Rats

Manipulés deux à trois fois par semaine pendant quinze jours, habitués une semaine aux gestes d'injection, puis traités un à sept jours de suite par piqûre intrapéritonéale, sous-cutanée ou gavage : 840 souris et 840 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La corticostérone administrée par voie orale leur fait prendre du poids et déclenche anxiété et stress, et le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer infections, inflammations et irritations au point de piqûre, les gavages des fausses routes et des irritations de l'œsophage. Aucune mesure n'est faite sur l'animal vivant : les 1 680 rongeurs sont anesthésiés à l'isoflurane puis décapités, et c'est sur des tranches de leur cerveau que l'activité électrique est enregistrée. Le porteur écrit avoir besoin de réseaux neuronaux "natifs et connectés", ce que seule la mise à mort permet d'obtenir.

Objectifs

L’objectif de ce projet sera d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules destinées à réduire les effets du stress chronique. Pour cela, nous utiliserons un modèle chez le rongeur dans lequel un état de stress prolongé sera reproduit en administrant une hormone du stress, la corticostérone. Grâce à ce modèle et à nos mesures d’activité électrique du tissus nerveux nous pourrons mieux comprendre si les molécules testées peuvent corriger les effets du stress chronique, et d’identifier les traitements potentiels les plus prometteurs pour des études ultérieures.

Bénéfices attendus

Notre projet permet de caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments dans ce modèle. Nos techniques, mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation de leurs effets sur le tissu nerveux vivants constitue une bonne approche car elle permet : - Dans un modèle de la pathologie chronique une analyse fine de l’effet de la molécule ; - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons, ex vivo); Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement des composés testés avant de lancer les premières étapes précliniques.

Procédures

Les animaux sont manipulés 2 à 3 fois par semaine les 15 premiers jours puis habitué aux futures manipulations d’injection pendant une semaine et enfin à chaque injection les jours suivants. Ils sont traités entre une fois par jour pendant un jour ou 7 jours maximum soit 1 à 7 injections. Ces traitements peuvent être soit une injection intrapéritonéale, soit une injection sous cutanée ou soit un gavage oral. Chacun dure moins d’une minute. Et enfin une anesthésie à l’isoflurane durant 5 min maximum.

Impact sur les animaux

La projet peut générer des effets indésirables. : *-Du stress peut être induit par la manipulation régulière d’un animal ; *-la prise de poids importante, l’anxiété et le stress sont déclenchés par la prise orale de corticostérone ; *-des infections, inflammations, irritations peuvent apparaitre lors des administrations répétées au site d’injections. *-de fausses routes et irritations de l’œsophage peuvent apparaitre lors des gavages répétés.

Devenir

Ce projet nécessitant une analyse fine de l'efficacité des molécules à tester sur tranche de cerveau, nous devons mettre à mort tous les animaux de ce modèle.

Remplacement

Nos évaluations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons donc utiliser des animaux vivants pour cela. En effet, nos tests, permettent d’évaluer des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions anormales ou perturbées observées lors d’un état de stress chroniques.

Réduction

Un test statistique a été utilisé pour calculer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre est de 84 animaux maximums pour la réalisation de ce protocole lors d’une étude. Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, une analyse précise à l’échelle du tissu tout en s’affranchissant des problèmes de passage dans le système nerveux et des problèmes de disponibilité dans l’organisme, mais aussi d’analyser rapidement l’impact sur le fonctionnement électrique du tissus nerveux d’un composé dans ce modèle de stress chronique.

Raffinement

Tous les animaux bénéficient de trois groupes d’enrichissement tournants adaptés pour contrecarrer l’anxiété des animaux. Les animaux utilisés seront habitués, dès le départ, aux contentions à réaliser pour limiter le plus possible les stress futurs liés à ces gestes techniques. Une attention particulière sera portée aux animaux pour repérer chaque signe de dispute/bagarre et isoler au plus tôt les agresseurs. Une vigilance spéciale autour des animaux injectés de façon répétée est posée, pour que lors de ces injections répétées, les sites d’injection soient modifiés dans la zone cible en surveillant tout problème éventuel d’inflammation, au lieu d’injection. Les points limites sont aussi adaptés aux effets possibles dus à cette induction de stress. Lors de la mise à mort par décapitation rapide, les animaux adultes sont au préalable anesthésiés grâce à une induction à l’isoflurane par du personnel qualifié et formé.

Choix des espèces

Le développement de ce modèle inductible de stress et la grande quantité d’informations scientifiques disponibles sur le fonctionnement du système nerveux des souris et rats, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique et au développement de techniques d’enregistrement de l’activité cérébrale sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour la préparation de tranches de tissu nerveux et l’évaluation de l’efficacité de futur médicament. Pour ces raisons, nous n’utilisons que ces rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 6 et 16 semaines post natal afin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.

Jusqu'à trois heures d'acquisition par séance sous sédation continue, et trois séances par souris à 3, 6 et 12 mois : 260 souris et 60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit d'abord une chirurgie de la tête d'une à deux heures pour marquer, lire puis inactiver les cellules qui relient les neurones aux vaisseaux sanguins, geste dont le porteur indique qu'il peut provoquer des douleurs et une perte de poids les jours suivants. L'objet est de calibrer des marqueurs d'IRM fonctionnelle capables de suivre l'évolution des maladies des petits vaisseaux cérébraux, que l'imagerie anatomique ne renseigne pas sur la gravité. Le porteur retient des rongeurs de 8 semaines à 18 mois pour couvrir tous les stades, du jeune adulte à l'animal vieillissant, et les cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour examen au microscope.

Objectifs

Les maladies des petits vaisseaux cérébraux (MPVC), qui affectent les vaisseaux intracrâniens de moins de 500 microns de diamètre, sont responsables de 20 à 30 % des accidents vasculaires cérébraux ischémiques (mauvaise irrigation du cerveau) et de 90 % des hémorragies intracérébrales. Elles peuvent entraîner un déclin cognitif allant de légères altérations des fonctions exécutives jusqu'à une démence sévère. À un stade avancé, elles favorisent également des difficultés de marche et d'équilibre, des troubles de l'humeur et des changements de comportement. Comme d'autres maladies neurodégénératives, les MPVC n'ont actuellement pas de traitements pharmacologiques. Le diagnostic de ces maladies repose sur l'identification de lésions caractéristiques par imagerie par résonance magnétique (IRM) anatomique. Bien que l'IRM soit utile pour le diagnostic, elle ne permet pas de définir la gravité de la pathologie, étant donné que le nombre et l'étendue des lésions varient dans le temps de manière quasi indépendante de la gravité. Elle ne permet donc pas de suivre l’évolution de la maladie. Notre premier objectif est de voir si une modalité d’IRM cette fois-ci dynamique, l’IRM fonctionnelle cérébrale (IRMf), pourrait permettre de collecter des données renseignant finement sur l’évolution de la maladie, en mesurant presque en temps réel les changements locaux de flux sanguin. Chez les souris, en alternative à l'IRM fonctionnelle, nous utiliserons l'écho-encéphalographie fonctionnelle, qui a démontré une meilleure sensibilité et une résolution temporelle supérieure, tout en fournissant des signaux similaires à ceux de l'IRMf. Pour y parvenir, nous aurons recours à plusieurs modèles animaux des MPVC qui ont été développés au cours des dernières décennies. Ces modèles génétiques ou pharmacologiques, nous permettront de comprendre l’origine des altérations vasculaires et notamment de faire la différence entre des altérations des vaisseaux eux-mêmes et des altérations de l’environnement cellulaire de ces vaisseaux.

Bénéfices attendus

Nos recherches visent à identifier et calibrer de nouveaux outils diagnostiques basés sur l'IRMf pour évaluer la présence et la gravité des MPVC. Actuellement, le diagnostic de ces maladies ne s'effectue qu'à partir des symptômes ou par analyses génétiques. Ces approches ne répondent pas aux besoins des patients, car elles ne fournissent pas d'éléments sur la gravité de la maladie et n'informent que sur les stades les plus avancés de celle-ci. Des outils diagnostiques capables de détecter les phases précoces et de produire des données quantitatives sur la gravité ouvriront la voie aux tests de différents traitements pharmacologiques déjà validés sur des modèles de souris. A plus long terme, l’obtention de marqueurs fins de la maladie et de son évolution devrait permettre de développer des premiers traitements efficaces pour ces maladies.

Procédures

Les animaux recevront un antidouleur et une anesthésie générale avant de subir une quelconque intervention. Certaines souris avec des mutations transgéniques activables via l'administration de substances spécifiques, recevront le traitement par applications transdermiques de la durée de quelques minutes, le temps pour faire absorber la solution sur la peau, pendant 5 jours consécutifs. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ une heure (et pas plus de 2 heures) réalisée au niveau de la tête– pour : I) marquer les cellules qui participent aux interactions entre les neurones et les vaisseaux sanguins, II) pour "lire" les signaux provenant des cellules marquées, III) pour « inactiver » ces cellules avec des substances spécifiques, déjà largement utilisées dans des expériences précédentes sur des rongeurs. La lecture et l'inactivation des cellules d'intérêt seront effectuées pendant les séances d’IRM ou par l'écho-encéphalographie, mais ces imageries ne provoquent aucune douleur ni gêne aux animaux, d’autant plus qu’ils seront sédatés. Avant les sessions d'imagerie un cathéter sera posé sur le dos de animaux pour leur administrer en continue une molécule qui induit une sédation. Une fois le cathéter positionné, les animaux seront ensuite positionnés dans un berceau compatible avec l’IRM ou avec les ultrasons fonctionnels pour 3h maximum d’acquisition. Il n’y aura pas plus de 3 séances d’acquisition par souris, à 3, 6 et 12 mois. Une seule séance pour les rats.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour préparer les animaux aux expériences d'IRM pourra entraîner des douleurs et/ou une perte de poids dans les jours suivants l’expérimentation. L’anesthésie mise en place lors du protocole d’acquisition IRM pourra fragiliser les animaux en induisant une modification de leur comportement et/ou une perte de poids. Pendant les applications sur la peau des substances d’intérêts, les souris peuvent réagir brièvement à la sensation de froid de l'éthanol, mais aucune douleur durable ni lésion tissulaire n'a été observée par des études précédents. Les animaux seront gardés isolés pendant quelques minutes dans une cage, au chaud, après chaque session d'IRM pour qu'ils se réveillent. Dans ce cas, un mouchoir en papier sera ajouté à la cage pour servir de nid et une partie de la litière de la cage d'origine sera ajoutée pour rendre l'environnement moins étranger à l'animal.

Devenir

La suite du projet prévoit des analyses approfondies des différents tissus du cerveau. Les animaux seront donc mis à mort en fin de procédure pour prélever leurs cerveaux et pour les étudier par microscopie.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier la dynamique vasculaire grâce à l’IRM fonctionnelle et de mettre en place de nouvelles méthodes diagnostiques de la MPVC chez l’humain. Il n’existe pour l’instant pas de modèles in vitro suffisamment robustes et complexes pour reproduire la dynamique vasculaire cérébrale. Seul un organisme vivant suffisamment proche de l’humain possède les mêmes caractéristiques d’organisation et de complexité. Cette caractéristique du cerveau n’est présente que dans le cerveau vivant au repos. C’est pour cette raison qu’il n’est pas possible de remplacer les animaux par une autre alternative non animale.

Réduction

Nous effectuerons des recherches constantes dans la littérature scientifique pour vérifier que des études similaires à la nôtre soient publiées entre-temps. Dans ce cas, nous suspendrons les investigations qui pourraient dupliquer inutilement des résultats déjà publiés, sauf s'il y a des besoins évidents de vérification des résultats ou des doutes fondés sur la qualité des résultats publiés. En outre, tous les groupes expérimentaux ont été soigneusement calculés a priori, sur la base d'études antérieures similaires, dans le but d'utiliser le nombre minimum d'animaux, tout en permettant une analyse statistique rigoureuse des résultats.

Raffinement

Tous les animaux seront surveillés tout au long de la procédure. Pendant les interventions chirurgicales les animaux sont anesthésiés et reçoivent un analgésique ainsi que des injections d’anesthésique locales. Pour le suivi post chirurgie des modèles pharmacologiques, nous utiliserons une grille de score dans laquelle des points limites sont déterminés. Les IRM seront réalisées par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous anesthésie générale. Un monitoring de la respiration et température est prévu tout au long de la séance IRM. Si un animal présente un signe de douleur persistant il sera retiré du protocole et euthanasié. Les animaux seront hébergés en groupe. Un enrichissement avec des balles de papiers pour réaliser un nid et une maisonnette en plastique seront prévus pour chaque cage. De par notre expérience passée sur des protocoles similaires, la probabilité qu’un animal présente des signes importants de stress ou de souffrance (à cause d’une blessure par exemple) sera très faible. Néanmoins, un système d’observation rigoureux des animaux sera mis en place afin de repérer rapidement d’éventuels signes de stress ou de souffrance. Des points limites adaptés ont été définis, permettant d’identifier ces rares cas. Dans une telle situation, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Notre projet repose sur l'utilisation des modèles suffisamment proches de l’humain d’un point de vue organisation générale (des organes, des tissus, des types cellulaires et des fonctions). Les rongeurs constituent un modèle adapté pour les expériences proposées, où l'unité neuro-vasculaire complètement fonctionnelle est requise. Nous utiliserons également des modèles de souris issus de lignées génétiquement modifiées disponibles, ayant une reproduction bien maitrisée. Les souris et les rats sont très couramment utilisés en recherche sur les MPVC, et de nombreux modèles expérimentaux existent déjà. Les MPVC sont des maladies qui se déclenchent à l’âge adulte. Cependant, l’intérêt de cette étude est de pouvoir mettre en place des biomarqueurs détectables à tous les stades de la maladie (d’un stade précoce à un stade âgé). Les animaux utilisés seront donc des animaux adultes âgés de 8 semaines à 18 mois afin d’avoir un panel élargit allant de jeunes adultes à rongeurs âgés.

Pour évaluer la toxicité pulmonaire de trois substances candidates à un revêtement antimicrobien autodésinfectant, 360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent la substance par voie respiratoire sous anesthésie générale, trois fois en une semaine, et sont pesés et observés jusqu'à une fois par jour. Le porteur indique que ces expositions peuvent provoquer une inflammation, une perte de poids et des signes cliniques anormaux touchant la respiration et les muqueuses, et que des points limites déclencheront des mesures correctives. La mise à mort sert à ouvrir les animaux et prélever des échantillons, et le porteur annonce que les résultats pourront donner lieu à des brevets protégeant les formulations développées.

Objectifs

Le projet dans lequel est inclus cette étude vise à concevoir et développer des produits intégrant des nanoparticules biosourcées aux propriétés antimicrobiennes, efficaces contre de nombreux pathogènes, tout en garantissant la sécurité pour l’humain et l’environnement. Il s’appuie sur une évaluation des dangers et des risques, combinant des nouvelles approches méthodologiques, notamment des tests in vitro et des études in vivo en vue d’une future validation réglementaire. Dans ce contexte, cette étude a pour objectif d’évaluer la toxicité et la toxicocinétique de l’exposition par voie pulmonaire de trois substances candidates au développement d’un revêtement antimicrobien autodésinfectant chez le rongeur (rats).

Bénéfices attendus

Le projet dans lequel est inclus cette étude a pour objectif de développer des produits intégrant des nanoparticules biosourcées aux propriétés antimicrobiennes, efficaces contre de nombreux pathogènes, tout en garantissant la sécurité pour l’humain et l’environnement. Il s’appuie sur une évaluation des dangers et des risques, combinant des nouvelles approches méthodologiques, notamment des tests in vitro et des études in vivo en vue d’une future validation réglementaire. Cette étude permettra en particulier de caractériser les effets sur la santé liés à une exposition par voie pulmonaire à des nanoparticules candidates au développement d’un revêtement antimicrobien autodésinfectant. Les résultats du projet seront publiés dans des revues scientifiques et pourront trouver des applications à court terme, tandis que des brevets pourront être déposés pour protéger les formulations développées.

Procédures

Observations cliniques et pesées (moins de 5 min) : au moins 2 fois/semaine, au maximum tous les jours. Administration par voie respiratoire sous anesthésie générale (moins de 10 min par administration) : 3 fois durant 1 semaine à raison d’1 fois/jour tous les 2 à 3 jours (traitement mercredi, vendredi et lundi).

Impact sur les animaux

Administration par voie respiratoire (modérée) : stress lié à l’anesthésie, et inflammation potentiellement induite par la méthode d’administration et l’administration par voie respiratoire des substances d’essai. De manière générale, la manipulation des animaux pourra modifier leurs réactions à la préhension et leur niveau d’activité, et une légère perte de poids pourra être observée dans les jours qui suivront les administrations (effets habituellement relevés suite à l’application de cette méthode d’administration par voie respiratoire chez des animaux témoins de même souche, âge et sexe). Les expositions aux substances d’essai pourront également induire des effets locaux et systémiques susceptibles de faire souffrir les animaux. Des signes cliniques anormaux, affectant notamment la respiration, les muqueuses et la physiologie, pourront être observés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser un examen interne, et prélever et analyser des échantillons biologiques.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement de méthodes alternatives à l’expérimentation animale qui permettent seules de déterminer la toxicité subaiguë et la toxicocinétique de nanoparticules suite à une exposition par voie pulmonaire et qui soient reconnues d’un point de vue réglementaire et scientifique. La complexité du système respiratoire, la nécessité d’une évaluation intégrée et dynamique, les propriétés spécifiques des nanoparticules, les limites actuelles des méthodes alternatives et les attentes réglementaires justifient le recours à des études in vivo. Concernant le choix des animaux, le projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour les études d’exposition par inhalation (utilisation de rats mâles et femelles) à l’âge adulte et de souches couramment utilisées en laboratoire.

Réduction

Les modalités d’essai ont été définies compte tenu des résultats d’études antérieures in vitro réalisées dans le cadre du projet, des données toxicologiques et physico-chimiques disponibles sur les substances d’essai, et des objectifs de l’étude. Le nombre d’animaux qui sera utilisé a été déterminé conformément aux recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour l’évaluation de la toxicité par inhalation, ainsi qu’en fonction de l’effectif nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique pertinente et robuste des données ex vivo de pathologie clinique et de toxicocinétique qui seront générées. Les groupes seront comparés par les tests appropriés au traitement de chaque type de données et à leur distribution. Plusieurs paramètres seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés.

Raffinement

A réception des animaux au laboratoire, une période d’acclimatation d’au moins 5 jours sera respectée. Ils seront hébergés à plusieurs par cage (2 ou 3 selon leur poids) par modalité d’essai pour leur socialisation. Un animal sera séparé de ses congénères en cas de lésions, d’agressivité, de respiration anormale ou de comportement anormal. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et limiter le stress des expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier et du matériau en bois à ronger seront disposés dans leurs cages d’hébergement. Les administrations par voie respiratoire seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront observés attentivement au plan clinique dans les heures qui suivront chaque administration, et jusqu’à ce que leur bon état de santé soit avéré. Des points limites relatifs à l’apparition de signes de douleur et des actions correctives visant à soulager les animaux ont été définis en adéquation avec les informations toxicologiques disponibles sur les substances étudiées et les paramètres étudiés pour assurer leur bien-être.

Choix des espèces

Ces expérimentations seront réalisées chez le rat car sa physiologie est largement connue et car il constitue un modèle de prédiction des effets respiratoires et systémiques reconnu par la réglementation (cf. Document d'orientation de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°39). Ce projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques d’évaluation de la toxicité par inhalation, d’utilisation d’animaux jeunes adultes, mâles et femelles, âgés au moment du traitement de 7 à 12 semaines.

Une électrode détruit d'abord les neurones du noyau suprachiasmatique, deux semaines plus tard une seconde chirurgie injecte une protéine Tau fluorescente dans le cerveau et pose un cathéter dans la veine du cou, puis les animaux sont tués dix jours après. 958 souris et rats passent par ces protocoles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certains gardés jusqu'à vingt mois et isolés seuls en cage pendant deux semaines. Un groupe de 150 souris est empêché de dormir par un aliment appétant distribué au début de leur phase de sommeil, puis testé à trois, six et douze mois sur l'activité locomotrice, l'anxiété et les performances cognitives. Aucun animal n'est gardé vivant, y compris ceux qui servent de témoins, tous étant mis à mort pour l'analyse de leur cerveau.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la démence la plus fréquente chez les personnes âgées dont la prévalence augmente exponentiellement après 65 ans et qui touche 23% de la population après 80 ans. Compte tenu du vieillissement démographique, le nombre de personnes touchées pourrait doubler d’ici à 2050. Comprendre le développement de la maladie est donc primordial. Cette démence se caractérise en partie par une accumulation et une agrégation d'une protéine, la protéine Tau, provoquant la dégénérescence des neurones touchés. Les atteintes cérébrales sont variées : hippocampe, cortex, … mais également l’hypothalamus et en particulier les neurones du Noyau Supra-Chiasmatique (NSC) impliqués dans le contrôle des rythmes circadiens (rythme biologique qui régule l'alternance veille/sommeil). Les troubles du sommeil représenteraient un marqueur précoce de la maladie avant l’apparition des troubles cognitifs mais également un facteur de risque. Notamment, il a été montré qu’une privation de sommeil chez l’animal et chez l’Homme conduit à une élévation des protéines Tau toxiques dans le liquide céphalorachidien. De plus, le travail de nuit, occasionnel ou habituel, qui concerne environ 15% des salariés en France soit 3,5 millions de personnes, constitue une préoccupation majeure de santé publique du fait des effets sanitaires divers qui lui sont associés, en particulier des troubles cognitifs et d’une augmentation du risque de démences. En outre, il a été montré récemment que les cellules bordant le troisième ventricule du cerveau, nommées les tanycytes, étaient également dégradées dans la maladie d’Alzheimer. Or, ces tanycytes pourraient être impliquées dans la clairance de la protéine Tau contenue dans le liquide céphalorachidien. De plus, il a été récemment suggéré que les neurones du NSC pourraient communiquer avec les tanycytes pour réguler certaines fonctions circadiennes. Le projet se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans l’arrivée de la maladie d’Alzheimer. Les résultats de ces recherches pourraient permettre d’évaluer l’impact des troubles du sommeil ou les horaires de travail décalés sur le développement de la maladie d’Alzheimer et également d’autres démences, et ainsi aider les autorités sanitaires à mettre en place des actions afin de limiter ces facteurs de risques. D’autre part, la dégradation des tanycytes et le manque de nettoyage du liquide céphalorachidien au cours des phases de sommeil profond par ces cellules spécialisées, les tanycytes, pourraient être à l’origine d’autres pathologies et ouvre la voie à de nouvelles recherches. En effet, l’accumulation d’autres protéines dans le liquide céphalorachidien, tel que l’Orexine, pourrait être responsable de troubles métaboliques observés chez les personnes ayant des troubles du sommeil ou en travail posté.

Procédures

Chacune des interventions sera réalisées dans les 2 animaleries. Un 1er groupe d'animaux (100 souris/100 rats) sera nécessaire pour étudier les changements des tanycytes induits par une lésion des NSC. Une chirurgie cérébrale détruira les neurones des NSC par l’introduction d’électrodes qui envoient un courant électrique. Ces animaux subiront une 2e chirurgie 2 semaines après afin d'injecter dans le cerveau une protéine Tau fluorescente et un cathéter sera placé dans la veine du cou afin d'effectuer des prélèvements de sang réguliers. Les animaux seront euthanasiés 10 jours après afin de prélever les cerveaux et étudier leurs morphologies. Un 2e groupe d'animaux sera utilisé pour vérifier l'impact d'une perturbation du rythme circadien (travail posté, mauvais sommeil) sur les fonctions cognitives des souris soit par lésions des NSC, soit par une manipulation environnementale. Un 1er sous-groupe de 240 souris (90 souris sauvages, 90 souris modèles de la maladie d'Alzheimer et 60 souris contrôles) subiront une chirurgie de lésion cérébrale des NSC; un 2e sous-groupe (90 souris avec chocolat en phase de sommeil et 60 souris contrôles avec chocolat en phase de veille) se verra administrer un aliment appétant au début de la phase de sommeil afin de les empêcher de dormir. Toutes ces souris seront testées 3, 6 et 12 mois après par des tests de comportements et par des tests du sommeil. Un 3e groupe d'animaux sera utilisé pour étudier un changement des gènes dans les tanycytes à court et à long terme induit par une lésion des NSC sur 80 souris et 80 rats. Les animaux subiront une lésion des NSC puis après 1, 3, 6, 12 et 18 mois, une chirurgie cérébrale permettra l'injection d'un virus qui rendra les tanycytes fluorescents. Ces animaux seront euthanasiés 2 semaines après l'injection du virus pour des expériences de transcriptomique. Un 4e groupe d'animaux permettra de voir l'impact de l'activation ou l'inhibition des neurones des NSC à la fois sur la morphologie et sur la modification des gènes des tanycytes. Deux sous-groupes (52 souris et 52 rats chacun) auront une injection cérébrale de virus permettant d’activer ou d’inhiber sélectivement les neurones des NSC et un virus qui rendra les tanycytes fluorescents. Deux semaines après l’injection cérébrale, les animaux seront mis à mort 30min après l’activation ou l’inhibition des neurones. Chacune des interventions chirurgicales durera entre 30 minutes et 1 heure.

Impact sur les animaux

Toute manipulation des animaux peut provoquer du stress, de la fatigue et de l’inconfort et des mesures de raffinement seront mises en place pour les limiter au maximum. En particulier, les expériences de chirurgie ou de prélèvements de sang sont faites sous anesthésie générale avec l'administration d'analgésique pour éviter toute douleur à l'animal lors de son réveil. Afin d’évaluer la perturbation des rythmes circadiens, il sera nécessaire d’isoler les animaux individuellement pendant 2 semaines (évaluation du poids, de l’absorption d’eau et d’aliments, expériences d’optogénétique). Cet isolement reste limité et sera effectué dans des cages transparentes à coté les unes des autres afin de permettre à chaque souris/rat de voir ses congénères. La lignée de souris transgéniques est une lignée de souris mimant la maladie d'Alzheimer. Ce modèle murin développe une perte des fonctions cognitives progressives, à partir de l’âge de 3 mois, avérée à 6-7 mois et maximale à 12 mois. Ces animaux n'ont pas de problème de déplacement et ne souffriront pas de cette pathologie. D’autres manipulations seront effectuées sur les animaux vigiles : des tests de comportement (sur 390 souris) consistant à déterminer l’activité locomotrice, l’anxiété et le stress des souris ou les performances cognitives. Ces expériences n’entraînent aucune douleur, mais peuvent générer du stress suite aux manipulations; les expériences seront réalisées par le même manipulateur et une habituation est effectué avant chaque test. Les molécules (anesthésiques, analgésiques, activateur/inhibiteur) devront parfois être injectés dans le péritoine de l’animal et nécessiteront la contention et l’injection de l’animal; un analgésique local peut être utilisé pour limiter la douleur de l'injection.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés dans chacune des procédures sera euthanasié à terme même ceux qui servent de contrôles. La durée maximale de conservation des animaux après le début des expériences est de 18 mois. Les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude pour faire des analyses de transcriptomique ou étudier la morphologie des populations cellulaires.

Remplacement

Les expériences prévues ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3R. L’étude des communications entre différentes régions cérébrales nécessite, en particulier au niveau du cerveau, d’utiliser des organismes entiers. Aucun système cellulaire n’est capable à l’heure actuelle de mimer toutes les interactions entre différentes régions cérébrales et les influences périphériques. Les tanycytes de l’éminence médiane sont des cellules placées au cœur d’une région cérébrale impliquée dans la régulation des fonctions endocrines et préserver l’influence des différentes parties de l’organisme sur cette communication cérébrale est indispensable pour notre projet. Les modèles de rongeurs rats et souris sont donc pertinents pour ce type d’étude et permettront une étude comparée des deux espèces ayant des physiologies différentes.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est calculé de façon à avoir un nombre minimal et homogène d’animaux et que ce nombre soit suffisant pour une analyse statistique. Le calcul du nombre d’animaux est basé sur un calcul statistique d’effectif (seuil de significativité de 5%, puissance égale à 85%, différence entre les moyennes de 15 et écart-type de 10) pour une comparaison entre deux lots et un test statistique bilatéral. Ce calcul évalue le nombre minimum de souris par groupe entre 6 et 10.

Raffinement

Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur. * Les animaux sont habitués à la manipulation. * Les hébergements seront enrichis. * Pour les prélèvements sanguins, les animaux sont anesthésiés dès que possible. * Une surveillance quotidienne est effectuée afin de détecter le plus tôt possible une éventuelle morbidité (suite à l’infection). En cas de signes cliniques défavorables et/ou si une perte de poids supérieure à 20% survenait, les animaux concernés seront mis à mort par anesthésie à l’isoflurane avant l’injection létale de barbiturique (Pentobarbital 182,2mg/kg) par voie intrapéritonéale. La souffrance, la détresse, l’inconfort des animaux de laboratoire seront évalués en se basant sur les cinq paramètres suivants : 1. variation du poids de l’animal 2. apparence physique externe (horripilation, accélération de la respiration, tremblements, consistance anormale des fèces associée à une distension de l’abdomen) 3. signes cliniques mesurables (hypothermie) 4. changement du comportement (diminution des soins, animal prostré) 5. réponses comportementales aux stimuli externes (réaction violente de douleur associée à des vocalisations). Les douleurs seront limitées par l'utilisation d'un analgésique (Metacam 5mg/kg pour les souris et 1mg/kg pour les rats; et lidocaine en spray). Une grille de score basée sur ces 5 critères (issue de Wolfensohn et Lloyd, 2003) sera utilisée pour évaluer l'état de chaque animal aprè les chirurgies. Un stress momentané est possible et sera réduit grâce aux bonnes pratiques de la préhension des animaux (suivant les recommandations « refining procedures for the administration of substances » - report of the BVAAWR/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group of refinement). Un tranporteur agréé sera chargé de transporter les animaux entre les 2 animaleries. Une temps de 7 jours sera laissé pour leur permettre de s'habituer à l'animalerie et se remettre du stress généré par le transport.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle rongeur est essentielle pour décrypter les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie d’Alzheimer. La communication entre différentes populations cérébrales impliquées nécessite l’utilisation de l’animal entier. Par ailleurs, la possibilité d’utiliser des souris transgéniques THY-Tau22 mimant le déclin cognitif est un plus et nécessite l’utilisation de souris transgéniques et wild-type. L’utilisation des technologies DREADD et d’optogénétique nécessite également l’utilisation de souris et de rats, technologies aujourd’hui indispensables pour moduler des populations neuronales et en déduire leurs fonctions. La physiologie des souris et des rats étant différente, il nous parait nécessaire d'étudier dès que possible ces 2 espèces afin de permettre leur comparaison. Tous les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux adultes de 8 semaines à 21 mois. Toutes les expériences démarreront à l’âge de 8 semaines et se poursuivront sur 14 ou 24 jours pour les études à court-terme, ou sur 3 mois, 6 mois, 12 mois et 18 mois pour les études sur le long-terme (au maximum, les animaux seront âgés de 20,5 mois).

Deux chirurgies par animal, la seconde durant de quatre à douze heures, puis des enregistrements cérébraux d'une à six heures pendant leur sommeil : 200 rats et 200 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés en cages individuelles ou semi-partagées et maintenus en restriction alimentaire pendant environ un mois, avant d'être entraînés à des tâches de mémoire dans des labyrinthes puis soumis à des micro-stimulations cérébrales destinées à modifier leurs performances. Le porteur écrit que la restriction alimentaire est bénéfique pour la santé et ne constitue pas une nuisance, et que l'isolement n'engendre qu'un stress léger. La validation des enregistrements exige un prélèvement histologique, donc la mise à mort, seuls des animaux non implantés pouvant être placés auprès d'associations, et les tests comportementaux sont annoncés sans être précisés.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier les mécanismes de la formation et de la consolidation de la mémoire, ainsi que de son utilisation pour la prise de décision, l’anticipation et l’imagination. Nous entraînerons des rongeurs à effectuer des tâches de mémoire, nous enregistrerons leur activité cérébrale pendant l’accomplissement de ces tâches et pendant le sommeil, et nous tenterons de modifier les performances des animaux grâce à des micro-stimulations cérébrales ciblées (à l’instar des micro-stimulations qui améliorent la motricité de patients atteints de la maladie de Parkinson). Des rats et des souris seront utilisés pour toutes les étapes de ce projet. Ces rongeurs sont des modèles standards, aussi bien en psychologie animale qu’en neurophysiologie chez l’animal libre de ses mouvements, pour l’étude de la mémoire en conditions normales et pathologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux de la mémoire. Nous nous intéresserons en particulier à l’hippocampe, une structure qui chez l’homme joue un rôle clef dans la mémoire des souvenirs personnels (mémoire épisodique) et des faits généraux (mémoire sémantique), et qui est particulièrement impactée dans les troubles mnésiques liés aux maladies neurologiques, notamment l’épilepsie, la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer. À ce titre, nos travaux précédents décrivant une méthode d’amélioration de la consolidation de la mémoire chez le rat ont été récemment répliqués chez l’homme et laissent entrevoir la possibilité de pallier certains déficits mnésiques liés à l’âge ou à la pathologie.

Procédures

Ce projet utilisera au plus 200 rats et 200 souris. Les animaux seront hébergés en cages semi-partagées ou individuelles et en légère restriction alimentaire typiquement pendant 1 mois. Tous subiront 2 chirurgies : la première durant typiquement 1 à 2 heures, la seconde durant typiquement 4 à 12 heures. Les deux chirurgies sont espacées de 1 à 3 semaines. Les enregistrements dureront typiquement 1 à 2 heures pendant les tests comportementaux et 1 à 6 heures pendant leur sommeil, le tout pendant 2 à 3 semaines. En général, chaque animal n’est testé que dans une seule tâche, et n’explore donc qu’un labyrinthe particulier (dans certains cas, comme pour des tâches en plusieurs étapes, ils peuvent être amenés à en explorer plusieurs, mais le principe reste le même et la durée totale est similaire, soit typiquement un mois en incluant la familiarisation et le pré-entraînement avant enregistrements). État de conscience : les animaux sont vigiles pendant l’hébergement, les tests comportementaux et les enregistrements ; ils sont anesthésiés pendant les chirurgies.

Impact sur les animaux

Les chirurgies peuvent engendrer des douleurs post-opératoires modérées sur de courtes périodes. Les implants peuvent être source d’inconfort pendant le cours laps de temps que l’animal s’y habitue. L’isolement des animaux va engendrer un stress léger typiquement pendant 1 mois. Concernant les tests comportementaux et les enregistrements, ils peuvent occasionner un très léger stress lié à la nouveauté lors des toutes premières sessions. La légère restriction alimentaire est bénéfique pour la santé et ne constitue pas une nuisance.

Devenir

À l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. La validation des enregistrements nécessite un prélèvement histologique. Certains animaux non exploitables seront replacés auprès d’associations spécialisées (animaux non implantés, jugés aptes par un vétérinaire, acceptés pour placement, etc.)

Remplacement

Certains mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant la mémoire (par exemple, le recrutement de nouveaux récepteurs au niveau synaptique) peuvent être défrichés in vitro. Certaines propriétés computationnelles de petits réseaux de neurones peuvent être testées in silico. Mais in fine, l’étude des mécanismes de réseau de la mémoire nécessite de faire des liens corrélationnels et causaux précis entre activité neuronale à grande échelle et comportements d’apprentissage et de mémoire, et ne peut se faire que sur des animaux au cours même de l’apprentissage, du sommeil et du rappel.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des systèmes d'acquisition haute densité, permettant d'enregistrer >100 neurones simultanément, ce qui maximisera la quantité d'information apportée par chaque animal. L'approche statistique tirera profit des tout derniers développements statistiques et analytiques du domaine.

Raffinement

Les soins post-opératoires incluront des traitements analgésiques, ainsi qu'une surveillance quotidienne des animaux. Nos expériences s'effectueront sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements pour se rapprocher au mieux de la physiologie et limiter le stress. Les systèmes d’enregistrement sont miniaturisés au maximum pour s’assurer que les animaux implantés aient un comportement tout à fait normal. Pendant les périodes nécessitant une restriction alimentaire précise et une protection des implants, les animaux (rats et souris) doivent être maintenus dans des cages semi-partagées maintenant un contact auditif, olfactif, et visuel. Les rats auront également un lien tactile partiel. De la musique sera diffusée dans la pièce pour réduire le stress causé par les éventuels bruits environnants, qui bien que réduits pourraient devenir plus saillants dans le silence. La légère restriction alimentaire est bénéfique pour un grand nombre de marqueurs de santé et de vieillissement. L’exploration de labyrinthes constitue par ailleurs une stimulation bénéfique (exercice physique, curiosité, récompenses alimentaires,…) Les animaux sont suivis grâce à l’utilisation de grilles de score qui permettent la mise en place de points limites adaptés.

Choix des espèces

Le rongeur est un modèle idéal pour étudier la mémoire spatiale en raison de ses excellentes capacités de navigation. S’agissant de l’espèce de référence pour toutes les études depuis les années 70, les données déjà publiées servent de base pour faire progresser nos connaissances. De plus, l’existence de modèles transgéniques permet de cibler des groupes cellulaires spécifiques. Nous utiliserons de jeunes adultes (typiquement 2 à 6 mois), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.