Rats

Soumis à un clampage de l'aorte au-dessus des artères rénales, 80 rats subissent une intervention de soixante à soixante-douze minutes destinée à provoquer une ischémie puis une reperfusion des reins. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une molécule bloquant l'héparanase et un préconditionnement ischémique. Parmi les nuisances attendues, le porteur cite la contention au moment de l'injection des anesthésiques, avant les douleurs abdominales dès le réveil et la réduction de la mobilité. L'apparition de signes cliniques de souffrance, respiration difficile, poils hérissés, prostration, constitue le seuil à partir duquel un rat est retiré de l'étude et mis à mort.

Objectifs

Le traitement chirurgical ouvert des anévrismes de l’aorte peut nécessiter de bloquer temporairement la circulation du sang vers les reins (clampage des artères rénales). Cette interruption de la circulation provoque un manque d’oxygène suivi d’une reperfusion, ce qui peut endommager les reins et entraîner une insuffisance rénale aiguë (AKI). Cette atteinte rénale est le plus souvent réversible, mais elle augmente le risque de développer plus tard une insuffisance rénale chronique et des maladies cardiovasculaires. Après une chirurgie d’anévrisme juxta-rénal, environ un quart des patients (24 %) présentent une AKI, et ce chiffre peut atteindre 30 % pour les anévrismes situés plus haut (sus- ou pararénaux). Dans 8 à 10 % des cas, une dialyse est nécessaire après l’opération. Nous faisons l’hypothèse qu’une structure appelée glycocalyx endothélial, qui recouvre la surface interne des vaisseaux sanguins, joue un rôle important dans ces lésions rénales. Lorsqu’il est dégradé, notamment sous l’effet d’une enzyme appelée héparanase, il favorise des réactions inflammatoires et des lésions durables du rein. Le but de notre projet est d’étudier, sur un modèle animal, le rôle de cette enzyme héparanase dans les lésions rénales liées au clampage aortique sus-rénal, et de tester deux approches pour limiter ces dommages : 1. L’utilisation d’une molécule qui bloque l’action de l’héparanase. 2. L’application d’un préconditionnement ischémique (une technique visant à préparer le rein à mieux supporter le manque d’oxygène).

Bénéfices attendus

Nous comptons évaluer et caractériser les effets protecteurs de l'utilisation d'une anti-héparanase et du préconditionnement ischémique dans un modèle d'ischémie-reperfusion viscérale reproduisant la cure chirurgicale d'un anévrisme de l'aorte abdominale supra-rénale. Ce projet s'inscrit dans une thématique de recherche sur l'intêret des méthodes de protection lors des chirurgies aortiques. En effet le précondionnement constitue une voie de recherche déjà étudiée chez l'Homme. L'utilisation d'une antihéparanase pourrait aussi constituer une approche thérapeutique interessante et innovante en préservant la fonction endothéliale.

Procédures

La procédure expérimentale concerne l’ensemble des 80 rats inclus dans l’étude. Pour tous les groupes, l’intervention chirurgicale durera entre 60 et 72 minutes. La mise à mort nécessitera une nouvelle induction anesthésique, afin de permettre le prélèvement des organes et du sang, et aura une durée d’environ 10 minutes par rat.

Impact sur les animaux

La nuisance sera la contention de l'animal qui peut le stresser lors de l'injection des anesthésique et analgésique . Des douleurs attendues seront d'ordre abdominal dès le réveil pendant la période de reperfusion et en postopératoire, nous nous attendons également à une réduction de la mobilité du rat.

Devenir

Tous les rats inclus dans ce protocole seront mis à mort à la fin de l’étude afin de permettre la récupération des organes pour des analyses fonctionnelles, moléculaires et structurelles. Cette démarche vise également à prévenir toute éventuelle souffrance.

Remplacement

Actuellement, il n'existe pas encore chez l'Homme de biomarqueurs permettant de diagnostiquer ou d'étudier la dysfonction endothéliale dans l'ischémie-reperfusion viscérale ou rénale. Afin d'étudier les phénomènes physiopathologiques qui entourent une ischémie-reperfusion viscérale et rénale, des modèles ont été créés chez le petit animal tel que le rat. Ce modèle permet de reproduire les conditions réelles chez l'Homme d'une chirurgie aortique nécessitant un clampage au dessus des artères rénales. Ainsi, l'étude de ce modèle animal peut nous permettre de caractériser l'impact du clampage supra-viscéral sur la dysfonction endothéliale, la degradation du glycocalyx et de pouvoir étudier les bénéfices d'une molécule anti-héparanase, novatrice, du pré-conditionnement ischémique. L’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro reproduisant pleinement une chirurgie aortique. De plus, le lien entre dysfonction endothéliale et glycocalyx a été largement étudié et confirmé in vitro sur des cellules en culture. Le recours isolé au préconditionnement ischémique a déjà fait l'objet de plusieurs études chez l'animal. La combinaison de ces deux approches n'a pas été réalisée à l'heure actuelle. Ainsi, la validation de l'effet protecteur de ces deux approches isolées ou combinées ne peut que passer par l'utilisation d'un modèle animal.

Réduction

Nous avons opté pour des études sur des espèces animales élevées à des fins scientifiques, caractérisées par une faible variation génétique entre individus. Cette homogénéité réduit la variabilité des réponses biologiques, permettant ainsi de limiter le nombre d'animaux nécessaires. Le nombre d'animaux requis a été estimé à partir des études antérieures sur la dysfonction endothéliale menées au sein de notre unité. De plus, nous avons mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo lors de la mise à mort. Ce nombre d’animaux garanti un effectif suffisant pour réaliser les analyses histologiques, ELISA et étudier la vasoréactivité à l’aide du myographe de Mulvany. En l’absence de données sur les effets potentiels des anti-héparanases et du préconditonnement ischémique dans un modèle d’ischémie-reperfusion viscérale sur l'atteinte systémique et rénale nous avons estimé qu’il faudrait au moins 20 rats par groupe pour détecter une différence d’au moins 40 % sur la vasoréactivité de l’artère rénale entre les groupes,. Le nombre d'animaux à été determiné avec les analyses statistiques .

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur, avec un environnement enrichi pour favoriser leur bien-être. Une attention particulière sera portée à la qualité de l’anesthésie et de l’analgésie afin d’éviter toute douleur ou stress pendant et après les interventions. L’anesthésie générale sera assurée par inhalation d’un gaz anesthésiant, et complétée par des traitements antalgiques avant et après la chirurgie. Les animaux respireront spontanément sans intubation. À la fin de l’intervention, un anesthésique local sera appliqué au niveau de la cicatrice pour renforcer le confort post-opératoire. Pour réduire le stress, les interventions auront lieu une à deux semaines après l’arrivée des animaux à l’animalerie, afin qu’ils puissent s’adapter à leur nouvel environnement. Les chirurgies et prélèvements seront réalisés dans une pièce calme et isolée, avec un seul expérimentateur, pour limiter les sources de bruit et de distraction. Tout au long de l’expérimentation, les signes cliniques de souffrance (respiration difficile, poils hérissés, posture anormale, prostration, perte d’activité, etc.) seront surveillés. L’apparition de tels signes constituera un point d’arrêt anticipé : l’animal sera alors retiré de l’étude et euthanasié pour éviter toute souffrance. Une grille d’évaluation permettra de suivre leur état général et de définir précisément ces points limites. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour favoriser leur habituation. Ils auront accès à la nourriture et à l’eau sans restriction et seront hébergés par petits groupes, avec des aménagements dans les cages pour stimuler leur comportement naturel. Après l’anesthésie, le réveil se fera dans des cages individuelles pendant quelques heures afin d’assurer leur sécurité.

Choix des espèces

Les premiers modèles ont été développés chez le rat, en particulier chez le rat Wistar. Les études antérieures menées au laboratoire sur la dysfonction endothéliale chez le rat ont permis d’identifier et de valider des marqueurs spécifiques de cette pathologie. Par ailleurs, notre animalerie dispose d’une infrastructure adaptée, garantissant des conditions optimales d’hébergement et de bien-être pour les animaux. Les animaux utilisés pour l’étude seront des rats Wistar âgés de 8 semaines et qui pèseront entre 300 et 400 g. Ceci correspond à la plupart des études publiées sur le préconditionnement ischémique sus-rénal chez le rat.

Apporter aux autorités sanitaires les preuves d'innocuité exigées avant la mise sur le marché de dispositifs médicaux censés reconstituer le collagène de la peau : 300 rats sains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leur peau. Le dos rasé, chaque animal reçoit le même jour jusqu'à six injections d'hydrogels différents en sous-cutané ou en intradermique, sous anesthésie et après administration d'un analgésique opiacé. Le porteur présente cette accumulation de six produits sur un même individu comme une mesure de réduction qui divise par six le nombre d'animaux utilisés. Il énumère les limites des modèles de peau humaine, explants qui ne survivent que sept à huit jours et échantillons d'abdominoplastie au derme épaissi, pour conclure que l'évaluation chez l'animal reste "nécessaire".

Objectifs

Les traitements contre le diabète, l’obésité (anti-GLP1) ou l’infection par le virus du SIDA (VIH) ont pour effets secondaires une atrophie des tissus adipeux sous-cutanés (lipoatrophie) et un vieillissement cutané (perte de collagène) accéléré. L’infection par d’autres virus chroniques ainsi que certains troubles métaboliques peuvent aussi être à l’origine de ces effets. La perte de collagène est une cause sous-jacente majeure du vieillissement cutané observé chez ces patients. Il est donc nécessaire de développer des thérapies susceptibles de stimuler la régénération cutanée (production de collagène, régénération du tissu adipeux dermique) et de combler les zones atrophiées afin de limiter l’impact structurel. Ces effets secondaires présentent également un impact psychologique délétère qui dégrade fortement la qualité de vie de ces patients. Ce programme de recherche s’intéresse à caractériser chez le rat la régénération tissulaire et la stimulation de la fabrication naturelle de collagène grâce à de nouvelles formulations ou composés (efficacité), et vérifier l’absence de réactions inflammatoires délétères autour du site d’injection (innocuité). Ces études consistent à injecter, en une seule fois, par voie sous cutanée ou intradermique, plusieurs composés sous forme d’hydrogel à potentiel régénérateur de collagène, sur des sites différents d’un même animal, dans le but d’évaluer la réponse induite par la stimulation sur la peau. Afin d’évaluer et de caractériser cette réponse, des prélèvements post mortem de peau, seront ensuite réalisés tout au long de l’étude afin de suivre la régénération tissulaire dans le temps et de comparer la stimulation induite par différents composés ou formulations (augmentation du collagène, élastine et autres protéines de la matrice extracellulaire). Des prélèvements sanguins longitudinaux seront également possibles pour suivre certains biomarqueurs de l’activité tissulaire. La production de collagène supplémentaire est étudiable chez l’animal sain, et ces études seront donc réalisées sur animaux sains, en amont d’éventuelles études sur animaux présentant des anomalies cutanées comparables à celles observées chez les patients. Cela permettra donc de cribler au mieux plusieurs composés avec le minimum d’impact sur le bien-être animal, avant d’envisager des études plus impactantes pour le bien-être animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles formulations et composés pour une utilisation dont l’innocuité et l’efficacité doivent être testées avant des essais cliniques. Les expériences menées chez le rat, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettront l’introduction en clinique de nouvelles stratégies pour la régénération tissulaire cutanée dans le cadre des lipoatrophies. Un bénéfice supplémentaire sera de sélectionner un nombre réduit de composés candidats qui seront testés sur des modèles pathologiques plus complexes.

Procédures

Les animaux (rats) seront exposés à des composés multiples. Les zones à injecter seront rasées (manipulation de 5 minutes) ce qui pourrait créer une légère rougeur transitoire. Les animaux recevront le même jour et une seule fois dans toute la procédure, plusieurs injections successives en sous-cutané ou intradermique de produits non dispersibles sur des sites différents localisés sur le dos de l’animal (maximum 6 sites = 6 injections pour le rat) en respectant le volume d’administration maximum recommandé par la SBEA sur une journée (ex : rat en sous cutané). Pour les traitements multiples et pour les intradermiques une administration préalable d’un analgésique opiacé en sous cutané sera réalisée (30 min avant) et l’administration des composés sera ensuite réalisée sous anesthésie à l’isoflurane. Les traitements seront administrés sous anesthésie d’un total d’enviton 30 minutes. Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au minimum 1 fois par semaine (manipulation de 5 minutes). Le site d’injection sera observé sur les quelques jours suivant l’administration pour surveiller l’absence de réactions dans la zone (par ex. irritation, pétéchie, œdème, érythème…), effets cependant extrêmement peu probables, et l’état général des animaux sera vérifié. Lorsqu’ils sont nécessaires, les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible (manipulation de 5 minutes sans anesthésie ou anesthésie d’un total de 30 minutes). En fin de projet, les animaux seront euthanasiés. Un prélèvement de sang terminal en intracardiaque pourra être réalisé sous anesthésie générale profonde puis des prélèvements d’organes pourront être effectués après mise à mort.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, aucun effet sur l’évolution du poids des animaux n’est attendu. Les animaux seront rasés au niveau des sites d’injection. Une rougeur pourra être présente juste après le rasage. Les animaux recevront plusieurs traitements en une seul occurrence sur des sites différents . Des douleurs transitoires aux différents sites d’injection peuvent être observés, nécessitant administration d’un analgésique. Nous n’attendons pas d’effets nuisibles au site d’injection, cependant nous surveillerons l’apparition éventuelle de signes d’irritation de la peau, de lésions cutanées, pétéchies, d’érythèmes, nécroses cutanées, d’œdèmes ou toute autre altération macroscopique de la peau. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés principalement pour des mesures de poids qui pourront entraîner un stress que l’on peut considérer comme faible. Le jour de la formation des groupes, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress modéré de 1-2 jours. Lorsqu’ils sont nécessaires, les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre la récupération de différents échantillons biologiques d’intérêt (notamment peau).

Remplacement

Des modèles in vitro permettent d’étudier certains processus de régénération tissulaire et sont utilisés pour pré-sélectionner les composés les plus intéressants. Ces études sont réalisées en amont dans nos laboratoires. Cependant, aucune ne reproduit la complexité observée in vivo, et les meilleurs composés sélectionnés in vitro doivent être évalués in vivo. En effet, il est possible de travailler dans un premier temps avec des modèles 3D de peau, des cultures de cellules de tissu adipeux et des échantillons de peau humaine mais ceux-ci présentent plusieurs limites : - Toxicité des gels sur cellules isolées du fait de l’absence de matrice extra-cellulaire - Modèles incomplets ne récapitulant pas tous les effets (par exemple inflammation) - Origine de la peau : les échantillons proviennent de chirurgies de type abdominoplasties et présentent donc en général un derme hypertrophié et non hypotrophié (patients en surpoids) - Durée de vie des explants : les échantillons de peau ne peuvent survivre qu’environ 7-8 jours, ne permettant pas une évaluation sur le long terme De plus, s’agissant de dispositifs médicaux, des preuves d’innocuité et d’efficacité doivent être apportées aux autorités sanitaires avant essais cliniques et mise sur le marché. C’est pourquoi l’évaluation chez l’animal de la régénération tissulaire par biostimulation de composés chimiques ou biologiques est nécessaire, pour sélectionner le meilleur composé avant un passage en phase clinique chez l’Homme.

Réduction

Dans les études de ce projet, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux (en général de 6 à 8 animaux) selon le poids en début d’étude (randomisation). Grace à l’injection de plusieurs composés sur un même animal (maximum 6, sous forme de matrices hydrogel restant au niveau de l’emplacement d’injection sous-cutanée), le nombre d’animaux utilisé en est d’autant réduit. En pratique, le nombre d’animaux utilisés est divisé par 6 si on ne se limite pas à un produit par animal. Le nombre d’animaux nécessaire par groupe a été estimé sur la base de tests statistiques.

Raffinement

Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes (comportement, masque facial de douleur). Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les traitements simultanés sur plusieurs sites en sous-cutané ou intradermique sur un même animal sont réalisés sous anesthésie générale précédé d’une analgésie (30 minutes minimum avant). Pour l’administration intradermique, la zone sera préalablement stérilisée. La possibilité de réaliser les intradermiques par « microneedling » sera évaluée, afin de répartir le volume au niveau des sites d’injection ID . De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie (nids, jouets en bois, niche). Des graines de tournesol pourront être utilisées comme enrichissement positif après la manipulation des animaux. Lorsqu’ils sont nécessaires, les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible. Les volumes et fréquences d’administration et de prélèvement sont conformes aux bonnes pratiques et aux recommandations de la SBEA. Toutes les techniques sont réalisées par du personnel formé et compétent. Les prélèvements d’organes/tissus sont réalisés après mise à mort de l’animal. En cas d’apparition de signes cliniques indésirables, les animaux seront observés quotidiennement et des mesures seront mises en œuvre pour arrêter, minimiser ou diminuer la souffrance et/ ou détresse de l’animal.

Choix des espèces

Les études à l’aide des rongeurs, notamment les rats, sont utilisées pour l’exploration de la régénérescence tissulaire ou l’évaluation de l’efficacité de tout nouveau composé stimulateur de la régénérescence, qu’il soit d’origine chimique, issu de la biotechnologie ou naturel. La connaissance de la peau des rongeurs et de son organisation extracellulaire, conduit à une meilleure connaissance du même système chez l’Homme et permet d’explorer de nouvelles pistes pour la médecine. Les animaux seront immunocompétents pour répondre à l’objectif du projet et se rapprocher le plus possible du phénomène de régénérescence tissulaire humaine. De plus, le rat en raison de sa taille, est l’espèce la plus adaptée à ce projet pour la co-implantation de plusieurs matrices simultanées (réduction). Les rats sont par ailleurs de loin l’espèce la plus utilisée dans la littérature pour ce type d’évaluation, permettant de comparer les données obtenues avec la littérature. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines minimum lors de leur première manipulation). Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adultes et afin qu’ils présentent une peau et un système immunitaire matures.

Deux à quatre injections dans les muscles des pattes arrière, pratiquées sur des rats dont les muscles sont déjà lésés par une dystrophie de Duchenne, avec un antalgique renouvelable toutes les douze heures pendant deux à trois jours. 52 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour analyses génétiques, histologiques et moléculaires. Le porteur écrit pourtant qu'"aucun effet indésirable significatif n'est attendu" et que la méthode n'a montré ni toxicité ni effet secondaire. Le bénéfice visé, renforcer assez la force des bras et des doigts pour manipuler un fauteuil roulant, reste un objectif de long terme conditionné à la confirmation des résultats précliniques.

Objectifs

Les dystrophies musculaires constituent un groupe de maladies génétiques rares et graves pouvant affecter différents tissus, principalement le muscle squelettique. L’une des formes les plus sévères, la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), est causée par des anomalies du gène codant la dystrophine, une protéine essentielle au bon fonctionnement des fibres musculaires. En l’absence de cette protéine, les muscles s’affaiblissent progressivement, entraînant d’abord une perte de la capacité à marcher, puis des complications respiratoires et cardiaques. À ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible, bien que plusieurs pistes thérapeutiques soient activement explorées. Certaines approches visent la réparation ciblée des mutations génétiques, afin de corriger le gène défectueux. Dans ce contexte, le système CRISPR-Cas9, souvent appelé « ciseaux moléculaires », offre une capacité puissante pour modifier l’ADN de manière précise, en supprimant ou insérant des fragments de séquence afin de corriger les mutations responsables. L’une des principales difficultés demeure la délivrance efficace et sûre de cet outil dans les cellules musculaires. Ce projet propose d’évaluer une méthode innovante d’administration du CRISPR-Cas9, reposant sur l’introduction directe et transitoire de la protéine Cas9 – ainsi que d’autres composants d’édition génétique – dans les cellules musculaires, de façon non toxique et sécurisée. L’objectif est de tester l’efficacité de cette approche chez un modèle animal présentant des symptômes et caractéristiques similaires à ceux des patients, afin de déterminer si cette méthode permet de restaurer la production de dystrophine à différents stades de la maladie. Le protocole inclura également l’évaluation de l’impact des administrations successives (deux injections) en comparaison avec une administration unique. Bien que ce type de thérapie ne constitue pas une guérison définitive, il peut être envisagé comme une option complémentaire aux traitements existants. L’objectif à long terme est de développer cette approche comme une thérapie permettant, par exemple, de renforcer la force des bras pour manipuler les fauteuils roulants, ou celle des doigts pour saisir des objets et utiliser les commandes des fauteuils, améliorant ainsi l’autonomie quotidienne et la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider l’efficacité et la sécurité d’une méthode innovante d’administration des outils d’édition génique directement dans les cellules musculaires, dans un modèle de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’objectif principal est de démontrer que cette approche, appliquée à des muscles spécifiques, permet de restaurer la production de dystrophine et d’induire une amélioration de la force musculaire, contribuant ainsi à renforcer la fonction motrice. Un avantage majeur de cette méthode, selon les données préliminaires, est qu’elle n’active pas le système immunitaire, ce qui permet des administrations répétées pour renforcer l’effet thérapeutique sur un même muscle ou pour traiter différents muscles. De plus, la stratégie sera testée à différents stades de la maladie (précoce et avancé), afin d’évaluer son efficacité tout au long de l’évolution de la dystrophie. Cela ouvre la possibilité d’une application chez des patients d’âges variés, y compris ceux présentant une forme avancée de la maladie. En ciblant des muscles spécifiques plutôt qu’en diffusant le traitement de manière systémique, cette approche se positionne comme un traitement complémentaire, visant à améliorer l’autonomie et la qualité de vie des patients. À long terme, si les résultats précliniques se confirment, cette stratégie pourrait ouvrir la voie à des essais cliniques chez l’humain, avec l’objectif d’aider les patients à renforcer la force des bras pour manipuler les fauteuils roulants, ou celle des doigts pour saisir des objets et utiliser les commandes, facilitant ainsi les activités quotidiennes et l’indépendance. Ainsi, ce projet pourrait poser les bases d’une thérapie innovante et sûre, capable d’améliorer durablement la qualité de vie des patients et de leurs familles.

Procédures

Dans ce projet, le traitement sera administré par injection dans un muscle de chacune des pattes arrière, soit deux injections par animal, ou quatre dans le cas de doses répétées. Toutes les injections seront réalisées sur des animaux préalablement traités avec un médicament contre la douleur. Ce traitement pourra être répété toutes les 12 heures pendant deux à trois jours, uniquement si des signes de douleur sont observés. À la fin de la procédure, un prélèvement sanguin sera effectué sur des animaux complètement endormis (anesthésiés au moyen d’une injection). Ce prélèvement sera réalisé une seule fois pour chaque animal. Chaque injection sera effectuée en moins d’une minute, et le prélèvement sanguin en moins de trois minutes. Au total : - 36 animaux, chacun recevant 2 à 7 injections d’un médicament contre la douleur et 2 injections du traitement, une dans chaque patte. - 16 animaux, avec 3 à 13 injections d’un médicament contre la douleur et 4 injections avec le traitement, deux dans chaque patte.

Impact sur les animaux

Des études antérieures utilisant cette méthode ont montré l’absence d’effets toxiques ou secondaires liés à l’administration du traitement. Par conséquent, aucun effet indésirable significatif n’est attendu chez les animaux dans le cadre de ce projet. L’administration dans le muscle peut toutefois provoquer une légère gêne ou douleur, en particulier chez des animaux présentant déjà des lésions musculaires. Deux types des interventions seront réalisées : 1. L’administration d’un médicament anti-douleur, qui ne devrait pas entraîner de gêne notable. 2. L’administration du traitement dans un muscle de chaque patte arrière. Ces interventions peuvent provoquer une douleur locale transitoire. Ils seront effectués chez des animaux âgés de 4, 12 et 16 semaines, à un stade où les muscles sont peu (4 semaines) ou modérément (12 et 16 semaines) affectés, avec un impact très limité ou plus marqué respectivement, selon l’âge. Les animaux seront suivis jusqu’à un âge compris entre 3 et 6 mois, avant l’apparition des symptômes les plus graves de la maladie (vers 9 mois), afin de limiter autant que possible leur souffrance liée à l’évolution naturelle de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les échantillons nécessaires aux analyses génétiques, histologiques et moléculaires.

Remplacement

La dystrophie musculaire de Duchenne touche plusieurs organes interconnectés (muscle, cœur, cerveau, tube digestif), mais le muscle squelettique est l’un des plus affectés. La méthode thérapeutique proposée est une approche innovante d’administration des outils d’édition génique dans les cellules musculaires, permettant de corriger de manière précise le gène défectueux responsable de cette maladie. Aucun produit n'est testé chez nos animaux sans qu’un mécanisme et un effet biologique robustes aient été préalablement établis. Avant les essais précliniques sur les animaux issus de nos lignées modèles, l’efficacité et la sécurité de cette thérapie ont été testées sur des cultures de cellules musculaires (in vitro), avec des résultats très encourageants : la méthode montre une forte efficacité pour modifier le gène défectueux, sans altérer la santé ni le fonctionnement normal des cellules. De plus, afin d’évaluer l’efficacité et la toxicité dans un organisme entier, cette stratégie a été testée in vivo sur un modèle animal de plus petite taille, confirmant que la méthode permet d’introduire efficacement les outils de réparation dans les fibres musculaires, sans toxicité, sans effets secondaires visibles et sans déclencher de réponse immunitaire chez les animaux traités. Le présent projet cherche à valider cette stratégie (en termes d’efficacité et d’innocuité) chez un organisme mammifère sévèrement atteint par la maladie, plus proche de la réalité humaine, et présentant des signes cliniques similaires à ceux observés chez les patients (perte musculaire, faiblesse et évolution progressive de la maladie), y compris dans la complexité de la réponse de l’organisme à l’administration du traitement.

Réduction

Lors des essais précliniques, le traitement de moins de 10 individus permet généralement d’obtenir des données suffisantes pour confirmer ou infirmer un effet majeur d’un candidat médicament sur l’évolution de la maladie. Des analyses statistiques ont été réalisées, permettant de réduire le nombre moyen d’animaux nécessaires pour répondre aux questions biologiques posées lors des expérimentations. Pour les objectifs de ce projet, nous avons mis en place des procédures pilotes et en cascade, permettant de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire selon la progression du projet. Le nombre d’animaux témoins pour les procédures pilotes a été réduit au minimum, tout en permettant que leurs données soient analysées et intégrées dans notre banque d’échantillons.

Raffinement

Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à des manipulations douces et régulières. Ils sont hébergés par groupes de deux ou plus, dans un environnement enrichi afin de prévenir l’ennui et le stress. Pour anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage, yeux), leur comportement (mobilité) et leur état général (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont mises en place : surveillance renforcée biquotidienne et administration de médicaments visant à atténuer ou supprimer la douleur. Dans le but de prévenir toute souffrance animale, des points limites ont été établis et feront l’objet d’un suivi rigoureux, avec application immédiate de procédures préétablies. Par ailleurs, pour réduire au maximum le stress lié aux manipulations ou aux tests, les animaux sont préhabitués et familiarisés avec l’expérimentateur 2 à 3 jours avant le début des procédures, afin d’éviter toute réaction de peur ou de stress lors des manipulations scientifiques.

Choix des espèces

Le rat est un mammifère appartenant à la même classe que l’être humain. Cette proximité évolutive en fait un modèle particulièrement apprécié pour la recherche biomédicale. Il partage de nombreux aspects anatomiques et physiologiques avec l’homme, notamment la constitution et le fonctionnement des organes ainsi que les processus métaboliques. Grâce aux outils génétiques récents, le rat est devenu un modèle de choix pour l’étude des troubles musculaires. Les modèles de rat reproduisent de manière très fidèle ce type de maladies humaines, tout en conservant les avantages des rongeurs : courte durée de gestation, taille raisonnable et longévité compatible avec l’évaluation à long terme des médicaments sur des individus âgés. Le rat constitue ainsi un excellent complément aux autres modèles animaux, permettant de mieux comprendre la physiopathologie et d’évaluer l’efficacité et la sécurité de nouvelles thérapies. Les animaux seront âgés de 1 et 3 mois au moment de la procédure, correspondant aux stades précoce et avancé de la maladie. Ces stades permettent d’explorer les muscles et d’évaluer l’effet de la thérapie à la fois fonctionnellement et morphologiquement, en tenant compte des différents degrés de progression pathologique.

Hébergés seuls quarante-six heures en cage à métabolisme et nourris pendant vingt et un ou cent jours d'un régime dont seule la forme du fer change, 400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements du côlon. 240 d'entre eux reçoivent en plus une injection intrapéritonéale d'azoxyméthane, un cancérogène, pour déclencher les premiers stades d'un cancer colorectal. L'objet réel est d'évaluer si un substitut végétal de viande riche en fer, dont la mise sur le marché européen est envisagée à court terme, produit les mêmes effets sur le côlon que la charcuterie. Le porteur écrit que les régimes n'ont pas d'effet attendu sur le bien-être des rats et que la formation des phases précoces du cancer du côlon n'induit aucune douleur, tout en déclarant les 400 animaux au niveau de souffrance modéré.

Objectifs

La consommation excessive de viande rouge et de charcuteries est associée chez l’Homme à une perturbation du fonctionnement de l’intestin, et à un risque augmenté de développer un cancer du côlon. Des études scientifiques ont permis de démontrer que ces impacts sont liés au fer présent dans les viandes. Ainsi, ce fer va pendant la digestion arriver au niveau du côlon et favoriser la formation de molécules toxiques. Les recommandations nutritionnelles actuelles sont donc de limiter la consommation de produits carnés riches en fer. Dans ce contexte, plusieurs produits alternatifs à la viande sont proposés aux consommateurs. Plus précisément, certaines de ces alternatives misent sur la ressemblance parfaite avec les produits carnés en utilisant une forme de fer végétale proche de celle apportée par les viandes afin de provoquer une couleur et un goût similaires aux viandes. La mise sur le marché d’une alternative à base de ce fer d’origine végétale est envisagée à court terme en Europe. Au regard de sa proximité avec le fer des viandes, se pose donc la question de savoir si ce produit destiné à végétaliser davantage nos régimes est susceptible d’engendrer des effets néfastes sur le côlon et le cancer du côlon. En termes de santé publique, l’objectif de cette étude est d’évaluer si un apport en fer d’origine végétale risque ou non d’induire les mêmes effets délétères sur le côlon qu’un apport en fer d’origine animale. Étant donné que chez l’Homme, aucune étude interventionnelle n’est envisageable, une évaluation pré-clinique chez le rat identique à ce qui a été mis en place par le passé pour alerter les politiques publiques sur la consommation des viandes rouges et le risque de carcinogénèse colorectale est proposée.

Bénéfices attendus

À l’issue du projet, nous serons en mesure de savoir si le fer d’origine végétale peut engendrer ou non la formation dans le côlon de produits toxiques en comparaison avec d’autres formes de fer d’origine animale. Ainsi, ces études permettront de (i) évaluer le risque de pathologies associées à la consommation humaine de ces substituts, et en conséquence, selon les résultats obtenus (ii) alerter les pouvoirs publics, pour qu’ils puissent à terme proposer des messages de recommandation nutritionnelle adaptés spécifiquement à ces substituts riches en fer végétal.

Procédures

400 rats recevront un régime expérimental dont seule la nature du fer sera modifiée selon le groupe expérimental pendant 21 jours pour 160 d’entre eux, et pendant 100 jours pour les 240 autres. Ces 400 rats seront hébergés individuellement une fois pendant 46 heures en cage à métabolisme après avoir été habitués 3 heures en amont. Parmi eux, les 240 rats exposés 100 jours aux régimes expérimentaux recevront en amont une injection intrapéritonéale d’azoxyméthane d'une durée de moins d'une minute, le temps de la préhension et l'injection, pour induire les premiers stades non douloureux du cancer du côlon.

Impact sur les animaux

Les régimes n’ont pas d’effet attendu sur le bien-être ou la croissance des rats. L’hébergement en cage individuelle d’une journée peut générer un stress transitoire mais il disparait dès le retour en hébergement conventionnel. Hormis les stress attendus lors de l’injection, seule une légère douleur passagère peut se produire au site d’injection en raison du produit injecté. La formation progressive des phases précoces du cancer du côlon pendant cette étude n’induit aucune douleur.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les rats seront mis à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures destinées à caractériser l’effet des régimes administrés sur la muqueuse colique, et engendrant éventuellement des perturbations de l’homéostasie des tissus environnants ou d’organes plus distants.

Remplacement

Bien que nous menions des études in vitro, aucun des modèles de cellule du côlon en culture ne permet d’évaluer l’ensemble des répercussions induites par un régime riche en produits carnés au niveau du côlon. En effet, outre la formation de composés toxiques, la consommation de fer des produits carnés va fortement modifier l’ensemble des composantes du côlon. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité du côlon et de l’impact de l’alimentation sur cet organe.

Réduction

Les études antérieures associées à ce projet ont permis d’améliorer les procédures sur le plan technique et du bien-être de l’animal, contribuant ainsi à minimiser le nombre d’animaux nécessaires pour mettre en évidence l’effet des régimes chez le rat. De plus, afin d’assurer la fiabilité des résultats, les études et analyses des échantillons issus de l’étude seront conduites en aveugle. La reproductibilité sera assurée par une répétition indépendante des études. Le traitement des données sera réalisé grâce à des tests statistiques appropriés permettant d'exploiter au maximum l'ensemble des données générées.

Raffinement

Le nombre et la durée d’hébergement individuel en cage individuelle seront limités au minimum nécessaire (46h) pour obtenir les quantités suffisantes d’urines et de fèces. Des phases d’habituation à ce type d’hébergement ont été mises en place afin de minimiser le stress. Quel que soit le type de cages, elles seront transparentes, alignées pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Lors de l’injection pour induire les premiers stades du cancer du côlon, l’acidité de la solution sera corrigée pour éviter une douleur au moment de l’injection, une habituation au geste de la piqure sera réalisée les jours précédents. Une observation des rats à l’occasion notamment de la distribution quotidienne des régimes permettra, grâce à l’utilisation de fiches individuelles de suivi, de détecter à temps toute anomalie éventuelle. Enfin, toutes les mesures susceptibles de réduire la douleur sans affecter l’objectif scientifique seront mises en application.

Choix des espèces

Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études chez l’Homme mais aussi des approches qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus approprié à notre étude est le rat qui a l’avantage de présenter un développement de la maladie comparable à celui chez l’Homme. De plus, ce modèle chez le rat permet d’obtenir des résultats fiables dès les stades précoces du cancer, sans qu’il soit nécessaire de poursuivre l’étude aux stades avancées de la maladie (tumeur, métastases), qui sont des stades davantage susceptibles d’engendrer des dommages et des douleurs. Les études se feront sur des rats adultes de 5 à 6 semaines à leur arrivée. À cet âge, le système digestif est suffisamment mature et fonctionnel et la composition du microbiote bien stabilisée. Afin de se placer dans les conditions pour lesquelles le modèle est maîtrisé au laboratoire, il est important de rester au même stade de développement.

627 rats porteurs d'une myopathie de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie de trente minutes pour l'implantation d'une pompe sous la peau, d'autres reçoivent des injections quotidiennes dans le péritoine, d'autres une injection de cardiotoxine directement dans le muscle, avec des prélèvements de sang chaque semaine pendant deux mois. Le porteur indique que les rats seront tués entre quatre et six mois, avant l'apparition des atteintes majeures du phénotype dystrophique qu'il situe après dix mois. Sur le remplacement, il reconnaît que l'inhibition de la ferroptose réduit déjà la mort des fibres musculaires en culture, et conclut que seule l'expérimentation sur "l'animal entier" permet de valider un traitement, en visant à terme un essai chez le chien puis chez l'enfant.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique rare, grave et encore incurable. Elle est causée par des mutations d'un gène responsable de la production d'une protéine appelée dystrophine. Cette protéine est essentielle pour protéger les fibres musculaires pendant l’effort. Son absence rend les muscles fragiles, ce qui provoque leur mort progressive. Cela entraîne une faiblesse musculaire sévère qui touche les muscles squelettiques, mais aussi les muscles respiratoires (comme le diaphragme) et le cœur. Bien que la mort des fibres musculaires (appelée myonécrose) soit une caractéristique bien connue de la DMD, on ne comprend pas encore parfaitement comment elle se déclenche. Récemment, une nouvelle forme de mort cellulaire appelée ferroptose a été découverte. Cette forme de mort est liée à un excès de stress oxydatif dans les cellules, notamment au niveau des graisses qui composent les membranes cellulaires, et à une baisse des défenses naturelles de la cellule. Des travaux récents ont montré que cette ferroptose pourrait jouer un rôle dans la DMD. À l'heure actuelle, il n'existe aucun traitement permettant de s’attaquer directement à la cause de la maladie ou d’arrêter son évolution. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer si bloquer la ferroptose permettrait de protéger les muscles et de ralentir la progression de la DMD. Pour cela, nous testerons trois composés qui ont déjà montré leur efficacité en laboratoire ou dans d'autres modèles de maladie. Ces traitements seront administrés à des rats atteints de DMD entre 2,5 et 4 mois, une période où la dégénérescence musculaire est particulièrement active. Deux méthodes d’administration à court terme seront comparées : une perfusion continue grâce à de petites pompes placées sous la peau, ou des injections quotidiennes. Les effets des traitements seront analysés à travers des biomarqueurs sanguins, des tests fonctionnels, des examens histologiques et moléculaires du muscle. La méthode la plus efficace sera retenue pour une étude plus longue, afin d’évaluer si les bénéfices peuvent durer dans le temps. Par ailleurs, nos premières observations en laboratoire suggèrent que ces traitements pourraient aussi aider les muscles à se réparer. Cette idée sera testée chez des rats sains, dans un modèle de lésion musculaire aiguë, afin d’observer si les médicaments favorisent la régénération des fibres musculaires après une blessure.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples : (1) évaluer le potentiel thérapeutique d’un inhibiteur spécifique de cette voie, seul ou en association ; (2) identifier des effets secondaires ou bénéfiques non anticipés, comme une possible stimulation de la régénération musculaire. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques combinées pour la DMD, et, à plus long terme, être transposables à d'autres myopathies impliquant des phénomènes de mort cellulaire régulée. A plus long terme et en cas de résultats encourageant, nous envisageons de pouvoir programmer un essai préclinique chez le chien afin de consolider le dossier préclinique qui serait utile pour un essai clinique chez l'enfant.

Procédures

Dans ce projet, certains animaux subiront une chirurgie légère pour poser une pompe (environ 30 minutes/animal), d’autres seront soumis à des injections quotidiennes dans le péritoine (environ 30 secondes/animal) et enfin certains subiront une injection dans le muscle de cardiotoxine (environ 30 secondes/animal). Des prélèvements de sang seront réalisés de manière hebdomadaire sur une durée de maximum 60 jours. Des tests non invasifs fonctionnels pour évaluer la force musculaire seront réalisés tous les 15 jours sur une durée maximale de 60 jours

Impact sur les animaux

Utilisation de modèles pathologiques : Les animaux dystrophiques utilisés dans ce projet (modèles DMD) présentent un phénotype pathologique progressif. Toutefois, les signes cliniques majeurs n’apparaissent qu’après l’âge de 10 mois. Dans ce protocole, les animaux seront mis à mort au plus tard à 6 mois, avant l’apparition des altérations sévères. Intervention chirurgicale pour l’implantation de pompes : Cette procédure, réalisée sous anesthésie générale, peut induire un stress opératoire, une douleur post-chirurgicale modérée et un inconfort local dû à la présence du dispositif. Ces nuisances seront limitées grâce à un protocole analgésique adapté (pré, per et post-opératoire) et à une surveillance étroite des animaux durant la phase de récupération. Injections répétées : Les injections quotidiennes peuvent engendrer une douleur légère et transitoire ainsi qu’un stress lié à la contention répétée Prélèvements sanguins hebdomadaires : Les prélèvements seront réalisés via des techniques peu invasives entraînant un stress modéré et une douleur légère de courte durée. Tests fonctionnels : Certains tests peuvent provoquer une fatigue musculaire, en particulier chez les animaux myopathes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Il a été démontré, dans des modèles cellulaires, l’activation des voies de mort cellulaire régulée de type ferroptose, ainsi que la capacité de leur inhibition à réduire significativement la mort des myofibres en culture. Ces résultats in vitro soulignent la pertinence de la ferroptose comme cible thérapeutique, mais nécessitent désormais une validation in vivo. En effet, seule l’expérimentation sur l’animal entier, dans un environnement physiologique intégrant l’ensemble des organes et systèmes en interaction, permet d’évaluer de manière complète et fiable l’efficacité et la tolérance d’un traitement. Nous proposons ainsi de tester l’efficacité d’inhibiteurs de la ferroptose dans des modèles de rats DMD, afin de confirmer leur potentiel thérapeutique dans un organisme vivant.

Réduction

De nombreuses données ont été cumulées sur les modèles animaux utilisés dans ce projet. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique et le calcul de puissance statistique nous recommande d'utiliser 8 animaux par groupe. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés pour lesquels nous avons pu conclure qu'il était suffisant et approprié pour conclure de façon non ambiguë.

Raffinement

Afin d’assurer leur bien-être, nous utilisons les plus grandes cages disponibles sur le marché, permettant aux rats de marcher, courir et se dresser sur leurs pattes arrière. Ce niveau d’activité spontanée est essentiel pour des rats dont les capacités locomotrices sont évaluées. Le milieu est enrichi par des éléments variés tels que des lanières de papier kraft,des bâtons à ronger, balles, tunnels et carrés de coton compressé. Pour limiter le stress lié aux manipulations et aux tests, les rats sont habitués dès leur jeune âge à être manipulés régulièrement et avec douceur. Le suivi des animaux est assuré par du personnel expérimenté, capable de détecter, évaluer, et atténuer ou éliminer les signes de douleur ou de détresse. Pour la pose de la pompe par chirurgie, une anesthésie chimique est réalisée. Les prélèvements sanguins sont effectués sous une couverture analgésique chimique. La gestion du bien-être et la mise à mort : Dans ce projet, les rats modèles DMD seront mis à mort à l’âge de 4 à 5 mois, avant l’apparition des signes délétères majeurs du phénotype dystrophique, qui surviennent généralement après 10 mois (difficultés à mastiquer, risques de rhabdomyosarcome) ou au-delà de 12,5 mois pour les insuffisances cardiaques fatales. Une grille critériée d’évaluation de la douleur et des seuils limites a été mise en place et affichée. Les animaux sont surveillés quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Toute atteinte d’un seuil critique entraîne une action corrective immédiate. En l’absence d’amélioration et en cas de trouble irréversible, une mise à mort compassionnelle est pratiquée afin de prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nos animaux appartiennent à une espèce de mammifère évolutivement proche de l'humain, ce qui en fait un modèle apprécié pour la recherche. Grâce aux récents outils de modification du génome, cette espèce est devenue un choix privilégié pour l'étude des troubles musculosquelettiques. Nos modèles reproduisent fidèlement les myopathies humaines et sont appréciés en recherche médicale. Les animaux seront âgés de 2,5 à 4 mois jusqu’à maximum 6 mois, ce qui correspond au stade où la maladie progresse le plus et les muscles sont de plus en plus impactés, fonctionnellement et morphologiquement.

Trente-cinq minutes enfermés dans un tube de contention pour mesurer leur réaction au stress : 150 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'étude de leur cerveau. Ils reçoivent une injection intracérébrale sous une anesthésie d'environ cinquante minutes, cinq injections d'un marqueur des nouveaux neurones, et passent un test de mémoire de dix minutes, à 3, 8, 12 et 18 mois. Le résumé cite le labyrinthe comme exemple de mesure de la mémoire spatiale, sans préciser quel test est employé ici. Le porteur retient le rat pour la continuité de vingt ans de travaux du laboratoire sur cette espèce et la possibilité de comparer les données déjà collectées.

Objectifs

Avec l’âge, notre mémoire peut se dégrader, ce qui peut nuire à notre santé, notre bien-être et notre qualité de vie. Ce déclin est souvent lent et naturel, mais il ne touche pas tout le monde de la même manière : certaines personnes gardent une bonne mémoire, d’autres non. Ce phénomène dépend notamment de l’hippocampe, une partie du cerveau importante pour créer et consolider les souvenirs. Dans certains cas, le cerveau arrive à compenser cette baisse grâce à des mécanismes internes, comme la neurogénèse, c’est-à-dire la création de nouveaux neurones. Cette production de neurones se fait surtout dans l’hippocampe, et elle semble favoriser une bonne mémoire, en particulier pour se repérer dans l’espace (comme dans les tests de labyrinthe chez les rats). Ce processus peut être influencé par le stress, qui agit sur un système du corps appelé l’axe corticotrope. Mais d’autres éléments, moins connus, peuvent aussi jouer un rôle dans le déclin de la mémoire. Par exemple, une barrière protectrice du cerveau, appelée barrière hémato-encéphalique (BHE), peut devenir plus perméable avec l’âge ou en cas de maladies neurodégénératives. Quand cette barrière laisse passer trop de substances du sang vers le cerveau, cela peut dérégler son fonctionnement normal, et donc affecter la mémoire. Le but du projet est donc de mieux comprendre ces phénomènes en étudiant l’état de cette barrière chez des individus âgés, et voir comment les nouveaux neurones et d’autres cellules s’intègrent dans le réseau sanguin du cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet est le premier à s’intéresser à la façon dont les vaisseaux sanguins du cerveau interagissent avec les nouveaux neurones produits à l’âge adulte, pour aider à préserver nos capacités mentales en vieillissant. C’est une approche innovante, car jusqu’à présent, on pensait surtout que le déclin de la mémoire avec l’âge venait uniquement des neurones eux-mêmes. En étudiant aussi la circulation sanguine dans le cerveau, ce projet pourrait mieux expliquer les mécanismes du vieillissement cérébral.

Procédures

Dans le cadre de l’étude, 4 types d’interventions seront réalisés sur les animaux. À différents âges (3, 8, 12 et 18 mois), ils seront brièvement placés dans un tube de contention afin d’évaluer leur réaction au stress. Cette situation provoque un stress modéré, pendant lequel des prélèvements sanguins seront effectués ; la durée totale de cette procédure est de 35 minutes par animal. Des injections cérébrales seront également réalisées sous anesthésie, pour une durée d’environ 50 minutes par animal. Par ailleurs, un marqueur permettant d’identifier les nouveaux neurones sera injecté à plusieurs reprises (cinq fois au total, chaque injection dure environ 4 minutes. Enfin, un test comportemental de 10 minutes sera mené afin d’évaluer leurs capacités de apprentissage et de mémoire.

Impact sur les animaux

Comme pour tout projet impliquant des injections et des opérations sur le cerveau, certains effets secondaires peuvent apparaître, même si nous faisons très attention et suivons des procédures adaptées. Par exemple, il arrive, même si c’est rare, que les zones où l’on fait les injections (sous la peau) ou les plaies liées à l’opération chirurgicale s’irritent. Cette opération est susceptible de provoquer des douleurs après l’opération qui seront traitées grâce à des anti-douleurs. Par conséquent, dans les deux jours qui suivent l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids (jusqu’à 5 % de leur poids de départ).

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre l'étude poussée du cerveau.

Remplacement

Dans ce projet, nous voulons comprendre comment le vieillissement agit sur le cerveau, en particulier sur la façon dont les cellules nerveuses et les vaisseaux sanguins communiquent entre eux. Pour cela, nous étudions directement des animaux vivants, car cela nous permet aussi d’évaluer leur mémoire. C’est une approche globale qui demande que l’animal puisse se comporter normalement. Nous ne pouvons pas faire ce type d’étude en laboratoire sur des cellules isolées ou par ordinateur. Enfin, pour bien comprendre les effets du vieillissement sur le système sanguin dans son ensemble, il est indispensable d’étudier un organisme entier. C’est pourquoi nous ne pouvons pas utiliser de méthodes de substitution.

Réduction

Ce projet vise à étudier le vieillissement à 3 étapes de la vie : jeune adulte (8 mois), milieu de vie (12 mois) et fin de vie (18 mois). Pour cela, trois lots d’animaux seront constitués, correspondant à ces âges. Dans chaque lot, les animaux seront répartis en trois groupes selon leurs performances à un test comportemental à 3 mois (groupe contrôle, groupe résilient et groupe vulnérable). Le nombre de rats a été estimé sur la base d’une approche statistique permettant de déterminer la taille des groupes, et en tenant compte de nos données précédentes ainsi que des pertes possibles liées à l’âge (problèmes de santé, décès naturel). Pour garantir des résultats fiables, 50 rats seront utilisés par lot (6 rats contrôles, 22 rats résilients, 22 rats vulnérables), soit un total de 150 animaux. Ce nombre pourra être réduit si les différences entre les groupes sont plus marquées que prévu et sans nuire à la qualité scientifique de l’étude.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux sont laissés une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement, avec des conditions favorisant leur bien-être (enrichissement, contact humain régulier). Une intervention chirurgicale est ensuite réalisée sous anesthésie pour injecter un virus traceur dans une zone spécifique du cerveau. Un traitement anti-douleur est administré durant cette intervention pour limiter l’inconfort lié à cette intervention. Les animaux reçoivent des soins adaptés avant, pendant et après l’opération, ainsi qu’une surveillance quotidienne. Durant le vieillissement des animaux, un suivi régulier est mis en place pour détecter d’éventuelles complications, avec un protocole pour exclure l’animal de l’étude si nécessaire. À différents âges, les animaux participent à des tests de comportement liés à la mémoire et au stress. Pendant ces tests, ils sont logés seuls mais restent en contact sensoriel avec leurs congénères. Un entraînement progressif permet de les habituer à la tâche. Leur comportement est observé en continu pour prévenir toute détresse, avec des mesures immédiates en cas de signes de mal-être.

Choix des espèces

Dans ce projet, le modèle choisi est le rat. Le système nerveux des mammifères est trop complexe pour être reproduit en laboratoire, que ce soit en utilisant des cellules en culture ou des animaux plus simples comme les insectes. Le rat est un modèle de référence en neurosciences, souvent utilisé pour des études comportementales comme celles réalisées dans notre laboratoire. De plus, la formation de nouveaux neurones dans l'hippocampe est un phénomène commun à plusieurs mammifères, y compris le rat, le singe et l'humain. Cette étude s'inscrit dans la continuité de nos recherches menées depuis plus de 20 ans sur cette espèce, et nous permet de comparer des données déjà collectées pour mieux contrôler les résultats. Les rats seront reçus à l'âge de 10 semaines pour être opérés à 12 semaines. Ensuite, les expériences auront lieu entre 5 et 15 mois après les injections dans leur cerveau. Nous étudierons des rats adultes à différents stades de vieillissement : 1) jeune adulte (8 mois) ; 2) milieu de vie (12 mois) ; 3) fin de vie (18 mois). Ces âges ont été choisis pour pouvoir suivre, sur le long terme, l'impact de l’intégrité de la barrière hématoencéphalique sur les nouveaux neurones formés à l'âge adulte sur l'apparition de problèmes de mémoire.