Rats

Avant de tester un implant de reconstruction faciale sur des chiens et des chats atteints de cancers de la bouche, 34 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués trois mois après la dernière intervention. Chacun subit une chirurgie d'implantation d'environ trente minutes, et vingt-cinq d'entre eux reçoivent ensuite douze séances d'irradiation réparties sur quatre semaines. Le porteur annonce des douleurs postopératoires, des difficultés à s'alimenter, une dermatite radio-induite et des troubles du comportement, anxiété, dépression ou agressivité, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet une telle évaluation. Il inscrit l'ensemble dans une démarche "One Health" qu'il présente comme une réduction du nombre d'animaux non-humains utilisés.

Objectifs

La présente demande couvre une sous partie du projet de recherche hospitalo-universitaire (RHU) , qui vise à développer une solution innovante pour résoudre un problème clinique pour lequel les solutions actuelles ne sont pas optimales : la reconstruction osseuse immédiate et personnalisée pour les cancers de la tête et du cou, tout en limitant la morbidité. Nous souhaitons modifier le procédé chirurgical standard de reconstruction des os du visage - qui consiste actuellement à utiliser un lambeau osseux libre du patient - en proposant un dispositif médical (DM) idéal, combinaison de 4 biomatériaux. Le projet repose sur un consortium de 7 partenaires experts dans le domaine de la recherche clinique humaine et vétérinaire, du DM, et de la caractérisation des biomatériaux. Le DM final sera constitué par 4 DM distincts qui seront associés le jour de l’intervention: 1- Implant en céramique: substitut osseux. 2- Implant à base de Titane : Système de fixation utilisé en combinaison avec le substitut osseux . 3- Membrane d’albumine (Alb) : revêtement cicatrisant et biocompatible, avec des propriétés anti-inflammatoires. 4- Spray antimicrobien.. Plus particulièrement la partie du projet qui fait l’objet de cette présente demande d’autorisation a pour but d'évaluer l’efficacité du DM en termes de biocompatibilité et néovascularisation après irradiation versus sans irradiation. L’objectif primaire est d'évaluer l’efficacité du DM en termes de biocompatibilité et néovascularisation après irradiation versus sans irradiation. La tenue d’un tel dispositif post-irradiation reste un challenge, compte tenu de l’impact de la radiothérapie sur les tissus environnant. L'objectif secondaire vise à évaluer l'effet de l'albumine avec ou sans spray antibactérien sur la biocompatibilité du DM et sa capacité de néovascularisation comparée à celui du DM HA-Ti seul chez le rat irradié ou non irradié. La biocompatibilité du DM sera évaluée par analyse histopathologique dans les différentes conditions. Cet essai est nécessaire avant l’essai clinique de reconstruction osseuse faciale par la procédure sur des animaux de compagnie souffrant de cancers de la cavité orale dans le cadre d’une médecine « One Health ». Le projet est réalisé dans 2 Etablissements Utilisateur (EU1 et EU2)

Bénéfices attendus

A moyen terme, le projet permettra d'éviter le risque de séquelles esthétiques et morbides sévères aux patients atteints d’un cancer de la tête et du cou et aux animaux de compagnie ayant besoin d’une reconstruction osseuse, et ainsi d’améliorer leur qualité de vie et réduire le fardeau économique pour la collectivité. Le DM mis au point dans le cadre du projet pourra également bénéficier aux animaux de compagnie, pour lesquels il n’existe actuellement pas de solution de reconstruction des os de la face. Plus particulièrement, cette étude de biocompatibilité et de néovascularisation chez le rat irradié est cruciale puisqu’elle permettra de donner les premières preuves de faisabilité d’utilisation du DM suite à une radiothérapie avant de passer à des essais cliniques sur des animaux de compagnie souffrant de cancer de la tête et du cou.

Procédures

Les 34 rats vont subir 1 chirurgie d’implantation du dispositif sous anesthésie générale d’environ 30 minutes réalisés dans l'EU 2/2. Les 2/3 des animaux (25 rats) seront ensuite irradiés 3 fois par semaine pendant 4 semaines (soit 12 séances d’une durée d'une minute maximum par animal à chaque fois), 4 semaines après l’implantation , cette étape est réalisée dans l'EU 1/2. 3 mois après la chirurgie (groupe contrôle),ou 3 mois après la dernière séance d’irradiation (groupe expérimental) seront mis à mort et explantés pour analyse, étape réalise dans l'EU 2/2

Impact sur les animaux

1. Douleurs post-opératoires dans les jours suivant l'implantation 2. Difficultés à l'alimentation dans les jours suivant l'implantation / les séances d'irradiation 3. Infection du site opératoire dans les jours suivant l'implantation 4. Mauvaise cicatrisation dans les jours suivant l'implantation 5. Dermatite radio induite dans les jours suivant les séances d'irradiation 6. Effets secondaires systémiques : tels que des effets sur le poids corporel, le métabolisme, ou d'autres paramètres physiologiques. 7. Problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés trois mois après la dernière intervention (implantation ou radiothérapie, selon le groupe). Les analyses qui seront faites pour vérifier l’intégration des DMs ne permettent pas de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Cette étude de biocompatibilité et de néovascularisation vise à évaluer la faisabilité d’implantation d’un nouveau DM dans un contexte de tissu irrad L’utilisation des implants à base d’Hydroxyapatite et à base de Titane est déjà autorisée en reconstruction osseuse et a été largement documentée. Les deux autres éléments qui composeront le DM final, le spray antibactérien et la membrane d’albumine, ont déjà fait d’étude in vitro et in vivo mais dans le cadre de tests séparés. Cette étude sera la première à tester la biocompatibilité et la néovascularisation suite à l’implantation de l’assemblage des 4 DMs. Il n’existe à ce jour et à notre connaissance aucun modèle in vitro permettant une telle évaluation.

Réduction

Le projet s’inscrit dans la démarche One Health. En effet, il est prévu que le DM mis au point soit aussi testé chez des chats et chiens atteints de cancers oraux dans le cadre d’une étude clinique vétérinaire. Les données générées lors de cette étude permettront de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire tout en offrant une solution de reconstruction pour les animaux participants à cette étude clinique. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus (avec un biostatisticien), ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Le taux de succès sera estimé dans chaque groupe avec un intervalle de confiance de 95% . L’effet de l’irradiation sera évalué par un test statistique non paramétrique . Le protocole d’irradiation a été défini avec une spécialiste de radio-oncologie vétérinaire

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux. Les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire, notamment en post-opératoire). Les animaux seront surveillés avec attention chaque jour (comportement, cicatrice) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. La douleur sera prise en charge dès que nécessaire. La taille des DM a été adaptée à la morphologie des animaux. Dans les jours suivants la chirurgie et les séances d’irradiation, une surveillance renforcée des animaux sera mise en place (Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie.

Choix des espèces

Le rat est un modèle établi pour les tests de biocompatibilité..De plus, comme nous cherchons à reproduire le protocole de soins, et en particulier la radiothérapie subit par les patients et les animaux de compagnie atteints de cancer de la tête et du cou. Le projet visant la mise au point d’un DM permettant la reconstruction faciale chez l’adulte, les procédures ne concerneront que des rats adultes

Intubés sous anesthésie générale, 2 300 rats reçoivent dans les poumons une substance qui y provoque une fibrose, puis un traitement quotidien pendant quatre semaines. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour récupérer leurs organes. Le protocole prévoit des imageries cardiaques d'une vingtaine de minutes sous anesthésie, parfois l'implantation chirurgicale d'une pompe sous la peau, puis une chirurgie finale de mesure de pression dans le ventricule droit et l'artère pulmonaire, une ponction de sang dans le cœur et une mise à mort par surdose d'euthanasiant. Le porteur décrit un inconfort respiratoire pouvant aller jusqu'à la détresse, sans jamais nommer ni la substance qui induit la fibrose ni les composés testés.

Objectifs

La fibrose idiopathique pulmonaire (FPI) est une pathologie pulmonaire chronique rare représentant la forme la plus fréquente de fibrose pulmonaire et dont la prévalence est de 18 cas pour 100 000 habitants dans le monde. La durée médiane de survie après l’établissement du diagnostic est estimée entre 2 et 5 ans. La FPI se caractérise par une rigidification du tissu pulmonaire affectant son fonctionnement et entrainant une insuffisance respiratoire pouvant aboutir, à terme, à des troubles cardiaques. Cette pathologie se manifeste ainsi par un essoufflement progressif, une toux sèche, une fatigue et une diminution de la tolérance à l’exercice. Plusieurs facteurs de risque sont associés à cette pathologie tels que le tabagisme et la pollution atmosphérique, les infections virales chroniques ou encore sont d’origines génétiques. Les stratégies pharmacologiques actuelles ne permettent pas de guérir la maladie mais seulement de ralentir sa progression et s’accompagnent d’effets secondaires importants. La seule stratégie curative repose sur une transplantation pulmonaire très invasive qui s’accompagne d’un risque important de complications post-opératoires et dont les greffons sont en quantités limitées. Il est donc nécessaire de pouvoir développer et tester de nouveaux composés permettant de soigner cette pathologie. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments dans un modèle préclinique chez le rat dont la pathologie est induite par l’administration d’une substance connue pour être à l’origine de fibrose pulmonaire chez l’Homme. Ce modèle repose sur l’administration de cette substance dans la trachée. L’efficacité du candidat médicament sera comparée à un ou plusieurs traitements de référence.

Bénéfices attendus

Le modèle de fibrose pulmonaire induite par l'administration d'une substance entrainant la fibrose apparait comme un modèle élaboré, présentant des marqueurs de l'inflammation précoces suivi par l’installation progressive de la fibrose des tissus pulmonaires, observée dans la maladie de la FPI chez l’Homme. Ainsi, des caractéristiques fonctionnelles et tissulaires aussi bien au niveau pulmonaire que cardiaque sont présentes chez les animaux induits, de manière similaire aux patients atteints de FPI. À terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.

Procédures

Les animaux sont d'abord mis sous anesthésie générale avant d'être intubés puis une canule est glissée dans les voies respiratoires de l'animal et une injection liquide contenant la substance induisant la fibrose est administrée rapidement (durée de l'intervention: 6-8 min) dans les poumons. Durant les 4 semaines suivantes, les animaux seront traités quotidiennement avec plusieurs composés ou des composés de références selon différentes voies d'administration (voie orale, intraveineuse, injection dans l'abdomen ou en sous-cutanée: durée de chaque administration = 1min). Au cours du protocole, les animaux seront à nouveau anesthésiés de manière générale afin de pouvoir effectuer des imageries cardiaques (environ 20 min par passage) intermédiaires (c'est-à-dire à 2 semaines post-administration) pour contrôler les répercussions de l'induction de la pathologie et l'effet potentiel des candidats médicaments ai cours du protocole. Une autre imagerie cardiaque sera effectuée en fin de protocol puis une chirurgie sera effecutée sous anesthésie et analgésie afin de réaliser des mesures de pression dans le ventricule droit et dans l'artère pulmonaire puis pourront être soumis à un prélèvement sanguin par ponction directe dans le coeur avant d'être mis à mort par surdose d'euthanasiant (durée 15min). En parallèle, ces animaux pourront subir un prélèvement sanguin par ponction directe de la veine du cou réalisée sous anesthésie générale ou dans la veine de la queue sans anesthésie (durée: 5 min par prélèvements).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une administration dans les voies respiratoires avec la substance induisant la fibrose pulmonaire réalisée sous anesthésie générale et par intubation entrainant un risque d’irritation des voies respiratoires. L’administration de cette substance entraine une réponse inflammatoire pulmonaire rapide responsable d’un inconfort respiratoire et pouvant provoquer une détresse respiratoire plus ou moins sévère en fonction de la sévérité de la lésion. Dans les heures qui suivent l’administration de cette substance, une baisse de la mobilité peut être observée ainsi qu’une perte d’appétit et une baisse de l’hydratation entrainant une perte de poids. Une chirurgie d’implantation de pompe contenant les composés pourra être réalisée nécessitant une ouverture de la peau pouvant être source de douleur et/ou une gêne notamment avec la présence de la pompe et de la diffusion des substances via celle-ci. L’administration répétée de candidat médicament par voie orale, dans l'abdomen, intraveineuse ou sous-cutanée est une source de stress puisqu’il est nécessaire d’appliquer une contention chez le rat afin de pouvoir réaliser ces gestes. Un des effets indésirables potentiels est lié à l'administration du candidat médicament. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules avec peu de recul. Le traitement par injection dans l'abdomen peut entrainer une inflammation de l'abdomen. Le traitement par voie orale peut entrainer des fausses routes associées à des troubles respiratoires. Des prélèvements de sang seront réalisés soit sur animal sous anesthésie générale lorsque ce dernier sera effectué à la veine du cou soit sur animal vigile soumis à une contention, impliquant des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille pouvant être à l’origine 1) d’une douleur, 2) de stress et 3) d’un écoulement sanguin persistant. Une nouvelle anesthésie générale est nécessaire pour chaque imagerie cardiaque ou lorsque des prélèvements sanguins à la veine du cou seront nécessaires. De même, en fin de protocole, des mesures des flux sanguins seront effectuées dans le ventricule droit et l’artère pulmonaire sur animal anesthésié, pouvant être suivie par un prélèvement de sang dans le coeur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de récupérer les organes pour faire des analyses approfondies sur l'effets des composés.

Remplacement

L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composés in vivo. Afin d’évaluer l’effet de candidat médicament sur les marqueurs de l’inflammation et de fibrose des tissus pulmonaires ou cardiaques, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, bien qu'une évaluation initiale de l'effet des composé peut-être effectué dans des modèles in vitro (permettant de faire un premier trie des composés les plus pertinents), ces derniers ne permettent pas d’induire et d’étudier les répercussions intégrées au niveau cardiorespiratoire et systémique, ni d’évaluer le devenir du candidat médicament.

Réduction

Le modèle de fibrose pulmonaire induite chez le rat à la suite de l’administration d'une substance connue pour induire de la pibrose dans les poumons est connu pour être reproductible permettant d’utiliser un nombre d’animaux réduit. Ajouté à cela, dans le cas où une imagerie cardiaque est pratiquée à un temps intermédiaire (à 2 semaines post-induction) en plus des mesures terminales, les animaux pourront 1) être répartis de manière aléatoire permettant ainsi d’homogénéiser les différents groupes et de diminuer ainsi la variabilité entre ces derniers, et 2) de faire un suivi sur plusieurs semaines sur les mêmes animaux limitant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations . Les animaux seront hébergés par 2 ou 3 par cage selon leur poids. Des enrichissements multiples leur sont proposés (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Par ailleurs, les animaux seront habitués à la manipulation par l'Homme ainsi qu’aux environnements nouveaux afin de réduire le stress. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention pour diminuer le stress lié aux différentes procédures. L’administration de la substance induisant la fibrose dans les poumons sera réalisée sous anesthésie générale et les animaux seront surveillés en phase post-opératoire sur tout le reste de la journée. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après l’administration de la substance induisant la fibrose. Une réhydratation pourra être effectuées en cas de signes de déshydratation. Les prélèvements sanguins ainsi que les doses et volumes d’injection d’analgésiques ou des traitements avec les candidats médicaments seront réalisés selon les recommandations éthiques [doses et volume adaptées en fonction des voies d’administration. Après chaque prélèvement de sang, une une héhydratation sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 2 fois le volume prélevé injecté en sous cutanée) afin de compenser la perte de sang. Les imageries cardiaques et prélèvements sanguins à la veine du cou seront réalisés sous anesthésie générale tout comme les mesures de flux sanguins. Ces derniers se feront également sous analgésie. Pour chaque anesthésie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et seront maintenus à une température comprise entre 36,5 et 37,5°C, et du gel ophtalmique sera déposé sur les yeux.

Choix des espèces

Le rat est largement utilisé en préclinique pour le modèle de fibrose pulmonaire. Il présente des structures alvéolaires et bronchiolaires suffisamment comparables à celle de l’Homme pour obtenir une réponse pro-inflammatoire suivie par l’installation de la fibrose pulmonaire, toutes deux typiques de la FPI. L'analyse des flux sanguins (pression artérielle et cardiaque) et imageries cardiaques sont également sensiblement comparables et peuvent être partiellement transposables à celles observées chez les patients FPI. Le rat présente une bonne tolérance physiologique à la substance induisant la pathologie dont le développement est stable et reproductible chez cette espèce. Le rat permet également de réaliser des prélèvements sanguins longitudinaux ainsi que de collecter des volumes sanguins suffisants pour étudier de manière plus précise la pharmacocinétique d’un composé dans l’organisme. Des rats âgés de 5-7 semaines le jour de l’administration intratrachéale de cette substance (entre 180-300g) seront utilisés dans ce projet car la grande majorité des résultats de la littérature concernant ce modèle a été obtenue sur des rats appartenant à cette gamme de poids.

Exposées jusqu'à 22 heures par jour aux ondes de la 5G à partir du septième jour de gestation, 76 rates sont hébergées seules pendant onze à dix-huit jours d'affilée, puis réunies avec leur portée. Les ratons naissent sous exposition et la subissent jusqu'à leur 80e jour de vie. Du premier au vingt-et-unième jour ils passent des tests sensori-moteurs, puis des tests de sociabilité, de cognition et de coordination locomotrice pouvant durer une heure par jour, avec des animaux stimulus non exposés. Le porteur indique que l'exposition pourrait provoquer des malformations, des retards de croissance et des signes comportementaux anormaux. Au total 1 198 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués à des temps précis de leur développement pour des analyses ex vivo.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact d’expositions aux champs électromagnétiques radiofréquences liés aux télécommunications, notamment à la fréquence de la 5ème génération de téléphone portable, sur le développement précoce, la sociabilité et la cognition chez le rat. L’étude portera sur des animaux exposés durant la gestation jusqu’à l’âge adulte, et évalués du début de leur vie postnatale jusqu’à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à apporter des éléments de réponse aux questions scientifiques et aux préoccupations sociétales relatives aux effets potentiels des expositions précoces aux champs électromagnétiques radiofréquences sur le développement du système nerveux.

Procédures

Observations cliniques et pesées (5 min) : au moins tous les 2 jours, au maximum tous les jours. Hébergement individuel des 76 femelles gestantes : dès leur réception, environ 3e et 10ᵉ jour de gestation jusqu’à la mise bas (11 et 18 jours en continu) pour respectivement les procédures 1 er 2. Exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences (jusqu’à 22h/jour) : tous les jours durant au maximum 3 mois, du 7ème jour de gestation à 80 jours après la naissance ; placement des cages d’hébergement dans la chambre d’exposition et exposition. Observation de la croissance physique et tests sensori-moteurs (5 min) : du 1er au 21ème (sevrage) jour de vie postnatal ; manipulation des animaux pour les observer et les positionner pour les tests. Test de sociabilité, et évaluation des fonctions cognitives et de la coordination locomotrice (jusqu’à 1h/jour) : 1 fois/âge/test d’intérêt ; manipulation des animaux pour les positionner pour les tests.

Impact sur les animaux

De manière générale, la manipulation des animaux lors des examens cliniques et des tests comportementaux peut provoquer un certain niveau de stress, susceptible d’influencer leurs réactions à la préhension ainsi que leur activité. La manipulation des ratons, l’ajustement des portées et les éventuelles adoptions impliqueront un stress pour les mères pouvant impacter le développement de leur descendance. Par ailleurs, l’exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences pourrait entraîner des effets systémiques pouvant occasionner de la souffrance. Des malformations, des retards de croissance et des signes cliniques anormaux, notamment comportementaux, pourront alors être observés.

Devenir

Tous les rats seront mis à mort à des temps précis de leur développement pour réaliser des analyses ex vivo et conclure sur le niveau de risque de l’exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences pour leur santé.

Remplacement

Pour ce qui est du remplacement, les approches cliniques, in vitro et in silico, par leurs limitations éthiques et techniques, ne peuvent pas répondre seules au questionnement concernant l’impact des expositions aux champs électromagnétiques radiofréquences sur le développement sensoriel et moteur précoce, la sociabilité, et la maturation des fonctions cognitives et locomotrices, nécessitant de fait le recours aux études in vivo.

Réduction

Au plan de la réduction, plusieurs paramètres biologiques seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés. Les échantillons collectés après la mort seront exploités pour l’analyse de plusieurs marqueurs biologiques d’intérêt fortement questionnés dans le cadre de l’étude des effets des champs électromagnétiques radiofréquences. Le nombre d’animaux qui sera utilisé a été déterminé sur la base de l’effectif minimum nécessaire pour mettre au point les protocoles de test adaptés à l’évaluation de paramètres développementaux chez le rat et de les appliquer à l’étude des effets de l’exposition précoce à des champs électromagnétiques radiofréquences. Il a été établi à partir des données bibliographiques disponibles sur des études antérieures d’intérêt réalisées chez l’animal qui permettront une analyse statistique robuste et une extrapolation pertinente des résultats à l’homme. Des tests appropriés au traitement de chaque type de données et à leur distribution seront utilisés pour les comparer et ainsi évaluer les effets de l’exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement des conditions expérimentales, chaque animal fera l’objet d’une observation quotidienne et sera pesé au minimum tous les deux jours. Les conditions d’hébergement seront enrichies afin de favoriser le bien-être et l’expression des comportements naturels. Les femelles gestantes seront hébergées individuellement, puis avec leur portée après la naissance. À partir du sevrage, les jeunes seront hébergés par sexe et par groupe, afin de favoriser leur socialisation. Un fond sonore musical sera diffusé en journée pour les habituer progressivement aux bruits associés aux manipulations et ainsi réduire le stress lié aux interventions expérimentales. Du matériau leur permettant de nidifier et des bâtons en bois à ronger seront disposés dans les cages d’hébergement, pour contribuer au comportement maternel, à l’enrichissement cognitif et au bien-être général des animaux. Des mesures complémentaires de raffinement concerneront la stabulation et la manipulation. Des points limites ont été définis pour détecter précocement tout signe de douleur ou de détresse. Pour chacun de ces critères, des actions correctives adaptées ont été prévues, en cohérence avec les paramètres étudiés, afin d’assurer le suivi attentif et le bien-être optimal des animaux.

Choix des espèces

Le rat est un animal de référence pour les études de toxicologie. En particulier, ses systèmes neurobiologiques et physiologiques ont été largement étudiés en laboratoire. Il existe une documentation très complète dans le domaine, dans la littérature et les ouvrages spécialisés. Ces recherches ont été effectuées majoritairement chez le rat. Dans un souci de comparer les données de ce projet avec les résultats obtenus précédemment concernant les effets des champs électromagnétiques radiofréquences sur les fonctions cérébrales, nous avons choisi d’utiliser la même espèce. Dans un 1er temps, des femelles avec leur portée, et des juvéniles et des adolescents seront exposés à des champs électromagnétiques radiofréquences et testés au plan comportemental pour mettre au point les conditions d’essai pertinentes à tester. Dans un 2ème temps, des femelles seront exposées aux champs électromagnétiques radiofréquences d’intérêt définis, durant la gestation jusqu’au sevrage, et leurs descendants du sevrage jusqu’à l’âge adulte. Ceux-ci seront évalués à quatre stades clés de leur développement : néonatal, juvénile, adolescent et adulte, au plan de leur croissance physique, développement neuromoteur, sociabilité et maturation des fonctions cognitives. Pour réaliser les tests de sociabilité aux stades juvénile et adolescent, des animaux stimuli, non exposés, seront utilisés en complément.

Un cathéter est glissé dans l'urètre de souris et de rats anesthésiés, puis une bactérie est injectée directement dans leur vessie. 480 souris et 480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des traitements une à trois fois par jour pendant trente jours au maximum, avec jusqu'à deux séjours de 48 heures en cage individuelle et un prélèvement de sang par semaine, pour tester des candidats médicaments contre les infections urinaires. Le porteur chiffre l'inconfort du cathéter à trois minutes et la douleur des piqûres à cinq secondes, tout en décrivant par ailleurs la fièvre, la perte de poids, la baisse de la prise alimentaire et la détresse respiratoire que provoque l'infection.

Objectifs

Les infections urinaires figurent parmi les infections bactériennes les plus fréquentes, constituant un problème de santé publique majeur. La prévalence est très élevée, touchant plus de 150 millions de personnes par an dans le monde, avec une incidence particulièrement forte chez les femmes. Les solutions thérapeutiques existantes reposent principalement sur les antibiotiques, le choix dépendant du type et de la gravité de l'infection (cystite, pyélonéphrite). La nécessité de nouveaux traitements est urgente, car l'efficacité des antibiotiques actuels est rapidement compromise par l'évolution de la résistance aux antimicrobiens. Les recherches se concentrent sur des alternatives comme les vaccins, la thérapie par phages et les agents anti-virulence. L'objectif est de trouver des solutions à long terme, non-antibiotiques de préférence, pour gérer les infections urinaires récidivantes et préserver l'efficacité des traitements de dernier recours. Le projet propose l’évaluation préclinique de candidats médicaments pour déterminer leur efficacité contre des agents pathogènes responsables des infections urinaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont multiples avec un impact significatif sur la santé humaine. En caractérisant de nouveaux candidats médicaments, le projet vise à répondre à des besoins non satisfaits dans la lutte contre les infections urinaires, en particulier face à la résistance antimicrobienne. Le projet permettra de développer de nouveaux traitements ciblant plus efficacement les infections, en particulier dans les contextes où les thérapies actuelles échouent. Ce projet pourrait améliorer la gestion des infections résistantes et des cystites/pyélonéphrites difficiles à traiter.

Procédures

Pose d'un cathéter dans l'urètre sur animaux anesthésiés-3 min: 1 fois (modèle aigu) ou 2 fois (modèle chronique) au cours de leur vie. Les animaux seront infectés 1 fois (modèle aigu) ou 2 fois (modèle chronique) avec le germe pathogène par administration intra-vésicale sous anesthésie (1 min). Les animaux feront au maximum 2 sessions de 48 h en hébergement individuel et seront traités 1 à 3 fois par jour (selon les voies d'administrations) pendant 30 jours consécutifs maximum. Temps requis pour les différentes voies d’administration : Orale-10 à 20 secondes ; Intraveineuse - 30 secondes à 1 minute ; Sous-Cutanée- 5 à 10 secondes ; Intrapéritonéale- 5 à 10 secondes. Au maximum un prélèvement de sang hebdomadaire sur animaux anesthésiés. Le temps nécessaire pour effectuer un prélèvement de sang dans la veine caudale pour chaque souris est de 3-5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances principales concernent la douleur et l'inconfort induits par les injections, les inflammations, l'infection et l'isolement en hébergement individuel. L'anesthésie gazeuse induit un stress de courte durée (15 secondes). Les piqûres d’aiguille pour traiter les animaux entraînent une douleur légère de courte durée (5 secondes). L'installation d’un cathéter intraurétral peut induire une inflammation locale de la vessie, causant un léger inconfort temporaire (3 minutes). L'infection par les agents pathogènes induit la pathologie avec des symptômes potentiels comme la fièvre, la perte de poids, la diminution de la prise alimentaire et hydrique, détresse respiratoire et une mobilité réduite. L’isolement en hébergement individuel pendant 48h peut être perturbant pour les animaux et induit un stress.

Devenir

A la fin de chaque procédure tous les animaux sont mis à mort et des prélèvements d'organes et de sang sont réalisés pour des mesures de charge microbienne, de paramètres inflammatoires ou des études d'histologie.

Remplacement

Préalablement à toute utilisation d'animal, nous intégrons dans nos projets des modèles cellulaires in vitro, et 3D tissulaires, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d’optimiser les essais précliniques. Ces alternatives non animales ne peuvent pas remplacer totalement les tests sur les animaux utilisés dans ce projet dans lequel un des paramètres analysés est la fréquence et le volume d’urine produite.

Réduction

Le premier principe de réduction du nombre d’animaux sera appliqué via l'intégration dans ce projet, préalablement à toute utilisation d'animal, de modèles cellulaires et tissulaires. Le principe de réduction du nombre d’animaux sera appliqué aussi via l’estimation du nombre d’animaux permettant de garantir l’interprétabilité des résultats. L'estimation du nombre d'animaux nécessaire se fait par un calcul de puissance statistique: 12 animaux seront inclus par lot. En combinant ces approches, nous réduisons les expérimentations animales, tout en garantissant la précision des résultats.

Raffinement

La fréquence de surveillance des animaux est essentielle pour garantir leur bien-être. Les signes de détérioration de l’état de santé, tels que perte de poids, fièvre, modifications de la mobilité, ou respiration laborieuse, sont particulièrement surveillés. Si des signes de stress apparaissent, nous ajusterons l'environnement pour améliorer le bien-être des souris et notamment stimuler leurs sens et leurs comportements naturels. Nous augmenterons l’enrichissement physique par l’apport de cachettes (boîtes, tunnels) et de matériaux pour la construction de nids (papier déchiqueté, fibres) ainsi que l’enrichissement sensoriel par la modification régulière de la disposition de leur cage et des éléments à l’intérieur de la cage pour offrir de la nouveauté. L'introduction de nouveaux enrichissements se fera progressivement pour éviter un stress supplémentaire. Des critères d'arrêt stricts sont définis pour éviter la souffrance des animaux. L’objectif est de garantir que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux à chaque fois que cela sera nécessaire.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles pertinents pour la caractérisation pré-clinique de molécules ciblant les infections urinaires pour des raisons principalement liées à ses caractéristiques biologiques, et notamment en raison de : (i) la similitude anatomique et physiologique des systèmes humain et murin. L'anatomie du système urinaire du rongeur (reins, uretères, vessie, urètre) est suffisamment similaire à celle de l'humain pour permettre l'étude de la progression de l'infection et de la réponse de l'hôte. (ii) Les mécanismes d'infection : Les souches bactériennes responsables des infections urinaires chez l'homme, notamment E. coli , peuvent être utilisées pour infecter la vessie et/ou les reins de la souris et du rat, reproduisant ainsi les stades d'infection (cystite, pyélonéphrite) et les mécanismes de virulence clés, comme la formation de communautés bactériennes intracellulaires dans les cellules de la vessie. Des animaux adultes seront utilisés afin de mimer au mieux la pathologie humaine : • Âge le plus touché : Les infections urinaires sont beaucoup plus fréquentes chez les femmes adultes en bonne santé que chez les enfants. Utiliser des animaux adultes permet de modéliser l'âge où la maladie est la plus prévalente chez l'humain. • Maturation du Système Urinaire : Le tractus urinaire d'un rongeur adulte est anatomiquement et physiologiquement plus proche de celui d'un humain adulte que celui d'un animal juvénile. La structure et la fonction de la vessie et des voies urinaires sont complètement développées et matures. • Réponse Immunitaire Mature : Les infections urinaires impliquent une réponse immunitaire complexe de l'hôte. Les rongeurs adultes possèdent un système immunitaire totalement mature et compétent

Opérés pendant une heure trente à deux heures pour recevoir un émetteur de télémétrie, puis isolés quinze jours, 200 rats sont exposés jusqu'à six fois à un air enrichi en CO2 destiné à déclencher chez eux une réaction de panique et de fuite. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. La moitié sera tuée pour des prélèvements terminaux ou après des effets marqués des produits testés, l'autre moitié réutilisée dans d'autres projets, dont des formations. Le porteur qualifie ces expositions de stress de courte durée, alors que le protocole vise précisément à provoquer une attaque de panique pour tester des candidats médicaments antipaniques.

Objectifs

L'attaque de panique est une des manifestations possibles des troubles anxieux. C'est une crise d'angoisse aiguë qui apparaît de façon brutale et qui dure de quelques minutes à quelques heures. La personne va ressentir une peur intense, une sensation de danger immédiat et des sensations physiques désagréables. Le projet a pour but d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments sur le comportement anxieux et les attaques de paniques, les variables physiologiques (paramètres cardio-vasculaires) induits par une exposition brève à un air enrichi en CO2 chez le rat. En effet, une exposition au CO2 à des concentrations élevées induit une baisse de pH sanguin qui va être détecté par le système nerveux autonome et induire une réaction comportementale illustrée par un comportement de panique et d'échappement.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les attaques de panique et l'anxiété, des pathologies dont on estime qu'une personne fera l'expérience d'au moins un épisode d'anxieté aigue au cours de sa vie. Les composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

Ce projet nécessite différents types d'interventions. Dans un premier temps mais pas systématiquement, une chirurgie sous anesthésie générale sera pratiquée afin d'implanter un dispositif (émetteur de télémétrie) permettant l'enregistrement automatique des paramètres cardio-vasculaires (durée: 1h30-2h). Les animaux instrumentés seront tenus afin de pouvoir leur administrer des produits anesthésiques et analgésiques (durée: environ 1-2minutes). Après la chirurgie d’implantation de l’émetteur de télémétrie, 15 jours de récupération, au minimum, sont prévus avec hébergement individuel des animaux pour optimiser la cicatrisation. Le candidat médicament ou du placebo seront administrés aux animaux (durée 1-2minutes). Les animaux seront ensuite placés dans un environnement restreint pendant 2h maximum où ils seront exposés pendant 5 minutes à un air enrichi en CO2. Six expositions maximum seront faites avec un espacement de 48h minimum. Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile ou anesthésié (durée des prélèvements: moins de 3min).

Impact sur les animaux

Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. La chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie peut induire des douleurs post-chirurgicales. Post-chirurgies, les animaux pourront être placés en hébergement individuel pendant 15 jours maximum. Cet hébergement engendra un stress de durée moyenne et d'intensité modérée. Les animaux seront soumis à plusieurs expositions à un gaz enrichi en CO2 qui entrainera un stress de courte de durée (6 sessions max). Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l'initiation du projet.

Devenir

Les animaux seront mis à mort si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets marqués des produits testés, si non utilisés pour d’autres projets. Certains animaux (ex: témoins, animaux ne présentant pas d'effets marqués après traitement) pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les troubles anxieux et les attaques de panique. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 10 / par groupe.

Raffinement

Le raffinement de la procédure expériementale sera obtenu par un protocole anesthésique et analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post opératoire de l'état de santé des animaux avec des soins adaptés. La cage des animaux présentera un sur-enrichissement (lanière de kraft par exemple) et ils seront en contact visuel - olfactif - sonore avec leur congénères afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel pendant la phase de récupération. les animaux seront habitués à la chambre expériementale pour réduire le stress lié à ce nouvel environnement et seront manipulés pour diminuer le stress lié aux contentions. Les animaux sont également suivis quotidiennement. Des points limites adpatés sont définis et le recours à l'euthanasie se fera lorsque cela s'averera nécessaire.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée et la plus couramment utilisée pour évaluer les effets bénéfiques d’un produit sur l’attaque de panique Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Jusqu'à soixante minutes d'immobilisation par test de sensibilité tactile, chaque semaine : 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent des injections répétées de bortézomib, un anticancéreux qui provoque une neuropathie douloureuse, pour vérifier si un oméga-3 en limite les effets. Le porteur indique que l'induction de cette neuropathie constitue en elle-même une nuisance modérée qu'il juge "indispensable", et suit l'allodynie tactile et thermique, une douleur déclenchée par un stimulus normalement indolore. Le rat est retenu parce que l'équipe a déjà travaillé sur ce modèle et dispose des doses et des durées de traitement.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’étudier l'effet d'un oméga-3 sur le mécanisme toxique des neuropathies induites par un anticancéreux utilisé en clinique et d'améliorer la compréhension de l’implication d’une altération de la membrane cellulaire (impliquant aussi bien une modification de la composition en lipides qu’en protéines) dans ce mécanisme.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prendre en charge ces neuropathies pour lesquelles à ce jour la prise en charge reste très limitée en clinique. Le mécanisme sous-jacent reste encore mal élucidé et l’implication d’un remodelage membranaire potentiellement responsable des neuropathies doit être élucidé.

Procédures

Ce projet reposera sur un modèle de neuropathie chimio-induite (CIPN) chez le rat. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires afin d’établir l’apparition de la neuropathie et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - évaluation de la sensibilité tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal – évaluation de la sensibilité thermique : durée du test pour un animal 5 minutes (max). La mesure de la conduction se fera sur animal sous anesthésie permettant la pose des capteurs au niveau du nerf sciatique (3-5 min max) avant euthanasie.

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance modérée à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. L’induction du modèle se faisant progressivement sur une semaine, nous pouvons redouter des symptômes notables associés à une altération de son bien-être sur les quelques jours qui suivent cette induction. Les administrations répétées d’anticancéreux peuvent notamment être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux (suivi quotidien du poids permettant un ajustement des doses ainsi que du bien-être de nos animaux). A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux. Un phénotypage des animaux au cours de l’induction de la neuropathie reposera sur l’évaluation des troubles du toucher et de la perception de la température au travers de tests comportementaux rapides et indolores. La mesure de la conduction nerveuse pourra être réalisée sur animal sous anesthésie gazeuse (capteurs cutanés) avant sa mise à mort.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies retrouvées au niveau des membranes cellulaires aussi bien au niveau de la composition lipidique que protéiques (expression et localisation) pouvant expliquer l’apparition des neuropathies.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Néanmoins, des travaux in vitro sont réalisées en parallèle sur une lignée cellulaire. Bien que ces travaux aident à compléter les connaissances sur le mécanisme lié à cette pathologie (notamment au travers de l’étude du stress oxydant), ils ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie induite par les anticancéreux. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer ces troubles neurotoxiques générés par les anticancéreux au travers de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maîtrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. Une grille de score basée sur le comportement de l’animal a été créée pour évaluer son niveau de souffrance et repérer une dégradation trop importante de son état, pouvant conduire à sa mise à mort anticipée.

Choix des espèces

Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies chimio-induites (CIPN). D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet.