Rats
Système Respiratoire
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Rats : 3000
Cochons d'Inde : 2000
5 500 animaux non-humains vont être utilisés, 3 000 rats, 2 000 cobayes et 500 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est placé plusieurs heures dans une chambre de pléthysmographie, reçoit une substance à tester, parfois après pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire, avant un prélèvement de sang terminal. Le porteur mène ces tests de pharmacologie de sécurité respiratoire comme prérequis réglementaire à la mise sur le marché de médicaments, et prévoit de tuer les animaux prélevés ou exposés à des substances mal connues, les autres cobayes étant remis en stock. Il affirme que ces effets sur la fonction respiratoire de l'animal vigile ne peuvent être observés par des méthodes alternatives.
Objectifs
Ce projet permet l'évaluation de l'effet des substances sur le système respiratoire: effet secondaire dans le contexte de la pharmacologie de sécurité ou modèle d'efficacité tel que des modèles d'asthme par exemple. L’objectif du projet est d’étudier les effets pharmacologiques principaux des substances étudiées, par rapport aux cibles thérapeutiques visées et d’établir le profil de sécurité de nouvelles substances médicamenteuses avant leur passage chez l’homme, et ce dans le cadre des recommandations européennes, américaines ou japonaises en vue de l’obtention des autorisations de mise sur le marché. Les tests utilisés dans ce cas sont des modèles prédictifs pour l’évaluation des risques au niveau du système respiratoire chez l’animal conscient et non restreint. La substance est généralement administrée à dose unique. Les études des effets de substances sur la fonction respiratoire sont réalisées par pléthysmographie, principalement chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Les tests décrits dans l’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été caractérisés de façon extensive dans la littérature scientifique et sont mis en œuvre au sein du laboratoire. Par ailleurs, la méthode de pléthysmographie peut également être un outil de choix pour l’étude de la fonction respiratoire sur des modèles animaux physiopathologiques tels que les souris transgéniques ou des modèles de bronchoconstriction ou d'asthme chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. L’intérêt sociétal est évident puisqu’il s’agit de prérequis réglementaires pour l’enregistrement de nouveaux médicaments. Les documents réglementaires (CPMP, FDA et MHW) s’accordent pour considérer le système respiratoire comme une des fonctions vitales à explorer dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité (ICH S7A guideline, 2001).
Bénéfices attendus
Ces modèles seront mis en place et utilisés afin de tester l’efficacité des médicaments et de s’assurer qu’ils n’induisent pas d’effets secondaires ou inattendus. Ils entrent comme prérequis règlementaires pour obtenir les autorisations de commercialisation des nouveaux médicaments. Avant les tests sur l’animal, les produits sont généralement testés et présélectionnées avec attention in vitro. Néanmoins, les procédures utilisées dans ce projet ont été étudiées attentivement et caractérisées de façon extensive par une bibliographie approfondie. Ainsi, les techniques utilisées dans ce projet ont été optimisées, afin d’assurer un maximum de bien- être pour l’animal dans le strict respect des 3Rs.
Procédures
Lors l'expérience, les animaux sont pesés puis installés dans la chambre de pléthysmographie (un animal par chambre) pendant une durée de 3 heures (temps d'habituation et de stabilisation). Ils sont ensuite sortis de la chambre, administrés puis remis dans la chambre. Pour certaines administrations en intraveineuse, les animaux subissent une chirurgie de courte durée pour la pose d'un cathéter au niveau de la veine jugulaire. Cette intervention est réalisée quelques jours avant le test. A la fin de l'expérience, les animaux sont observés. Un prélèvement de sang terminal est réalisé soit au niveau de la veine sublinguale sur animaux vigiles, soit en intracardiaque sur animaux anesthésiés de façon à pouvoir effectuer les analyses nécessaires sur les mêmes lots. Cela permet de ne pas inclure des animaux satellites pour la vérification de paramètres complémentaires.
Impact sur les animaux
Il est possible de choisir des doses efficaces qui ne présentent pas d’effet sur l’animal. Il est également à noter que des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Une procédure spécifique est toutefois présente dans ce dossier pour prendre en compte ce cas rare ou lorsque les prélèvements vivo sont importants. La pléthysmographie corps entier permet de suivre les paramètres respiratoires sur plusieurs heures sur l’animal vigile en leur laissant une liberté de mouvements.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, s’il y a un prélèvement, les animaux sont tous sacrifiés. S’il n’y a pas de prélèvement les animaux ayant reçu des substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont sacrifiés. Les animaux n’ayant pas reçu de substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont remis en stock.
Remplacement
L’impact de substances pharmacologiques sur les paramètres respiratoires des espèces choisies est prédictif de leurs effets chez l’Homme. De plus, le choix des espèces est basé sur la bibliographie scientifique, les modèles expérimentaux étant largement décrits chez le rat, la souris et le cobaye. Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la fonction respiratoire des animaux vigiles. Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes.
Réduction
Huit animaux par groupe sont classiquement inclus dans ces expériences. Les analyses de puissance ne sont pas réalisées car il serait nécessaire de générer de nombreuses études. Si cela est pertinent et afin de réduire le nombre d’animaux, tous les prélèvements d’échantillons biologiques seront réalisées à la fin des évaluations pharmacologiques (et non sur des animaux surnuméraires satellites). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des mesures. Dans le but de réduire le nombre d’animaux (dans l’application de la règle des 3R), certains animaux peuvent être réutilisés à la stricte condition qu’ils n’aient pas subis de procédures sévères et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Un soin particulier dans le raffinement des méthodes est assuré et garantit l’utilisation systématique du modèle apportant le maximum de réponses scientifiques et le minimum de souffrance pour l’animal. Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, des yeux, la posture, les réactions de l'animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l'appétit, l'état d'hydratation, les tremblements ou convulsions), afin d’assurer d’une part, un bon suivi des animaux et d’autre part, une fin sans souffrance ou angoisse lorsque nécessaire. Les méthodes d’euthanasie choisies, le cas échéant, sont sélectionnées pour supprimer toute forme d’angoisse, de stress ou de douleur. .). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment et il est mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des mesures.
Choix des espèces
Principalement rongeurs (rats, souris, cobayes) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique Les études des effets de substances sur la fonction respiratoire sont réalisées par pléthysmographie, principalement chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Les documents réglementaires (CPMP, FDA et MHW) s’accordent pour considérer le système respiratoire comme une des fonctions vitales à explorer dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité (Touvay et le Mosquet, 2000 ; ICH S7A guideline, 2001). Cette technique a montré toute sa pertinence pour détecter les effets broncho-stimulants de nouvelles substances qui augmentent la fréquence respiratoire et la ventilation/minute (De Sanctis et al., 1991) ou bien des effets broncho-constricteurs allergiques ou non-allergiques en augmentant le paramètre de pause augmentée, pris comme index d'obstruction des voies aériennes chez le Rat (Kirschvink et al., 2005), la Souris (Delorme and Moss, 2002; Hamelmann et al., 1997) et le Cobaye (Chong et al., 1998) ou d'asthme chez le Rat, le Cobaye ou la Souris (Murphy, 2003)..
Utilisation de l’imagerie par résonance magnétique pour rechercher des biomarqueurs pronostiques dans un modèle de traumatisme crânien chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
16 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Le porteur leur inflige un traumatisme crânien par percussion fluide après une craniectomie sous anesthésie, puis un unique examen IRM quatre semaines plus tard, avant l'euthanasie et l'analyse histologique du cerveau. Il indique que l'induction du traumatisme s'accompagne d'une mortalité pouvant atteindre 15 pour cent et d'une perte de poids d'environ 13 pour cent, et présente l'étude comme une faisabilité préalable à des projets de plus grande ampleur. Il conclut au recours au rat, dont il juge la structure cérébrale proche de celle de l'humain.
Objectifs
Chaque année, rien qu’en France métropolitaine, plusieurs centaines de milliers de personnes sont exposées à un traumatisme crânien (TC). Selon les estimations, 25 à 40 % des cas sont des TC avec des signes fonctionnels et/ou des séquelles neurologiques chroniques. La grande majorité des TC diagnostiqués sont des TC légers à modérés Il n’existe malheureusement pas, à ce jour de marqueurs, permettant de prédire et de suivre l’évolution des séquelles cérébrales de manière fiable pour ces types de TC, principalement par manque de moyens d’investigation suffisamment précis pour déceler les micro-lésions et micro-dysfonctionnements cérébraux post-traumatiques. La prise en charge des patients affectés ne peut donc pas être optimale. De nouvelles méthodes d’imagerie par résonnance magnétique (IRM) sont actuellement testées dans le domaine médical pour essayer de déceler les micro-déficits cérébraux produits par un TC léger-modéré. Malgré des résultats encourageants, les conclusions de ces études sont limitées par l’impossibilité de comparer les résultats d’imagerie avec des mesures réalisées dans le tissu cérébral des patients. Ainsi, le projet proposé vise à évaluer si des méthodes d’IRM récentes, similaires à celles testées en clinique, permettent de détecter des lésions cérébrales chez des animaux après exposition à un TC léger-modéré. Si c’est le cas, nous pourrons comparer les résultats IRM avec des mesures tissulaires, qui sont accessibles chez les animaux, et compléter les études d’imagerie réalisées chez les patients. Ce projet représente ainsi une étude de faisabilité préalable à la mise en place de projets de plus grande ampleur. Les mesures IRM seront réalisées chez des rats adultes exposés préalablement à une procédure chirurgicale et un TC sous anesthésie générale par percussion fluide et comparées à celles réalisées chez des animaux contrôles. Cette technique d’induction du TC est utilisée et maitrisée par notre laboratoire depuis environ 10 ans. Le fonctionnement du cerveau repose sur de nombreux mécanismes cellulaires et moléculaires intégrés qui ne peuvent pas à l’heure actuelle être modélisés de manière fiable, ni par le biais de cultures cellulaires, ni par des outils mathématiques et informatiques. Par ailleurs, l’imagerie IRM nécessite d’étudier le cerveau dans son intégralité. Ainsi, le recours au modèle animal ne peut pas être évité.
Bénéfices attendus
Si les résultats obtenus dans ce projet s’avèrent être favorables, nous serons à même de pouvoir mesurer par IRM les déficits cérébraux produits par un TC léger-modéré chez un modèle expérimental de TC léger-modéré. Nous pourrons pour chaque anomalie détectée par IRM évaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués, ce qui n’est actuellement pas possible dans le domaine médical. Nos futures expérimentations animales pourront potentiellement permettre de découvrir de nouveaux biomarqueurs pathologiques basés sur des mesures IRM, dont la validité et la pertinence pourront par la suite être évaluées chez des patients. L’utilisation de l’IRM permettra également d’évaluer expérimentalement chez l’animal l’efficacité de nouvelles thérapies pressenties pour la prise en charge des patients traumatisés crâniens. Par ailleurs, nous pourrons évaluer de manière non-invasive des modifications cérébrales dans des paradigmes de TC pertinents restant à étudier (poly-trauma, répétition de TC, interaction entre TC et stress, …). D’un point de vue purement éthique, nous pourrons dans le futur utiliser l’IRM pour évaluer l’intégrité du cerveau chez les animaux traumatisés de manière non invasive et longitudinale, ce qui n’est pas le cas pour l’instant. Nous pourrons ainsi réduire les effectifs utilisés lors de nos prochains programmes expérimentaux.
Procédures
Les animaux seront exposés à un TC léger-modéré unique. Le TC sera induit par la technique de percussion latérale fluide. Le principe de la percussion fluide repose sur l’exposition du tissu cérébral à une onde de pression fluide dont les caractéristiques modélisent un TC léger-modéré, c’est à dire un TC ne créant pas de lésion aigue du tissu cérébral mais pouvant induire une hémorragie sous méningée non létale pouvant se résorber naturellement. Cette technique nécessite de réaliser une préparation chirurgicale préalable et en particulier la réalisation d’une craniectomie sous anesthésie générale et analgésie locale. La durée de la phase chirurgicale préparatoire et de l’exposition au TC ne dépassera pas 70 minutes. Deux groupes contrôles sont nécessaires pour comparaison avec les animaux traumatisés. Des animaux contrôles « naïfs » ne subiront aucune préparation chirurgicale. Des animaux contrôles subiront les mêmes étapes préparatoires mais pas le TC. Le groupe contrôle est nécessaire car la chirurgie préparatoire au TC dans le modèle utilisé peut entraîner des phénomènes inflammatoires au niveau du cerveau et pourrait ainsi modifier les mesures IRM réalisées. Chaque animal subira un examen IRM unique 4 semaines après avoir été exposé au TC. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale. Ils seront maintenus sous anesthésie durant l’intégralité de leur séance de neuro-imagerie IRM. La durée du passage à l’IRM sera d’environ 1h30 pour chaque animal. Chaque animal ne recevra qu'une seule séance d'imagerie. Une fois réveillés, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine avec leurs congénères. Chaque animal subira un examen IRM unique 4 semaines après avoir été exposé au TC . Les animaux seront soumis à une anesthésie générale. Ils seront maintenus sous anesthésie durant l’intégralité de leur séance de neuro-imagerie IRM. La durée du passage à l’IRM sera d’environ 1h30 pour chaque animal. Chaque animal ne recevra qu'une seule séance d'imagerie. Une fois réveillés, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine avec leurs congénères. Les animaux devront être euthanasiés pour la suite des recherches. 48 heures après leur passage à l’IRM,
Impact sur les animaux
L’exposition au traumatisme crânien s’accompagne d’un taux de mortalité de 15% au maximum, au moment de l'intervention. En règle générale, les animaux exposés au traumatisme crânien qui survivent perdent 13 % de leur poids initial au maximum et commencent à prendre du poids sous 2 à 4 jours. Ils ne montrent pas de signes chroniques de douleur (pas de prostration, pas d’atonie prolongée, pas de vocalisations lorsque la plaie chirurgicale est manipulée, pas d’agressivité). Les animaux contrôle perdent en général moins de 10% de leur poids initial, et commencent à prendre du poids sous 2 à 3 jours. Ils ne montrent pas non plus de signes chroniques de douleur.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Leur cerveau sera étudié par histologie afin de compléter les analyses IRM.
Remplacement
L’utilisation de l’animal et non d’alternatives non vivantes s’explique par le fait que le fonctionnement du cerveau est complexe et que les effets du TC sur ce dernier ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être modélisés à l’aide de systèmes informatiques ou de systèmes cellulaires moins complexes. Le modèle choisi est le rat, qui est classiquement utilisé pour la modélisation du TC en laboratoire. Le rat est par ailleurs le modèle de choix pour étudier le fonctionnement du cerveau et ses perturbations, car la structure du cerveau du rat est proche de celle de l’Homme.
Réduction
L’objectif est de pouvoir comparer les résultats obtenus sur 5 animaux par groupe expérimental, comprenant des rats traumatisés et des rats contrôles (des animaux contrôles sains / « naïfs » n’ayant subi aucune préparation chirurgicale, et des animaux contrôles ayant subi les étapes chirurgicales préalables au TC mais n’ayant pas été exposés au TC). Ce nombre a été estimé grâce à nos expérimentations préalables et une analyse bibliographique. Le projet consistant essentiellement à vérifier si l’IRM peut générer des mesures fiables et reproductibles chez le rat, ce nombre semble cohérent et adapté. Aucun test statistique particulier n’est prévu car il s'agit une première approche exploratoire basées sur l'interprétation d'images radiologiques. Le taux de mortalité des rats Naïfs et contrôles étant nul, 5 animaux seront utilisés pour constituer chacun de ces groupes. En revanche, le taux de mortalité des rats traumatisés étant d’environ 15%, nous estimons qu’un animal supplémentaire pourrait être requis pour atteindre un nombre de 5 individus dans ce groupe expérimental au final. Ainsi, 5 animaux seront initialement exposés au TC, et un animal supplémentaire sera exposé en cas de nécessité.
Raffinement
Le modèle de TC choisi ainsi que les procédures d’hébergement, de médication (analgésie et anesthésie) et de soins sont parfaitement maitrisées par notre laboratoire depuis plus de 10 ans. Les étapes chirurgicales nécessaires à l’induction du TC seront réalisées sous anesthésie gazeuse et après une prémédication antalgique, ce qui assure une prise en charge optimale de la douleur infligée aux animaux. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux de manière à limiter leur angoisse (contact social, contact humain, enrichissement du milieu). Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de compléter les analyses IRM par des analyses histologiques du cerveau et des analyses sanguines.
Choix des espèces
Le rat Sprague Dawley est l’espèce/la souche utilisée dans la majorité des études pré-cliniques du TC et est une des espèces animales communément choisie pour les étudier le fonctionnement du cerveau. Son utilisation pour les études proposées est donc préconisée, car il est important de se fonder sur les connaissances existantes. Les rats seront réceptionnés à l’âge de 8 semaines. Ils seront âgés de 10 semaines au moment de l’induction du traumatisme crânien/de la chirurgie, ce qui correspond au stade de jeune adulte, stade pertinent chez l’humain car correspondant à un âge particulièrement propice à l’exposition au TC. Ils seront soumis à des examens par IRM et seront mis à mort entre les 4ième et 5ième semaines post-TC, ce qui correspond, d’un point de vue pathologique, au stade chronique précoce.
Evaluation de l’inflammation et de la perfusion cérébrale post accident vasculaire cérébral ischémique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Rats : 350
500 souris et 350 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les animaux subissent des craniotomies pour provoquer un accident vasculaire cérébral ischémique, permanent ou transitoire, avec pose de cathéter et injection d'agents de contraste pour l'imagerie. Le porteur indique que des complications peuvent survenir, prostration, arrêt de l'alimentation et perte de poids, les animaux concernés étant alors euthanasiés par exsanguination sous anesthésie. Il affirme le caractère de "stricte nécessité" des procédures et conclut qu'aucune méthode sans animaux vivants n'apporterait le même niveau d'information.
Objectifs
L’objectif principal de notre travail est d’étudier l’implication de la réaction inflammatoire post-ischémique dans les différentes situations de reperfusion. Cette étude établira également le potentiel des différents agents de contraste révélant l’inflammation comme outil prognostic de l’AVC ischémique. Les différents modèles d’AVC que nous allons comparer correspondent à des situations cliniques différentes. Pour ces modèles nous créerons une ischémie permanente ou transitoire, au niveau de l’artère cérébral moyenne (ACM) ou via l’artère carotide interne, avec une occlusion mécanique contrôlée ou via la formation d’un caillot in situ.
Bénéfices attendus
Cette étude établira le potentiel des différents agents de contraste révélant l’inflammation en IRM-TEP et de l'échographie super-résolur comme outil prognostic de l’AVC ischémique.
Procédures
Les animaux seront soumis à des chirurgies invasives comprenant des craniotomies pour induire l'ichémie cérébral (modèles AVC ischémiques), à la pose de cathéter dans la veine caudale pour l'injection d'agent de contraste et à des protocoles d'imagerie non invasive.
Impact sur les animaux
Des problèmes techniques importants peuvent avoir lieu pendant ou après la réalisation des différents modèles d'inflammation. Des complications peuvent apparaître comme une douleur chez les animaux (répérée par de la prostration, une inactivé dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson voire une perte de poids). Les animaux seraient alors euthanasiés par anesthésie profonde si l'une des situations se présentaient.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés par exsanguination après perfusion intracardiaque de sérum physiologique sous anesthésie profonde (5% isoflurane, O2/N2O 1/1). DIRECTIVE 2010/63/UE, ANNEXE IV.
Remplacement
D’un point de vue scientifique cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic d’un mauvais état de santé chez l'homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un diagnostic positif de l’inflammation post AVC et de son rôle dans la mauvaise reperfusion sanguine cérébrale doit s’effectuer sur des modèles in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures et la littérature disponible sur les modèles animaux utilisés. En s’appuyant sur nos précédents projets et sur les données disponibles dans la littérature, nos estimations du nombre d’animaux utilisés sont faites de manière à bénéficier d’une puissance statistique suffisante, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront suivies quotidiennement par un personnel qualifié. Plusieurs fois par jour, un contrôle du bien-être animal est réalisé sur l’ensemble des animaux utilisés dans ce projet. Tous les moyens pouvant contribués à la diminution de la souffrance animale seront mis en oeuvre. Seules les expérimentations considérées comme indispensables seront réalisées sur les animaux. Les animaux sont suivis et manipulés quotidiennement par un personnel formé afin de réduire le stress les jours d’expérimentation.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) et le rat (rattus norvegicus) sont les espèces animales qui ont été le plus étudiées dans le domaines de l’accident vasculaire cérébrale et les caractéristiques de la pathologie sont donc bien connus. Dans cette étude, nous allons intéresser précisément à la microcirculation cérébrale et au taux de collatéralité des animaux. Les données de la littérature scientifique rapportent un certains nombre de différences en IRM de perfusion sur des modèles d’AVC entre rats et souris. Cette différence dans le taux de microcirculation pourrait en être la raison. Il y a également des différences importantes au niveau de cette microcirculation cérébrale entre différentes races d’une même espèce. Il y a aussi des différences de réponses à l’AVC ischémique marqués entre rats et souris. Pour les souris le stade de développement des animaux est de 8 à 12 semaines soit un poids de 35-40g. Nous effectuons donc notre modèle sur des jeunes adultes. Pour les rats nous utiliserons également des jeunes adultes, de 8 à 12 semaines soit un poids de 220 à 250g.
Mise en place d’un modèle de modification du rythme circadien dans la maladie d’Alzheimer et étude de l’efficacité de nouveaux candidats médicaments dans ce modèle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 496 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une injection intracérébroventriculaire d'agrégats de peptide bêta-amyloïde par chirurgie stéréotaxique, puis reçoivent un candidat-médicament chaque jour pendant dix-sept jours, avant un prélèvement terminal de sang et de cerveau. Le porteur mesure l'activité locomotrice pour évaluer les rythmes circadiens et indique que des effets indésirables comme une sédation peuvent apparaître. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun test in vitro ni modèle informatique ne rend compte du comportement d'un "organisme vivant entier" et conclut à l'impossibilité de remplacer l'animal.
Objectifs
Au cours du vieillissement normal, le sommeil se modifie et il peut être profondément altéré par certaines maladies neurodégénératives, tel que la maladie d’Alzheimer (MA). Les personnes souffrant de démences présentent à la fois des modifications de l’architecture de leur sommeil et des perturbations de leurs rythmes circadiens. Des études ont montré que le manque de sommeil peut augmenter de manière significative les taux de bêta-amyloïde dans certaines régions du cerveau. L’objectif de cette étude est 1) d'examiner si une injection intracérébroventriculaire (ICV) d'agrégats du peptide bêta-amyloïde Aβ (1-42) perturbe le rythme circadien chez le rat et 2) dans le cas où l'injection ICV d'agrégats Aβ (1-42) perturbe le rythme circadien, d’examiner l’effet d’une administration quotidienne de candidats médicaments sur ces perturbations préalablement observées.
Bénéfices attendus
Au cours du vieillissement normal, le sommeil se modifie et il peut être profondément altéré par certaines maladies neurodégénératives, tel que la maladie d’Alzheimer (MA). Les personnes souffrant de démences présentent à la fois des modifications de l’architecture de leur sommeil et des perturbations de leurs rythmes circadiens. 40 à 70 % des personnes ayant la MA éprouvent des problèmes de sommeil qui au fil du temps vont être amplifiés ; ce qui est épuisant pour la personne atteinte mais également pour son aidant. La prise en charge de ces troubles repose sur des traitements médicamenteux tels que des antipsychotiques ou des benzodiazépines. Mais ces médicaments ont souvent des effets indésirables inquiétants chez les personnes atteintes de la MA ; ils peuvent aggraver le déclin cognitif et accroître les risques de chute. Ainsi, ce modèle peut être utile pour le développement de cibles thérapeutiques pour traiter cette problématique.
Procédures
Dans un premier temps, les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale (injection d'Aβ (1-42) par stéréotaxie) qui dure dans sa totalité environ 45 minutes (de l'anesthésie jusqu'au réveil). Ensuite, au moment du test de comportement (test de l'activité locomotrice), les animaux reçoivent une injection par jour du candidat médicament; et ceci durant 17 jours maximum. A la fin de l’étude, juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang et de cerveau est réalisé sur l'ensemble des animaux. Cette procédure est réalisée sous anesthésie générale et elle dure en moyenne 20 minutes (dans sa totalité). Le prélèvement de cerveau est une demande fréquente dans les études de recherche préclinique. Cela permet de réaliser des mesures de paramètres biochimiques.
Impact sur les animaux
1) Chirurgie : injection ICV - Les rats sont anesthésiés avec de l’isoflurane et placés dans un appareil stéréotaxique. Puis, selon les groupes, une injection intracérébroventriculaire (ICV) d'agrégats du peptide bêta-amyloïde Aβ (1-42) ou de véhicule est réalisée. 2) Administration des candidats médicaments - Les administrations sont réalisées tous les jours et pendant toute la durée de l’enregistrement de l’activité locomotrice. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)
Devenir
Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.
Remplacement
L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucun modèle permettant d’évaluer le cycle circadien dans la maladie d’Alzheimer.
Réduction
Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.
Raffinement
Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux reçoivent trente minutes, avant l’acte chirurgical, une administration en sous-cutanée d’’un analgésique (Opiacés ou AINS). Après la chirurgie, les animaux reçoivent 1 ml de solution de lactate Ringer en sous-cutanée. Une coupelle contenant du « Gel Diet Energy » (Safe) mélangé à de la nourriture mouillée est déposée sur le sol de la cage pour stimuler l’appétit et la mobilité gastro-intestinale de l’animal. 24h post-opératoire, les animaux reçoivent une administration en sous-cutanée ou voie orale (per os) d’analgésique (Opiacés ou AINS). Ils sont pesés et leur état général est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter tous signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rats correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. La lignée de rat utilisée est : Sprague-Dawley 9-10 semaines au moment de la chirurgie. Les molécules développées sont destinées à des patients adultes.
Mise en évidence in vivo de l’activité de ligands du récepteur à la ghréline sur la sécrétion d’hormone de croissance, la prise alimentaire et l’homéostasie glucidique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 192
960 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les animaux reçoivent une à deux injections de ghréline et de ligands, avec une à trois gouttes de sang prélevées à la queue, pour caractériser l'effet de ces molécules sur l'hormone de croissance, la prise alimentaire et la glycémie. Le porteur indique que les nuisances se limitent au stress de la contention et des piqûres. Quarante-huit souris servant à la mise au point sont d'abord réutilisées, puis tous les animaux sont euthanasiés.
Objectifs
La Ghréline ou hormone de la faim stimule l'appêtit en signalant au cerveau qu'il est l'heure de manger. Elle contribue également à la régulation du glucose et de l'insuline et donc maintien l'équilibre du métabolisme. Elle stimule également la sécrétion de l'hormone de croissance. Ce projet vise à apporter une vision intégrée de la chimie, de la pharmacologie in vitro des ligands du récepteur et leurs effets biologiques in vivo. Plusieurs résultats remarquables sont issus de cette approche dont notamment la mise sur le marché aux USA et en Europe de la macimoréline pour le diagnostic des déficits de sécrétion de l'hormone de croissance. La découverte de nouveaux ligands pourrait conduire à de nouveaux médicaments permettant également de réguler les dysfonctionnements alimentaires chez l'homme.
Bénéfices attendus
L’activité des molécules agonistes sera caractérisée pour leur capacité à induire la sécrétion d'hormone de croissance, augmenter la prise alimentaire, diminuer la tolérance au glucose et augmenter la glycémie à jeun ou non à jeun. L’activité des molécules antagonistes sera caractérisée par leur capacité à bloquer l’induction d'hormone de croissance, l’augmentation de la prise alimentaire, la diminution de la tolérance au glucose et l’augmentation de la glycémie à jeun et non à jeun induites par la ghréline.
Procédures
Un analgésique local sera appliqué sur la queue de l'animal une heure avant le prélèvement de sang. Les animaux seront soumis à 1 ou 2 injections intrapéritonéales ou sous cutanées (injection de la ghréline et du ligand à 10 mn d'intervalle). Un à 3 prélèvements d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale seront réalisés à 15 min d'intervalle (selon les procédures 1,3,4,5) . Les injections intrapéritonéales prennent moins de 3 minutes et le prélèvement d'1 goutte de sang 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir un stress du à la contention pour l'injection (piqure de l'aiguille au niveau de l'abdomen ou en sous cutanée) et lors de la prise d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale
Devenir
48 souris utilisées dans la mise au point des conditions d’administration de la ghréline (procédure 1) seront gardées en vie pour être réutilisées dans les autres procédures (2 à 5) pour la mise au point des conditions d’administration de la ghréline . Ensuite tous les animaux de l'étude seront euthanasiés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de réaliser une preuve de concept in vivo de l’activité de ligands de synthèse du récepteur à la ghréline. Il n’existe pas de méthode alternative permettant de répondre à cet objectif.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, seuls les ligands les plus actifs in vitro seront évalués in vivo (sélectionnés vis-à-vis de leurs affinités et activités sur des cellules en culture). A chaque fois que cela sera possible, nous réaliserons des co-administrations afin de limiter à une seule injection l’administration des ligands testés en association avec la ghréline.
Raffinement
Les animaux seront habitués à la contention plusieurs jours avant le début de la procédure afin de limiter leur stress. Une crème anesthésiante (EMLA® lidocaïne, prilocaïne) sera appliquée sur la queue de l’animal au moins une heure avant l’expérimentation sur la région où sera prélevé le sang. Les traitements seront effectués en aigu (c'est à dire sur une courte durée) limitant les complications potentielles liées à des administrations chroniques.
Choix des espèces
Dans la littérature les tests d’activité in vivo des ligands du récepteur à la ghréline sont réalisés majoritairement chez le jeune rat et la souris. Aussi, la preuve de concept de l’activité des ligands synthétiques sur la sécrétion d'hormone de croissance chez 2 modèles d’études (rat et souris) est essentielle afin d’écarter une éventuelle sélectivité d’espèces. En effet, des études menées au laboratoire sur des modèles cellulaires alternatifs in vitro montrent que l’affinité et la puissance de certains ligands varient en fonction de la séquence du récepteur (humain / rat). Enfin, les faibles rendements de synthèse de certains ligands nécessitent plutôt l’utilisation de souris afin de réduire la quantité de produit à administrer. Lors des expériences, les rats seront âgés de 3 à 5 semaines. A cet âge, les niveaux de sécrétion d’hormone de croissance plasmatique sont relativement élevés et cette sécrétion est plus sensible aux agonistes du récepteur de la ghréline. Les souris seront âgées de 1 à 2 mois conformément aux données de la littérature.
Mécanismes physiologiques des effets du soluté de lactate de sodium molaire sur la fonction cardiaque et énergétique au cours du sespis
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
75 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance qualifiés de légers à sévères. Un choc septique est provoqué par ligature et ponction du cæcum au cours d'une laparotomie, avec pose d'un cathéter dans la jugulaire, pour étudier les effets du lactate de sodium sur la fonction cardiaque. Le porteur indique que le processus inflammatoire peut conduire à une défaillance multiviscérale. Les rats sont ensuite euthanasiés pour prélever leurs organes.
Objectifs
Les travaux de notre laboratoire ont mis en évidence les effets bénéfiques du lactate en situation septique, nous n’avons pas pu explorer les mécanismes sous-tendant ces effets. L’objectif de présent projet expérimental est donc d’explorer ceux-ci par des approches in vivo et ex vivo.
Bénéfices attendus
Pour les patients atteints d'une pathologie, lié à une septicemie, les résultats préliminaires de notre étude apporteront une meilleure prise en charge thérapeutique, par l'amélioration de la compréhension des mécanismes pathologiques en jeu et du bénéfice d'un traitement au lactate.
Procédures
Les animaux auront une opération chirurgicale, de type"laparotomie", en vue de réaliser une ligature et une ponction caecale, pour l'induction d'un choc septique. De plus, nous ferons une cervicotomie, dans le but de poser un catheter sur la jugulaire droite, dans un but de perfusion. La durée totale de cette chirurgie sera de 30 minutes.
Impact sur les animaux
les nuisances principales sont principalement un processus inflammatoire, pouvant conduire à une défaillance multiviscérale.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés (Euthoxin en IP), afin de réaliser les prélèvement d'organes
Remplacement
Ce projet se propose d’étudier l’impact du lactate de sodium molaire au cours du sepsis expérimental induit par ligature et perforation caecale (CLP), dans des conditions de physiologie et de physiopathologie intégrées. L’utilisation de cellules ou de modèles expérimentaux ex vivo est par conséquent inadéquate pour répondre de façon pertinente aux questions posées dans le cadre de ce travail.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est optimal et minimal pour l'analyse et les outils statistiques.
Raffinement
Les données obtenues chez des animaux témoins (non-opérés) ou contrôles seront réutilisées autant que possible dans des études complémentaires ultérieures. Par exemple, des échantillons d’organes et des coupes histologiques seront préservés dans le laboratoire pour être réutilisés au cours d’autres protocoles. Les animaux seront observés régulièrement pendant les 6 premières heures suivant la chirurgie puis 1 fois par jour durant toute la durée du maintien en vie (1 mois). Les deux critères permettront indépendamment l’un de l’autre de définir des points limites pour cette étude. A savoir : 1 - une perte de poids importante (10% du poids du corps), des signes physiologiques ou comportementaux fortement modifiés, ou l’apparition d’une infection urinaire sévère modifiant la diurèse, 2 – un score (grimace sclae) basé sur l’expression faciale supérieur à 4. Une observation quotidienne sera tout de même effectué, afin d'oberver les animaux et d'utiliser l'outil de diagnostic , basé sur "le grimace scale": Définition de l'indice grimace faciale ou grimace scale; il est basé sur l'observation de 4 caratéristiques faciales marquant la souffrance , à savoir le resserrement orbital, le renflement du nez ou le renflement des joues, la position des oreilles et le changement des vibrisses. chaque signe clinique établi un score, voici le tableau définissant la méthode: 0-aucun signe De 1 à 3 : signes modérés, a ce stade, l'administrtion de morphinque sera réalisé (Buprecare), afin de limitre la souffrance. A partir de 4: ces signes évidents de caractéristiques de la souffrance, nous conduisent à l'euthnasie de l'animal ( une injection d'une dose léthale d'Euthoxin sera réalisé en IP)
Choix des espèces
Nous allons utiliser pour ce projet des rats de souche wistar. Ce choix se justifie par l’abondante littérature basée sur le sepsis expérimentale et l’expérience du laboratoire. Les animaux adultes mâles (10+/-2 semaines) seront utilisés à un poids compris entre 400 et 500g afin de faciliter la procédure expérimentale.
Contribution de l’immunité intestinale aux effets de la chirurgie de l’obésité
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1800 rats vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures majoritairement classées de souffrance sévère. Rendus obèses par un régime gras et sucré, ils subissent des gavages, des injections d'insuline et des prises de sang sur animal vigile, et une partie une chirurgie de l'estomac et de l'intestin de type bariatrique. Le porteur affirme qu'il n'est pas possible de recréer sans animaux la complexité des interactions entre l'intestin et le système immunitaire, tout en indiquant développer en parallèle des mini-intestins en culture pour les remplacer à terme. L'objectif est de comprendre le rôle de l'immunité intestinale dans les effets de la chirurgie de l'obésité.
Objectifs
L’obésité est une maladie chronique et un problème de santé publique majeur souvent associée au diabète. En France, elle est en augmentation constante depuis plusieurs années et touche maintenant près de 15% de la population. La chirurgie bariatrique (appelée aussi chirurgie de l'obésité) est le traitement de référence quand l’obésité devient très grave et dangereuse pour la santé. C'est une chirurgie qui remodèle l'estomac et l'intestin. Les deux chirurgies les plus pratiquées en France sont la Vertical Sleeve Gastrectomy (VSG, 80% de l'estomac est retiré) et le Roux-en-Y Gastric Bypass (RYGB, l'estomac et une partie de l'intestin sont détournés du circuit des aliments). L’obésité est asociée à une inflammation qui se caractérise par une augmentation des cellules immunitaires qui ont de nombreux effets délétères. L'intestin possède ses propres cellules immunitaires qui sont peu étudiées mais qui pourraient être impliquées dans le développement de l’obésité et du diabète, et donc pourraient jouer un rôle dans les effets bénéfiques de la chirurgie sur la perte de poids ou la réduction du diabète. Les objectifs du projet sont de caractériser le système immunitaire de l'intestin au cours de l’obésité et après chirurgie bariatrique et de déterminer son rôle sur la résolution du diabète observée après l’opération. Nous allons également comparer les effets de la chirurgie sur le diabète aux effets d’un antidiabétique couramment utilisé, la metformine, et caractériser les effets de la combinaison des deux (chirurgie et metformine).
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront d’obtenir des données uniques pour caractériser les conséquences de la chirurgie bariatrique de type VSG et RYGB sur l’immunité intestinale et comprendre le rôle de l’immunité intestinale dans les effets bénéfiques de la chirurgie bariatrique combinée ou non à un anti-diabétique couramment utilisé chez l'homme.
Procédures
Les animaux sont nourris pendant 14 semaines avec un régime riche en graisses et sucres qui va leur faire prendre du poids. Ils sont soumi, éveillés, à des gavages (glucose ou anti-diabétique), des injections intra-péritonéales (insuline) et des prélèvements de sang à la queue. Au maximum, les animaux, toujours éveillés, subissent 3 gavages de glucose et 3 injections d'insuline suivis de prélèvements à la queue. Chaque manipulation est séparée d'au moins une semaine. Une partie des animaux aura une chirurgie intestinale (opération RYGB ou VSG ou contrôle) qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie et va entrainer une perte de poids.
Impact sur les animaux
Le régime riche en graisses et en sucres est extrêmement agréable pour les animaux mais il entraine une prise de poids. Cependant, et contrairement à l'homme, il n'y a pas de maladies associées dans ce modèle (ni diabète, ni foie gras). Une augmentation modérée du taux de sucre dans le sang est parfois observée. L'anti-diabétique est très utilisé chez l'homme, il permet de diminuer le taux de sucre dans le sang des animaux diabétiques sans effets néfastes associés. Les chirugies sont réalisés sous anesthésie avec une prise en charge de la douleur avant, pendant et après l’acte chirurgical .Ces chirurgies entrainent une perte de poids sans aucun autre problème associé (pas de dénutrition majeure, pas de diarrhée). Les gavages, les injections et les prélèvements sanguins sont réalisés dans le respect du bien-être animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de toutes les procédures afin de prélever et d'analyser leur système immunitaire intestinal
Remplacement
Il n’est pas possible de re-créer sans l'usage d'animaux, la complexité des interactions entre le tractus gastro-intestinal et le système immunitaire intestinal dans les maladies associées à l’obésité comme le diabète. En parallèle de l’étude chez l’animal, la mise en place d’organoïdes à partir des intestins prélevés, c'est-à-dire de culture de cellules permettant de recréer et d'étudier des mini-intestins sans animaux, va permettre à terme de remplacer les animaux pour certaines études.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables. Au final, ce projet nécessitera l'utilisation de 810 rats Wistar et 810 rats GK sur 5 ans. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet.
Raffinement
L'ensemble des procédures de ce projet se fera dans le respect du bien-être animal. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur, avec l’administration d’analgésique, comme cela se fait chez les patients opérés d’une VSG ou d’un RYGB, est prévue avant, pendant et après l’opération. Nous avons inclus dans toutes les procédures des grilles de suivi de poids et de la prise alimentaire des animaux avec des pesées journalières les 15 jours après l'opération puis hebdomadaires, ainsi qu’une grille d'évaluation de la douleur avec des points limites précis et adaptés. Nous essayons de limiter au maximum l'isolement des animaux mais quand cela est nécessaire nous enrichissons les cages avec des tubes en polycarbonate.
Choix des espèces
Le rat est connu depuis longtemps pour être un bon modèle d’étude de l’obésité, suffisamment gros pour pouvoir reproduire le plus fidèlement possible les chirurgies réalisées chez l'homme. De plus il existe une souche de rat qui devient naturellement diabétique que nous utilisons également dans ce projet. Nous utilisons des animaux adultes mâles et femelles obèses car 80% des chirurgies sont réalisées chez des femmes adultes et 20% chez des hommes adultes.
Développement d’un traitement (dispositif médical) contre l’obésité par stimulation bioélectronique du système sympathique chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
300 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une chirurgie permettant d'enregistrer et de stimuler le système nerveux sympathique, puis est mis à mort en fin d'intervention. Le porteur, une société, indique vouloir développer un dispositif médical contre l'obésité par stimulation électrique, et affirme qu'aucun test in vitro validé n'offre d'alternative pour un phénomène jugé trop complexe. Il présente les traitements actuels comme insuffisants pour justifier ce développement.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de développer un dispositif médical contre l’obésité par stimulation bioélectronique du système nerveux sympathique chez le rat. De nombreux arguments et données scientifiques sont en faveur de l’existence d’une modulation neuronale du système nerveux sympathique pour traiter l’obésité. En effet, les signaux acheminés (nommés afférences) par le système nerveux sympathique jouent un rôle important dans la prise alimentaire: -1/3 des neurones spinaux sont sensibles à la distension stomacale, également nommé gastroparésie trouble fonctionnel digestif caractéristique de l’obésité, généralement chronique et caractérisé par un ralentissement de la vidange de l’estomac, en l’absence de tout obstacle mécanique. -Les afférences sympathiques sont sensibles à l’augmentation de glucose dans le duodénum. - L’inhibition des afférences sympathiques augmente la prise alimentaire. La stimulation du système nerveux sympathique pourrait être une solution permettant de lutter contre l’obésité. Les traitements actuels sont inefficaces. En effet, les traitements existants les plus efficaces sont le by-pass gastrique et la chirurgie bariatrique dont les effets passent par le système nerveux sympathique. Cette hypothèse d’une implication du système nerveux sympathique a été testée chez le rat. Cependant, ces deux traitements sont très invasifs et entraînent des effets indésirables (troubles digestifs, vomissement…) chez l’humain. Le développement d’un dispositif médical permettant par électrostimulation du système sympathique la régulation de la prise alimentaire pourrait être un outil très prometteur afin de lutter contre l’obésité. Les avantages de ce dispositif seraient : - de cibler les effets de l’électrostimulation par une organisation régionale du système sympathique - d’activer un arc reflexe simple - Une localisation anatomique qui rendrait le positionnement du dispositif accessible par voie dorsale - Une mise en œuvre peu invasive. Un dispositif similaire d’électrostimulation a déjà été approuvé en 2014 par la FDA pour le traitement de douleurs dorsales réfractaires à la chirurgie.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’obésité (Muller et al. Nat Rev Drug Discov 2021). Les deux traitements les plus efficaces sont le by-pass gastrique et la chirurgie bariatrique qui sont des traitements lourds, engendrant de nombreux effets secondaires. Par conséquent, le développement de traitements moins invasifs, plus efficaces et sans effets secondaires est nécessaire pour lutter contre l’obésité.
Procédures
La procédure de ce projet est sans réveil. Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale afin de réaliser les enregistrements/stimulation du système sympathique. Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.
Impact sur les animaux
La procédure mise en œuvre dans ce projet est une procédure sans réveil. La chirurgie et les enregistrements/stimulations seront menés dans le respect de la règle des 3R avec des protocoles d’anesthésie/analgésie adaptés à l’espèce de façon limiter au maximum la douleur.
Devenir
Les animaux inclus dans une expérimentation seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement ou test in vitro connu qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet. Le phénomène d’obésité ne peut être étudié correctement in vitro car il s’agit d’un phénomène complexe et doit donc être étudié chez l’animal, intégrant l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle expérimental in vivo est donc un prérequis à la phase de développement clinique. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour les animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.
Réduction
Le nombre de rat a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un test statistique. Les résultats seront analysés avec GraphPad Prism. Nous adapterons les tests statistiques en fonction de la distribution des observables, qu'elle soit normale (tests paramétriques : t-test pour comparer 2 échantillons, ANOVA pour comparer le nombre d’échantillons) ou non (tests non paramétriques : Mann-Whitney ou Kruskall Wallis). De plus des dispositions sont prises pour éviter tout double emploi injustifié des procédures expérimentales. Cette procédure est menée au sein d'une société qui effectue une planification rigoureuse des expériences menées. Elle ne duplique en aucun cas une autre procédure expérimentale.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (par exemple : igloos, briques de bois à grignoter, ambiance sonore dans la salle, commutation progressive de la lumière, etc.). Suivra alors une période d’acclimatation de 5 jours minimum, pendant laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera réalisé. Les conditions d’hébergement et de soins, et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Le contrôle mortalité des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (Week-ends & jours fériés) par du personnel compétent et qualifié. Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement par l’observation des signes cliniques. Soins : Des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés.
Choix des espèces
L’espèce rat sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant une implication du système nerveux sympathique dans la prise alimentaire sur ce modèle. Ce modèle sera par la suite transposé à l’humain. Utilisation d’animaux adultes car l’objectif est le développement d’un dispositif médical pour les sujets adultes.
Contrôle optique aigu de l’activité électrique cardiaque dans un modèle de rat anesthésié
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
110 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une ouverture de la cage thoracique et un enregistrement de l'activité cardiaque de moins de quarante-cinq minutes, avant l'euthanasie. Le porteur indique tester des peptides rendus sensibles à la lumière pour contrôler optiquement le rythme cardiaque, et affirme que seule l'expérimentation animale permet de valider l'intérêt clinique de l'approche. Il s'agit d'une preuve de concept, les perspectives thérapeutiques étant renvoyées à des étapes ultérieures.
Objectifs
Les troubles du rythme cardiaque d’origine génétique, médicamenteuse ou bien secondaires à une pathologie cardiaque ischémique conduisent dans de nombreux cas à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Les approches thérapeutiques actuelles requirent l’implantation d’un défibrillateur automatique ou bien l’utilisation de molécules anti-arythmiques dont la fenêtre thérapeutique est étroite en raison des effets secondaires associés à ces molécules. L'objectif de ce projet est de démontrer la possibilité de contrôler optiquement et in vivo l’activité électrique cardiaque dans un modèle de rat sauvage en utilisant des peptides préalablement rendus photo-sensibles. Les composés sont injectés sous forme inactive. L’illumination à 365-405 nm permet un clivage du groupement protecteur et donc l’activation du peptide dans les zones illuminées uniquement. Ces peptides ont été sélectionnés in vitro pour leurs effets sur des cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors d’études précédentes. Ainsi, par cette approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque, il sera par la suite possible de cibler les zones arythmogènes du cœur dans des modèles murins arythmiques ou bien chez le gros animal.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre : 1. de faire la preuve de concept du contrôle optique de l’activité de composés ciblant les canaux ioniques présents dans le cœur et impliqués dans la génération des arythmies cardiaques, et 2. de contrôler la survenue d’arythmies cardiaques en s’affranchissant des effets secondaires dans les zones du cœur non ciblées, offrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
La totalité des animaux sera soumise à une thoracotomie et un enregistrement électrocardiographique 6 dérivations. Le temps total de l’intervention sera inférieur à 45 min.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale mise en œuvre lors de ce projet nécessite la mise en place d’une thoracotomie. La gestion préopératoire de la douleur doit empêcher la survenue d’effets indésirables. Il s’agit d’une procédure sans réveil qui ne nécessite donc pas d’analgésie post-opératoire. Une étude précédente a démontré en aigu et chez la souris, l’absence d’effets indésirables de l’injection d’un peptide protégé comme réalisé dans cette étude. De plus l’ensemble de la procédure sera faite sous anesthésie avec sacrifice de l'animal en fin d'examen.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés par injectionintrapéritonéale de dose léthale de pentobarbital sodique (120 mg/kg) après sédation.
Remplacement
Cette étude requiert une exploration fonctionnelle afin de valider in vivo une approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque. Seule l'expérimentation animale peut permettre de déterminer si l’approche testée présente un intérêt clinique en limitant la survenue d’arythmies. Les peptides qui seront testés chez la souris ont été sélectionnés pour leurs effets sur nos cibles thérapeutiques à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.
Réduction
Un maximum de 110 rats seront utilisés dans cette étude. Au fur et à mesure de l'inclusion des données, des analyses statistiques seront réalisées. Si une différence statistiquement significative entre les rats du groupe contrôle et ceux recevant une illumination apparait (une valeur de p
Raffinement
Avant la procédure, Les rats seront hébergés par couple en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie (isoflurane) avec une prise en charge analgésique adaptée. Les peptides à tester, sous leur forme protégée, ayant été sélectionnés pour leur absence d’activité sur leurs cibles, nous n'anticipons pas de douleur ou d'effets indésirables suite à leur injection. Toutefois, si l'un des peptides devait entrainer des effets indésirables détectables sous anesthésie, comme des difficultés respiratoires ou des convulsions, l'examen serait interrompu et le rat euthanasié. Au cours de la chirurgie, un saignement abondant non maitrisable ou bien une extubation de l’animal conduirait à une euthanasie de celui-ci.
Choix des espèces
Le rat constitue un bon modèle pour l’études des arythmies cardiaques et de part la taille du cœur, offre une approche plus aisée que la souris pour le contrôle optique et localisé de l’activation des composés injectés. L'étude sera réalisée sur des rats adultes de 8-10 semaines pour faciliter les abords chirurgicaux.
Etude de l’impact de la chirurgie de l’obésité sur la grossesse de la rate obèse
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système urogénital
160 rats, 140 femelles et 20 mâles, vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les femelles sont rendues obèses par un régime gras et sucré, subissent l'ablation de 80 % de l'estomac, puis enchaînent trois gestations avec échographies et prises de sang répétées sous anesthésie. Le porteur indique que les nouveau-nés sont mis à mort deux jours après la naissance et les femelles après leur troisième gestation, pour prélever utérus, placentas et fœtus. Il affirme que la complexité de la gestation des mammifères rend ce modèle "indispensable", la retombée pour les femmes opérées restant hypothétique.
Objectifs
L’obésité, maladie chronique, est un problème de santé publique majeur. En France, elle touche environ 15% de la population. La chirurgie bariatrique (appelé aussi chirurgie de l'obésité) est le traitement de référence quand l’obésité devient morbide, c'est-à-dire dangereuse pour la santé. Actuellement, l’intervention de chirurgie bariatrique la plus réalisée en France est la sleeve qui consiste à enlever 80% de l'estomac. Cependant chez la femme enceinte qui a été opérée de sleeve, le fœtus présente un petit poids pour l’âge gestationnel. Le poids au cours de la gestation et à la naissance est lié à la prise de poids pendant la grossesse et à l’état nutritionnel maternel mais ces paramètres n’expliquent pas les observations. Il est donc probable que d’autres facteurs soient perturbés par la sleeve. La sleeve est responsable de la perte de la majorité des cellules qui produisent la ghréline, une hormone de l’estomac impliquée dans la prise alimentaire (c'est l'hormone qui donne faim) mais également impliquée dans le développement fœtal. Le taux de ghréline est diminué après sleeve mais aucune étude n’a évalué le taux de ghréline maternel au cours de la grossesse et son influence sur le déroulé de la grossesse. Chez les rates en gestation comme chez des femmes enceintes, un taux bas de ghréline pourrait avoir un effet direct sur la croissance du foetus ou un effet sur les vaisseaux sanguins du placenta qui permettent d'alimenter le foetus. Les objectifs du projet sont d’analyser les effets de la sleeve sur la gestation, le développement du placenta, la croissance fœtale et le nombre de petits chez des rates rendues obèses par un régime riche en graisses et en sucres.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de comprendre pourquoi les rates femelles qui ont eu une opération de type sleeve et ont perdu du poids donnent naissance à des ratons trop petits. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre ce qu'il se passe chez les femmes et d'envisager des compléments alimentaires ou des traitements médicamenteux pendant la grossesse pour limiter le risque de donner naissance à des bébés trop petits.
Procédures
Les animaux sont nourris avec un régime riche en graisses et en sucres pendant 14 semaines pour devenir obèses. Ils subissent ensuite une chirurgie de type sleeve (retrait de 80% de l'estomac). L'opération se fait sous anesthésie gazeuse et la douleur est prise en charge avant, pendant, et après l'opération qui dure 20 à 40min. Les animaux vivent trois cycles d'accouplement et gestation. 9 échographies et 14 prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (15-30min d'anesthésie à chaque fois) sont également réalisés. Il se passe au moins une semaine entre chaque prélèvement et entre chaque cycle de gestation.
Impact sur les animaux
Le régime riche en graisses et en sucres est extrêmement agréable pour les animaux mais il entraîne une prise de poids. Cependant, et contrairement à l'homme, il n'y a pas de maladies associées dans ce modèle (ni diabète, ni maladie du foie). La sleeve, qui est réalisée sous anesthésie avec une prise en charge de la douleur avant, pendant, et après l’acte chirurgical, entraîne une perte de poids sans autre problème associé (pas de dénutrition majeure, pas de diarrhée). Les échographies sont indolores et réalisées sous anesthésie. Les prélèvements sanguins sont réalisés dans le respect du bien-être animal sous anesthésie en même temps que les échographies quand cela est possible. Les animaux sont isolés après la chirurgie mais leur environnement est enrichi avec un tube de polycarbonate et du coton pour permettre aux femelles de faire un nid.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Les nouveau-nés sont euthanasiés 2 jours après leur naissance afin d'étudier leur développement et caractériser en détails les poids et tailles des différents organes. Les mâles reproducteurs sont euthanasiés quand ils sont âgés de plus de 6 mois car leur fécondité n'est plus optimale et des prélèvements post mortem sont réalisés et utilisés dans d'autres projets. Les femelles sont euthanasiées à la fin de leur 3e gestation afin de prélever les utérus, les placenta et les foetus avant la mise bas et caractériser en détails la vascularisation et le développement des placentas et des foetus.
Remplacement
Il n’est pas possible de créer, sans l'utilisation d'animaux, la complexité de la gestation des mammifères. L’utilisation du modèle animal, pour suivre la gestation, la taille des portées et des bébés à la naissance et pour étudier le développement du placenta, est donc indispensable.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables. Pour limiter le nombre d’animaux, nous multiplions le nombre de gestation par femelle tant que cela est possible. 20 femelles par groupe sont nécessaires. Il y a 7 groupes: 3 groupes non obèses (non obèse non opéré, non obèse opéré d'une chirurgie factice, non obèse opéré de sleeve) et 4 groupes obèses (obèse non opéré, obèse opéré d'une chirurgie factice, obèse opéré de sleeve, obèse mis au régime) nécessitant au total 140 femelles et 20 mâles pour les accouplements.
Raffinement
L'ensemble des procédures de ce projet se fera dans le respect du bien-être animal. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur est prévue avant, pendant, et après l’opération. Nous avons inclus dans toutes les procédures des grilles de suivi de poids et de la prise alimentaire des animaux avec des pesées journalières les 15 jours après l'opération puis hebdomadaires, ainsi qu’une grille d'évaluation de la douleur avec des points limites précis et adaptés.
Choix des espèces
Nous développons notre projet en utilisant le modèle de rongeur rat. Le rat est un bon modèle d’étude de l’obésité, suffisamment gros pour pouvoir reproduire le plus fidèlement possible les chirurgies réalisées chez l'homme. C'est aussi un modèle couramment utilisé pour étudier le développement du placenta, des embryons et des fœtus. Nous utilisons des animaux adultes (femelles et mâles) puisque nous les mettons en accouplement et étudions la gestation et le développement des fœtus.
Optimisation de l’imagerie non invasive (IRM et TEP) dans le cadre de tumeurs cérébrales et dans les AVC
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 100
200 animaux, 100 souris et 100 rats, vont être utilisés dans des procédures classées de souffrance modérée à sévère, la plupart tués à l'issue et cinquante animaux témoins réutilisés. Les rats reçoivent une tumeur cérébrale et les souris un accident vasculaire cérébral provoqué, la gravité venant de ces modèles et non des séances d'imagerie qui suivent. Le porteur indique que l'objectif est d'optimiser des séquences d'IRM et de TEP fournies par le constructeur, un travail de mise au point technique de la plateforme. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité d'étudier ces pathologies dans un "organisme entier".
Objectifs
Le projet consistera principalement à optimiser des séquences en imagerie par resonance magnétique grâce à un imageur à très haut champ. La plateforme dispose également d’un imageur hybride qui réalise des imageries par resonance magnétique couplés à de la tomographie par émission de positons qui permet des imageries à haute résolution. Les séquences et acquisitions à optimiser bénéficieront aux deux imageries. Pour cela nous avons prévu d'étudier les deux pathologies à étude. Les séquences à optimiser seront celles disponibles pour nos imageurs que nous souhaitons optimiser : anatomiques, de diffusion, de perfusion, ... avec injection ou non de produits de contraste ou de produits spécifiques.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons optimiser nos séquences d'imagerie à la mailleure qualité possible afin d'assurer aux chercheurs un maximum de signal réalisant des manipulations le plus courtes possibles (techniques moins invasives pour les animaux et moins de frais de temps machine et personnel).
Procédures
Les animaux setont inclus dans les groupes expérimentaux: - rats : tumeurs ou controles. - souris : accident vasculaire cérébral ou controles. Ils suivront donc une des deux procédures ou en seront les controles (sans chirurgie). Modèle tumoral : anesthésie maximum 30 minutes. Modèle d'accident vasculaire cérébral, anesthésie maximum 120 minutes. Dans les deux casn ils suivront les optimisations d'imagerie suivant maximum 3heures d'expérience pour les rats et 1,5h pour les souris, incluant le temps de pose de cathéter quand nécessaire (autour de 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux suivront des procédures d'imagerie qui ne sont pas invasives. Les séances se feront sous anesthésie et analgésie. Nous savons de facto qu'une pose de cathéter sera nécessaire pour des challenges en imagerie dynamique par exemple ou pour l'injection simple de contrastes, l'analgésie sera faite en conséquence. Nous avons prévu une analgésie locale (lidocaïne en spray) puis également à la buprénorphine au moment de la sédationLes animaux qui suivront des procédures pour la création d'AVC ou de tumeurs cérébrales auront en plus suivi le modèle propre à la thématique et qui prévoit une analgésie adaptée. La sévérité du protocole ne vient pas des séances d’imagerie mais des modèles utilisés (création de tumeurs et d’AVC) en amont de cette imagerie. Pour le modèle tumoral, d'après notre expérience les animaux ont un comportement social et score clinique normal. Néanmoins, un suivi du volume tumoral et du poids de l'animal est fait pour suivre le bien-être des animaux. Pour le modèle d'AVC, d'après notre expérience les animaux récupèrent de la chirurgie sans problème de comportement ou de score clinique une fois l'analgésie post-opératoire faite. Néanmoins, un suivi du score clinique est réalisé afin de suivre le bien-être des animaux.
Devenir
Les animaux modèle ont eu des procédures chirurgicales qui sont cumulées à l'imagerie. Ils seront mis à mort à la fin de la dernière séance d'imagerie, sous anesthésie (comme décrit dans l'onglet mise à mort). Les animaux contrôle seront réutilisés si possible pour les formations prévues en interne car ils n'auront pas subi d'interventions invasives (les animaux avec contraste auront eu une pose de cathéter veineux à la queue, nous attendrons une récupération totale avant réutilisation, au minimum d'une semaine). Ces animaux que nous prévoyons pouvoir réutiliser sont les 5 controles utilisés par an, donc 25 pour chaque espèce et pour l'intégralité du projet.
Remplacement
Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’étudier les deux pathologies à étude dans un organe spécifique qu’est le cerveau et d’un organisme entier.
Réduction
Pour chaque pathologie, 15 animaux « modèle » et 5 « contrôle » seront utilisés au maximum afin de valider ces séquences d’IRM par an (20 rats et 20 souris par an, donc 100 rats et 100 souris maximum en total pour tout le projet). Nous tenons compte du temps machine disponible en interne pour notre section de recherche et développement et la disponibilité de notre personnel pour réaliser deux séances de test par mois maximum. De plus, ces groupes expérimentaux sont calculés suivant le fait que le constructeur Bruker met à disposition 41 séquences d'imagerie que nous souhaitons optimiser pour assurer aux chercheurs un maximum de signal dans le minimum de temps possible. Cette optimisation ne nécessitera donc pas plus d'animaux que 50 par an maximum.
Raffinement
Tous les moyens sont mis en oeuvre afin de limiter la souffrance animale. En pré-opératoire et lors de la chirurge les animaux seront anesthésiés à l'isoflurane (4% en induction dans l'O2; 2.5% dans un mélange O2/N2O 30/70%). Une anesthésie locale est appliquée aau niveau de la sutire cutanée (xylocaïne 2%). En péri-opératoire, l'analgésie est assurée par l'injection de buprénorphine (0.05mg/kg au moment de l'installation dans la paillasse) et répétée à 6-8h post-chirurgie. Une surveillance post-opératoire est effectuée quotidiennement pour le suivi des points limites avec une pesée pour le suivi de croissance tumorale (3 fois par semaine). Si l'apparition de signes de critères de mise à mort s'avèrent, les animaux seront ethanasiés. Lors des examens d'imagerie par IRM et/ou TEP, les animaux seront anesthésiés de la même manière.
Choix des espèces
D’après l’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et grâce à l’expérience des plateformes thématiques développant ces modèles, nous avons décidé d’utiliser les espèces choisies : - des rats wistar pour l’implantation intrastriatale de cellules 9L permettant de développer des tumeurs. - des souris swiss dans le cas de l’étude de l’AVC, avec une occlusion de l’artère cérébrale moyenne reperfusées au bout de 20 minutes. Les rats seront âgés d’environ 8 semaines (250g) et les souris 8-10 semaines (30-35g) en début de protocole. Nous effectuons les procédures sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles de tumeurs cérébrales et d’AVC.
Evaluation de l’Imlifidase combinée à la thérapie génique AAV dans la maladie de Crigler-Najjar, en présence d’anticorps neutralisants
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
140 rats vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Ces rats d'une lignée naturellement atteinte d'une maladie du foie reçoivent des injections intraveineuses et de nombreuses prises de sang sur deux mois, tantôt vigiles sous contention, tantôt sous anesthésie. Le porteur indique que le traitement testé peut provoquer des réactions allant jusqu'au choc anaphylactique, une hypotension ou des troubles rénaux, et affirme que le recours à l'animal est obligatoire pour le développement clinique. L'objectif est d'élargir l'accès à la thérapie génique aux patients porteurs d'anticorps, retombée renvoyée à la clinique future.
Objectifs
Aujourd’hui, dans le cadre d’une utilisation clinique de la thérapie génique utilisant un virus adeno-associé recombinant, seuls les patients séronégatifs, c'est-à-dire ceux qui ne possèdent pas d’anticorps préexistants dirigés contre ce virus, peuvent bénéficier du traitement. Cette réponse en anticorps est variable selon le type de virus adeno-associés : les études ont montré que 5% à 70% de la population possèdent des anticorps neutralisants, y compris parmi la population pédiatrique. Cette forte immunisation limite considérablement l’accèssibilité au traitement. Pour remédier à cela, différentes approches ont été explorées au cours des dernières années : (i) immunomodulations pharmacologiques ou physiques, telles que l'utilisation d'immunosuppresseurs ou de la plasmaphérèse, (ii) ingénierie des virus recombinants pour contourner les défenses immunitaires, etc... mais aucune de ces techniques ne permet aujourd’hui l’inclusion des patients séropostifs, c'est-à-dire les patients qui possèdent les anticoprs, dans les essais cliniques. L'utilisation de l’imlifidase, une enzyme d'origine bactérienne capable de dégrader les anticorps humains, semble être une approche très prometteuse que nous souhaitons développer jusqu’à la clinique. Notre laboratoire a conçu un virus adeno-associé recombinant spécifique pour traiter le syndrome de Crigler-Najjar, une maladie métabolique extrêmement rare (1 naissance sur 1 million en France). Il est important de permettre à tous les patients atteints par cette maladie, y compris aux patients séropositifs, de bénéficier de ce traitement. Pour cela, nous souhaitons étudier l'efficacité de l'imlifidase à éliminer les anticorps préexistants dirigés contre notre virus recombinant et évaluer ses potentiels impacts sur la thérapie génique pour Crigler-Najjar. Ces études seront réalisées chez le modèle animal de cette pathologie, le rat Gunn. Les résultats de ces travaux serviront non seulement pour cette maladie, mais aussi à l’ensemble des programmes utilisant le virus adéno-associé recombinant pour une thérapie génique.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, de nombreux patients ne peuvent pas avoir accès aux traitements innovants qui sont développés à base de virus adeno-associés recombinants, car ils possèdent des taux d’anticorps neutralisants trop importants. Le statut sérologique des patients est aujourd’hui un des critères d’exclusion qui écarte le plus de patients d’un essai clinique. Les travaux de recherche pouvant aboutir à l’inclusion de ces patients sont donc extremement attendus par la communauté scientifique mais surtout par les patients eux-même, qui espèrent voir un jour la possibilité de recevoir un traitement. Nous souhaitons développer cette approche jusqu’à la clinique, dans un premier temps pour le syndrome Crigler-Najjar, mais elle pourra être étendue à tous les programmes scientifiques basés sur l’administration de virus adeno-associés recombinants, soit plus de 260 études cliniques référencées courant octobre 2021.
Procédures
En début de procédure, à j0 et j1, des injections intraveineuses (2 à 3 selon les procédures) seront reálisées sur les animaux vigiles placés sous contention (~200uL/injection). Les rats seront suivis et pesés pendant 2 mois et des prises de sang régulières seront effectuées (à j-2, j0, j1, j14, j30, j45, j60). Le volume maximal prélevé sera ~600uL/semaine. Ces prises de sang seront réalisées alternativement sur rat vigile, sous contention (veine caudale) et sur rat anesthésié sous isoflurane (veine submandibulaire).
Impact sur les animaux
Le rat Gunn est atteint d’une hyperbilirubinémie modérée pouvant provoquer chez lui, dans de rares cas, une atteinte neurologique. Toute manipulation/contention du rat vigile est susceptible de provoquer chez lui un stress. Aucun effet indésirable n'est attendu suite à l'administration des traitements décrits dans ce projet. Il est toutefois décrit quelques effets secondaires possibles comme : des réactions d’hypersensibilité/allergiques pouvant aller jusqu'au choc anaphylactique, une certaine hypotension, ou des troubles rénaux.
Devenir
A la fin des procédures 1 et 2, les rats sont euthanasiés afin de collecter les organes pour analyses.
Remplacement
Imlifidase étant une enzyme qui fonctionne essentiellement sur les anticorps humains, la grande majorité des informations essentielles à la démonstration de la faisabilité et de l’efficacité de cette approche seront tirées des expériences réalisées in vitro, sur des prélevements sanguins de donneurs et/ou patients (i.e cinétique d’action, dose efficace, ...). De plus, cette molécule étant déjà commercialisée (domaine des transplantations rénales), beaucoup de données sont disponibles dans la littérature. Cependant le recours à l’animal s’avère obligatoire pour le développement clinique de cette molécule dans une application en thérapie génique, afin d’étudier ses interférences éventuelles sur l’efficacité des virus adéno-asscociés recombinants, nottament celui que notre laboratoire a developpé pour la maladie de Crigler-Najjar. En effet, les paramètres physiologiques tels que la biodisponibilité du virus, une/des réponse(s) immunitaire(s) qu’il peut engendrer, une réaction inflammatoire, etc… sont autant de facteurs qui interviennent dans ces études et qui ne peuvent pas être reproduits, à l’heure actuelle, in vitro. De plus, pour apporter ces preuves que la loi exige avant tout essai chez l’Homme, nous devons nous assurer de l’absence de contre-indications éventuelles de l'imlifidase avec notre traitement de thérapie génique. Pour cela, il n’existe aucune méthode substitutive. Le rat Gunn est le modèle animal atteint du syndrome Crigler-Najjar qui est le plus prédictif pour évaluer l’efficacité du produit de thérapie génique développé pour cette maladie, c’est pourquoi il a été choisi pour ce projet.
Réduction
Nous avons réfléchi cette étude dans le souci d’utiliser le nombre adéquat d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée, tout en veillant à ce que ce nombre soit le plus bas possible. Nous avons optimiser les procédures de façon à ne pas dupliquer des groupes contrôles inutilement. Ainsi la dose d'imlifidase efficace sera définie dans la même étude que l'evaluation des interactions avec le virus adéno-associé recombinant. Le nombre d’animaux par groupe experimental a été établi par étude statistique. Puisque l’efficacité du transfert de gène est le paramètre essentiel dans ce projet, nous avons choisi d’utiliser le niveau de bilirubine plasmatique comme marqueur discriminant pour l’étude statistique. Nous avons donc décidé d’utiliser un nombre d’animaux approprié pour détecter une diminution d’environ 50% de la valeur contrôle : un traitement efficace doit être capable de faire passer un taux de bilirubine plasmatique de 7mg/dL (chez les animaux malades) à un taux maximum de 3 mg/dL, reflet d’une activité enzymatique restaurée dans le foie. Au regard de nos études précédentes (pour déterminer variance et écart-type) et à l'aide d'un test unilatéral standard de comparaison des moyennes pour calculer ce nombre, 6 rats seront utilisés par groupe : n= 2x(SD²/Δ²)x(zα/2-zpuiss)² • la différence attendue entre la moyenne d’un groupe contrôle et celle d’un groupe traité : Δ = 7-3=4 • les écart-type observés au cours des études précédentes= environ 2mg/dL • une puissance statistique de 90% et un risque d’erreur à 5% (loi normale, zα/2= 1.96 ; zpuiss =-1.28), n=2x(2²/4²)x(1.96-(-1.28))²=2x(4/16)x3.24²=2x0.25x10.5=5.2
Raffinement
La taille des cages devrait permettre aux rats de démontrer des comportements importants pour leur qualité de vie : ils seront hebergés par 2 ou 3 individus (selon leur poids) de même âge, favorisant les comportements normaux de l’espèce, comme le jeu et les relations sociales. L’enrichissment des cages avec des élements tels que des aménagements pour favoriser l’activité physique ou se cacher / éviter le contact (tubes, séparateur), des matières pour permettre de creuser, des objets à macher (blocs en bois) etc… devraient limiter le stress des animaux, les rendre moins craintifs et moins agressifs et favoriser leur bien-être général. Dès leur arrivée en zone d'expérimentation (2 semaines avant le début des traitements), les rats seront manipulés et contentionnés au moins 3 fois avant le début de la procédure, afin d’être familiarisés aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux. Le rat étant très sensible au stress, cette habituation est importante. ceci devrait réduire stress et angoisse. Avant chaque intervention, l’identification de l’animal doit être vérifiée et son état général observé avec attention. Les informations pertinentes pourront alors être notifiées sur une fiche d'évaluation. En effet, l'évaluation du comportement de l'animal et de ses signes cliniques doit etre réalisée de manière minutieuse afin de détecter tout changement ou signes d'inconfort de stress ou de douleur. Après chaque acte experimental, une surveillance minutieuse sera mise en place pour garantir que l’animal récupère pleinement. Une surveillance accrue sera établie durant les premières 48 heures afin de surveiller l’apparition eventuelle de signes d’hypersensibilité ou d’inflammation aigue. Afin de diminuer le recours à l'anesthésie et limiter la repetition des ponctions au meme site de prélevement, le sang sera prélevé alternativement à la veine submandibulaire et à la celle de la queue.
Choix des espèces
Le rat est une espèce animale qui développe une hyperbilirubinémie semblable au syndrome Crigler Najjar humain. Ce modèle animal naturel est le rat GUNN. Il est le modèle de référence pour cette maladie et le plus pertinent pour estimer les doses thérapeutiques de thérapie génique. Nous souhaitons traiter des animaux dont le foie est pleinement developpé. En effet, la croissance du foie pourrait entrainer une perte d'effacité à long terme de la thérapie génique. Pour cela nous allons utiliser des rats adultes ou jeunes adultes : basés sur nos études précédentes réalisées sur ce modèle, des animaux de plus de 6 semaine pourront être inclus.