Rats

Pour tester des dispositifs censés éviter l'accumulation de liquide après une ablation du sein, 450 rats subissent une mastectomie chirurgicale de 60 à 90 minutes, puis l'implantation du dispositif pendant plusieurs semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous les rats sont tués, l'analyse histologique des tissus étant présentée comme la méthode de référence. Échographies répétées sous anesthésie courte, pansements, hébergement individuel jusqu'à quatorze jours, hématomes, œdèmes et douleurs post-opératoires figurent parmi les effets attendus. Le nombre d'études dépend, écrit le porteur, des demandes formulées par les fabricants de dispositifs médicaux, à raison d'environ une étude par an sur cinq ans.

Objectifs

Le sérome, complication fréquente après une chirurgie mammaire (jusqu’à 85 % après mastectomie), résulte de la formation d’un espace vide sous-cutané favorisant l’accumulation de liquide. Cela entraîne inconfort, soins prolongés et risques infectieux pour les patients. Ce projet vise à évaluer la tolérance (sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) de dispositifs médicaux visant à réduire cet espace et parsuite réduire l'accumulation de liquide. Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à garantir, avant la mise sur le marché, que l’utilisation du produit de santé n’altère ni l’état clinique ni la sécurité des patients, conformément aux exigences des autorités réglementaires. Cette démarche s’inscrit dans une volonté de garantir un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité, pour les patients. Les résultats obtenus à l’issue des études seront intégrés aux dossiers de soumission auprès des autorités de santé compétentes, en vue de la mise sur le marché ou du maintien de l’autorisation du produit à court terme. Le nombre d’études et de dispositifs testés dans le cadre de ce projet dépend directement des demandes formulées par les fabricants de dispositifs médicaux. Toutefois, il est raisonnablement anticipé la réalisation d’environ une étude par an, ce qui correspondrait au développement et à l’évaluation de cinq nouveaux dispositifs sur une période de cinq ans.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale consistant à une mastectomie (retrait de la glande mammaire) visant à reproduire un modèle de formation de sérome post-chirurgical (présence de liquide dans l’espace laissé vide après retrait de la glande mammaire) visant à reproduire un modèle de formation de séromes post-chirurgical (présence de liquide dans l’espace laissé vide après retrait de la glande mammaire). Un dispositif visant à réduire cette formation de liquide est implanté dans l’espace créé et est laissé chez l’animal pendant plusieurs semaines. La durée de la chirurgie est estimée entre 60-90 minutes selon la complexité du modèle. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale (inhalée ou injectable) et accompagnées d’une analgésie pré- et post-opératoire adaptée. Des examens d’imagerie non invasifs (échographie) pourront être réalisés pour évaluer la présence et le volume du sérome, avec une anesthésie courte ( 4 semaines), étant donné qu’il s’agit d’un examen court et non invasif, cet examen pourra être renouvelé chaque semaine selon les besoins, à condition que l’animal soit en bon état général.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont les suivants : - Stress lors des manipulations pour l’anesthésie et pouvant aller jusqu’à 14 jours si présence d’un pansement et mise en place d’un hébergement individuel - Douleur suite à la chirurgie. – Gêne modérée : En cas de mise en place de pansements ou de dispositifs de protection post-opératoires, pouvant limiter temporairement la mobilité ou provoquer une gêne locale - Perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie, de la chirurgie et/ou du dispositif implanté, à court terme - Hématome, œdème ou sérome non résorbé au niveau du site opératoire, pouvant entrainer une gêne locomotrice en plus de la douleur.

Devenir

Afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet, des observations post-mortem sont indispensables. Pour cela, des prélèvements ciblés des tissus sont réalisés afin de procéder à des analyses histologiques, qui constituent la méthode de référence pour détecter des effets locaux tels que l’inflammation, la fibrose ou la nécrose. D'autres examens spécifiques sur les tissus prélevés, comme une observation macroscopique ainsi que la mesure du volume de sérome peuvent aussi etre réalisées. Compte tenu de la nature des interventions et des objectifs du projet, il n’est pas possible de maintenir les animaux en vie après la phase expérimentale. L’euthanasie est donc pratiquée conformément aux normes éthiques et réglementaires en vigueur.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux reste indispensable dans le cadre de l’évaluation préclinique des dispositifs médicaux, car requis par les exigences réglementaires. À ce jour, aucune méthode alternative validée (In-Vitro ou In-silico) ne permet de reproduire de manière fiable les conditions mécaniques et biologiques nécessaires à l’étude de la performance et de la tolérance locale de dispositifs destinés à un usage humain, en particulier dans le contexte de la prévention ou du traitement du sérome. La formation de sérome est un phénomène complexe impliquant des interactions mécaniques, tissulaires et immunitaires, difficilement reproductible in vitro. Les modèles cellulaires ne permettent pas de simuler la dynamique de l’espace vide sous-cutané, ni les processus de drainage, d’inflammation ou de cicatrisation associés. Donc le mécanisme de formation du sérome, complication fréquente après une chirurgie mammaire, reste difficile à modéliser. Les modèles animaux offrent ainsi une approche essentielle pour étudier ce phénomène dans des conditions réalistes. Parmi les espèces disponibles, le rat représente un modèle pertinent pour ce type d’étude en raison de sa taille adaptée, de sa bonne tolérance aux procédures chirurgicales, et de la disponibilité de données comparables dans la littérature scientifique.

Réduction

La réglementation demande d’avoir à minima 10 produits implantés par condition. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans les études, plusieurs stratégies sont mises en œuvre : Mutualisation des groupes contrôle : Un même groupe témoin (utilisant un produit de référence) peut être utilisé pour comparer plusieurs groupes test recevant des produits différents. Études pilotes : Réalisées sur un nombre restreint d’animaux, elles servent à orienter les choix de développement (produit, matériel, technique chirurgicale) avant de passer à des études réglementaires plus étendues. Quand cela est possible ; implantation de plusieurs dispositifs sur le même animal réduisant de moitié le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes sociaux compatibles afin de respecter leurs besoins comportementaux et de favoriser leur bien-être. Un hébergement individuel est uniquement instauré en cas de nécessité médicale, notamment en présence d’un pansement, et limité à la durée strictement nécessaire à la cicatrisation. Les installations permettent le maintien des contacts visuels, olfactifs et auditifs entre congénères. Des enrichissements adaptés à l’espèce sont fournis de manière systématique. L’environnement est contrôlé afin de limiter le stress (ambiance sonore adaptée, manipulation douce, surveillance régulière). Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie préventive et multimodale, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires, afin de prévenir toute douleur, souffrance ou détresse. La profondeur anesthésique et les paramètres respiratoires font l’objet d’une surveillance continue pendant toute la durée de l’intervention. Des mesures spécifiques sont mises en œuvre pour limiter les risques per- et post-opératoires : maintien de la température corporelle à l’aide d’un dispositif chauffant, protection oculaire, réalisation des actes en conditions aseptiques strictes sur une zone préparée, et administration d’un agent de réversion en fin d’intervention afin de favoriser un réveil rapide et sécurisé. Une analgésie post-opératoire adaptée est systématiquement mise en place et ajustée en fonction de l’évaluation clinique quotidienne des animaux. La durée du traitement est modulée selon l’état général et les signes de douleur observés.Les animaux sont observés au minimum quotidiennement par un personnel qualifié et toutes les observations sont tracées. La fréquence de suivi et la surveillance sont approfondies en cas de signes cliniques. Lors des examens d’imagerie, une anesthésie adaptée est administrée afin de garantir l’immobilité et le confort de l’animal. Une analgésie complémentaire peut être mise en œuvre si la situation clinique le justifie.

Choix des espèces

Le choix du rat comme modèle animal repose sur plusieurs critères scientifiques et réglementaires. Il est largement utilisé en recherche préclinique grâce à sa physiologie bien connue et sa facilité de manipulation, avec une littérature abondante facilitant la comparaison des résultats. Sa taille et son anatomie permettent de reproduire des modèles chirurgicaux pertinents, tels que la mastectomie et la création de poches sous-cutanées, utiles pour étudier la formation de séromes. Le rat permet également des évaluations quantitatives fiables, tant macroscopiques qu’histologiques, essentielles pour l’analyse de la biocompatibilité (sécurité et performance). Enfin, son utilisation est acceptée par les autorités réglementaires et il présente une transposabilité partielle aux conditions humaines, notamment en matière de cicatrisation et de réponse inflammatoire. Ces caractéristiques en font un modèle pour ce projet. Il n’y a pas de spécification dans les textes réglementaire, donc des animaux adultes seront privilégié. Si pour un projet spécifique, des animaux plus jeunes seraient nécessaire, le projet sera revu par la SBEA.

192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. Un cathéter intraveineux leur est implanté à demeure sous anesthésie, puis ils enchaînent cinquante séances quotidiennes d'auto-administration de cocaïne de trois heures chacune, et dix séances de mesure de choix où des impulsions électriques servent de punition. Le but déclaré est de comprendre comment une consommation répétée devient incontrôlable, pour mieux prévenir et traiter l'addiction chez l'être humain. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun test in vitro ou in silico ne permet cette recherche et qu'il n'est donc "pas envisageable d'utiliser des méthodes de substitution à l'animal entier".

Objectifs

L’addiction aux drogues est une maladie qui se traduit par une perte de contrôle : la personne continue de consommer malgré les conséquences négatives sur sa santé, sa vie sociale ou professionnelle. Cette perte de contrôle n’apparaît pas chez tout le monde, mais peut survenir chez certaines personnes après une consommation prolongée. Elle est due à des interactions complexes entre la drogue et le fonctionnement du cerveau. Pour mieux prévenir et traiter l’addiction, il est essentiel de comprendre ce qui rend certaines personnes plus vulnérables que d’autres. Des recherches suggèrent que la prise répétée de drogue pourrait conduire à des habitudes de consommation qui peuvent devenir pathologiques, si bien qu'une personne continue de consommer même si elle sait que cela lui fait du mal. Cependant, on ne sait pas encore précisément comment ces habitudes peuvent évoluer vers une consommation compulsive, c’est-à-dire incontrôlable. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre comment la répétition de certains comportements peut conduire à une perte de contrôle. Plus spécifiquement, l’objectif est de vérifier si certains individus sont plus enclins que d’autres à former des habitudes de consommation qui peuvent ensuite devenir compulsives. L’objectif final est de mieux comprendre les mécanismes cognitifs de l’addiction pour pouvoir, à terme, améliorer la prévention et les traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche pourrait permettre de mieux comprendre pourquoi certaines personnes deviennent dépendantes à la drogue et n’arrivent plus à s’arrêter, même si elles en souffrent. En identifiant les mécanismes cognitifs qui transforment une consommation volontaire en une habitude incontrôlable, nous espérons trouver de nouvelles façons de prévenir l’addiction avant qu’elle ne s’installe, et de développer des traitements plus efficaces pour aider les personnes déjà dépendantes.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter (durée : 15minutes par animal,) pour permettre l’auto-administration. Sur animaux vigiles : - 50 sessions d’auto-administration de cocaine (1 session / jour, 3 heures par session,). - 10 sessions de mesure de choix (1 session / jour, 5 minutes par session).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : Chirurgies : inconfort transitoire au réveil ; implantation d’un cathéter intraveineux à demeure : risques d’infection ou démangeaisons ; Impulsions électriques légères lors des tests de punition. Stress généré lors des différentes manipulations.

Devenir

Tous les animaux, à l’issue des procédures seront mis à mort afin de prélever le cerveau pour étudier les mécanismes neurobiologiques impliqués dans la compulsion à consommer de la drogue.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases du comportement habituel, peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Il faut également que la taille d’effectif soit suffisante pour tenir compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, nous utiliserons un maximum de 192 animaux sur 5 ans pour répondre à nos objectifs.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés et compétents. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée 3 fois par semaine. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et en cycle inversé avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger ; balle de jeu) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues/récompenses naturelles qui sont similaires à celles de l’Homme et ils peuvent apprendre à s’auto-administrer toutes les drogues abusées par l’Homme, de façon spontanée. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur de déclin cognitif lié au vieillissement.

Huit passages au scanner sous anesthésie et huit sessions de suivi de la démarche par animal, sur les huit semaines qui suivent l'opération : 36 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Un défaut osseux de 2 mm est percé dans un fémur après ouverture des tissus musculaires et cutanés, pour évaluer la combinaison de deux biopansements déjà testés séparément lors d'un projet précédent. Le porteur indique que la douleur postopératoire peut s'accompagner d'une perte de poids, d'une baisse de mobilité et d'une agressivité accrue envers les congénères pendant la première semaine. Il présente cette étude comme un moyen de réduire ensuite le nombre de rats soumis à un modèle de fracture fémorale complète, qu'il décrit lui-même comme plus invasif et plus douloureux.

Objectifs

Le projet vise à évaluer le potentiel de biopansements actifs (scaffolds) et de différents enrichissements sur l'étude de la cicatrisation osseuse. À la suite d’une lésion osseuse, un processus complexe de régénération se met en place. Dans ce contexte lésionnel, une solution innovante permet d'améliorer la régénration osseuse : les scaffolds. Ces biomatériaux offrent une matrice dont les propriétés physico-chimiques guident et stimulent la croissance cellulaire, favorisant ainsi la reconstruction progressive du tissu osseux. Leur potentiel peut encore être renforcé grâce à l’ajout de molécules bioactives, capables d’accélérer et d’amplifier le processus de cicatrisation. Dans ce volet, le projet souhaite étudier le pouvoir cicatrisant de deux biopansements combinés sur le tissu osseux. Ceux-ci ont déjà été testés et validés par le passé lors d'un précédent projet, de façon indépendante et sans enrichissement. Nous souhaitons aujourd’hui tester leur pouvoir cicatrisant en les combinant sur un modèle plus représentatif des contraintes mécaniques que peut subir le tissu osseux.

Bénéfices attendus

Ce projet ambitionne de valider la combinaison de deux biopansements innovants capables de stimuler fortement la cicatrisation osseuse, y compris dans des contextes lésionnels sévères. Ainsi, deux pansements testés lors d'un précédent projet et qui se sont révélés efficaces sur la régénération du tissu osseux indépendamment, ont été retenus afin d’être combinés sur ce projet pour leur propriétés respectives. Le bénéfice final attendu de ce projet sera la mise au point d'un biopansement combiné capable d'accélérer la réparation de défauts sévères.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1- Procédure chirurgicale osseuse (30 min) sous anesthésie volatile (30 min) avec deux injections sous-cutanées pour l'analgésie et l'antibiothérapie (10 secondes chacune) ; Tonte et aseptie (5 min), ouverture des volets cutanés et musculaires (5 min) avec exposition du fémur (5min). Un défaut osseux sera réalisé dans l'un des deux fémurs (5 min). Les volets musuclaires puis cutanés seront refermés à l'aide de fils chirurgicaux (10 min). Les animaux seront mis dans une chambre de réveil pour faciliter le retour à l'état vigile (30 min). Sur les jours suivants la chirurgie, l'antibiothérapie sera poursuivie sur deux jours (2 injections sous-cutanées) et de nouvelles injections d'analgésique seraient réalisées en cas d'apparition de signes de douleur (10 sec). 2- Suivi de la locomotion par un appareil de suivi de la démarche rongeurs toutes les semaines pendant 8 semaines (8*15 min par animal) sans qu'aucune contrainte ne leur soit réalisée. 3- Suivi de la régénération osseuse par imagerie Scanner sous anesthésie volatile (isoflurane) toutes les semaines pendant 8 semaines (8*15 min par animal). 4- Mise à mort terminale avec récupération des tissus en fin d'étude (30 min).

Impact sur les animaux

L'induction des défauts osseux circuclaires de 2mm au niveau des fémurs de rats vont premièrement nécessiter une anesthésie (volatile) et des injections sous-cutanées d'analgésiques. L'anesthésie peut entrainer une hypothermie qui sera à surveiller. Par la suite, ces défauts osseux qui seront induits sont susceptibles d’entraîner des niveaux de douleur modérés. Les nuisances cliniques attendues comprennent notamment une perte de poids et/ou déshydration, une diminution de la prise alimentaire, une diminution de la mobilité, une augmentation du stress (notamment visible par les aspects corporels) ainsi qu’une potentielle agressivité accrue envers les congénères. Des signes d’infection et/ou d’inflammation pourraient également survenir (membre chaud, rouge, glonflé,…) et seront surveillés. Ces manifestations apparaitront principalement au cours de la première semaine suivant la chirurgie et vont tendre à s’atténuer progressivement au fil des semaines.

Devenir

Une mise à mort des animaux est prévue en fin de procédure pour la récupération des fémurs afin de réaliser leur analyse en histologie.

Remplacement

Les biopansements ici testés ont déjà fait l’objet de tests in vitro et in vivo par le biais d'un précédent projet sur le calvarium de rats. Afin de vérifier le potentiel cicatrisant de la combinaison de ces deux pansements sur un modèle plus sévère, et répondre à cette hypothèse scientifique, un nouveau modèle in vitro serait insuffisant. Ainsi, un modèle animal est ici nécessaire afin d’étudier le processus de cicatrisation osseuse dans son ensemble, avec les contraintes que ce tissu peut subir au sein d’un organisme vivant (inflammation locale, vascularisation, remodelage, …). Ceci permettra de garantir la validité, la robustesse et la transposabilité des résultats, condition essentielle pour le développement d’outils thérapeutiques réellement applicables en médecine humaine.

Réduction

Cette étude sera dédiée à la caractérisation de la cicatrisation osseuse dans un modèle de fracture légère. Les données obtenues permettront de valider l'intérêt de ce nouveau biopansement combiné, d’optimiser les paramètres expérimentaux et, surtout, de réduire significativement le nombre de rats utilisés sur le modèle de fracture fémorale complète plus invasive et douloureuse qui viendra compléter cette étude. Ainsi, cette approche progressive contribue directement à limiter l’exposition des animaux aux procédures les plus contraignantes, conformément au principe de Réduction des 3R. Un nombre de 36 rats est prévu sur la procédure, incluant 18 mâles et 18 femelles. Ce nombre a été réduit au maximum afin d’apporter à minima 3 données sur chacun des temps de l’étude tout en gardant une significativité des résultats.

Raffinement

Raffinement de la technique chirurgicale : Des cadavres de rats issus de précédents projets ont été utilisés par le personnel de l’animalerie pour des sessions d’entraînement afin d’affiner et de sécuriser les gestes chirurgicaux de cette procédure. Raffinement des soins pré-per-post opératoires : Tous les rats seront induits en chambre d’induction puis maintenus sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane sur un plateau chauffant. Ils recevront également une injection sous-cutanée d'analgésique afin d’assurer une prise en charge optimale de la douleur et seront également mis sous antibiothérapie .Après la chirurgie osseuse, l’animal sera placé dans une chambre de réveil offrant des conditions optimales afin de faciliter un retour à l’état vigile dans un environnement sécurisé et confortable. Au cours des premières heures et jours post-opératoires, la surveillance des rats sera renforcée afin de permettre une prise en charge rapide et adaptée dès l’apparition des premiers signes de souffrance. En cas de détection de signes de souffrance, une administration d'analgésique sera effectuée afin de soulager efficacement la douleur des rats. De plus, de l’hydrogel sera ajouté dans chacune des cages afin de faciliter l’hydratation des rats et de contribuer à réduire leur inconfort post-opératoire. Par la suite, les animaux subiront une surveillance quotidienne, permettant d’intervenir le plus rapidement en cas d’apparition de signes de douleur / stress.

Choix des espèces

Le rat est largement utilisé dans la recherche preclinique, notamment sur les modèles chirurgicaux orthopédiques. La souche de rat choisie est réputée robuste et facilement manipulable, ce qui nous permettra un suivi clinique facilité. D’autre part, les structures anatomiques osseuses sont suffisamment proches de celles de l'homme et assez grandes pour être opérées et pour réaliser une perforation de 2mm dans l'un des deux fémurs. Une revue en cours de publication sur le critical-size defect ainsi que les entraînements ex vivo ont permis de déterminer que des rats âgés de 15 semaines constituent le modèle le plus adapté afin d’étudier la régénération osseuse. En effet, à ce stade de développement, la croissance osseuse est fortement réduite (stade adulte) ce qui réduit les interactions avec l’étude. De plus, les fémurs à 15 semaines, que ce soit chez les mâles ou les femelles, présentent la taille suffisante pour les modèles chirurgicaux réalisés.

Pour construire un atlas vasculaire cérébral et automatiser le recalage entre imagerie par résonance magnétique et imagerie ultrasonore, 66 rats de six à huit semaines vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun passe une heure d'IRM sous anesthésie avec pose d'un cathéter veineux, puis, vingt-quatre à soixante-douze heures plus tard, une chirurgie d'amincissement du crâne suivie sans réveil de l'imagerie ultrasonore, jusqu'à trois heures en tout. Une partie des rats reçoit en plus une injection de lipopolysaccharide dans le cerveau, pour provoquer une inflammation locale. La méthode sera mise à disposition des utilisateurs de la plateforme d'imagerie, et le porteur indique que des animaux de réforme pourront servir à la mise au point des protocoles.

Objectifs

L’imagerie ultrasonore ultrarapide est une technique récente d’imagerie qui permet d’étudier l’activité cérébrale, grâce à la mesure des changements de volume sanguin dans les vaisseaux qui irriguent le cerveau. En combinaison avec un agent de contraste ultrasonore (sous forme de microbulles injectées dans la circulation, la technique permet de créer des images haute résolution de la microcirculation. Cependant ces images offrent un contraste uniquement vasculaire, sans autre repère anatomique que les vaisseaux intra-cérébraux dans le champ de vue de la sonde ultrasonore. L’acquisition comme l’analyse de ces images requiert de pouvoir repérer les régions anatomiques cérébrales depuis un référentiel, qui ne contient en général aucune information vasculaire. Actuellement la méthodologie d’analyse des données ultrasonores reste très insatisfaisante car l'alignement des images vasculaires avec les images anatomiques (obtenues en IRM) est réalisé manuellement, avec un contrôle visuel de leur adéquation. C'est une source d'imprécision majeure dans la quantification des données. L’objectif est donc de développer une méthodologie robuste, reproductible et automatique de recalage des modalités d’imagerie ultrasonore et IRM.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un développement méthodologique qui permettra d’exploiter de manière plus fiable les données d’imagerie cérébrale ultrasonore acquise chez le rat. Plus généralement, l’intégration de cette modalité, qui permet l'enregistrement de l'activité cérébrale chez des animaux anesthésiés mais aussi vigiles, dans des projets exploitant l’imagerie médicale, sera facilitée. La méthodologie de recalage des modalités d’imagerie du cerveau par résonance magnétique (IRM) et ultrasonore (fUS/ULM) sera mise à disposition de tous les utilisateurs de la plateforme, et pourra, le cas échéant, être adaptée à la souris. Enfin une nouvelle classe d’agents de contraste ciblés sera évaluée, ouvrant la voie à une imagerie ultrasonore moléculaire, ce qui constituerait une nouveauté scientifique. A terme, cette technique d’imagerie pourra être utilisée pour l’évaluation de nouveaux agents de contraste ou médicaments à visée humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à une session d’imagerie par résonance magnétique (1 heure au maximum), sous anesthésie générale, avec pose d’un cathéter veineux. Entre 24h et 72h après, ils subiront une chirurgie consistant en un amincissement du crâne, nécessaire pour l’imagerie ultrasonore, qui sera réalisée dans la foulée (3 heures au maximum, pour l’ensemble, sans réveil de l’animal), avec pose d’un cathéter veineux. En outre certains animaux, auront préalablement subi une intervention chirurgicale consistant en une injection intracérébrale, réalisée 24 à 72h avant la première session d’imagerie. Le délai minimal entre chaque session (imagerie ou chirurgie) est de 24h, le délai maximal est porté à 72h pour tenir compte du week-end.

Impact sur les animaux

L'injection intracérébrale peut entraîner une douleur locale ainsi qu’une gêne transitoire susceptible d’affecter temporairement la prise alimentaire. L’induction de l’anesthésie par voie gazeuse peut être source de stress pour les animaux. Il sera nécessaire de poser un cathéter veineux caudal afin d’administrer des produits de contraste, ce qui constitue une source supplémentaire d’inconfort ponctuel. Préalablement à l’acquisition des images en ultrasons, les animaux subiront une chirurgie consistant en un amincissement du crâne, susceptible d’entraîner des douleurs.

Devenir

Mise à mort

Remplacement

Les développements méthodologiques en imagerie cérébrale doivent être réalisés sur des animaux vivants. En effet, seule l’expérimentation in vivo permet de tester et de valider ces approches dans des conditions physiologiques réelles, où interviennent des paramètres tels que la circulation sanguine, la respiration, l’activité cérébrale et les réactions biologiques de l’organisme.

Réduction

Des animaux de réforme pourront être utilisés pour la mise au point des protocoles d’imagerie. Des animaux de même âge et poids seront utilisés pour la construction de l'atlas vasculaire cérébral, et chaque animal sera mis à profit de manière optimale en subissant à la fois un examen d’imagerie IRM et ultrasonore. Ceci limite considérablement la variabilité et donc le nombre total d’animaux nécessaire. Pour l'évaluation de nouveaux agents de contraste "intelligents" ( car ciblant des protéines particulières), des groupes expérimentaux réduits au minimum (3-4 animaux) seront utilisés pour mener une comparaison exploratoire entre les deux modalités d’imagerie.

Raffinement

L’imagerie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Lors de l’induction de l’anesthesie, une lampe infrarouge est utilisée pour réchauffer la boite et limiter la perte de température corporelle. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse, avec supplémentation en oxygène, un traitement anti-douleur adapté, une thermorégulation continue, une hydratation sous-cutanée, et un monitoring respiratoire. Les groupes sociaux sont conservés (pas d'isolement en dehors de la période d'anesthésie). Le modèle animal d’inflammation cérébrale locale provoquée par l’injection intracérébrale de lipopolysaccharide (LPS) est utilisé car il est moins invalidant pour les animaux que d’autres modèles inflammatoires aigus (comme ceux mimant un accident vasculaire cérébral ou une sclérose en plaques). De plus les méthodes d’imagerie ciblées apportent une grande sensibilité de détection, ce qui permet de limiter à la fois la quantité de LPS injecté et la durée de suivi longitudinal.

Choix des espèces

Les développements méthodologiques visés utilisent des appareils d’imagerie dédiés aux rongeurs. Le projet est mis en oeuvre chez le rat, pour bénéficier d’une imagerie cérébrale mieux résolue en raison de la plus grosse taille de cerveau en comparaison avec la souris. La méthodologie sera entièrement adaptable chez la souris, si besoin. Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (jeunes adultes) : la maturité cérébrale sera atteinte, l’os crânien suffisamment développé et robuste, et le poids suffisant (250-300g) pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste.

Pour mesurer si des LED rouges ou proches infrarouges soulagent la neuropathie provoquée par les anticancéreux, 96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent huit injections de paclitaxel en vingt-cinq jours sous sédation légère, puis passent cinq minutes par séance dans un box de plexiglas, appareil allumé pour la moitié des groupes et éteint pour l'autre. Le porteur écrit que l'induction de la neuropathie est "une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l'étude", et suit chaque semaine par des tests comportementaux l'allodynie tactile et thermique qu'elle provoque. Une grille de points limites explore diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratation, perte de poids, pelage et locomotion, et retire du projet pour mise à mort rapide les rats dont le score l'exige.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques (taxanes, sels de platine…). La neuropathie périphérique chimio-induite se caractérise par des symptômes sensitifs distales et symétriques (picotement, douleur neuropathique, engourdissement), altérant la qualité de vie des patients, et pouvant perdurer longtemps après la fin des traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique est très limitée, car aucun traitement préventif n’est recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée pour traiter les douleurs neuropathiques associées. La littérature scientifique souligne aujourd’hui l’intérêt de la photobiomodulation dans le traitement des douleurs neuropathiques et de la neuropathie périphérique chimio-induite. La photobiomodulation est une technique non invasive qui utilise des lumières rouges ou proches infrarouges de faible intensité (LED), pour stimuler l’activité cellulaire en agissant principalement sur les mitochondries ; cette lumière déclenche une série de réactions biochimiques bénéfiques telles que l’augmentation de la production d’énergie cellulaire, la modulation de l’inflammation, la stimulation de la régénération tissulaire et de la synthèse de collagène, sans effet thermique ni endommagement des tissus. L’objectif du projet sera de mesurer les effets préventifs et analgésiques de la photobiomodulation sur un modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier une nouvelle stratégie de prise en charge de la neuropathie périphérique chimio-induite utilisant la photobiomodulation. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge de la neuropathie périphérique chimio-induite est très limitée, avec aucune stratégie préventive recommandée et seule la duloxétine avec un niveau de recommandation modérée pour le traitement des douleurs neuropathiques associées. Ainsi ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement et de prévention des neuropathie périphérique chimio-induite, avec une technique non-invasive.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections intraveineuses sous sédation légère. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours, et pour une durée des injections de 10 secondes (max). Tous les animaux seront exposés à la procédure de photobiomodulation (2 groupes d’animaux avec un appareil éteint et 2 groupes d’animaux avec un appareil allumé). La procédure de photobiomodulation durera 5 min, et durée pendant laquelle les animaux seront dans des box en plexiglass transparent permettant aux animaux de se toiletter, de se voir et de se sentir. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront en moyenne 5 à 10 min par animal. Il n’y aura aucun prélèvement sanguin durant les procédures. Un seul prélèvement sanguin total sera réalisé en fin de procédure sous anesthésie profonde et avec analgésie, à la suite de quoi les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

L’induction de la neuropathie périphérique chimio-induite chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La neuropathie périphérique chimio-induite sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées de paclitaxel seront responsables d’une réduction du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg et mesure bi-hebdomadaire), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au paclitaxel. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille (voir annexe), et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide.

Devenir

Les expérimentations conduiront à l'euthanasie des animaux pour permettre des analyses biologiques sanguines et tissulaires afin d'optimiser l'emploi des animaux à des fins de recherche.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur des cellules souches humaines de neurones ou organoïdes. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie périphérique chimio-induite, qui n'est-elle-même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'une étude sur la douleur neuropathique, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer, évaluer et valider les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité à 12 par groupe, afin de respecter le principe de réduction tout en garantissant la robustesse scientifique de l’étude. Dans ce type d’étude exploratoire, une diminution plus importante du nombre d’animaux ferait courir un risque élevé de ne pas pouvoir conclure, ce qui entraînerait une perte de valeur scientifique et une utilisation inutile des animaux. Le nombre retenu permet de réaliser des analyses statistiques fiables, fondées sur des tailles d’effet attendues suffisamment larges pour mettre en évidence des différences pertinentes entre les groupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe avec un enrichissement de l’environnement (cylindres en plastique et en carton) afin de favoriser les interactions sociales et les comportements de jeu, contribuant ainsi à améliorer leur bien-être tout au long de l’étude. Les injections de produits à l’étude seront réalisées sous sédation légère. L’exposition des animaux à la photobiomodulation n’imposera aucune contention. Les animaux seront dans des box individuels en plexiglass et sans contention pendant 5 minutes. Les box seront transparents et ouverts, permettant aux animaux de se voir et se sentir, ce qui limitera l’isolement des animaux. Enfin, lors du prélèvement sanguin en point final, les animaux seront sédatés profondément avec une analgésie.

Choix des espèces

Le choix du rat plutôt que la souris se justifie d’abord par sa taille, qui permet de prélever une quantité plus importante de matériel biologique par individu et donc de limiter le nombre total d’animaux nécessaires tout en répondant aux objectifs scientifiques. La souche Sprague-Dawley, connue pour son comportement calme et sa bonne maniabilité, est particulièrement adaptée aux tests comportementaux de la douleur, contrairement à des souches plus actives comme Lou ou Wistar qui peuvent introduire davantage de variabilité dans les mesures. L’utilisation de cette souche s’appuie également sur l’expertise existante et des données antérieures au sein du laboratoire, ce qui renforce la robustesse et la comparabilité des résultats. Les animaux seront utilisés à un âge correspondant à de jeunes adultes (environ 9 semaines), ce qui est cohérent avec la plupart des études publiées et facilite la comparaison avec la littérature ainsi qu’avec les données internes. Le recours à des animaux plus âgés pourrait mieux refléter la situation clinique en oncologie (cancers touchant majoritairement des sujets seniors), mais leur coût élevé et leur moindre utilisation dans les modèles précliniques limitent cette option. Des mâles et des femelles seront inclus afin de refléter la réalité clinique des traitements par paclitaxel, administrés aussi bien chez les hommes que chez les femmes, et de prendre en compte d’éventuelles différences liées au sexe dans les réponses aux traitements.