Rats
Développement, homologation et benchmark de formulations d’appâts destinées à la lutte contre les rongeurs nuisibles
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 1050
Autres rongeurs : 1050
3 150 rongeurs, soit 1 050 souris, 1 050 rats et 1 050 rongeurs d'autres espèces, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par gavage des appâts rodenticides, une entreprise cherchant à développer et homologuer ces produits destinés à les tuer. Le porteur reconnaît qu'il est "certain que les rongeurs vont subir des nuisances qui devraient les conduire à la mort", les survivants étant ensuite tués. Il présente ces essais comme une "obligation réglementaire européenne" imposant de tester chaque espèce cible et un nombre minimal d'animaux.
Objectifs
Il existe un vrai besoin de développement de nouveaux appâts rodonticides à mettre sur le marché de la lutte contre les rongeurs nuisibles. Cette lutte est justifiée par la nécessité absolue de préserver les personnes et les biens (alimentation, bâtiments et matériels) des risques et méfaits induits par ces rongeurs cibles nuisibles. En effet, ces derniers sont porteurs de zoonoses (maladies transmissibles à l’homme) et sont responsables de plusieurs milliers de morts chaque année, via des contaminations directes ou indirectes. Les maladies véhiculées par les rongeurs ont tué plus de personnes au cours des 10 derniers siècles que toutes les guerres. Ce projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité de divers appâts rodenticides, depuis leur développement jusqu'à leurs autorisations de mise en marché (AMM), aux renouvellements périodiques des homologations, ainsi qu'à leur benchmark par rapport aux produits du marché. Il permettra également de faire progresser la connaissance scientifique. La société développe et commercialise des produits de lutte contre les rongeurs nuisibles, sous forme d’appâts. Ces appâts doivent répondre à de nombreux critères pour être efficaces et homologués. Ils doivent être appétents pour les cibles visées afin qu’ils soient consommés et que les rongeurs ingèrent la substance active qu’ils contiennent. Ils doivent être adaptés aux conditions d’utilisation variables selon les cas : lieu sec, humide, chaud, froid … et assurer la stabilité de la substance active et de l’appétence au cours du temps. Le besoin de régulation des populations de rongeurs nuisibles et les exigences réglementaires contraignantes imposent le développement et l'optimisation des formulations d'appâts. Pour procéder à leur développement et à leurs homologations, la société a besoin de conduire des essais sur des produits nouveaux. Elle doit également conduire des essais sur des produits connus en vue du renouvellement périodique de leurs homologations. Enfin, elle se doit de benchmarquer les produits concurrents qui arrivent sur le marché. L’objectif de ce protocole doit permettre de développer puis de valider l’appétence et l’efficacité de formulations d’appâts contenant des substances rodonticides en vue de leur homologation sur les 3 espèces cibles. Les animaux seront utilisés au stade adulte et répartis entre mâles et femelles, le plus équitablement possible. Pour être validé, un essai devra afficher une efficacité d’au moins 90%.
Bénéfices attendus
La conduite de ces essais d'efficacité et d'appétence permettra à l'entreprise de progresser dans ses connaissances au niveau de la formulation d'appâts et de finaliser le développement des nouveaux produits, avant d'engager les demandes d'homologation. Dans les dossiers de demande d'homologation, la réglementation européenne impose la présentation de résultats d'essais conduits en laboratoire avec des animaux de chacune des espèces cibles revendiquées dans les demandes d'AMM. La guidance de l'ECHA impose également le nombre minimum d'animaux par essai, afin d'avoir une représentativité suffisante.
Procédures
Lors de la procédure expérimentale n°2, les animaux seront soumis à des opérations de gavage. Ces gavages pourront être uniques : 1dose gavée une seule fois, ou répétés, une fois par jour sur 2 à 5 jours consécutifs. Les opérations de gavages auront une durée limitée d'une minute par gavage. Pour les procédures expérimentales 1 et 2, les animaux pourront être soumis à un prélèvement sanguin (procédure n°3), sous anesthésie terminale, juste avant euthanasie.
Impact sur les animaux
Dans la mesure où les produits à tester sont des rodonticides, il est certain que les rongeurs vont subir des nuisances qui devraient les conduire à la mort. Afin de réduire au maximum ces nuisances, la règle des 3R et le respect de l'atteinte des points limites seront appliqués.
Devenir
Tous les animaux survivants à l'issue des procédures 1 et 2 seront euthanasiés. En effet, l'exposition aux substances actives et la durée des essais ne permettront pas de les réutiliser dans d'autres essais.
Remplacement
La conduite des essais sur les rongeurs cibles : rats (Rattus norvegicus et Rattus rattus) et souris (Mus musculus) répond à une obligation réglementaire européenne et ne peut être remplacée. Pour pouvoir accéder au marché, ces appâts doivent être homologués. Une des conditions requises pour l'obtention de l'homologation consiste à fournir des résultats d'essais d'efficacité, conduits en laboratoire, selon la guidance de l'ECHA (Guidance on the Biocidal Products Regulation. Volume II Efficacy - Assessment and Evaluation (Parts B+C), Version 3.0, April 2018) qui impose que les essais soient conduits sur les espèces cibles. Par ailleurs, il n'existe pas de méthode de substitution pour valider l'efficacité et l'appétence des appâts. Le recours aux animaux est donc obligatoire.
Réduction
Les trois espèces cibles (Rattus norvegicus, Rattus rattus et Mus musculus) ont des comportements alimentaires différents. Elles ne sont donc pas substituables. Selon la réglementation européenne, les essais doivent être conduits en laboratoire sur chaque espèce cible pour l'obtention des AMM. Les guidances mentionnent qu'il est nécessaire d'utiliser au moins 10 animaux par essai afin d'atteindre une représentativité suffisante des résultats. Imposé par la réglementation, ce nombre d'animaux par essai ne pourra être réduit. Il est prévu, pour la première année du projet : Procédure 1 : 10 essais par espèce, puis 15 essais par an les 4 années suivantes, soit(10x12x1+15x12x4=) 840 animaux par espèce, soit 3x840= 2520 animaux au total, pour la procédure 1 sur la durée du projet. Procédure 2 : 5 essais, dont 2 avec groupe témoin, par espèce et par an soit (5x6x5 + 2x6x5=) 210 animaux par espèce cible sur la durée du projet, soit au total 630 animaux pour la procédure 2 sur la durée du projet. Pour la procédure 3, il n'est pas prévu d'animaux supplémentaires. Les animaux intégrant cette procédure seront tous issus des procédures 1 ou 2. Le total d'animaux prévu sur l'ensemble du projet est donc de 2520 + 630 = 3150 animaux sur les 5 ans du projet. Ce nombre est justifié par le besoin d'appâts de formulations variées afin de répondre aux besoins des différents sites à traiter selon leurs caractéristiques.
Raffinement
Les essais seront conduits dans un environnement enrichi - objets susceptibles d’être rongés ou déchiquetés et pouvant servir à la construction de nids (papiers, cartons, etc)-, par des personnels qualifiés formés au respect des conditions du bien-être des animaux, afin de minimiser au maximum le stress et la souffrance imputables à ces essais. Afin de respecter le caractère grégaire des animaux, les rats seront hébergés à 3 par cage et les souris par groupe de 5 ou 6, en veillant à séparer les mâles des femelles. Pour éviter toute souffrance inutile, le concept de Raffinement et de points limites sera mis en œuvre. Un suivi clinique des animaux sera effectué, au moins quotidiennement, afin de relever la présence d’éventuels symptômes de mal-être. Les animaux moribonds ayant atteint des points limites seront euthanasiés, en accord avec la structure en charge du bien-être animal de l’EU. Pour les essais par gavage et pour les prélèvements sanguins, les gestes techniques seront réalisés par des personnels formés et expérimentés.
Choix des espèces
Les 3 espèces (Rattus norvegicus, Rattus rattus et Mus musculus) répondent à une exigence réglementaire européenne (Règlement BIOCIDE au niveau européen, selon guidance ECHA : Guidance on the Biocidal Products Regulation. Volume II Efficacy - Assessment and Evaluation (Parts B+C), Version 3.0, April 2018). En effet, ces trois espèces représentent les 3 cibles majoritaires des produits développés pour la protection des personnes et des biens, contre les rongeurs nuisibles. La réglementation impose que des essais d'efficacité et d'appétence soient conduits en laboratoire sur chacune des espèces cibles. Les animaux des 3 espèces seront utilisés au stade adulte afin de respecter les guidances de l'ECHA (European CHemical Agency) pour ce type d'essai.
Protocole d’immunisation appliqué au rat mâle Wistar à des fins pédagogiques
- Enseignement supérieur
18 rats mâles Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées légères. Ils reçoivent trois injections d'albumine avec adjuvant de Freund dans les pattes, à quinze jours d'intervalle, puis sont tués par ponction du sang dans l'aorte pour produire du sérum. Le porteur indique qu'une fièvre passagère est possible après immunisation, et destine ce sérum à des travaux pratiques d'immunologie pour environ 80 étudiants par an. Il justifie le recours au rat par le volume de sang nécessaire et par un coût moindre que l'achat de sérum commercial.
Objectifs
- Obtention d'immunsérums en quantité suffisante pour la réalisation de TP par tous les étudiants en formation sur deux années consécutives (environ 80 étudiants/an, soit 160 étudiants sur deux ans). - Sensibilisation des étudiants aux protocoles d'immunisation réalisés sur des modèles animaux de laboratoire.
Bénéfices attendus
- Obtention d'immunsérums en quantité suffisante pour la réalisation de TP par tous les étudiants en formation sur deux années consécutives (environ 80 étudiants/an, soit 160 étudiants sur deux ans). - Sensibilisation des étudiants aux protocoles d'immunisation réalisés sur des modèles animaux de laboratoire.
Procédures
Pour cette expérience, 6 rats Wistar sont immunisés, une année sur deux, par du personnel qualifié niveaux concepteur ou applicateur. A J0, les rats vigiles recevront une première injection d'une solution de Serumalbumine bovine (BSA) ou d'ovalbumine (OVA) en présence d'adjuvant complet de Freund. Pour cela, 200 μL de BSA ou OVA à une concentration de 12,5 mg/mL sont ajoutés à 1,8 mL d'adjuvant complet de Freund, puis 200 μL de cette solution sont administrés aux rats. Le mélange préparé est injecté en intramusculaire au niveau de la patte du rat, à raison de 100 μL à chaque patte postérieure. A J15 (15 jours plus tard), les rats vigiles recevront une deuxième injection (1er rappel), identique à la première (200 μL de BSA ou OVA en présence d'adjuvant complet de Freund en intramusculaire). A J30, les rats vigiles recevront une troisième injection (2eme rappel) d'une solution de BSA ou OVA en présence d'adjuvant incomplet de Freund. Pour cela, 200 μL de BSA ou OVA à une concentration de 12,5 mg/mL sont ajoutés à 1,8 mL d'adjuvant incomplet de Freund, puis 200 μL de cette solution sont administrés aux rats. Le mélange préparé est injecté en intramusculaire au niveau de la patte du rat, à raison de 100 μL à chaque patte postérieure. A J45, les rats vigiles recevront une quatrième injection (3ème rappel), identique à la précédente (200 μL de BSA ou OVA en présence d'adjuvant incomplet de Freund en intramusculaire). A J60, les animaux sont anesthésiés par injection intra-péritonéale d'un mélange kétamine/xylazine (Imalgene 1000 100 mg/kg / xylazine 2% 10 mg/kg) et le sang est collecté au niveau l'aorte abdominale. Les animaux sont tués par exsanguination. Les injections, intramusculaires immunisantes ou intra-péritonéale anesthésiante, seront réalisées par deux techniciennes (une pour la contention, une pour l’injection) en moins d’une minute chacune afin de limiter le temps de contention et le stress de l’animal.
Impact sur les animaux
A priori, de par l’expérience que nous avons sur ce protocole d’immunisation, il ne semble pas y avoir de symptômes secondaires. Cependant, les animaux étant immunisés pourraient développer une fièvre qui pourrait temporairement les rendre moins vigilants et modifier leur comportement naturel de base (prise de nourriture, motricité, posture recluse).
Devenir
Mise à mort de la totalité des animaux par exsanguination par ponction aortique abdominale après anesthésie générale afin de prélever la totalité du sang pour obtenir du sérum en quantité suffisante pour l'ensemble des 80 étudiants en formation.
Remplacement
Le rat est utilisé afin d'avoir un prélèvement de sang total suffisant pour obtenir un volume de plasma en quantité suffisante pour couvrir les besoins en immunsérum pour les TP d’immunologie de 80 étudiants/an. L’utilisation de cet immunsérum en travaux pratiques d’immunologie permet en outre d'obtenir des informations lors de l'analyse des résultats que ne permettraient pas d'obtenir l'achat d'immunsérums commerciaux. Afin d’optimiser l’utilisation des animaux, des organes (prélèvement du foie pour les TP d’histologie) pourront être prélevés pour être utilisés dans d’autres travaux pratiques du BUT. De plus, la sous-traitance auprès d’un tiers implique un coût financier que nous ne pouvons inclure dans le fonctionnement des TP.
Réduction
Un nombre de 6 animaux toutes les deux années sera utilisé. Ce nombre est réparti de la façon suivante : lot BSA : 3 rats - lot OVA : 3 rats. Le nombre de 3 rats par lot ne peut pas être réduit davantage car cela permet d'obtenir suffisamment de volume de sang total et donc d’immunsérum pour tous les étudiants sur deux ans. De plus, cela permet aussi de participer au bien-être animal en recréant des conditions sociales favorables pour les 3 rats (diminution du phénomène dominant/dominé).
Raffinement
Bien-être animal : 3 rats par cage permet de limiter le phénomène dominant/dominé. Les animaux sont hébergés dans une animalerie contrôlée (température, ventilation, hygrométrie, photopériode) et dans le respect de la méthode des 3R, avec un enrichissement adapté à chaque espèce animale. Le milieu sera enrichi en objets permettant aux animaux de créer un environnement propice à leur développement et à leur épanouissement. Les soins sont apportés par du personnel qualifié (concepteur et applicateur des procédures expérimentales), dans le respect du bien-être animal. La nourriture est en quantité suffisante pour que les animaux aient un accès à volonté. Les cages à étage sont utilisées (en plexiglas et munies d’une grille dans sa partie supérieure) permettant une disponibilité à volonté des aliments (bouchons) et de l’eau de boisson ainsi qu'un épanouissement physique des rats. La surveillance quotidienne effectuée au sein de l’animalerie par le personnel qualifié, permettra de vérifier l'état sanitaire des animaux utilisés. En cas de douleur ou de fièvre suite à l'immunisation, on pourra administrer un antalgique antipyrétique type paracétamol (solution buvable) au rat pendant une durée de 3 jours à raison de 30 mg/kg/j. Si le Rat est toujours fiévreux au bout de 3 jours, un avis du vétérinaire référent sera demandé. Le vétérinaire décidera de la médication nécessaire à l’animal et de la suite à donner au protocole d’immunisation de cet animal (interruption définitive/poursuite).
Choix des espèces
Le rat est utilisé afin d'avoir un prélèvement de sang total suffisant pour obtenir un volume de plasma en quantité suffisante pour couvrir les besoins en immunsérum pour les TP d’immunologie de 80 étudiants/an. L’utilisation de cet immunsérum en travaux pratiques d’immunologie permet en outre d'obtenir des informations lors de l'analyse des résultats que ne permettraient pas d'obtenir l'achat d'immunsérums commerciaux. Rats adultes. Ce stade permet d'éviter toute perturbation associée au développement ou au vieillissement
Rôle de l’oxygène dans les mécanismes de régénération hépatique : étude de deux modèles d’occlusion veineuse du foie
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
61 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent sous anesthésie une chirurgie du ventre avec occlusion des veines du foie et prélèvement d'une partie de l'organe, puis quatre prélèvements de sang à la queue. Le porteur indique qu'une hémorragie, une insuffisance du foie ou une ouverture de la cicatrice sont possibles, et que les rats perdant plus de 20 % de leur poids seront mis à mort. L'ensemble de l'effectif est tué pour prélever le tissu du foie, le porteur revendiquant chez le rat un patrimoine génétique proche de l'humain et une taille facilitant la chirurgie des vaisseaux.
Objectifs
Le projet est intitulé « Rôle de l'oxygène dans les mécanismes de régénération hépatique : étude de deux modèles d'occlusion veineuse du foie ». Le foie est capable de se régénérer, c’est à dire de renouveler le volume et la fonction qu’il perd lorsqu’on enlève une quantité trop importante de foie. L’embolisation portale pré-opératoire (occlusion de la veine porte qui perfuse le foie) est la procédure la plus pratiquée pour faire grossir le foie avant une intervention au cours de laquelle une partie importante de foie doit être enlevée. La mortalité après l’intervention par dysfonction du foie est ainsi beaucoup diminuée en faisant compenser le foie, avant l’opération de résection hépatique. La technique de déprivation veineuse du foie : embolisation portale pré-opératoire et veineuse sushépatique du foie (occlusion de veines de drainages du foie) en un seul temps est une nouvelle procédure faisant augmenter le volume du foie, réalisée chez l’homme depuis peu, avec des résultats de l’ordre du double d’efficacité en deux fois moins de temps. Les mécanismes sous-jacents de ce gain d’augmentation de volume ne sont pas élucidés. Elle représente donc un nouveau modèle de compréhension d’une science du foie appelée régénération hépatique qui étudie la capacité du foie à renouveler son volume et sa fonction après agression. Cette science permet les avancées sur les traitements des maladies hépatiques. L'objectif principal du projet est de valider un modèle expérimental animal de déprivation veineuse du foie chez le rat. Le second objectif est de répondre à la question suivante : le niveau d’oxygène dans le foie après une procédure visant à faire augmenter le volume du foie prédit-il son efficacité à faire grossir le foie ?
Bénéfices attendus
Notre objectif est de développer un modèle expérimental fiable et exploitable de déprivation veineuse du foie afin d’étudier davantage cette technique prometteuse dont la pratique internationale est récente. En effet cette technique représente un nouveau modèle de compréhension de la régénération hépatique. Une fois validé, ce modèle pourra être exploité pour la compréhension d’autres phénomènes : immunitaires, tumoraux ou hémodynamiques par exemple. Ici, nous tentons d’investiguer le rôle que joue l'oxygène dans cette technique. Si le manque d'oxygène permet un gain de volume plus important que dans la technique classique alors nous pourrions cibler le manque d'oxygène comme une thérapie possible dans de multiples maladies du foie. La compréhension scientifique de la régénération hépatique permet d'avancer dans le domaine du traitement des maladies du foie, aigues ou chroniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois types de procédures sous anesthésie générale : - Ligature portale (40 minutes) : Occlusion de la veine de perfusion du foie (veine porte) et prélèvement d’une partie du foie (biopsie) par voie chirurgicale par une incision du ventre sous anesthésie générale suivi de l’administration systématique d’antidouleurs sur le site opératoire et par voie générale. - Déprivation veineuse (50 minutes) : Occlusion de la veine de perfusion du foie (veine porte), occlusion de la veine de drainage du foie (sushépatique) et prélèvement d’une partie du foie (biopsie) par voie chirurgicale par une incision du ventre sous anesthésie générale suivi de l’administration systématique d’antidouleurs sur le site opératoire et par voie générale. - Simulation occlusion (40 minutes) : Groupe contrôle servant de référence de comparaison : incision du ventre, simulation d’une occlusion de la veine porte du foie sans l’occlure, puis administration systématique d’antidouleurs sur le site opératoire et par voie générale. Les animaux subiront 4 prélèvements sanguins de 200 µL sur site de la queue : 1 prélèvement la veille de l’opération puis 1 prélèvement par jour les trois premiers jours pour l’analyse de la fonction hépatique ainsi que de la phosphorémie. Ils recevront peu avant le sacrifice, pour 44 animaux, après injection d’antidouleurs, une injection unique dans le ventre d’un produit révélant l’oxygénation des tissus nécessaires aux analyses réalisées Une imagerie de type scintigraphie (30 minutes) visant à évaluer l’oxygénation du foie sera réalisée sur 8 animaux. Une imagerie de scanner (20 minutes) nécessaire à l’analyse des volumes du foie sera réalisée sur 17 animaux.
Impact sur les animaux
La fiche d’évaluation clinique utilisée en routine au sein de notre institut de recherche a été adaptée aux procédures réalisées afin de pallier au mieux aux éventuels effets indésirables. 1) La douleur est la première nuisance possible aux animaux. 2) L’anxiété de l’animal sera diminuée grâce à l’aide d’un environnement enrichit en coton avec un abri. 4) Il est habituel de constater une perte de poids après embolisation portale de l’ordre de 5 à 10 % en 5 jours. Ce pour quoi la perte de poids < 20% ne constituera pas un point limite dans cette étude. Au-delà de 20% de perte de poids une mise à mort sera réalisée par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l’isoflurane. 5) Une hémorragie est possible après l’opération chirurgicale 6) Une insuffisance du foie est possible en tant que complication qui causerait une somnolence de l’animal et diminution de ses mouvements. 7) Des troubles de cicatrisation sont possibles en tant que complication. 8) Une extériorisation des organes du ventre par la cicatrice du ventre est possible en cas de lâchage de la suture de parois qui conduirait à une mise à mort de l’animal sous anesthésie générale.
Devenir
L’ensemble de l’effectif est destiné à être sacrifié afin de pouvoir prélever les échantillons de tissus hépatiques à analyser. Le prélèvement de tissus hépatique permet : - D’analyser la composition du foie en cellules immunitaires et cellules spécifiques du foie. - D’analyser l’oxygénation du tissu après occlusion d’une ou deux veines du foie afin de comprendre s’il existe un lien avec le gain d’augmentation du volume du foie dans la nouvelle procédure d’occlusion des deux veines du foie étudié dans ce projet. - L’analyse de données concernant les messagers envoyés par les cellules du foie pour recruter de nouvelles cellules et se reconstruire.
Remplacement
Les méthodes de culture in vitro ne peuvent simuler les effets mécaniques que sont la privation d’apports nutritifs sanguins veineux ainsi que l'oedème induit par l'occlusion de la veine de perfusion et de la veine de drainage du foie. Le processus d'augmentation de volume du foie s’appuie également sur des messagers qui ne dépendent pas que du foie, ainsi que sur une mécanique vasculaire de débit, de pression et de recrutement de cellules en provenance d'autres organes que le foie. L'analyse du foie et de son oxygénation après l'occlusion d'une ou deux veines du foie chez l'Homme nécessiterait de faire des prélèvements de foie de façon répétée au cours du temps, ce qui serait difficilement concevable car trop risqué pour la santé des patients. Le rat constitue une espèce animale dont le génome est le plus proche de l’être humain, largement étudié en science du foie et dont la taille, plus importante que celle de la souris, permet la réalisation de contrôles des vaisseaux du foie et notamment des veines de drainage .
Réduction
Dans une logique de réduction, le nombre de sujets nécessaire par groupe est calculé selon la bilbiographie dans laquelle des résultats significatifs peuvent être mis en évidence avec des effectifs de 5 rats par groupe en considérant une mortalité post-opératoire d'environ 10%. Le nombre d’animaux nécessaire pour notre étude est de 61. Nous réaliserons dans un premier temps, une étude de l'oxygénation du foie par une méthode non invasive de scintigraphie afin de déterminer quel est le moment où la baisse d'oxygène dans le foie est la plus importante.
Raffinement
Pour tenir compte des contraintes liées à la chirurgie, les animaux pourront être hébergés à raison de deux rats par cage. L’environnement du rongeur sera enrichi avec du coton, un abri et un accès illimité à la nourriture et l’eau. L'alimentation sera enrichie en protéines pour limiter l'impact de l'intervention et limiter une perte de poids. La température de la pièce sera contrôlée à 22°C avec un rythme jour nuit de 12h/12h et contrôle du taux d'humidité. Les procédures ne débuteront que 7 jours après réception des animaux pour permettre leur acclimatation à leur nouvel environnement. Le rythme circadien des rongeurs sera respecté et les procédures réalisées à heures fixes. Les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane). Une injection d'anti-douleurs morphiniques (buprénorphine) sera réalisée par voie sous-cutanée 0.05 mg/kg lors de l'anesthésie puis toutes les douze heures pendant les 2 premiers jours puis adaptée en période post-procédure. Une injection d'anesthésique local sous-cutanée sera également réalisée en fin de procédure. Si la douleur n'est pas soulagée par la prise de mesures antalgiques, une mise à mort sera envisagée pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Nous avons choisi, conformément à la littérature, d’étudier les rats mâles adultes car ils ne sont pas soumis aux variations hormonales des animaux en croissance ce qui pourrait interférer avec l'augmentation du volume du foie, du fait de stades de développement différents ou de vitesses de croissance différentes d’un animal à l’autre et d’un nuage hormonal complexe. Les rats possèdent un patrimoine génétique très proche de l’espèce humaine tout en conservant une taille supérieure à la souris, ce qui augmente la faisabilité de la dissection des vaisseaux sushépatiques.
Ciblage spécifique de cellules de la rétine à l’aide du système CRISPR Cas9 et évaluation d’une immunité dirigée contre la protéine Cas9 pour la maladie de Stargardt.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
142 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 132 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections sous la rétine ou dans le vitré des deux yeux sous anesthésie, une imagerie rétinienne répétée et des prélèvements sanguins, avant une ponction intracardiaque terminale, pour tester une édition génique CRISPR-Cas9 contre la maladie de Stargardt. Le porteur indique aussi que le projet sert à mettre au point des gestes techniques et à valider les compétences des personnels. Il affirme qu'il est impossible de reconstituer la rétine in vitro.
Objectifs
Parmi les vecteurs viraux, ceux qui dérivent du parvovirus humain Adéno-Associé (AAV) sont aujourd’hui considérés comme les plates-formes les plus performantes pour le traitement par thérapie génique des maladies génétiques. Parmi les différents sérotypes d’AAV connu, le sérotype AAV2/8 avec les ITRs d’AAV2 encapsidés dans la capside d’AAV8 montre une grande efficacité en termes de tropisme et de niveau d’expression dans les photorécepteurs de la rétine. Par ailleurs, les vecteurs AAV pouvant donner lieu à une réponse immunitaire suite à une pré-exposition au virus, nous souhaitons également tester les nanoparticules lipidiques (LNP) afin de délivrer la nucléase Cas9. L’objectif de ce projet repose sur le potentiel d’une stratégie d’édition génique en ciblant l’intégration d’un minigène correctif dans un site de coupure d’ADN double-brin induit par la nucléase Cas9. Ce minigène permet la correction des mutations du gène ABCA4 qui impactent le fonctionnement de la protéine ABCA4, transporteur essentiel pour le métabolisme des rétinoïdes dans les photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. Avec une preuve de concept déjà établie in vitro et avec des résultats préliminaires in vivo, la valeur thérapeutique de cette approche est réalisable. L’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. Pour cela, les praticiens et concepteurs en recherche sur la cécité doivent acquérir les compétences nécessaires à la réalisation de leurs projets de recherche impliquant des animaux selon la Directive Européenne (arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques). C’est dans ce cadre que nous souhaitons mettre au point les techniques d’injections sous rétinienne et intravitréenne sur le modèle rat. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce.
Bénéfices attendus
L’immunogénicité de la protéine Cas9 a été décrite dans quelques études. Il est cependant à noter qu’en transfert de gène, plusieurs facteurs peuvent influencer l’initiation d’une réponse immune ; parmi eux, la dose de vecteur, la nature du transgène ou encore la voie d’administration. Dans cette étude, le but est d’étudier la présence d’une réponse immune après transfert de gène dans l’œil qui est un site décrit comme immunoprivilégié et ce, à une dose cliniquement pertinente. Concernant la détection d’une réponse immune dirigée contre la protéine Cas9, les techniques d’analyse décrites dans la littérature ne sont pas standardisées et aucun kit n’est, à ce jour, commercialisé. Notre étude permettra d’établir un protocole adéquat pour la détection de la réponse immune anti-Cas9. De plus, l’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. L’évaluation in vivo de notre stratégie d’édition génique nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. En effet, l’utilisation d’un minigène codant plusieurs exons à la fois, si efficace, permettra de corriger une large partie du gène, ce qui sera utile pour de nombreux patients, même avec des mutations différentes. Enfin si notre approche se révèle efficace, elle pourrait être utilisée pour soigner les pathologies liées à d’autres gènes de la famille ABCA.
Procédures
Phases 1 et 2 : (i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 à 3 µL injectés dans les 2 yeux des animaux, durée de la chirurgie 30 minutes maximum. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis une fois par mois, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’examen 20 minutes maximum. (iii) Imagerie rétinienne (ERG) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis avant l’euthanasie de l’animal, soit 2 fois au total. Durée de l’examen 30 minutes maximum. (iv) Prélèvements sanguins (Phase 2) : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. En pré-injection puis toutes les deux semaines post-injection, soit au maximum 7 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. Phase 3 (v) Injection sous cutanée de 50μg de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund : Geste réalisé sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vi) Injections en intramusculaire : 1 semaine après l’injection SC. Geste réalisé sous anesthésie générale, 200μL de vecteur en 4 sites d’injection, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vii) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. En pré-injection SC, soit une fois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. (viii) Ponction intracardiaque terminale : Geste réalisé sous anesthésie générale avec renforcement analgésique. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
(i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : A ce jour, l’administration sous rétinienne de vecteurs AAV chez le rat n’a pas d’effet délétère notable sur la morphologie et la fonction rétinienne ni sur l’état de santé général de l’animal. Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection. Une pommade ophtalmique composée de dexaméthasone et d’oxytétracycline est appliquée à la suite de l’intervention pour minimiser l’irritation de la cornée. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT et ERG) : Aucune douleur n’est attendue lors des examens d’imagerie (non invasifs). En effet, afin que l’animal soit immobilisé, cet examen est fait sous anesthésie générale n’entrainant pas de stress ou de douleur que pourrait entrainer une contention physique de l’animal et permettant ainsi d'assurer une qualité optimale d'acquisition des images. (iii) Prélèvements sanguins : un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. (iv) Injection sous cutanée de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund et injections en intramusculaire : afin de limiter le stress de ces injections et que l’asepsie soit optimale, ces gestes seront réalisés sous anesthésie général de l’animal. Aucune douleur n’est attendue suite à ces injections. (v) Ponction intracardiaque terminale : Une ponction intracardiaque terminale sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux. De plus, les anesthésies répétées seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur, la récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie gazeuse ou recevront un réversif pour accélérer le réveil et la récupération de l’animal.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.
Remplacement
La rétine est une structure complexe composée de multiples couches de neurones et de cellules nourricières. Il n’est pas possible de reconstituer parfaitement cet organe complexe in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la physiopathologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire, nous utiliserons au maximum des animaux de réforme pour la phase 1. Nous avons calculé nos estimations sur les séances précédentes d’injections sous rétiniennes. D'après une revue des publications d'études similaires ainsi que l’expérience du laboratoire notamment sur la reproductibilité des ERG, 8 animaux par groupe seront suffisants pour réaliser des analyses statistiques pertinentes (comparaison des groupes à l’aide d’un test non paramétrique ‘one-way ANOVA’). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales. Nous ne pouvons pas raisonnablement supposer que les données seront normalement distribuées, par conséquent, nous pensons essentiellement utiliser des tests statistiques de type Mann-Whitney U pour analyser les données générées par l’expérience. Pour réduire le nombre d’animaux au minimum nous avons mis en place des mesures pour limiter la variabilité des données, y compris l’effet de la lumière. La luminosité est normalisée entre toutes les cages (mesurée par luxmètre chaque semaine). La détermination du nombre d’animaux pour l’évaluation de l’immunogénicité de Cas9 a été réalisée par approche statistique et sur la base de l'expérience d'études similaires en thérapie génique des maladies de la vision. Une analyse de puissance été effectuée avec le logiciel R et le package pwr en utilisant l'écart-type que nous observons dans les mesures d’ERG chez nos rats WT. De là, nous avons sélectionné une taille d’échantillon n=8 animaux/lot comme maximum.
Raffinement
Les études antérieures de notre équipe ont été faites sur d’autres modèles pour des études précliniques. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce. Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une euthanasie
Choix des espèces
Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt : la lignée, issue de rats Sprague Dawley, que nous utilisons ici, a été créée par la technologie de CRISPR/Cas9. Cette technologie nous a permis de produire, lors du même projet de transgénèse, des rats « knock-out » pour ABCR4 (ABCR-/-). Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. L'augmentation du niveau de bis-rétinoïdes est mis en évidence dès l'âge de 3 mois et augmente avec l'âge comme le montrent nos résultats préliminaires par HPLC et spectrométrie de masse. Il semble donc pertinent de commencer le traitement entre l'âge de 2 et 3 mois : à cet âge le risque de décollement de la rétine est faible et on se situe dans la fenêtre thérapeutique. Pour l’évaluation de la réponse immunitaire, nous souhaitons évaluer celle-ci sur des animaux ayant un système immunitaire mature, donc sur des rats adultes de 3 mois.
Travaux Pratiques d’introduction à l’expérimentation animale et de physiologie animale
- Enseignement supérieur
Rats : 140
70 souris et 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, les souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et les rats dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Les souris servent à des étudiants pour apprendre la contention et une injection de sérum physiologique, les rats sont opérés sous anesthésie avec pose d'une canule dans la trachée et de cathéters dans la jugulaire et la vessie, pour des mesures de ventilation et de diurèse. Le porteur indique que le règlement de l'animalerie interdit toute réintroduction et que les corps sont congelés pour des travaux pratiques de dissection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive satisfaisante ne remplace ces séances.
Objectifs
Dans le cadre de notre formation universitaire, régi par un programme pédagogique national, nos étudiants sont amenés à "mettre en oeuvre les techniques d'expérimentation animale pour mieux comprendre le fonctionnement, la physiologie des systèmes/appareils des organismes animaux. Ils doivent ainsi acquérir les compétences suivantes: 1) Manipuler les animaux de laboratoire; 2) Respecter la réglementation, les règles de la bioéthique; 3) Maîtriser les techniques liées à l’expérimentation animale utilisées en physiologie animale. Ces compétences de base doivent leur permettre ensuite de mettre en œuvre les techniques d'expérimentation animale pour des études de toxicologie, de pharmaco-cinétique, ou encore des études du métabolisme.
Bénéfices attendus
Ces TP sont extrêmement importants dans le cursus de ces étudiants. La formation doit les amener à être directement opérationnels en laboratoire de recherche. Cette première approche permet ainsi de les confronter à la réalité de l’expérimentation animale, et de les sensibiliser au respect absolu de la réglementation, en particulier aux procédures de raffinement. Ils permettent de lever l’appréhension d’un certain nombre d’étudiants et de les conforter ou non dans leur désir de travailler sur l’animal et de s’engager dans cette démarche. Le 1er TP d'introduction au semestre 1 (sur la souris) leur permet d’aborder plus sereinement les TP de physiologie (sur le rat) qui ont lieu au semestre 2. Le résultat pédagogique est extrêmement satisfaisant, car les étudiants sont extrêmement impliqués et se montrent transformés (positivement) entre le début et la fin des TP. Les TP du semestre 2 représentent une réelle "plus value" pour nos étudiants qui peuvent être amenés à manipuler des animaux dans leurs fonctions ultérieures. Le retour des étudiants est unanime.
Procédures
Dans le cadre du TP d'introduction à l'expérimentation animale, les souris seront manipulées par les étudiants dans un premier temps pour se familiariser avec l'animal de laboratoire (30 minutes à 1 heure), puis pour apprendre la contention de base (1 heure à 1h30), mais également pour réaliser une injection sous cutannée ou intrapéritonéale de sérum physiologique (30 minutes). Dans le cadre des TP de physiologie animale, les rats seront manipulés selon une procédure d'anesthésie sans réveil. Différentes procédures seront menées sur ces animaux : pose d'une canule dans la trachée (30 minutes), pose d'un cathéter dans la veine jugulaire (1 heure), et pose d'un cathéter dans la vessie (30 minutes). Concernant le TP sur la ventilation, le protocole de mesure de la ventilation est ensuite estimé à environ 20 minutes maximum. Concernant le TP sur la diurèse et la pression artérielle, le protocole de mesure est ensuite estimé à environ 1 heure maximum. Dans tous les cas, aucun prélèvement ne sera effectué.
Impact sur les animaux
Concernant le TP d'introduction, hormis un stress lié à la manipulation des souris pour l'apprentissage de la contention, aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu. Concernant les TP de physiologie, la buprénorphine peut entrainer une faible dépression cardio-vasculaire.
Devenir
Le règlement de l’animalerie interdisant la ré-introduction d’animaux après expérimentation, tous les animaux sont euthanasiés (dose létale de pentobarbital) à l'issue des TP. Une fois euthanasiés, les animaux sont congelés et utilisés ultérieurement pour des TP d’anatomie/dissection.
Remplacement
Il n’existe actuellement aucune méthode substitutive satisfaisante qui permettrait le remplacement de ces séances telles qu’elles ont été conçues pour préparer les étudiants à la réalité des procédures en laboratoire de recherche et au respect de la règle des 3R.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernés pour l’ensemble des cinq années et 28 étudiants pas promotion (partagés en 2 groupes de 14 étudiants) est de 210, dont 70 souris et 140 rats. En effet, dans le cadre du TP d’introduction, chaque année, 14 souris seront utilisées (une souris par étudiant), les souris du groupe du matin étant ré-utilisées pour le groupe de l’après-midi. Afin de réduire le nombre de rats (28/an contre 42/an précédemment), nous avons décidé de supprimer une séance de TP par rapport aux années précédentes. La saisine actuelle ne comprend par conséquent que 2 protocoles expérimentaux sur les rats, contre 3 les années précédentes. Ainsi, sur 5 ans, 70 rats de moins seront utilisés dans le cadre de cette formation. Par ailleurs, les animaux euthanasiés seront congelés et utilisés pour des TP d’anatomie/dissection.
Raffinement
La formation ne dispose pas d’animalerie. Nous utilisons donc l’animalerie de l’UFR dédiée à la recherche qui existe sur le site. Les animaux sont réceptionnés au minimum 5 jours avant chaque TP. Les animaux sont stabulés dans des cages ayant une surface de 410 cm2 et une hauteur de 12cm (souris) ou ayant une surface de 820 cm2 et une hauteur de 15cm (rats) contenant de la litière mélangée à du coton. Des "maisons dômes" en carton et des tunnels en plexiglass rouge sont ajoutés aux cages des souris et des rats, respectivement. Une surveillance quotidienne est effectuée par le personnel de l'animalerie. Il y a 4 souris ou 2 rats par cage, la température de l'animalerie est de 21°C +/- 2, la nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Une alternance jour/nuit de 12h est respectée. Dans le cadre des TP d’introduction/contention, chaque étudiant est invité à faire une démonstration de contention à l’enseignant. Si l’enseignant estime la contention réalisée correctement, il invite ensuite l'étudiant (uniquement dans le cadre du volontariat) à pratiquer une injection de sérum physiologique par voie sous-cutanée ou par voie intrapéritonéale sous le contrôle exclusif de l’enseignant habilité et formé aux gestes garantissant le bien-être des animaux. Dans le cadre des TP de physiologie animale, les rats seront anesthésiés avant l'arrivée des étudiants selon un protocole mis au point avec l'aide d'un vétérinaire. Une prémédication permet de réduire la dose du mélange anesthésique administré, mais aussi de rendre l’anesthésie plus facile et surtout permet une analgésie plus efficace, plus profonde, et plus longue. Au cours de la séance, si le rat montre des signes de réveil, l'injection d'une dose supplémentaire d'anesthésiant sera pratiquée par les enseignants.
Choix des espèces
Le rat et la souris seront utilisés lors des séances de travaux pratiques. Ces deux espèces mammifères ont une physiologie assez proche de l’homme. La souris sera utilisée pour les travaux pratiques sur l’apprentissage de la contention car c’est un petit animal facile à appréhender pour des étudiants n’ayant pas l’habitude de manipuler les animaux. Par ailleurs, nous avons choisi de réaliser ce TP avec des souris de souche OF1 ou Swiss réputées calmes et non agressives. Pour les autres TP le rat sera utilisé car il y aura nécessité de réaliser des procédures au niveau des abords veineux et la taille du rat est mieux adaptée. Les animaux ne sont pas identifiés. Ils seront utilisés à maturité sexuelle afin de ne pas avoir des animaux trop petits et faciliter les expériences. Les rats utilisés ne proviennent pas de notre animalerie qui n'est pas une animalerie d'élevage. Il s'agit d'anciens mâles reproducteurs (animaux de réforme). Concernant les souris, nous ne sommes pas en mesure d'utiliser des souris de réforme de notre animalerie pour plusieurs raisons. En premier lieu, l'animalerie n'est pas une animalerie d'élevage et n'est donc pas en mesure de fournir 14 souris de réforme à une date précise. Le responsable de l'animalerie pourra le confirmer. Par ailleurs, la quasi totalité des souris de l'animalerie sont de la souche B6, connue pour être nerveuse et agressive, ce qui n'est pas idéal pour un TP d'initiation à l'expérimentation animale, à la contention.
Développement d’un pancréas bioartificiel : validation de matrices d’encapsulation d’îlots pancréatiques de rats et humains.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 791 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 008 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 783 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est induit par injection de streptozotocine, suivi de chirurgies abdominales pour prélever le pancréas ou implanter des modules d'encapsulation d'îlots, avec un suivi de 91 jours et des tests répétés de tolérance au glucose. Le porteur indique qu'une dégradation rapide de l'état des rats diabétiques peut survenir malgré l'insuline, ceux perdant plus de 20 % de leur poids étant mis à mort. Il affirme le recours aux animaux "indispensable" pour évaluer le biomatériau.
Objectifs
La transplantation d’îlots pancréatiques est une thérapie prometteuse du diabète de type 1. Celle-ci vise à remplacer les cellules béta pancréatiques (sécrétrices d’insuline) défectueuses par l’injection d’îlots sains (issus de dons multi-organe) par voie intra-portale dans le foie de patients diabétiques. Cette stratégie thérapeutique qui permet une régulation glycémique plus physiologique et moins contraignante que les injections pluriquotidiennes d’insuline.
Bénéfices attendus
La transplantation d’îlots pancréatiques comporte de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Ainsi, l’encapsulation d’îlots pancréatiques permettrait de protéger leur destruction par les réactions inflammatoires et de rejet. De plus, au vu de la pénurie d’organe inhérent à toute greffe d’organe, l’encapsulation permettrait d’utiliser des îlots pancréatiques d’espèces différentes. Par ailleurs, l’implantation de d’îlots encapsulés dans l’omentum permet de se soustraire de ces réactions inflammatoires médiées par le sang à l’origine d’une destruction massive des îlots post transplantation. Ainsi, notre stratégie permettrait de maintenir à long terme la survie et la fonction des îlots et d’appliquer la stratégie de transplantation d’îlots pancréatiques à un plus grand nombre de patients diabétiques.
Procédures
- Procédure 1 : L’injection de streptozotocine se fera en intra péritonéale à l’aide d’une aiguille 23G. L’injection réalisée sur animal vigile par une seule injection et l’intervention (et la contention) durera quelques secondes. Chez les rats devenus diabétiques, mise d’implants à insuline afin de permettre un maintien à l’équilibre de la quantité de sucre dans le sang (glycémie) et de prendre du poids (nécessaire à la transplantation des îlots). Procédure réalisée sous anesthésie générale d’environ 10 minute. Une mesure de glycémie quotidienne avec un glucomètre à partir d’une micro goutte de sang prise à la queue pour vérifier l’efficacité de notre insulino-thérapie. - Procédure 2 : Isolement d’îlots de rat qui seront inclus dans nos hydrogels. Pour le prélèvement du pancréas, une laparotomie abdominale et une cathétérisation du canal cholédoque seront réalisé sous anesthésie générale. Après quoi l’animal est euthanasié puis le pancréas prélevé (procédure sans réveil). - Procédure 3 : L’implantation des modules d’encapsulation dans l’omentum des rats se fera après incision de l’abdomen (2 cm). Chirurgie réalisée sous anesthésie générale d’une durée d’environ 15 minutes. Des anti-inflammatoires seront administrés post-chirurgie pendant 3 jours. Concernant le suivi de la survie et de la fonction des îlots implantés, celui-ci durera 91 jours. Pour cela, quotidiennement la prise de poids et la glycémie capillaire (lecteur de glycémie) seront mesurées. Hebdomadairement, une prise de sang sera effectuée pour la réalisation de divers dosage plasmatique (marqueurs de fonction de la greffe, marqueurs de l'inflammation...). Une fois par mois un test de tolérance au glucose sera réalisé. Ce test est nécessaire afin de déterminer la fonction réelle de la greffe. Ce test durera deux heures et consistera à injecter dans le péritoine une solution sucré en utilisant une aiguille 23G et de mesurer la glycémie capilaire à l’aide d’un lecteur de glycémie toutes les 5, 10, 15, 30, 45, 60 et 120 min post injection du sucre. Avant le test, les animaux seront mis à jeun 6h (accès à l'eau ad libitum). Une prise de sang de 200 μL(incision de l'extrémité de la queue) et une mesure de la glycémie seront effectuées à jeun juste avant l'injection intraéritonéale du glucose.
Impact sur les animaux
Suite à la procédure d’induction du diabète et/ou la perte progressive de la fonction du greffon, une dégradation rapide de l’état sanitaire des animaux diabétiques pourrait survenir malgré l’administration d’insuline et la transplantation des îlots. Cela pourrait se manifester par une diminution marquée de l’activité ou à l’inverse une hyperactivité, une diminution du toilettage, une perte de poids rapide supérieure à 20%, une polyurie, des hyper et hypoglycémies. Néanmoins, l’insulino-thérapie et la greffe d’îlots devraient empécher cela. Si aucune
Devenir
- Procédure 1 : « Induction du diabète par injection intra-péritonéale de Streptozotocine et mise de pompe à insuline en sous-cutanée. » Les rats devenus diabétiques poursuivent l’étude et seront utilisés dans la procédure 3. Les rats non devenus diabétiques seront euthanasiés selon la méthode décrite au 3.3.3 (« euthanasie sans préservation de sérothèque et tissuthèque (atteinte du point limite) »). - Procédure 2 : « Isolement d’îlots pancréatiques de Rat. » L’ensemble des animaux de la procédure seront euthanasiés selon la méthode décrite au 3.3.3 (« Prélèvement pancréas »). - Procédure 3 : « Implantation intra-omental des hydrogels + îlots et suivi métabolique des rats par mesure glycémique, par évaluation de la prise de poids, par tests de tolérance au glucose (IPGTT) et dosage plasmatique de biomarqueurs. » A la fin de cette procédure tous les rats seront euthanasiés selon la méthode décrite au 3.3.3 (« euthanasie sans préservation de sérothèque et tissuthèque (atteinte du point limite) ») car il s’agira de la fin de l’étude. Nous pourrons ainsi prélever le sang total pour réaliser des dosages plasmiques de marqueurs de survie et de fonction du greffon, de paramètre statuant sur la régulation de la glycémie, sur l’état inflammatoire etc… Nous prélèverons les modules d’encapsulation pour analyse (histologique ...). Enfin, nous prélèverons également les organes impliqués dans la régulation de la glycémie et impactés par le diabète afin de faire des analyses histologiqsues, de protéomique et de génomique.
Remplacement
L'étude consiste à déterminer l’efficacité de biomatériaux sur la fonction du greffon chez un sujet diabétique, ainsi, le recours à des animaux est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. Cette étude nécessitera 1791 rats.
Raffinement
Le respect du principe de raffinement intervient en premier lieu au niveau des conditions d’hébergement : les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, bénéficieront de conditions de température et d’hygrométrie régulées et conformes aux règles en vigueur, ainsi que de cages enrichies à l’aide de cylindres en PVC rouges. Les rats sont placés dans des cages de 1500cm², en fonction de leur poids (jusqu’à 200 g ils sont 6 par cage), entre 200 et 300 g ils sont 5 et ensuite un rat est enlevé par tranche de 100g). Nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes de préanesthésie, d’anesthésie et de prise en charge post-opératoire. Enfin, des points limites prédictifs et précoces ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le Rat est la principale espèce utilisée dans de nombreuses d’études sur le diabète. En effet, lors de l’induction ou l’apparition du diabète, les rats diabétiques partagent des caractéristiques similaires à la physiopathologie du diabète chez l’Homme, notamment une glycémie à jeun supérieur à 1,26 g/L et des taux d’HbA1c (reflet de l’équilibre glycémique sur les semaines antérieures) comparables. Les rats employés pour ces études sont de souche Lewis, souche consanguine provenant d'un élevage agréé. Ils ont été préférés aux souris à cause de leur taille qui permet une aisance de manipulations, facilite les interventions chirurgicales, et permet une étude à plus long terme (environ deux mois dans de bonnes conditions par rapport à leur état diabétique). Les rats pour cette étude seront uniquement utilisés à un stade jeune adulte (Age : 8 semaines) possédant un système immunitaire. De plus, à ce stade de développement, les animaux présentent un poids idéal pour réaliser les isolements. En effet, c’est à partir de cet âge que le canal cholédoque possède une taille suffisamment grande pour réaliser facilement la cathéterisation permettant l’injection de l’enzyme utilisée pour la digestion du pancréas. Cela permettra d’obtenir un rendement d’isolement optimal.
Pharmacologie : Etude de deux composés anti-obésité en développement chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
6 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une semaine d'habituation, ils reçoivent des composés par voie orale puis subissent des prélèvements sanguins rapprochés jusqu'à 24 heures par la veine caudale, avant euthanasie au pentobarbital. L'étude, commanditée par une société cliente, vise à caractériser deux candidats médicaments anti-obésité avant essais cliniques. Le porteur indique que la répétition des prélèvements est source de stress et d'angoisse, et justifie le choix du rat par un volume sanguin supérieur à celui de la souris.
Objectifs
Le projet vise à étudier deux composés en développement chez le rat sain. L'objectif est de sécuriser le développement de composés d'intérêt thérapeutique avant leur passage sur l'animal pathologique et avant le stade d'études cliniques. Cette étude est commanditée par une de nos sociétés clientes, dans le cadre de la recherche de l’efficacité de leurs composés dans ce domaine d’application.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de préciser les paramètres pharmacocinétiques des composés en développement. Ainsi, les paramètres d'absorption, de distribution et d'élimination seront déterminés. Il s'agit ici de sécuriser le développement d'un candidat médicament anti-obésité, notamment en priorisant les composés les plus prometteurs avant passage aux études d'efficacité et aux études clinique. Les données obtenues permettront également de définir les doses a utiliser dans la suite des études.
Procédures
Pendant 7 jours (de D-7 à D-1), les animaux seront soumis à des administrations du véhicule (composé de référence) per os quotidiennement dans le but de les habituer à ce type d'administration. A D1, des prélèvements sanguins de 150µL par la veine caudale seront effectuées avant l'administration per os puis à 15min, 30min, 1h, 3h1 8h et 24h après.
Impact sur les animaux
La répétition rapprochée de certains prélèvements sanguins sera la source de stress et d'angoisse de l'animal même si l'animal aura été préalablement habitué au tube de contention. Aucune nuisance n'est attendu sur l'administration des composés et les animaux ayant subi une phase d'habituation seront donc acclimatés à l'administration par voie orale et au tube de contention pour prélèvement sanguin.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par injection intraperitonéale de solution de pentobarbital (Euthasol, 250mg/kg)
Remplacement
L'utilisation d'animaux à des fins scientifiques se justifie ici car pour étudier l'effet de l'organisme sur le composé à visée thérapeutique, il est nécessaire d'utiliser un modèle vivant. Nous avons choisi le rat comme modèle animal car il s'agît d'un modèle bien documenté dans la littérature scientifique, qui nous permet de récolter un volume sanguin plus important que chez la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de déterminer ce que l'organisme fait au médicament et donc les paramètres d'absorption, de distribution et d'élimination. Nous avons choisi le rat comme modèle animal car il s'agît d'un modèle bien documenté dans la littérature scientifique, qui nous permet de récolter un volume sanguin plus important que chez la souris. Ainsi, le nombre d'animaux utilisé a donc été réduit en comparaison avec la souris.
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les phases d'acclimatation (de D-12 à D-8) et d'habituation (de D-7 à D-1) permettent d'éviter tout angoisse de l'animal pendant la phase d'expérimentation. Les rats seront hébergés en cages individuelles et un enrichissement du milieu sera assuré par l'ajout de tubes en carton et de briquettes. Les expérimentateurs en charge des administrations orales et des prélèvements sanguins sont rodés à ce type de pratique.
Choix des espèces
Nous avons choisi le rat comme modèle animal car il s'agît d'un modèle bien documenté dans la littérature scientifique, qui nous permet de récolter un volume sanguin plus important que chez la souris. Ce modèle a été validé avec le client et le chef de projet. Les animaux utilisés sont de jeunes rats adultes (201-225g à réception correspond environ 7-8 semaines). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine qui sera ciblée par les composés à tester, à savoir une population adulte.
Etude de l’effet de biothérapies ciblant l’interleukine-4 (IL-4), l’IL-13, les IgE ou les mastocytes sur les défenses antiparasitaires
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rats : 416
416 rats et 444 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue par exposition au CO2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats sont infectés par le parasite S. ratti pour entretenir la lignée parasitaire, les souris vaccinées jusqu'à quatre fois puis infectées à deux reprises, avec trois prélèvements sanguins. Le projet teste si des biothérapies anti-allergiques nuisent aux défenses contre les vers parasitaires. Le porteur affirme que cette immunité complexe ne peut être reproduite in vitro et que le maintien du parasite impose le recours aux rats.
Objectifs
Les infections par les vers parasitaires touchent actuellement près de 1/4 de la population mondiale. A l’heure actuelle, les mécanismes innés et adaptatifs de défense contre ces parasites ne sont pas complètement compris. L’immunité « de type 2 » impliquant les IgE, les cytokines IL-4 et IL-13 et les mastocytes joue un rôle très important dans les pathologies allergiques. De ce fait, de nombreuses biothérapies développées actuellement pour traiter les allergies ciblent cette immunité de type 2. Cependant, les mêmes acteurs cellulaires et moléculaires sont également impliqués dans la défense contre certains parasites. Il est donc très important de tester l’effet de ces nouvelles biothérapies anti-allergiques sur les réponses contre des parasites, afin de s’assurer de la sureté de ces approches.
Bénéfices attendus
L'immunité adaptative (principalement la réponse anticorps) joue un rôle fondamental lors d’une réinfection avec le même parasite. Les mastocytes jouent un rôle important lors des infections primaires et secondaires, permettant l’expulsion des parasites. Cependant, les sous-populations de mastocytes (connectifs versus mucosaux) et les mécanismes permettant aux mastocytes de jouer ce rôle de défense ne sont pas bien connus. Notre laboratoire développe des stratégies vaccinales et des biothérapies pour le traitement de l’asthme et des allergies, ciblant principalement les cytokines de type 2 (IL-4 et IL-13), les IgE et les mastocytes. Il est très important de vérifier que ces biothérapies n’auront qu’un effet limité sur les défenses anti-parasitaires afin de s’assurer de la sureté de ces nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
Un total de 416 rats sera infecté en sous-cutané avec le parasite S. ratti afin de collecter des larves dans leurs fèces. Les rats seront mis à mort par exposition au CO2 après 9 jours au plus tard (procédure 1). Un total de 192 souris sera immunisé un maximum de 4 fois aux jours 0, 7, 28 et 49 en intramusculaire dans la cuisse arrière avec une formulation de vaccin dirigé contre l’IL-4, l’IL-13 ou les IgE dans un volume de 50 µL (procédure 2). Un total de 96 souris sera injecté en intrapéritonéal deux fois par semaine pendant 3 semaines (6 injections au total) avec un conjugué SCF-doxorubicine (10mg/kg maximum dans 200 µL de PBS) (procédure 3). A l’issue des procédures 2 et 3, l’ensemble des souris ainsi que 156 souris additionnelles (soit un total de 444 souris) seront ensuite injectées en sous-cutané avec des larves de parasite S. ratti pour un total de deux fois à 28 jours d’intervalle. Nous réaliserons trois prélèvements sanguins à la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%) aux jours 0, 7 et 21 (procédure 4).
Impact sur les animaux
D’après les données de la littérature et notre expérience antérieure avec ce modèle, l’infection avec le parasite S. ratti n’induit pas de signes visibles de douleur ou de comportement anormal chez les animaux.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort par exposition au CO2. L’ensemble des animaux des procédures 2 et 3 seront utilisés dans la procédure 4. Et à l’issue de la procédure 4, l’ensemble des animaux sera mis à mort par exposition au CO2.
Remplacement
Les mécanismes de défense contre les nématodes (parasites) sont complexes et nécessitent l’action concertée de plusieurs types de cellules immunitaires et d'anticorps. Ceci ne peut être reproduit in vitro. De plus, le maintien de ces nématodes ne peut être fait in vitro et nécessite donc l’utilisation de rats pour maintenir la lignée parasitaire.
Réduction
L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permettent d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 4 animaux par groupe de même âge et sexe pour chaque expérience. Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. Les tests statistiques seront effectués avec le logiciel Graph-Pad Prism. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs nous choisirons un des tests statistiques suivants : 1- way ou 2-way ANOVA, Mann-Whitney ou unpaired 2-tailed Student’s t test ; nous considèreront une valeur de P significative si elle est inférieure à 0.05.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux. Ce suivi permet d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (4 à 5 animaux par cage, pas d’isolement ni de changement de cage). De plus, un enrichissement sera rajouté aux animaux (carrés de coton pur ou du papier absorbant) permettant aux animaux de faire une nidation, selon la directive européenne 2010/63/UE. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Enfin, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sous un fond génétique bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Les rats Wistar sont utilisés pour la conservation de la souche S.ratti. Comme le rat est l’hôte naturel de S.ratti, les rats de Wistar permettent d’obtenir facilement la quantité de vers nécessaires pour les expériences qui seront réalisées chez la souris. Pour la majorité des expériences, les souris seront utilisées entre 8 et 12 semaines, ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les animaux seront utilisés à 6 semaines uniquement pour les procédures 2 et 3 (vaccination anti-IL4, anti-IL13 ou anti-IgE et déplétion des mastocytes).
Etude de l’impact d’un régime riche en gras et en sucre sur des rats à des fins d’enseignement en travaux pratiques.
- Enseignement supérieur
24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent pendant huit semaines un régime riche en gras et en sucre pour induire un surpoids, sont mis à jeun, anesthésiés puis tués afin de prélever sang et organes pour des travaux pratiques d'étudiants. Le porteur qualifie l'expérience de peu douloureuse et affirme que la simulation n'est pas une alternative efficace pour la formation. Il revendique la "nécessité" de l'expérimentation animale en recherche.
Objectifs
Le projet consiste à faire prendre du poids à des rats en leur donnant plus de sucre et de gras qu'ils n'en ont besoin pour vivre, afin de mimer ce qu'on observe dans l'obésité chez l'homme. Le poids des rats est suivi chaque semaine le temps de l'expérimentation. Les effets du surpoids sur le métabolisme de ces rats seront étudiés par des étudiants grâce à des analyses biochimiques lors de leurs travaux pratiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet d'expérimentation animale sont multiples tant sur le plan de l'enseignement que de l'expérimentation en elle-même. Tout d'abord c'est le seul et unique projet impliquant ce type d'expérimentations lors des trois années de formationdes étudiants (80% des leurs autres TP ne font pas appel aux animaux/expérimentation animale). Les modèles animaux sont utilisés en recherche et sont pertinents pour étudier l'impact de l'alimentation sur la santé. On leur enseigne cet aspect là de la recherche et les analyses associées lors ce TP . De plus ils approfondissent et mettent en pratique des notions vues en cours. Les étudiants s'intéressent aux projets qui ont un sens et pour lesquels une problématique claire est annoncée (lien direct avec la santé humaine). Ils ne vont donc pas seulement faire des dosages mais verront les marqueurs dosés être modifiés et devront analyser cette variation et faire des recherches pour comprendre pourquoi ils évoluent. Nous avons choisi ce régime riche en graisses et en sucre (High fat High Sugar HFHS) car la thématique est abordée en cours (métabolisme des glucides, des lipides, stress oxydant, physiologie de la digestion, phyiologie cardiaque, physiologie hépatique...), et cette pratique n'est pas douloureuse pour les animaux. Ce projet d'expérimentation animale permettra de générer des tissus pour plusieurs années de travaux pratiques (réduction du nombre d'animaux utilisés). Pour résumer les étudiants bénéficieront d'une initiation à l’utilisation de modèle animaux pour tester les effets de l’alimentation sur la santé, à l'étude du métabolisme glucidique et lipidique (analyses associées), à la mise en place d’analyses à partir d’un protocole, à l'acquisition de compétences techniques (pipetage, préparation de tampons, de solutions à pH contrôlé ou non, mise pratique d’expériences à partir d’un protocole), à la mise en forme des résultats, à l'analyse des résultats, au traitement statistique, à la discussion critique des résultats et à la recherche bibliographique associée. Et grâce à une seule expérimentation peu douloureuse/invasive pour les animaux nous pourrons mettre en place ce TP pendant 4 années universitaire. Cette expérience animale ayant déjà été réalisée auparavant, nous savons que la prise de poids (bien que limitée) est significative chez les rats HFHS, et que les marqueurs proposés sont significativement modifiés grâce au régime HFHS.
Procédures
Les animaux seront alimentés avec une nourriture riche en gras et en sucres pendant 8 semaines. A la fin du protocole ils seront anesthésiés avant mise à mort pour prélèvement de sang et organes à la fin de l'étude.
Impact sur les animaux
Le régime riche en sucre et gras fera prendre du poids aux animaux et pourrait les rendre diabétiques (raremant sur une durée de 2 mois). La mise à jeun des animaux la veille du prélèvement pourrait être inconfortable pour les animaux. L'injection de l'anesthésique peut créer un stress pour les animaux.
Devenir
La veille de la fin de l'étude les animaux ne recoivent plus de nourriture. Le lendemain ils sont anesthésiés et mis à mort pour prélèvement de sang et des organes pour faire les travaux pratiques.
Remplacement
Les travaux pratiques ont été modifiés depuis quelques années. La plupart des TP nécessitant des animaux ont été remplacée soit par des modèles in vitro (exemple modélisation de la digestion in vitro, modèles cellulaires, analyse de données et bibliographie, enquêtes diététiques sur les étudiants eux-mêmes...). Les modèles animaux sont utilisés en recherche car nous connaissons leurs caractéristiques physiologiques et leur fonctionnement bien connu permet de mimer ce qui se passe chez l'homme. L'utilisation de l'expérimentation animale que nous pensons nécessaire en recherche, et qui donc doit être vue lors de la formation d'étudiants appliquée à la nutrition, a été réduit à une part minime. La modélisation quand elle est possible et concrète (impliquant des dosages biologiques) est intéressante; Par contre l'utilisation de la virtualisation et la simulation n'est pas une alternative efficace pour la formation des étudiants.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour l'étude permet de faire l'étude seulement une fois tous les 3-4 ans et d'optimiser l'analyse des résultats obtenus par les étudiants. Le nombre d'animaux est donc relativement important (24 rats au total) pour une expérimentation mais cette expérimentation au lieu de se dérouler chaque année, se déroule une fois tous les 3-4 ans. Ce qui diminue de ce fait le nombre d'animaux et engendre une optimisation d'utilisation des tissus récoltés.
Raffinement
les animaux traités par le régime HFHS ont un suivi pondéral régulier et un changement de litière adapté en fonction de leurs besoins Les animaux sont anesthésiés pour éviter toute douleur à la fin de l'étude avant la mise à mort.
Choix des espèces
Les rats sont couramment utilisés pour développer des modèles d'obésité/maladies métaboliques grâce aux régimes riches en en graisses et en sucres, sujets développés en cours et lors du TP en question. Les mâles sont utilisés car le statut hormonal peut faire varier la réponse au régime HFHS. La même chose aurait pu être faite sur des femelles. Les mâles sont souvent retrouvés dans les études publiées . Tous les marqueurs qui seront étudiés en travaux pratiques sont fréquemment dosés et étudiés lors de divers travaux publiés sur l'impact d'une alimentation trop grasse et sucrés en santé humaine. En tant qu'enseignants nous avons donc des sources fiables auxquelles nous référer pour construire nos TP et les étudiants eux pourront après formation faire une bibliographie pertinente pour analyser les données lors des TP. Le rat est une espèce utilisée en laboratoire pour la recherche fondamentale et aussi appliquée en industrie. La formation aux techniques utilisées en laboratoire de recherche (publique/privé) fait partie intégrante du cursus des étudiants.
Evaluation des effets des champs électromagnétiques sur la thermorégulation selon les conditions d’expositions à différents âges chez des rats mâles et femelles
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
432 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont exposés à un champ électromagnétique de type 5G deux heures par jour pendant une à trois semaines, avec des mesures non invasives de température de la queue et de prise alimentaire, puis un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie. Le porteur cherche des effets sur la thermorégulation à différents âges et déclare n'avoir observé aucun effet indésirable notable lors d'expositions antérieures. Les retombées annoncées, revoir la législation ou "rassurer la population", restent conditionnelles et lointaines.
Objectifs
Depuis novembre 2020, les opérateurs ont l’autorisation d’émettre des champs électromagnétiques (CEM) de type 5G. Pour cela, en France, 3 bandes réparties entre les 4 opérateurs en 2020 pourront être utilisées, dont deux le sont déjà pour la 4G : 700 MHz et 2,1 GHz, auxquelles viendra s’ajouter la bande de 3,5 GHz. Au 1er novembre 2020, 54 000 sites d’émission contenant parfois plusieurs antennes étaient installés en France, soit 30 000 de plus qu’il y a 5 ans. L’extension de l’exposition à ces rayonnements pose la question des effets sanitaires, notamment au regard de la jeune population, qui pourrait présenter une vulnérabilité plus grande aux CEM en raison de la taille, l’immaturité tant cérébrale, que métabolique, endocrinienne ou immunitaire des enfants. Cette vulnérabilité anatomique conduit à ce que les ondes pénètrent plus profondément dans l’organisme d’un enfant que dans celui d’un adulte, majorant ainsi l’exposition. Il est donc important de rechercher si les expositions pourraient produire des effets susceptibles de se répercuter (voire s’accentuer) à l’âge adulte. Dans ce contexte, nous voulons tester si une exposition de type 5G induit des modifications physiologiques. Pour cela, nous étudierons les fonctions physiologiques pour lesquelles nous avons observé des modifications lors d’exposition à 900 MHz : la température cutanée de la queue et la prise alimentaire. Ainsi, dans ces précédents travaux, après 5 semaines d’exposition aux CEM de 900 MHz, les animaux présentaient une vasoconstriction périphérique et une prise alimentaire augmentée qui sont des réponses typiques au froid. Afin d’étudier les effets d’une exposition de type 5G à une intensité de 1,5 V/m (intensité estimée sur les bases des données d’exposition 4G), nous analyserons ces 2 fonctions physiologiques lors d’une exposition à 3,5 GHz en les comparant avec les résultats issus d’un groupe non exposé (groupe contrôle) et d’un groupe exposé à 900 MHz (groupe contrôle positif) lors de différentes durées d’exposition (d’une à trois semaines), à différents âges (3, 8 et 13 semaines) chez des animaux mâles et femelles. Au maximum, 432 animaux seront étudiés, répartis dans 54 groupes constitués de 8 animaux chacun.
Bénéfices attendus
Une précédente étude menée au laboratoire PériTox avait été une des premières études françaises à montrer des effets des CEM de faible intensité sur la régulation thermique. Cette étude avait été citée dans les rapports « Radiofréquences et santé » (ANSES, 2013) et « Radio Frequency fields: Environmental Health Criteria Monograph » (OMS, 2015). Pour ce projet à court terme, nous souhaitons développer la même stratégie en communiquant les résultats à une très large échelle auprès de la communauté scientifique (congrès scientifiques nationaux et internationaux, publication dans des revues scientifiques généralistes) et d’agences mandatées par l’Etat pour réaliser des expertises sur les avancées récentes des travaux sur les effets des CEM. A long terme, si des effets sont observés, nous espérons qu’ils permettront de revoir la législation et d’abaisser les valeurs limites d’exposition de la population. Au contraire, si aucun effet n’est observé, les résultats pourront rassurer la population et notamment les différents collectifs et associations des personnes hypersensibles aux champs électromagnétiques.
Procédures
Les animaux seront exposés à un champ électromagnétique 2h par jour (2 sessions d'une heure) pendant 1, 2 ou 3 semaines selon les groupes d'animaux. Les différentes mesures effectuées seront réalisées en utilisant des techniques non invasives (comportement alimentaire en pesant l'alimentation et température cutanée en utilisant une caméra infrarouge). Il n'y aura donc aucune procédure chirurgicale. Un seul prélèvement sanguin sera réalisé à la fin de la procédure sous anesthésie générale avant la mise à mort. Il faut moins d'une minute pour prélever le sang nécessaire avant l'arrêt cardiaque. Une fois l'animal déclaré mort, différents organes d'intérêt seront prélevés.
Impact sur les animaux
Dans le passé, nous avons exposé des rats à 900 MHz pendant 5 semaines afin d’étudier les effets sur différentes fonctions physiologiques. Durant l’exposition, aucun effet indésirable notable n’avait été observé (comportement, poids corporel, prise alimentaire).
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux seront anesthésiés afin de réaliser un prélèvement sanguin intracardiaque qui induira la mort.
Remplacement
La fonction étudiée dans ce projet est la thermorégulation. Il existe des mannequins qui permettent d’étudier les échanges thermiques entre le corps et l’environnement mais il n’existe pas de modèle permettant d’étudier les modifications de la régulation thermique. De plus, cette fonction est en étroite relation avec d’autres fonctions physiologiques (sommeil, fonction cardiovasculaire). Ces interactions ne peuvent être étudiées qu’à l’aide d’un modèle in vivo car il n’existe à ce jour pas de modèle in vitro capables de modéliser ces interactions.
Réduction
Le nombre de groupes se justifie afin d’étudier un maximum de paramètres pouvant influer sur les effets observés. Nous nous limitons à étudier 8 animaux par groupe. Ce nombre se justifie par de précédentes études menées dans le laboratoire : 4 animaux permettent d’observer une tendance à une diminution de la température de la queue sans atteindre le seuil de significativité alors qu’avec 8 animaux nous nous assurons d’observer une éventuelle diminution significative de la température de la queue. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel Statview. La normalité de la distribution des données sera vérifiée avec le test de Kolmogorov-Smirnov. Si les données suivent la loi normale, des tests paramétriques seront réalisés. L’analyse de variance (ANOVA) sera utilisée pour tester les effets des différents paramètres (âge, sexe, fréquence et durée d’exposition). Les différences entre les séries expérimentales seront également testées afin de s’assurer que tous les animaux d’un même groupe ont des réponses uniformes. Lorsque la valeur de F sera significative, un test de Fischer sera appliqué. S’il existe des interactions entre plusieurs facteurs, un test t des Student sera réalisé. Le seuil de significativité sera fixé à 0,05.
Raffinement
Pour assurer le raffinement des animaux dans ce projet, ils seront quotidiennement observés selon des critères bien précis qui permettront de déterminer un score. Selon la valeur du score, une action sera réalisée pour soulager au maximum l’animal. Pour diminuer le stress lié à l’hébergement individuel, différents enrichissements (cylindres en carton et lanières de papier kraft) seront présents dans chaque cage. Un fond sonore sera également présent afin de couvrir d’éventuels bruits extérieurs, brefs et bruyants, sources de stress pour les animaux. Les paramètres physiologiques étudiés in vivo seront mesurés sans contrainte pour l’animal : la température cutanée de la queue sera mesurée avec une caméra infrarouge et la prise alimentaire par une balance reliée à la mangeoire.
Choix des espèces
Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à une contrainte. - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude des systèmes neurophysiologiques (comme le sommeil) qui sont particulièrement bien référencés dans la littérature (Revel et al., 2009). - l’hébergement dans les chambres climatiques au sein du laboratoire sont adaptés depuis plusieurs années pour cette espèce. L’exposition sera évaluée chez des animaux ayant 3 âges différents. La population juvénile étant potentiellement plus sensible aux CEM, des animaux âgés de 3 semaines seront étudiés, âge minimum d’animaux sevrés. Afin d’évaluer les effets sur une population adolescente, des animaux âgés de 8 semaines seront étudiés, âge de la maturation sexuelle. Enfin des animaux adultes âgés de 13 semaines seront étudiés afin d’évaluer si les effets observés disparaissent à l’âge adulte.
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 80
780 rongeurs, 700 souris et 80 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tués à l'issue et dix-huit réutilisés pour d'autres entraînements. Des stagiaires s'exercent à la contention, aux injections et aux prélèvements sur animaux vigiles, puis à la mise à mort par dislocation cervicale sur animaux anesthésiés. Le porteur indique qu'aucune limite n'est fixée au nombre de tentatives de gestes techniques par stagiaire, l'animal n'étant remplacé qu'en cas d'agitation. Il décrit cette mise à mort comme un apprentissage à "but pédagogique" et juge le recours aux animaux vivants "indispensable".
Objectifs
● Répondre à des besoins de formation sur l’expérimentation animale. De nombreuses entreprises privées ou institutions publiques nécessitent que leurs personnels soient formés à l’application ou à la conception de procédures/projets pour l’expérimentation animale pour être conforme à la réglementation en vigueur. Cette formation permet de répondre en partie à la demande locale e peut être réalisée dans le cadre de formation initiale ou continue. ● Pédagogique : de nombreux étudiants /doctorants de science, pharmacie ou médecine – de notre université - étudient dans le cadre de leur formation initiale les bases de l’expérimentation animale. Cette formation complémentaire s’inscrit dans la continuité de leur formation initiale et leur permet d’approfondir et valider leurs connaissances théoriques vis-à-vis de l’expérimentation animale. ● Scientifique : Proposer une formation qui permettra aux stagiaires de saisir les enjeux de l’expérimentation animale et de ces limites. Les travaux pratiques répondent à l'ensemble de ces trois points. Ils permettent d’apporter une réelle plus-value à la formation ainsi qu'aux stagiaires. Le stagiaire peut ainsi se familiariser avec les animaux tout en étant encadrer par des intervenants « experts » en expérimentation animale.
Bénéfices attendus
Les stagiaires à la suite de cette formation réglementaire, scientifique et pratique possèdent l’ensemble des pré-requis indispensables à l’application et/ou à la conception des procédures/projets en expérimentation animale. Cela se traduit in fine par des connaissances robustes sur la réglementation française liée à l’expérimentation animale ainsi que les aspects éthiques et scientifiques. La simulation APAFIS permet aux stagiaires d’acquérir des connaissances et expériences suffisantes afin de procéder à l’élaboration et écriture de leur propre formulaire. Les travaux pratiques quant à eux s’inscrivent dans la lignée de ces cours théoriques. La mise en situation est indispensable pour appliquer les aspects théoriques enseignés. Ces TPs sont suffisamment étoffés pour enseigner les techniques d’administration, de prélèvement et de mise à mort les plus couramment utilisés et sont parfaitement adaptés pour rappeler les notions théoriques (réglementation – 3R – points limites…). Ces TPs sont basés sur une démonstration puis l’application des gestes les plus fréquemment rencontrés lors de la manipulation des rongeurs. Sur les précédentes sessions, l’évaluation par les stagiaires nous a confortés sur les bénéfices de notre formation et notamment sur l'importance de préserver des séances de mise en pratiques.
Procédures
Lors des enseignements, les animaux (souris et rats) seront soumis à de la manipulation et contention par les encadrants et stagiaire (30 minutes). Cela n'engendre pas de douleurs physiques aux animaux. Aucune limite n'est fixée sur ces gestes. Cependant, en cas de stress des animaux (agressivité ou prostration), ils seront remplacés. Des injections et prélèvements sur animaux vigiles (30 minutes-1 heure) sont également prévues dans le cadre de ces enseignements. Lors de la démonstration, deux injections et un prélèvement peuvent être réalisés au maximum chez la souris. Les voies d'administration étudiées chez la souris vigile sont : la voie orale - gavage, l'injection intraveineuse caudale, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée. Les voies de prélèvement enseignées sont : la voie caudale et la voie mandibulaire. Seule la voie intrapéritonéale est enseignée sur le rat. Aucune limite de tentatives de geste technique est fixée pour le stagiaire sur souris vigile. Cependant, les volumes injectés et prélevés resteront en adéquation avec les limites d'usage. En cas d'agitation, l'animal sera remplacé. A noter, que les souris utilisées par les stagiaires pour la pratique en condition vigile seront automatiquement anesthésiées puis mises à mort. À la suite de cette anesthésie (
Impact sur les animaux
La première partie de l'enseignement pratique a pour but d'enseigner la contention et la manipulation et n'engendre pas de douleurs ou effets secondaires aux animaux. Les animaux sont utilisés avec parcimonie. Cependant, la manipulation par des stagiaires inexpérimentés peut induire un stress chez l'animal (agressivité - prostration). Dans ce cas, l’animal expérimenté est substitué. La deuxième partie des travaux pratiques est basée sur l'injection et le prélèvement sur animaux vigiles. La manipulation par les stagiaires sur souris vigile sera supervisée étroitement par un des encadrants (4 encadrants minimum pour 10 étudiants) qui pourra le cas-échéant accompagner le stagiaire dans le bon geste de contention puis d’injection et/ou de prélèvement. Dans le cas d'une mauvaise manipulation par le stagiaire, l’encadrant jugera du besoin de remplacer l’animal, de la mise en place de stratégie antalgique ou de la mise à mort de l'animal en fonction des critères définis. L’administration sera réalisée avec du sérum physiologique au volume adapté au poids de l’animal. Aucun effet pharmacologique n’est attendu. Un maximum de deux procédures d'administration et une procédure de prélèvement sera mis en œuvre par animal. La dernière partie de l'enseignement cible l’injection, le prélèvement et la mise à mort sur animaux anesthésiés. Une souris par étudiant et une souris par encadrant ; pour la démonstration de la mise à mort; seront utilisées pendant cette partie du TP. L'ensemble des animaux utilisé ayant reçu les anesthésiques ne seront pas gardés en vie. La mise à mort sera réalisée par dislocation cervicale par le stagiaire sous supervision d’un encadrant. Dans le cas d'une séance normale, aucun point limite ne sera atteint pendant lors des deux premières parties des enseignements. Les animaux seront alors replacés dans l'animalerie. Un suivi longitudinal des animaux est réalisé quotidiennement pour s'assurer de la récupération des animaux par du personnel qualifié. Cette évaluation est basée sur les grilles d'évaluation de la douleur et de points limites décrits dans l'annexe 1. En fonction des scores de douleurs, des stratégies analgésiques peuvent être mises en place. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort par dislocation cervicale.
Devenir
La mise à mort des animaux à la fin de la séance de TP est à but pédagogique afin d’inculquer aux stagiaires les bons gestes. Les souris et rats, non mis à mort seront réutilisés à des buts de formation et d’entrainement de la mise en pratique de ces gestes par le personnels et chercheurs du laboratoire en dehors de la formation de CESU. Dans le cadre du roulement de personnel actif, de nombreux étudiants et post-doc de notre laboratoire s'inscrivent au CESU de niveau A ou de niveau B. À la suite de la formation, ce personnel nécessite de continuer la formation pratique à l'expérimentation à l'aide d'un tuteur diplômé. Les animaux restants sont mis à profit afin qu'ils puissent s'exercer avant de débuter tout projet scientifique. Cet entrainement consiste à la répétition des gestes enseignés sur animaux vigiles. A l'issue, de cet entrainement, l'évaluation des scores de douleurs et points limites sont évalués par le tuteur basée sur l'annexe 1. Le suivi longitudinal quotidien des animaux est poursuivi (basée sur l'annexe 1 également). Les animaux sont mis à mort à la fin de l'apprentissage de ce personnel.
Remplacement
Cet enseignement/apprentissage est indispensable pour la mise en œuvre de futures expérimentations précliniques dans les meilleures conditions possibles. L’emploi d’animaux vis-à-vis des procédures enseignées ne peut être substitué par l’usage de mannequin notamment sur la pratique de gestes complexes tels que la réalisation d'injections ou prélèvement par voie rétro-orbitaire. Les stagiaires sont cependant sensibilisés pendant la formation théorique : 7h00 d’enseignement destiné aux méthodes in silico (ex : modèle pharmacocinétique), in vitro (modèle de tumoroides) ou in vivo chez des espèces alternatives (Drosophiles – Nématodes) et au respect des 3R. De plus, l'évaluation de ces TPs par les stagiaires convergent vers la nécessité les préserver.
Réduction
Ce projet à but pédagogique n’est pas basé sur l’obtention de résultats. Ainsi les méthodes statistiques requises habituellement ne peuvent s’exercer dans ce cas. Le nombre d’animaux est alors évalué en fonction du nombre de stagiaires inscrits à la formation. Ce nombre est donc prévu pour couvrir l’ensemble des TPs (TP1, TP2 et TP3) sur l’animal avec la prise en compte du nombre d’animaux mis à mort et du nombre d’animaux utilisés pour les exercices de contention – injection et prélèvement. L'objectif primaire de ces séances est de fournir une expérience pratique à la fois utile et en adéquation avec les points abordés lors des enseignements théoriques. Nous estimons que l'indépendance et la mise en situation des stagiaires sont des principes indispensables à ce type de formation. Pour cela, tout est mis en œuvre pour diminuer le nombre d'animaux. L'équipe pédagogique et encadrante (conforté par les résultats de satisfaction des séances de TPs par les stagiaires) a évalué qu'une souris par stagiaire était le minimum afin de pouvoir suivre la progression et conseiller les stagiaires individuellement à la pratique des gestes techniques et d'optimiser le temps de pratique pendant les séances. La réalisation de binôme ou trinôme pour l'expérimentation animale ne semble pas adapté du fait : les besoins des stagiaires ne sont pas les mêmes, certains gestes doivent être répétés plusieurs fois pour les "acquérir", ou ne peuvent être réalisés raisonnablement qu'une seule fois (prélèvement intracardiaque). Au-delà de ces considérations liées à l'enseignement, nous nous efforçons de maintenir les règles de distanciation sociale pendant ces séances. Le nombre de rat est adapté aux objectifs du TP1 et TP2 (manutention et injection intrapéritonéale) et au nombre de stagiaires. Pour terminer, les stagiaires se préinscrivent à minima, trois semaines avant le début de la formation, permettant de commander le plus petit nombre d'animaux nécessaire.
Raffinement
Les animaux sont commandés et réceptionnés à minima 14 jours avant le début des séances de travaux pratiques. Lors des journées de TPs : Les animaux seront acclimatés dans la salle de TP, d’une à deux heures avant le début de la séance afin de diminuer leur stress. Dans cet optique, les animaux seront utilisés dans une ambiance sereine et calme favorisant la lumière naturelle dès que possible. Lors du TP1, aucune souffrance physique n'est infligée à l'animal. L'état de stress des animaux (agressivité/prostration) est évalué tout au long de la séance par les encadrants. Si l'animal apparait trop stressé, il sera remplacé. Les injections réalisées pendant le TP2 sont faites avec du sérum physiologique (par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, gavage, IV). Les volumes injectées maximales correspondent au volume optimal en fonction du poids de l'animal soit 1mL/100g de souris - 1 à 5 ml/kg de rat. Le choix des dimensions de l'aiguille doit correspondre à la voie d'administration étudiée, l'espèce et au poids de l'animal. Dans le cadre de mauvaise manipulation (injection ou prélèvement par le stagiaire), les encadrants jugeront du maintien de l’animal dans l’expérience, du remplacement ou de la mise à mort de l’animal en se référant à l'annexe 1. Lors du TP3, toute souffrance est évitée par l'anesthésie de l'animal avec des agents médicamenteux adaptés suivie de la mise à mort de l’animal à la fin de l'enseignement. Les animaux ne sont pas utilisés deux jours successifs pour éviter. En dehors des journées de TPs, les animaux sont monitorés quotidiennement par du personnel qualifié en fonction des scores et points limites établis en annexe 1. Les souris et rats sont hébergés sur des portoirs ventilés en groupe (adapté à la masse des animaux et surface de la cage), dans un environnement enrichi (copeaux, dôme, alimentation solide). L'eau et la nourriture sont en accès libres et illimités. Les locaux sont monitorés en permanence avec un suivi de l'hygrométrie et température. Une alternance jour/nuit de 12h est également mise en place.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont les principales espèces utilisées pour les études précliniques. Il existe une forte demande de formation vis-à-vis institutions privées ou publiques pour ces deux espèces. Ces espèces sont la base de l'enseignement pour l'expérimentation animale Afin de faciliter la contention, manipulation et injection par les stagiaires les animaux seront adultes. De plus, conventionnellement, l’expérimentation animale est réalisée chez des rongeurs adultes âgés de minimum 6 à 8 semaines.
Formation aux techniques de prélèvement et d’injection
- Formation professionnelle
Rats : 600
1 200 animaux non-humains, 600 souris et 600 rats, vont être utilisés dans des procédures classées sans réveil, pour former le personnel aux gestes de prélèvement et d'injection. Chaque animal peut subir jusqu'à deux voies de prélèvement et deux voies d'injection, avec un maximum de trois essais infructueux par méthode, avant d'être tué au CO2. Le porteur présente cette formation comme un moyen d'améliorer le "bien-être" animal et la fiabilité des résultats, et prévoit d'utiliser des animaux de réforme voués à l'euthanasie. Il affirme que ces gestes ne peuvent être appris de façon réaliste sur simulateur et juge l'usage de l'"organisme entier" incontournable.
Objectifs
Les mauvais gestes de prélèvement ou d'injection chez les petits animaux peuvent engendrer des dommages ou du stress pour l'animal. Ces perturbations peuvent avoir un impact significatif sur le bien-être de l’animal et sur la valeur scientifique des résultats. L’objectif de ce projet est d'assurer une formation continue de qualité pour notre personnel ou utilisateurs afin d'améliorer le bien-être animal, de diminuer le nombre d'animaux utilisés dans les différents projets et de contribuer au bon déroulement des protocoles expérimentaux.
Bénéfices attendus
Ce projet fait appel à différentes procédures expérimentales à visée éducative. Il a pour but de raffiner les procédures de prélèvement et d'injection afin d’éviter la souffrance des animaux, de réduire le nombre d’animaux et d’obtenir des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles.
Procédures
Les injections (per os - gavage, intraveineuse directe, intrapéritonéale, sous cutanée) seront faites sur animaux vigiles (rat et souris). Une anesthésie générale à base d’Isoflurane (4% pour induction et entre 1.5 à 2.5% pour le maintien) et une analgésie à base de buprénorphine (0.05mg/kg pour les rats et 0.1mg/kg pour les souris 30 minutes avant les manipulations) seront utilisées pour tous types de prélèvements sanguins. Nous prévoyons au maximum deux voies de prélèvements et deux voies d’injection par animal. Le nombre d’essai infructueux ne dépassera pas 3 par méthode. Le temps de manipulation pour chaque animal est estimé à 5 minutes. Après quoi, l’assistance de l’encadrant est demandée pour effectuer un dernier geste technique. Le volume total des prélèvements/animal ne dépassera pas 10 % du volume sanguin total (souris et rat).
Impact sur les animaux
Les injections seront faites avec du sérum physiologique au volume adapté au poids de l’animal (stérile, isotonique, ph physiologique et réchauffé) qui ne cause aucune douleur pour les animaux. Pour les prélèvements le nombre d’essai devrait se limiter à trois (ponctions). Par la suite l’assistance de l’encadrant doit être demandée. L’arrêt de saignement doit être assuré avant de retourner l’animal dans sa cage. Dans le cas d'une mauvaise manipulation, l’encadrant jugera du besoin de remplacement de l’animal, ou le cas échéant si un point limite est atteint de la mise à mort de l’animal.
Devenir
A la fin de chaque séance de formation, les animaux ayant subi des interventions d’injection et/ou de prélèvement ne seront pas conservés en vie pour éviter des souffrances inutiles, ils sont mis à mort par CO2.
Remplacement
L’apprentissage des procédures de prélèvement et d’injection chez les petits animaux comme la souris et le rat ne peut être simulée de façon réaliste et didactique. En outre, il n’est pas possible d’apprendre à faire par des prélèvements rétro-orbitaires ou sous maxillaires sur des vaisseaux artificiels. L’usage de l’organisme entier est incontournable.
Réduction
Les études statistiques requises habituellement dans les études scientifiques ne peuvent pas être appliquées car le projet est pour but éducatif. Le nombre des animaux est évalué en fonction du nombre des participant à cette formation. Pour réduire le nombre d’animaux commandés, nous utiliserons des souris et des rats provenant de notre établissement (animaux de réformes ou de génotype non désirés destinés à l’euthanasie).
Raffinement
Avant les procédures, Les animaux sont hébergés en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton pour les rats, des maisonnettes en plastique et dôme pour les souris, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. L'alimentation et l'eau seront distribué à volonté. Les injections seront faites avec du sérum physiologique qui sera réchauffé à l’aide d’un bain-marie ou tapis chauffant afin d’éviter la diminution de la température corporelle lors de l’administration.
Choix des espèces
Notre animalerie héberge principalement des rats et souris. La majorité des demandes de travaux pour les procédures d’injection et de prélèvement dans notre établissement utilisateur concernent principalement les deux espèces souris et rat. Afin de rentabiliser le nombre de souris, nous allons utiliser des souris de réforme en provenance de notre établissement qui doivent être mise à mort : souris en fin de reproduction, ou souris sauvage issus des différents accouplements des lignées transgéniques (2-3 mois). Dans le but de faciliter la contention, manipulation et injection pour les participants, nous utiliserons des rats adultes de 300 à 350 g commandés chez un fournisseur agréé.