après installation de la pathologie) des anomalies ostéo-articulaires liées à l’obésité. L’action préventive de la vitamine D et de l'activité physique sera évaluée sur un modèle de rat Wistar soumis à un régime riche en gras. La vitamine D3 (cholécalciférol) sera incorporée dans l’alimentation (15 000 UI/kg). L'activité physique sera effectuée sur tapis roulant selon un programme de 60 minutes, 5 fois par semaine. Pendant une première période de 14 semaines, les rats seront soumis au régime riche en gras seul. Pendant les 14 semaines suivantes, en plus du régime riche en gras, les rats seront traités avec la vitamine D3 et la marche sur tapis roulant. Après réception de tous les animaux sur leur lieu d'hébergement, ils subiront une période d’acclimatation de 7 jours avant le début des procédures. L’aliment et l’eau seront fournis ad libitum. Les rats seront âgés de 6-7 semaines au commencement de l’étude. Un total de 80 rats seront utilisés dans le cadre de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin de limiter et/ou prévenir les complications ostéo-articulaires associées à l’obésité chez le rat. À terme, l'étude pourrait déboucher sur de potentielles applications chez l'Homme ou chez les animaux de compagnie tels que les chiens et les chats. Ce projet pourrait également donner l'opportunité de mieux comprendre les mécanismes qui régissent la pathogenèse de l'arthrose. De plus, il pourrait mettre en lumière de nouveaux bénéfices de l'utilisation de la vitamine D et/ou de la marche. Enfin, ces travaux pourraient permettre d'éclaircir le lien entre le microbiote et l'obésité ou les complications ostéo-articulaires et ainsi amener de nouvelles informations sur son rôle.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions. La marche sur tapis roulant pour 4 groupes sur 8 (1 heure par rat) sera effectuée 5 jours par semaine pendant les 14 dernières semaines du protocole expérimental. Le test de tolérance au glucose (1h30 par rat), le prélèvement de fèces (environ 1h par rat), le prélèvement de sang (environ 20 minutes par rat) et le catwalk (environ 30 minutes par rat) seront effectués en début, milieu et fin de protocole (0, 14, 28 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements d'organes (après 28 semaines) après leur anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg) puis euthanasie par exsanguination au niveau de l'aorte abdominale. Ces interventions concernent les 80 animaux sur une durée totale de 28 semaines.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu sur les animaux du groupe avec le régime contrôle. Les animaux soumis au régime HFD vont développer une obésité avec des complications métaboliques et ostéoarticulaires qui seront l'objet de l'étude. Chez les animaux soumis uniquement au régime HFD, il y a une très bonne tolérance de ce régime sur la période (28 semaines) sans dommage majeur pour la santé de l'animal. Les traitements mis en oeuvre ont comme objectif d'atténuer les complications générées par l'obésité.
Devenir
Tous les animaux des lots étudiés sont concernés par l’euthanasie. Cette dernière est pratiquée par exsanguination au niveau de l’aorte abdominale après anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg). L'euthanasie est justifiée par les prélèvements d'organes qui serviront aux analyses fonctionnelles, histologiques, biochimiques et moléculaires.
Remplacement
Le remplacement des animaux n’est pas possible pour répondre aux questions du présent projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in silico ou in vitro) pour explorer un développement naturel des lésions ostéo-articulaires liées à l’obésité et des potentiels effets bénéfiques du traitement.
Réduction
De manière à respecter la règle de réduction, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum permettant d’anticiper les différences interindividuelles. Le nombre de 10 rats par groupe est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats reproductibles et exploitables et réaliser une analyse descriptive. Le nombre d'animaux a été calculé sur BiostaTGV en prenant l'estimation de la variation du taux de leptine avec ou sans traitement (delta de 35 pg avec écart-type de 24 pg à 5% d'erreur de première espèce et 0,93 de puissance) et donne 10 animaux par groupe expérimental.
Raffinement
- Un hébergement qui respecte les recommandations en vigueur, une animalerie contrôlée (température, hygrométrie) et un enrichissement des cages (des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). - Manipulation douce régulière des animaux pour habituation à l'expérimentateur. - Un suivi régulier des animaux par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). - Définition des points limites et une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. - Optimisation des protocoles expérimentaux pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.
Choix des espèces
L’obésité est une pathologie systémique caractérisée par des altérations multi-organiques et une inflammation de bas-grade qui peuvent déclencher des problèmes ostéo-articulaires comme étudié ici. La souche de rat Wistar est communément utilisée, selon la bibliographie, pour étudier les modifications métaboliques et ostéo-articulaires et répond très bien à l'utilisation d'un régime obésogène. L’utilisation de ce modèle permettra d’étudier la capacité de nos produits testés à prévenir le développement des problèmes ostéo-articulaires et son impact sur l'obésité. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6-7 semaines pendant 28 semaines. Ces animaux sont des jeunes adultes, stade optimal pour étudier l'impact de nos traitements sur les régimes apportés.
Accélération de la cardiomyopathie dans un modèle rat de la glycogénose de type III et test de stratégies de thérapie génique basées sur les vecteurs
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
190 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'implantation sous la peau de pompes délivrant de l'angiotensine II pour accélérer une atteinte cardiaque, puis des prélèvements de sang, des épreuves de course sur tapis roulant et des échographies sous anesthésie, pour tester une thérapie génique de la glycogénose de type III. Le porteur indique attendre un possible dommage rénal lié à l'angiotensine, jugé limité par la durée courte d'administration. Il affirme que le mécanisme de défense contre les virus est "impossible à recréer en laboratoire" et que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
-Etudier l’efficacité d’une approche de thérapie génique pour la glycogénose de type III (GSD III) dans un nouveau modèle rat de la pathologie présentant une hypertrophie du ventricule gauche à 9 mois. -Administration de l'Angiotensine II pour accélérer le développement du phénotype cardiaque afin d’évaluer l’effcicacité des produits de therapie génique sur le traitement ou la prévention de l’apparition de la pathologie cardiaque.
Bénéfices attendus
Développement d’un traitement de thérapie génique pour la glycogénose de type III
Procédures
-Implantation de les pompes d’Ang II. Procédure chirurgicale légère car l’implantation se fait sous le peau. La procédure d'implantation durera 10 minutes maximum. Les pompes resteront sous le peau un maximum de 14 jours. -Prélèvements du sang sont réalisés sur animal anesthésié lors d’un prélèvement au sinus rétro-orbitaire ou sur animal vigile à la veine sous-maxilliare. La procédure de prélèvement de sang est rapide, 5 minutes maximum de l’endormissement de l'animal à son réveil après le prélèvement. Pour le prélèvement dans la veine sous-mandibulaire, le prélèvement durera entre 30 sec et 1min maximum. -Evaluation fonctionnelle: tapis roulant (course maximum 10 minutes) et wirehang (moins d'un minute). -Echocardiographie et ECG sur animaux anesthésiés : la durée maximale sera de 15 minutes pour chaque procédure de l’endormissement au réveil de l’animal après les examens.
Impact sur les animaux
Le dommage collatéral que pourrait causer l’administration d’Ang II pourrait être le développement d’un dommage rénal, car l’effet direct est l’augmentation de la tension artérielle. Par contre on n'éspère pas avoir un dommange rénal car le temps de dosage sera que de 15 jours.
Devenir
Ils seront éuthanasiés par surdosage d’anesthésique (0,35 ml/kg d'EUTHASOL en tant que 140mg de pentobarbital sodique par kilo) à la fin du protocole afin de prélever les tissues: coeur, foie et muscles squelettiques pour analyser en premier lieu l'accelaration de la cardiomyophatie avec l'infusion de la AngII (fibrose et hypertrophie des cardiomyocites), asin que la correction par nos produits de therapie genique de la cardiomyopathie et de la pathologie musculaire et du foie présent chez les patients GSDIII et que le modèle de rat reproduit.
Remplacement
Dans le cas particulier des maladies génétiques, le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation de corps étrangers à l’organisme pour véhiculer le gène « médicament » jusqu’aux cellules à traiter. Pour apporter le cDNA de l’enzyme GDE (enzyme de débranchement du glycogène) jusqu’aux cellules du foie, nous utilisons des virus modifiés. L’organisme est entrainé à lutter naturellement contre les virus et ce mécanisme de défense est à ce jour impossible à recréer en laboratoire. Le recours à l'animal est donc indispensable pour vérifier le pouvoir thérapeutique des virus modifiés que nous utilisons. Nous testerons les virus que nous avons sélectionnés après nos premières expériences réalisées sur des cellules: tous les virus qui ne produisaient pas suffisamment d’enzyme GDE fonctionnelle ont ainsi été éliminés.
Réduction
Lors de la procédure 1, nous identifirons la dose, l’âge et le temps d’administration optimals de l’Ang II, cela nous permettra d’utiliser ces paramètres dans les procédures suivantes. Nous réaliserons une analyse statistique afin d'avoir le nombre d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée. Nous avons utilisé un test unilatéral standard de comparaison des moyennes afin d’avoir 90% de chance (Z1-β=-1.282) de détecter une baisse de la force chez le rat GSDIII avec un risque d’erreur de 5% (Z1-α =-1.645). Formule : n=2*((σ²/Δ²)*(Z1-α+Z1-β)²) - σ :déviation standard attendue (σ=0,261) - Δ : différence entre les moyennes (Δ=0,4998) D’où n=5 rats GSDIII par groupe.
Raffinement
Prélèvement de sang dans la veine sous-maxillaire sur rat vigile ou à la queue sur rat anesthésié pour mésurer la glycemie. L'échocardiographie est non invasive et sans douleur, mais pour réaliser cet examen dans les meilleures conditions pour les animaux, les rats seront anesthésiés par voie gazeuse, ça sera aussi le cas pour l'ECG. La minipompe d’Ang II est placée sous la peau des rats anesthésiés par voie gazeuse.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle rat car dans un autre modèle rat de glycogénose de type II (maladie de Pompe), une atteinte cardiaque majeure a été identifiée. Le rat GDS III est le modèle de la glycogénose de type III, voilà pourquoi nous utiliserons ce rat et non le rat GDS II qui est le modèle pour la glycogénose de type II. De plus, le modèle rat a une taille qui permet de mieux étudier la morphologie du coeur par échocardiographie. Les procédures 1-2 nous permettront de définir la dose et le temps d'administration de l'Ang II ainsi comme la durabilite du phenotype apres l'enlevement des pompes. L'expérience que nous avons chez la souris et les rats nous a montré que les animaux accumulent du glycogène à partir de la naissance et qu'ils montrent un phénotype d'hypoglycemie à partir de 6 semaines. Donc nous utiliserons des rats de 6 semaines minimun.
reconstruction osseuse segmentaire fémorale avec greffe d’un biomatériau
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
125 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du fémur pour y greffer un biomatériau, puis quatre séances d'imagerie sur trois mois avant d'être tué pour analyse des tissus. Le porteur indique une douleur modérée traitée par analgésique et précise que les rats dont le fémur n'a pas été correctement stabilisé sont tués et remplacés. Il présente cette étape animale comme un préalable "impératif" avant des essais sur de plus gros animaux puis en clinique.
Objectifs
La reconstruction des pertes de substances osseuses importantes, telles qu'elles se produisent dans les cas d'accidents graves, de cancers ou de métastases osseuses, reste un challenge. Les greffes d'os autologue (lambeaux osseux, prélevés chez le patient) sont le traitement de référence mais ils présentent de nombreux inconvénients, en raison de la quantité limitée d'os que l'on peut prélever sur un site sain, et des conséquences de ce prélèvement sur son état général et sur sa qualité de vie. En outre, ces procédés chirurgicaux complexes ne sont pas toujours réalisables en raison de contre-indications d'ordre anatomique, vasculaire ou médicale. Le but des recherches qui seront menées durant les 5 prochaines années, est de développer un procédé de reconstruction osseuse avec greffe d'un biomatériau capable de se substituer à l'os manquant dans un premier temps, puis idéalement de permettre la régénération d'un os nouveau.
Bénéfices attendus
Les résultats des expériences conduites sur ce modèle animal sont un préalable à la poursuite de travaux impliquant d'autres modèles, notamment chez le gros animal. Des résultats médiocres obtenus avec un biomatériau conduisent à l'arrêt de l'étude de celui-ci. A l'inverse, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une chirurgie orthopédique (il s'agit d'un acte chirurgical unique d'une durée de 20 minutes), puis à 4 séances d'imagerie de rayons X (durée de l'examen: 15 minutes) et d'IRM (durée de l'examen: 30 minutes) à J2, J28, J56, J72, éventuellement J90.
Impact sur les animaux
Les opérations réalisées pourront entraîner une douleur modérée. Celle-ci sera traitée par l'injection intra-péritonéale de buprénorphine. Dans certains cas, une réduction de la mobilité des animaux pourra être constatée, si les fixateurs externes destinés à stabiliser le fémur n'ont pas été parfaitement posés. Dans ce cas, les animaux concernés seront sacrifiés et remplacés par d'autres.
Devenir
Les animaux sont maintenus en vie jusqu'à 3 mois après l'opération. Ils sont tous sacrifiés à J90 pour procéder à une analyse histologique des tissus dans la région opérée.
Remplacement
L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau (nHA +/- Sr) et pour évaluer le potentiel de différenciation ostéoblastique de ce complexe. Le modèle de défait osseux critique sur la diaphyse fémorale de rat a été décrit dans plusieurs études antérieures.
Réduction
L'utilisation de systèmes d'imagerie non invasie (IRM et microtomographie de rayons X) permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. En effet, le suivi de chaque animal permet d'obtenir des informations sur le processus de régénération et sur divers autres paramètres biologiques à différents temps, sans avoir besoin de sacrifier les animaux. Sans ces procédures, il faudrait envisager des groupes de rats pour chaque temps expérimental où une analyse est requise.
Raffinement
L'utilisation de l'imagerie non invasive par microtomographie de rayons X constitue en soi un raffinement dans la mesure où il limite le nombre d'animaux et permet d'obytenir un grand nombre d'informations sur le même animal tout au long de l'expérience. Pendant la chirurgie, une cage après l'autre sera amenée dans la salle d'opération afin d'éviter toute source de stress par contact visuel, olfactif et sonore des animaux opérés et des animaux à opérer. Après la chirurgie, chaque rat se réveillera dans une cage à part pour éviter le contact avec des conégnères non anesthésiés. L'anesthésie se fera par inhalation d'isoflurane, et la profondeur de l'anesthésie sera vérifiée par immobilité, réflexe de retrait et fréquence respiratoire. La prise en charge de la douleur sera prise en charge par l'injection sous-cutanée d'un analgésique: 0.3 mg par kg de buprénorphine juste avant l'intervention et 24 heures après comme recommandé. Si nécessaire, une troisième dose peut être appliquée après 48 heures. Pour réduire le risque d'infection au niveau du site opératoire, un antibiotique prophylactique (céfazoline, 100 mg/kg) sera injecté par voie sous-cutanée le jour de l'opération et le lendemain (protocole calqué sur celui utilisé en clinique). Après le réveil, le rat reviendra dans sa cage d'origine. Les rats seront hébergés par 3 dans des cages comportant des tunnels, avec accès illimité à l'eau et à la nourriture, placées dans une salle dont les paramètres d'ambiance (température, hygrométrie) sont parfaitement contrôlés.
Choix des espèces
le rat wistar a été choisi à la suite de travaux réalisés dans notre laboratoire et par d'autres équipes portant sur l'analyse des propriétés hostologiques et biologiques des membranes induites en site osseux fémoral chez le rat. Il est d'autre part décrit dans de nombreuses études dans le monde. Autres critères retenus: animaux adultes , poids 225-250 grammes la croissance du squelette doit être arrivée à son terme il faut des animaux de poids suffisant pour supporter la procédure
Approche régénérative pour restaurer les fonctions après une lésion traumatique du système nerveux : de l’étude fondamentale à l’étude translationnelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1170
1 104 souris et 1 170 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, en majorité dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit de une à quatre chirurgies, dont des sections ou contusions de la moelle épinière entraînant une paralysie des pattes postérieures, ou des lésions du nerf sciatique, avant d'être euthanasié pour analyses post-mortem. Le porteur souligne que cette paralysie est chez le rongeur partiellement réversible, à la différence de l'humain. Il affirme que les études sans animaux ne permettent pas d'étudier le contrôle moteur et conclut que trouver une solution thérapeutique est "indispensable".
Objectifs
Les lésions traumatiques (médullaires et crâniennes) et neurodégénératives du cerveau et de la moelle épinière chez l’homme induisent en général un handicap sévère et qui peut être permanent. Par leur importante prévalence, ces pathologies ont un fort impact sociétal et économique. Analyser l’évolution de la lésion du système nerveux central et, en parallèle, élucider comment le neurone répond à ces changements constitue un grand défi pour concevoir des stratégies thérapeutiques visant à stimuler la régénération et la réparation du réseau neuronal affecté. Cela s’applique également aux lésions sévères des nerfs périphériques où la régénération axonale est limitée pour atteindre les cibles périphériques appropriées. Le projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la dégénérescence versus la régénération des fibres nerveuses, avec l'objectif de contribuer à l'élaboration de stratégies de réparation, basée sur l’ingénierie tissulaire. L’utilisation des rongeurs, rat et souris, constitue le modèle animal adapté pour ce projet. Ces modèles inclus les lésions médulaires : la transection bilatérale dorsale ou la contusion, au niveau thoracique qui entraine une paralysie des pattes postérieures, mais qui est suivie d’une récupération partielle. De même, la lésion du nerf sciatique est le modèle de lésion périphérique couramment utilisé. Enfin pour obtenir une preuve de concept de notre stratégie d’ingénierie tissulaire du trauma au niveau du cerveau, le modèle de contusion corticale contrôlée sera adapté. La règle des 3R a été́ considérée tout au long de l'élaboration de ce projet et sera appliquée au quotidien.
Bénéfices attendus
Notre objectif ultime est de déterminer quand et comment, après la lésion de la moelle épinière, la combinaison de l'implantation du biomatériau avec les traitements cités montrerait une efficacité. Par ailleurs, nous poursuivrons notre processus de valorisation et d’interaction avec des cliniciens vers une perspective clinique, pour aboutir à des solutions transposables, réalisables et convaincantes pour leur application en clinique. Grâce aux preuves de concept obtenues au préalable, notre projet de recherche préclinique démontre qu’il est possible de réactiver et de soutenir la plasticité du système nerveux central (ici la moelle épinière), même dans les conditions les plus toxiques et néfastes de la lésion traumatique de la moelle épinière. Notre motivation dans cette thématique et qu’aujourd’hui aucune solution thérapeutique curative n’est disponible en routine clinique pour favoriser significativement la récupération médullaire chez les patients paralysés. Trouver une solution est indispensable.
Procédures
Les animaux sont soumis à 1 à 4 procédures chirurgicales, de durées inférieures à 30 min chacune pour les souris et inférieures à 45 min pour les rats. La durée entre 2 chirurgies soumises à un animal s’étale entre 24h et 8 semaines. Toute procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie et analgésie. Aucun prélèvement n’est effectué sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Nos procédures sont, pour la plupart, classées sévères. Cependant chez le rongeur, les modèles expérimentaux utilisés, entrainent une paralysie (paraplégie) qui, à la différence de l’homme, est réversible partiellement. Les traitements utilisés ne sont pas nocifs, au contraire, ils améliorent la récupération fonctionnelle. Ils sont biocompatibles et résorbables. Ils pourront aussi être envisager dans le cas de trauma ou dommages du système nerveux des animaux domestiques comme le chien ou le chat. Enfin, la réglementation est strictement respectée et appliquée.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié à l’issue de leur procédure, afin de réaliser des études histologiques et biochimiques sur les prélèvements post-mortem. Ces analyses constituent une part importante des projets sur lesquels nous travaillons, auxquelles les méthodes alternatives ne répondent pas.
Remplacement
Les études in vitro et sur les invertébrés ne permettent pas l'étude de comportements tel que le contrôle moteur latéralisé. D’autre part, le système nerveux traumatique est complexe et évolutif ; l’utilisation de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender ces études ni de développer des stratégies à visées thérapeutiques pour obtenir des preuves de concepts pour une application translationnelle. Néanmoins, dans notre projet, des études in vitro sont menées en parallèle pour des questions fondamentales de mécanistiques à l’échelle moléculaire ainsi que des tests de criblage sont développés en amont de l’expérimentation animale.
Réduction
Les expériences antérieures nous ont permis de définir le nombre minimal d'animaux permettant de générer des données statistiquement solides. Ainsi, les analyses comportementales et biochimiques ou anatomiques sont réalisées sur les mêmes animaux, pour des raisons de rigueur d’analyse et pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. A cette fin, les groupes d’animaux sont créés au fur et à mesure, avec les contrôles à l’intérieur de chaque groupe. 2274 animaux seront utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec un cycle jour/nuit adapté et avec la boisson et la nourriture ad libitum. outes les chirurgies sont effectuées sous anesthésie (isofluorane au masque) et analgésique. Les animaux sont regroupés dès le lendemain après chirurgie pour limiter la période d’isolement et un enrichissement adapté pour chaque espèce de rongeur (briques en bois pour les rats et nid végétal pour les souris) est placé dans la cage. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien par une personne formée et compétente. Ces contrôles, enregistrés et validés par le SBEA local, permettent de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Les points limites sont définis et les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie par injection d’une surdose d’euthanasiant. (ces injections sont réalisées après une brève anesthésie ; induction à l’isoflurane). Par ailleurs, nous continuons à poursuivre des formations de mise à jour pour appliquer au mieux la réglementation et d’avoir l’opportunité d’introduire des améliorations pout le meilleur raffinement possible en le validant en amont par notre SBEA et en interagissant avec le vétérinaire référant.
Choix des espèces
Rat et souris sont les animaux d’expérimentation les plus utilisés dans la recherche sur le traumatisme du système nerveux, afin d’améliorer la connaissance de la physiopathologie et développer des stratégies thérapeutiques adaptés. Malgré des différences entre l’homme et les rongeurs, les changements pathologiques, la réponse inflammatoire et l’expression des gènes précoces post-traumatiques sont les mêmes. L’induction du trauma est très reproductible et standardisée chez le rat et de nombreux tests sensori-moteurs ont été très bien établis. Les outils disponibles sont multiples et permettent de caractériser l’évolution d’une lésion. Malgré l’absence de formation de cavités chez la souris (présente chez l’homme et le rat), elle permet de démontrer la fonction d’un gène spécifique grâce à la transgénèse et les caractéristiques moléculaires, cellulaires et fonctionnelles post-traumatiques y sont comparables. Chez le mammifère l’incapacité d’un neurone à régénérer son axone après une lésion mécanique est essentiellement notée à l’âge adulte. Ainsi la majorité de nos expériences seront réalisées chez la souris et le rat adultes âgés de 6 à 7 semaines, soit 30g et 250g respectivement. A noter que les lésions arrivent en grande majorité sur des jeunes adultes. Par ailleurs, dans le cadre du développement d’une stratégie thérapeutique après traumatisme, nous projetons de combiner l’implantation de biomatériaux biocompatibles et biodégradable avec une greffe de cellules : des neurones issus d’embryons à E12-14 de rongeurs et des cellules de Schwann issues de rat adulte. Cette greffe homotypique sera réalisée uniquement chez le rat.
Développement d’un modèle murin sur rat Fischer de lambeau libre perforant ostéo-cutané par ingénierie tissulaire pour la reconstruction des pertes de substances osseuses interruptrices de mandibule
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
52 rats Fischer vont être utilisés, tous tués à l'issue, la plupart dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et six sous anesthésie sans réveil. Ils subissent la dissection d'un lambeau de peau puis la mise en place d'un implant osseux autour du pédicule vasculaire, en vue de mettre au point une reconstruction de la mâchoire. Le porteur indique une douleur faible et prévoit une analgésie, l'euthanasie servant à analyser les implants. Il affirme que le recours aux rongeurs reste "nécessaire" avant d'envisager des expériences sur de plus gros animaux puis chez l'humain.
Objectifs
Les pertes de substances pluritissulaires ostéo-cutanées ou ostéo-muqueuses suite à un traumatisme, une chirurgie cancérologique ou une infection représente un défi pour la chirurgie reconstructrice du fait des différents types de tissus à reconstruire et régénérer. Ces pertes de substance peuvent être accompagnées de séquelles fonctionnelles, sensorielles, sensitives, ou esthétiques non négligeables avec des conséquences multiples pour la victime (intégrité physique et morale affectée). Ceci étant d’autant plus vrai pour les pathologies maxillo-faciales.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer un modèle de lambeau chez le rat, ce lambeau se voudra bi tissulaire (osseux et cutané) et autorisera des reconstructions complexes de la mandibule en s’affranchissant de prélèvements séquellaires. En effet, les reconstructions actuelles passent par des prélèvements osseux conséquents (autogreffe osseuse nécessitant un apport de tissus mous secondaire ou alors des prélèvements libres ostéocutanés tels que une fibula avec une palette cutanée). Ces prélèvements sont lourds, responsables de douleurs, boiterie, troubles neurologiques, instabilité de cheville. Ce projet associe reconstruction osseuse par ingénierie tissulaire osseuse (impression 3D avec ensemencement cellulaire et reconstruction des parties molles par lambeau perforant (prélèvement uniquement de peau et de son pédicule vasculaire respectant les structures nobles telles que les muscles, nerfs et os). Cette construction néoformée permettra de reconstruire en un seul temps opératoire des pertes de substances complexes bi tissulaires sans séquelle sur la zone donneuse.
Procédures
Expérimentation animale préliminaire (14 rats, deux semaines) Expérimentation animale avec génération en site ectopique d’une construction osseuse vascularisée avec implants (4 groupes de 8 rats et 6 rats permettant le prélèvement de matériel médullaire, durée 8 semaines pour la moitié de chaque groupe et deux semaines supplémentaires pour la deuxième moitié.
Impact sur les animaux
Les conséquences de ces études sur les animaux seront potentiellement les suivantes : - Douleur faible lors de la première expérimentation (dissection du lambeau perforant) et deuxième (mise en place de l’implant autour du pédicule in situ) - Pas de limitation de mobilité attendue, ni de stress particulier - Les éventuels effets dureront 2 semaines lors de la première procédure, 8 semaines pour la moitié de chaque groupe dans la deuxième procédure et deux semaines supplémentaires pour l’autre moitié de chaque groupe.
Devenir
L’euthanasie des animaux est nécessaire afin d’analyser les implants mis en place autour du pédicule vasculaire du lambeau.
Remplacement
l’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des matériaux avant d’envisager des expériences sur de plus gros animaux et l’ultime but : l’utilisation chez l’homme.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, l’utilisation de rat Fischer mâles permet un prélèvement de moelle osseuse plus important sans devoir prélever sur tous les rats. Une analyse statistique a été réalisée afin de déterminer le nombre minimal de rats nécessaire pour obtenir un effet statistique : afin d’obtenir une puissance statistique pertinente (P = 95%, alpha 1%), le nombre d’animaux pour les procédures 1 et 2 a été évalué à à 14 et 8 par groupe (4 groupes soit 32 rats). Un animal supplémentaire par groupe est requis afin de pallier les possibles complications expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans un cycle jour/nuit un cycle jour/nuit saisonnier (e.g., 12h/12h/ été, 8h/14h hivers) avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 2 pour limiter le stress de la surpopulation ou de l’isolement. Des tunnels pour les rats (marque SERLAB/Modèle tunnel mandrin large)seront placées dans la cage pour permettre aux animaux de s’enfouir et se cacher. Chaque protocole a été choisi pour répondre à une question précise, par sa reproductibilité afin de réduire la variabilité expérimentale et par conséquent le nombre d’animaux utilisés par expérience. Le protocole sera interrompu le plus tôt possible en accord avec des points limites définis et réalisés sur le plus petit nombre d’animaux possible suffisant pour obtenir une différence statistiquement significative. La fréquence des inspections sera faite tous les jours pour ce protocole. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des animaux. La prise en charge de la douleur des animaux sera réalisée par injection en sous cutanée de buprénorphine dès l’anesthésie à la dose de 0,03mg/kg et répétée toutes les huit heures pendant deux jours si besoin. Des AINS (Meloxicam 5mg/kg SC toutes les 24 heures) seront administrés de manière systématique pendant au moins deux jours.
Choix des espèces
Le rat permet une première approche in vivo avant de tester les hypothèses confirmées avec ce modèle sur des animaux plus similaires à l’Homme, puis chez l’Homme. C’est un modèle de référence pour la recherche fondamentale dans le cadre d’implantation allogénique afin de se concentrer sur l’effet propre des biomatériaux évitant toute réponse immunitaire non désirée et permet de sélectionner les méthodes efficaces de réparation au sein d’un grand nombre de conditions expérimentales. Les études seront réalisées avec des rats adultes, c'est-à-dire, âgés de 10 semaines (300g), ce qui correspond au modèle validé et développé depuis plusieurs années dans notre laboratoire et dans la littérature.
Etudes histologiques chez les rongeurs
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Rats : 100
200 souris et 100 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil par exsanguination puis dissection. Ils ne servent pas à produire des connaissances mais à mettre au point des protocoles d'histologie et à former étudiants et collaborateurs à ces techniques. Le porteur justifie le recours aux animaux par la baisse du nombre de pièces anatomiques disponibles et par le souci de ne pas "gaspiller" des tissus issus de projets scientifiques. Il affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer l'utilisation des animaux" puisque l'histologie porte sur des pièces anatomiques.
Objectifs
L’objectif du projet est de développer et valider des protocoles d’histologie (2D et 3D), pour la plateforme. En effet, l’histologie reste la méthode de référence pour visualiser post mortem les biomarqueurs ou les différents types cellulaires présents dans un tissu biologique. La réduction du nombre d’animaux dans les études fait qu’il n’y plus de reliquat de pièces anatomiques non utilisées dans les projets. Il n’est pas pertinent de compter uniquement sur les animaux dédiés à une étude pour à la fois mettre en place un protocole d’histologie et réaliser une étude complète, les zones d’intérêt étant parfois très petites (structures cérébrales) ou le protocole d’histologie difficile à mettre au point (multi-marquage et histologie 3D). Ce projet vise donc à utiliser des animaux afin à mettre au point de nouveaux protocoles d’histologie avant de les utiliser pour les projets scientifiques, tels que les études de vieillissement ou les études sur le cancer. Les développements méthodologiques que sont les multiples marquages, l’histologie 3D, ou révélation de la vascularisation d’un organe entier nécessitent de nombreuses mises au point. Les multiples marquages permettent de visualiser sur une même coupe de tissus plusieurs marqueurs, permettant la visualisation de colocalisations de marqueurs ou le dénombrement de différentes cellules dans une même région. Les nouvelles techniques d’histologie en 3D nécessitent également beaucoup de mises au point, pour obtenir un immunomarquage visible en profondeur, en rendant transparent la pièce anatomique. La visualisation de la vascularisation d’un organe entier, en rendant transparent la pièce anatomique, est particulièrement intéressante pour corréler avec l’imagerie IRM mais également très difficile à mettre en place, nécessitant de nombreux ajustements. Ce projet vise aussi à obtenir assez de pièces anatomiques pour pouvoir vérifier un protocole déjà validé sur une espèce sur une autre espèce ou une autre souche. Enfin, et de façon non négligeable, il est nécessaire de disposer de pièces anatomiques pour former les étudiants et les collaborateurs, aux techniques d’histologie, sans gaspiller une pièce « précieuse » car issue d’un projet scientifique. La prise en main des techniques (découpes, immunomarquages et microscopie) nécessitant un apprentissage important, notamment sur la découpe au cryostat.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la mise au point de nouveaux protocoles complexes d’immunomarquages en 2D et 3D pour pouvoir réaliser ensuite des études complètes en histologie sur les projets scientifiques de la plateforme. Le bénéfice est également de pouvoir réaliser la formation des étudiants sans gâcher des pièces anatomiques « précieuses » car issu d’un projet et de pouvoir contrôler les résultats sur un animal sain en cas de résultat inattendu (ex : perte neuronale dans une souche de rat).
Procédures
Une procédure chirurgicale sans réveil, comportant une exsanguination perfusion puis une dissection afin de recueillir des organes d’intérêt. La procédure est déclinée en plusieurs possibilités : 1 : procédure standard d’exsanguination perfusion, puis recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever. 2 : Injection intracardiaque, intra-artérielle ou intraveineuse préalable d’un marqueur coloré (colorant vasculaire), avant exsanguination perfusion et recueil des organes. Le produit est laissé agir 5 min avant de commencer la procédure d’exsanguination perfusion, durée totale estimée à environ 30-40 minutes, en fonction du site d’injection et du nombre d’organes prélevés. 3 : Injection d’un marqueur coloré (colorant vasculaire) pendant la procédure d’exsanguination perfusion et recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever. 4 : Injection d’un marqueur coloré (remplissage vasculaire) à la fin de la procédure d’exsanguination perfusion et recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever.
Impact sur les animaux
Procédures sans réveil.
Devenir
Une procédure sans réveil pour histologie
Remplacement
L’histologie concerne les pièces anatomiques, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux.
Réduction
Les études rats étant moins nombreuses que les études sur souris, le nombre de 20 rats/an a été déterminé par le nombre de projets nécessitant ce type de mise au point. Les études souris sont beaucoup plus nombreuses mais nous avons déjà accumulé également plus de données histologique, nous pensons donc que 40 souris /an seront suffisantes, en tenant compte des besoins de formation. Soit un total maximal de 100 rats et 200 souris en 5 ans. Il est estimé qu’environ 10 à 15 % de ces animaux seront utilisés pour les action de formation et 85 à 90% pour des actions de mise au point en histologie. Une partie des animaux peuvent être des animaux de réforme issus de projets antérieurs, ou des élevages du CEA, n’ayant subi soit aucune procédure, soit des procédures légères ou modérées n’ayant pas entrainés de signes cliniques persistants. Les actions de formations seront réalisées sur ces animaux. Les mises au point peuvent également être réalisés sur ces animaux à l’exclusion des animaux suivants : - Animaux ayant des signes cliniques, pathologiques ou non. - Animaux d’un âge trop avancé pour l’expression des biomarqueurs d’intérêt (en fonction des marqueurs) - Animaux qui ont reçu un traitement (y compris produits de contraste) - Animaux qui ont subi des procédures chirurgicales lourdes (craniotomies …) - Animaux qui ont subi des procédures pouvant entrainer une inflammation (ouverture de la barrière hémato-encéphalique) - Animaux issus de souche atypique, de souche immunodéficiente ou encore ayant un métabolisme pathologique (sans forcément présenter des signes cliniques - Animaux de l’élevage ayant déjà montré une déficience cellulaire/moléculaire (sans signes cliniques) Les animaux jeunes et sains sont privilégiés pour ces mises au point, limitant les facteurs pouvant troubler l’analyse de l’expression des marqueurs et permettant d’avoir des points de comparaisons avec des animaux ayant une pathologie ou un traitement. Des animaux d’élevage n’ayant absolument subi aucune procédure, peuvent cependant servir pour les mises au point en histologie quand cela concerne l’expression des biomarqueurs liés à l’âge, à condition que la souche soit identique à celle prévue dans le projet lié à l’âge et que les animaux n’ont pas déjà été identifié comme déficients/anormaux pour les marqueurs d’intérêts. Les animaux provenant d’autres animalerie que celle de notre plateforme, seront gardés en quarantaine à réception jusqu’à utilisation.
Raffinement
Procédure sans réveil Une antalgie sera réalisée par injection sous-cutanée de Buprénorphine (0,06 mg/kg pour les souris et 0,03 mg/kg pour les rats), 30 minutes avant anesthésie.. Les animaux seront anesthésiés par une injection intrapéritonéale d’un mélange Kétamine/Xylazine (100/10 mg/kg, dose de 10 ml/kg).
Choix des espèces
La plupart des projets scientifiques sont réalisés sur le rongeur, les mises au point techniques se sont donc en priorité sur ces espèces. Des souris de 6-8 semaines environ, pour un poids de 20-25 g, et des rats de 8 semaines environ, pour un poids de 300 g, seront utilisés de préférence, sauf pour mettre au point des études histologiques sur des animaux plus âgés, où des animaux de plus de 6 mois seront utilisés. En effet, les tissus et en particulier le cerveau montre des différences importantes au cours du temps, avec par exemple la diminution de certains types cellulaires et l’augmentation de dépôts protéiques susceptibles d’interagir avec les anticorps et de donner de faux positifs.
Etude de l’activité anti-biofilm à Candida sur cathéter vasculaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
57 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Livrés déjà porteurs d'un cathéter vasculaire, ils reçoivent dans ce cathéter un composé d'origine lichénique contre la formation de biofilm à Candida, et sont hébergés seuls avant d'être tués pour récupérer les cathéters. Le porteur indique que l'isolement, lié à la fragilité du point de sortie du cathéter, est source de stress géré par de l'enrichissement. Il affirme qu'il est difficile de reproduire in vitro les conditions du flux et du système immunitaire, et conserve donc le modèle animal.
Objectifs
L'objectif du projet est de pouvoir montrer l'intérêt de l'utilisation de composés d'origine lichenique comme antifongique dans le cas de la formation de biofilm sur cathéter vasculaire.
Bénéfices attendus
L'objectif est de selectionner de futurs candidats médicaments permettant d'inhiber la formation de biofilm à Candida dans les cathéters des patients.
Procédures
les animaux sont cathétérisés par le fournisseur. Un changement de lock solution doit être effectué toutes les 72h, au minimum, selon les recommandation du fournisseur. Celle-ci est utilisée pour remplir le cathéter afin que le sang ne remonte pas dedans entre 2 utilisations. Cela évite la formation de caillots présentant un risque d'obstruction du cathéter et/ou de diffusion de celui-ci ensuite dans l'organisme. Ces caillots pourraient ainsi entrainer des dégats au niveau des viscères de l'animal en obstruant les voies de circulation sanguine.
Impact sur les animaux
Les animaux cathétérisés sont achetés chez l'éleveur après chirugie. Le traitement par les composés évalués sera administré seulement dans le cathéter pour un effet local (lock solution). Nous n'envisageons donc pas d'effet sytémqie chez le rat. Les animaux seront hébergés individuellement en raison de la fragilité du point de sortie du cathéter. Ce stress sera géré par l'ajout d'enrichissement.
Devenir
Les cathéters devant être récupérés en fin d'expérience pour être analysés, les animaux sont euthanasiés au préalable.
Remplacement
Il a été démontré que les espèces particulières de Candida, la nature de la surface de l’appareil, la présence d’un film de conditionnement dérivé de l’hôte et le débit de liquide affectent le développement du biofilm (Chandra, J. J. Bacteriol, 2001). En raison de la complexité du milieu entourant les dispositifs médicaux prothétiques implantés, comme les cathéters intravasculaires, il est difficile de reproduire avec précision les conditions in vivo dans les modèles in vitro. Bien que des progrès aient été faits pour reproduire le flux dans un modèle in vitro, pour imiter le conditionnement des dispositifs intravasculaires par une exposition préinfectieuse à divers composants sériques comme le fibrinogène, ces deux paramètres n'ont pour le moment pas encore été corcectement simulés en raison de la complexité du flux intavasculaire et intracathéter et/ou de la diversité de la composition protéique sérique . Il n’est pas possible d’inclure dans ces modèles chacune des protéines hôtes qui sont probablement importantes in vivo (Chandra, J. J. Bacteriol, 2001) . Plus important encore, le système immunitaire de l’hôte et le site d’infection n’ont pas été pris en compte dans ces systèmes in vitro. Il est donc souhaitable de tester des modèles de biofilms in vivo et le straitements permetatnt de les éliminer (Andes D., Infect Immun, 2004).
Réduction
Le nombre d'animaux a été déterminé en utilisant le logiciel G*Power avec les paramètres suivants (test = anova, risque alpha = 0.05, puissance = 0.80, 4 groupes). Cette expérience sera réalisée en double pour valider les résultats obtenus lors de la première expérience. Afin d'améliorer le raffinement, une première expérience sera réalisée pour déterminer le meilleur paramètre de développement du biofilm reposant sur la détermination de la concentration de l'inoculum de levures à injecter dans le cathéter. Le nombre d'animaux a donc été réduit au strict nécessaire pour conduire à des résultats interprétables.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement dès leur arrivée et seront traités conformément aux indications du fournisseur, en particulier pour l'entretien du cathéter. Le choix de l'espèce Rattus norgegicus est issu de la littérature, ce modèle est décrit comme robuste et moins susceptible d'obturation du cathéter (information du fournisseur et expérience personnelle chez la souris). Le nombre d'animaux a été déterminé de façon rationnelle pour obtenir des résultats interprétables et analysables statistiquement. L'expérience a été conçue pour éviter toute souffrance inutile des animaux. Cependant tout animal montrant des signes de gravité sera euthanasié conformément aux critères indiqués dans les procédures.
Choix des espèces
Les modèles de biofilm sur cathéter sont décrits chez plusieurs espèces animales : la souris, le rat et le lapin. Les cathéters chez la souris sont difficles à manipuler et s'obstruent plus facilement en raison d'un diamètre interne faible. Chez le rat et le lapin, cet inconvénient est très fortement diminué. Le modèle de cathéter vaculaire chez le lapin est peu utilisé par les équipes de recherche, selon la littérature scientifique. De plus, l'expérimentateur n'a pas d'expérience dans la manipulation des lapins. Le rat a donc été choisi comme espèce dans les modèles décrits dans les procédures. Cette étude visant à évaluer le traitement de cathéters vaculaire chez des animaux en pleine possession de leur capacité de défense immunitaire, des animaux trop jeunes ou trop vieux ne réponderont pas à cette condition. De plus, le diamètre des cathéter utilisables chez des animaux jeunes sera plus restreint rendant le risque d'obstruction plus élevé.
Origine de Troubles du Spectre Autistique dans un modèle de rat : étude du métabolome et rôle du microbiote intestinal maternel.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
420 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie étant tuée pour prélever les cerveaux et 66 renvoyés vers l'élevage. Des rattes gestantes reçoivent une injection d'acide valproïque pour induire un modèle d'autisme, subissent une greffe de microbiote fécal et une échographie sous anesthésie, et leur descendance passe quatre tests comportementaux comme le labyrinthe en Y et l'enfouissement de billes. Le porteur indique que le valproïque provoque quelques minutes de pelage hérissé, prostration et flancs creusés, et que les tests génèrent un léger stress. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser les troubles du spectre autistique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment différents facteurs de l’environnement vont avoir un impact sur le microbiote intestinal maternel, et de mieux comprendre comme la modification de microbiote sera liée à un développement cérébral anormal à l’origine des TSAs.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre l'implication du microbiote intestinal maternel dans le développement des troubles du spectre de l'autisme chez le rat.
Procédures
Les rattes gestantes fournissant les fèces pour la greffe de microbiote fécal seront massées chaque jour pour la récolter de leur fèces fraiches (sortie du côlon). Les rattes gestantes ayant reçu une greffe de microbiote fécale ainsi que leurs ratons subiront une anesthésie et l'injection d'un produit de contraste pour échographie. Il y aura 4 tests comportementaux: - labyrinthe en Y : 5 min - scorage des stéréotypies motrices : 10 min - enfouissement de billes : 15 min - interaction sociale directe : 10 min
Impact sur les animaux
L'effet de l'injection de l'acide valproïque induit une légère souffrance. Différents symptômes sont observés pendant quelques minutes (pelage hérissé, prostration, et flancs creusés) et tout redevient normal au bout d'environ 10 min. Les tests comportementaux, de par le changement de l'environnement des ratons, peuvent générer un léger stress chez l'animmal, donc une contrainte pour ces derniers.
Devenir
Procédure 1: tous les animaux sont réutilisés car des prélèvements seront effectués à GD19. Procédure 2: tous les animaux sont réutilisés car ils sont concernés par la procédure 3. Procédure 4: tous les animaux sont réutilisés car ils sont concernés par la procédure 5. Procédure 5: tous les animaux sont réutilisés car des tests comportementaux seront réalisés avec les progénitures Procédure 3: mise à mort des animaux concernés par cette procédure et récupération des cerveaux pour des analyses immunihistochimiques.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives permettant de modéliser les Troubles du Spectre Autistique.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au maximum tout en permettant de pouvoir observer des différences à un seuil significatif de 0,1 %.
Raffinement
Tout sera mis en oeuvre pour maximiser le bien-être des animaux pendant le protocole. Les animaux seront en cycle inversé pendant l'ensemble du protocole. Les mères seront en présence d'enrichissement Sizzle Nest, bâton en bois, papier absorbant et maison pour une nidification optimum. Les animaux seront observés 2 fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout incofort qui pourrait être induit par ce modèle.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les espèces les plus adaptées pour pouvoir mener ces études, la taille de leur cerveau est compatible avec la résolution spatiale des caméras du microTEP. De plus, le modèle de rat exposés à l'acide valproïque pendant la gestation est l'un des plus couramment utilisé et décrit pour étudier les TSA. Dans ce projet, certains prélèvements sont réalisés au 19ème jours de gestation. Ce stade a été choisi pour avoir des échantillons prénataux dans le modèle à un stade permettant d’obtenir les quantités nécessaires notamment pour le liquide amniotique nécessaires aux analyses métabolomiques. Ce stade correspond chez l’homme à la fin du second trimestre de grossesse. D’autres prélèvements sont réalisés à 7 jours de vie postnatale. Ce stade correspond chez l’homme à la fin du dernier trimestre de grossesse. Les TSAs sont considérés comme un groupe d’affections prénatales, d’où l’objectif d’avoir des prélèvements à des stades correspondants au développement prénatal chez l’homme. L’étude comportementale et l’imagerie seront réalisées comme classiquement dans le modèle à l’adolescence.
TL-EVOTEC-EARLYTOX Evaluation précoce de la toxicité de produits futurs candidats médicaments
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 28000
Cochons d'Inde : 1120
Hamsters dorés : 1120
Gerbilles de Mongolie : 1120
59 840 animaux non-humains, en majorité des souris et des rats mais aussi des cochons d'Inde, des hamsters dorés et des gerbilles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent sur 28 jours maximum des administrations répétées de composés candidats médicaments à doses élevées, avec des prélèvements de sang, pour détecter précocement une toxicité. Le porteur indique que la recherche de doses toxiques ou maximales tolérées peut provoquer inconfort, stress, dommages réversibles voire irréversibles et douleur. Il reconnaît que des tests in vitro remplacent déjà des animaux mais affirme qu'il n'existe pas de test couvrant l'ensemble des systèmes biologiques, et cale le nombre d'animaux sur les normes ICH et OCDE.
Objectifs
Le projet a pour objectif : • d’étudier les putatifs mécanismes de toxicité liée à l’administration de la molécule d’intérêt. La détection précoce de toxicité permet d’arrêter le développement d’une molécule avant des études de toxicologie règlementaires couteuses d’un point de vue éthique et économique. Ces effets toxiques pourront être reliés à la concentration circulante du candidat médicament administré grâce à des données de toxicocinétique générées en parallèle. • de déterminer dans le cas de toxicité des biomarqueurs pertinents qui pourront être par la suite étudiés chez l’homme. •de caractériser éventuellement des populations répondeuses ou non à la molécule d’intérêt en associant des méthodes d’analyses ex vivo de génomique, protéomique ou métabolomique
Bénéfices attendus
Le projet vise à détecter très tôt dans le développement de effets de toxicité d'un composés test ce qui obligatoirment impliquerait l'arrêt du développement d’une molécule avant même les études de toxicologie règlementaires coûteuses d’un point de vue éthique, en animaux, et économique. Le projet
Procédures
Les animaux subissent des adminsitrations uniques voire répétées sur 28 jours maximum de composé d'intérêt à des doses élévées afin d'identifier des effets secondaires susceptibles d'être observés chez l'homme. Pour les voies d'administration contraignantes, les animaux sont anesthésiés pour éviter tout inconfort ou souffrance inutile. Des prélèvements de sang sur animaux vigiles ou anesthésié sont également effectués pour mesurer les concentrations du composés d'intérêt dans le sang ou les tissus pour évaluer l'exposition des animaux au composé ou suivre un biomarqueur qui réflète l'évolution de lésions. Le maximum d'administrations quotidienne est de 4 et ceux pendant 28 jours maximum. La durée de ces administrations vont de quelques secondes pour une voie orale à moins d'une heure pour les perfusions longue durée sur animal contraint et à plus d'une heure pour des animaux libre de leurs mouvements. Le maximum de prélèvements de sang est limité au volume totale de sang prélevé sur une semaine qui doit être infèrieur à 10% du volume de sang total. La durée de ces prélèvements n'excèdent pas 2 minutes.
Impact sur les animaux
La recherche de dose toxiques ou de doses maximales tolérées occasionne de l'inconfort, du stress, des dommages réversibles voire irréversibles et potentiellement de la douleur chez les animaux. Les administrations et les prélèvements répétées de sang sur animal vigile vont également générer du de l'inconfort et du stress sachant que si la voies d'adminsitration ou de prélèvements est jugées douloureuse ou dangereuse pour l'animal ou l'opérateur , l'animal est systématiquement anesthésié.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d'étude
Remplacement
De nombreux test in vitro de toxicité remplacent déjà les animaux. Il s'agit de tests orientés sur un organes. Il n'existe pas de tests englobant l'ensemble des systèmes biologiques
Réduction
Le nombre d'animaux est défini par les recommandations internationales comme les normes ICH, OCDE
Raffinement
L'ensemble des procédures contraignantes jugées douloureuses pour les animaux sont faites sous anesthésie générale par inhalation ou par injection de composés à propriétés anesthésiantes. Les étapes de contention sont limitées (
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est défini par les lignes directrices internationales (ex. ICH, CHMP, OECD, WHO, FDA, MHLW) et sur des bases scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le(s) véhicule(s) envisagé(s) et les données disponibles de pharmacocinétique, de métabolisme et de toxicologie in vitro. Le stade adulte est celui utilisé afin de disposer d’animaux dont les systèmes biologiques sont matures. Exceptionnellement, des animaux nouveau-nés pourraient être utilisés si un impact sur le développement de l’animal doit être évalué.