Rats
Évaluation de la biocompatibilité et/ou de l’efficacité de biomatériaux après implantation ou injection chez le rat.
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Pour répondre aux exigences réglementaires qui encadrent la mise sur le marché des dispositifs médicaux, 2 520 rats vont être utilisés afin d'évaluer la tolérance et l'efficacité de biomatériaux. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré pour 1 620 d'entre eux et sévère pour 900, tous étant tués à l'issue pour le prélèvement des organes. Le matériau leur est injecté ou implanté sous la peau, dans le muscle ou dans l'os, les implantations osseuses exigeant la création préalable d'un défaut dans l'os pour reproduire une perte de substance humaine. Le porteur annonce une inflammation, une douleur locale, un gonflement et parfois une boiterie au site d'implantation, et prévoit de tuer tout animal atteignant un point limite.
Objectifs
La présente saisine vise à évaluer la biocompatibilité (sécurité) et l’efficacité de biomatériaux selon les exigences réglementaires et scientifiques actuelles. Les biomatériaux représentent un enjeu majeur dans l’innovation médicale, car ils permettent de restaurer la fonction des tissus, de remplacer ou de soutenir des organes défaillants, et d’améliorer significativement la qualité de vie des patients. Leur utilisation s’étend à de nombreux domaines, tels que la chirurgie orthopédique, la cardiologie, la dentisterie, la chirurgie reconstructrice et la médecine régénérative. Face à la complexité croissante des dispositifs médicaux et à l’évolution rapide des technologies, il est essentiel de garantir que les biomatériaux mis sur le marché répondent à des critères stricts de sécurité, de performance et de durabilité. Cela implique la réalisation d’évaluations approfondies, incluant des essais in vivo, pour vérifier l’absence de toxicité, la compatibilité avec les tissus biologiques, ainsi que l’efficacité clinique attendue. L’objectif global de cette démarche est donc double : d’une part, assurer la conformité réglementaire des biomatériaux avec les normes européennes et internationales en vigueur ; d’autre part, favoriser le développement de solutions innovantes, sûres et performantes, capables de répondre aux besoins cliniques actuels et d’anticiper les défis médicaux de demain. Pour évaluer les biomatériaux au fil du temps, un nombre robuste de sites implantés ou injectés sera utilisé, avec un effectif suffisant par groupe pour permettre des comparaisons fiables. Ce dispositif garantit le développement de biomatériaux sûrs et performants, supérieurs à ceux actuellement disponibles. Jusqu’à 2520 rats pourront être mobilisés, ce qui correspond à la réalisation de 7 études par an sur 5 ans, chacune impliquant 72 animaux répartis en 4 groupes, observés à 3 points temporels différents.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer la biocompatibilité et l’efficacité de nouveaux biomatériaux implantables ou injectables chez le rat, un modèle largement utilisé et reconnu en recherche biomédicale. Les bénéfices attendus sont multiples et touchent à la fois l’avancée des connaissances scientifiques, la santé humaine et la santé animale. À court terme, durant la durée du projet, l’étude permettra d’acquérir des données fondamentales sur le comportement des biomatériaux in vivo, notamment leur cinétique de dégradation, leur intégration tissulaire, leur tolérance locale et leur impact immunologique. Ces résultats sont essentiels pour mieux comprendre les mécanismes d’interaction entre matériaux artificiels et organismes vivants, et pour optimiser les formulations futures dans un objectif d’application clinique. Ils permettront également d’identifier d’éventuels effets indésirables et de proposer des solutions adaptées avant toute utilisation chez l’homme. À long terme, les résultats obtenus contribueront à la conception de nouveaux biomatériaux plus sûrs, plus efficaces et mieux adaptés aux besoins cliniques. Ils orienteront la mise au point de dispositifs médicaux innovants, capables de réduire les risques de complications post-opératoires ou de rejets immunitaires, et d’améliorer la qualité de vie des patients. Ces avancées pourront trouver des applications dans des domaines variés. Les bénéfices du projet dépassent le cadre strictement humain. Les connaissances acquises pourront également profiter à la santé animale, notamment en médecine vétérinaire, en permettant le développement de traitements ou d’implants spécifiques adaptés aux animaux. En résumé, ce projet s’inscrit dans une démarche responsable, visant à maximiser les bénéfices scientifiques et médicaux tout en minimisant les impacts négatifs. Il ouvre la voie à des applications concrètes et innovantes, tant pour la recherche biomédicale que pour la santé humaine et animale, à court, moyen et long terme.
Procédures
Les rats recevront une injection ou une implantation du biomatériau à évaluer. Les injections sous-cutanées, intra- ou intermusculaires, ainsi que les injections intradermiques seront réalisées sous anesthésie, avec un temps opératoire estimé entre 5 et 10 minutes. Les implantations sous-cutanées, intra- ou intermusculaires et intra-osseuses seront également effectuées sous anesthésie et sous analgésie, pour une durée chirurgicale estimée entre 20 et 30 minutes. Les implantations intra-osseuses nécessiteront la création préalable d’un défaut osseux afin de mimer la perte de substance osseuse observée chez l’homme. L’analgésie sera assurée pendant l’intervention, puis maintenue après la chirurgie, jusqu’à 72 heures pour les implantations intra- ou intermusculaires et intra-osseuses. Un suivi quotidien des animaux sera mis en place afin de détecter précocement toute anomalie et d’exclure de la procédure expérimentale les animaux présentant des signes de souffrance. Au cours de l’étude, des prélèvements sanguins pourront être réalisés, avec une durée estimée à environ 1 minute. Le volume prélevé n’excédera pas le volume maximum éthiquement prélevable, à raison d’un prélèvement maximum par semaine. Si un prélèvement important est nécessaire, il sera effectué uniquement en point final, après anesthésie et analgésie. Des prélèvements d’urine pourront également être réalisés au cours du protocole en environ 1 minute, en exerçant une légère pression sur la vessie, à raison d’un prélèvement maximum par jour. Des analyses radiographiques pourront être menées sur animaux anesthésiés, avec un temps estimé à environ 5 minutes (anesthésie + radiographie). Si nécessaire, les animaux recevront une double injection de produit fluorescent, peu de temps avant leur mise à mort. En général, ces injections seront administrées environ deux semaines, puis une semaine avant la mise à mort. La mise à mort des animaux sera réalisée conformément aux normes éthiques en vigueur. Ce projet sera limité à un maximum de 2520 animaux sur 5 ans, avec une durée maximale d’étude fixée à 52 semaines après implantation.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement liées à l’acte chirurgical ou à l’injection / implantation du biomatériau : - Suite à la chirurgie : traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’implantation ou d’injection, pouvant entraîner douleur locale, gonflement, rougeur ou chaleur, une boiterie. Risque de réaction inflammatoire, de rejet local, bien que les biomatériaux soient choisis pour leur biocompatibilité. - Stress post-chirurgical ou post-injection, pouvant se manifester par une diminution de la mobilité, une inactivité ou un comportement anormal. - Perte de poids transitoire dans certains cas, surtout en période post-opératoire immédiate. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien) sera euthanasié.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort. Les organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le composé et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie. Grâce à ces prélèvements / analyses il sera possible de conclure sur la sécurité et l’efficacité des produits testés.
Remplacement
De manière générale, les biomatériaux que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro. Le biomatériau idéal doit allier biocompatibilité, pour garantir la sécurité d’emploi (exigence réglementaire), et efficacité clinique (la sécurité seule ne garantit pas que le matériau soit utile ou performant). La recherche de nouveaux biomatériaux sûrs et performants est donc essentielle et nécessite une évaluation en expérimentation animale afin d’assurer leur conformité réglementaire (tests requis par la loi) et leur potentiel d’application en santé humaine. Le passage chez l’animal reste indispensable afin de vérifier les interactions avec l’organisme et aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité.
Réduction
La présente saisine vise à évaluer la sécurité et l’efficacité de biomatériaux, selon les exigences réglementaires et scientifiques actuelles. Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. En s'appuyant sur les recommandations des normes et compte tenu de la variabilité probable des réponses aux biomatériaux, le protocole expérimental prévoit : Pour chaque point de temps (jusqu’à 3 selon la nature du biomatériau) et étant donné la variabilité probable de réponse aux biomatériaux, 10 sites d’implantation par biomatériau seront évalués sur au moins 3 animaux. Cet effectif pourra être revu, notamment si le biomatériau évalué est déjà connu, si des données antérieures permettent d’établir un parallèle, ou dans le cas où seules des données préliminaires sont nécessaires et que l’analyse reste pertinente.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Les conditions d’hébergement seront optimisées si nécessaire (par exemple : litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente). Un hébergement individuel transitoire pourra-être réalisé, par exemple, en cas de complications post-opératoire nécessitant un isolement comme la réouverture d’un site. Dans ce cas l’enrichissement sera augmenté (en plus de celui déjà présent, ajout minimum d’un élément supplémentaire). Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée. En plus de l’analgésie et de l’anesthésie assurées lors de la chirurgie et de tout autres gestes le nécessitant (ex : prélèvement sanguin), une observation quotidienne sera mise en place, l’état général des animaux et du site d’injection/implantation (gonflement, rougeur, boiterie, paralysie du membre, et autres paramètres), ainsi que les poids seront évalués au minimum deux fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. En cas d’apparition de signes persistants ou sévères, des mesures spécifiques seront mises en œuvre afin de garantir le bien-être animal, conformément aux protocoles éthiques établis. Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront abordés avant toute mise en œuvre du projet. Ils seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues lors de protocoles préalablement réalisés et appuyés d’une veille bibliographique. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures).
Choix des espèces
Le rat, mammifère largement utilisé en recherche biomédicale, présente des caractéristiques physiopathologiques et des réponses tissulaires proches de celles observées chez l’homme. Ce parallèle permet d’obtenir des résultats pertinents pour la transposition à l’espèce humaine, notamment grâce à des approches statistiques robustes et validées. De plus, le rat est un modèle reconnu pour l’étude des effets de composés ou de dispositifs médicaux : les données générées permettent d’extrapoler efficacement les résultats à l’homme et de faciliter la prédiction des réponses biologiques attendues lors des premiers essais cliniques. Ce modèle offre également la possibilité de prélever un volume suffisant et analysable de liquides biologiques (sang, urine), ce qui est essentiel pour évaluer l’impact systémique des biomatériaux implantés. Enfin, le rat permet de réaliser des études de sécurité et d’efficacité dans des conditions standardisées, conformément aux recommandations internationales. A noter, que les animaux seront largement sevrés et auront dépassé la majorité squelettique.
Étude de la balance excitation/inhibition des neurones épineux moyen du complexe striatal chez des animaux compulsifs pour l’alcool.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Conditionnés à boire de l'alcool au cours de près de 80 sessions de trente minutes, 240 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils vivent seuls en cage individuelle de 129 à 138 jours, subissent une chirurgie du cerveau en deux sites, puis quatre injections intracérébrales à deux jours d'intervalle. Six sessions associent la recherche d'alcool à un signal désagréable, pour séparer les rats qui continuent de boire malgré ce signal de ceux qui s'arrêtent. 192 sont tués pour prélever leur cerveau, et le porteur prévoit d'orienter les 48 autres, ceux qui n'ont pas montré assez d'appétence pour l'alcool, vers des formations à l'expérimentation animale.
Objectifs
Démontrer qu’en modulant spécifiquement l’activité de certaines populations de neurones sensibles à la dopamine (une substance active du cerveau) dans le cerveau par des approches génétiques et pharmacologiques chez le rat - on peut moduler une prise compulsive d’alcool (une consommation irrépressible d’alcool en dépit des conséquences négatives que ces prises d’alcool peuvent avoir sur l’individu).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de comprendre une partie des mécanismes liés à la prise compulsive d’alcool en lien avec le rôle de deux neurotransmetteurs (le GABA et le Glutamate) dans le cerveau. La prise compulsive d’alcool est à la base de nombreux troubles psychiatriques et comprendre son fonctionnement est un préalable indispensable au développement de stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces.
Procédures
La production des animaux transgéniques nécessitera une biopsie de tissu. La recherche envisagée s’étale sur une durée d’environ 20 semaines. Des rats adultes seront conditionnés à consommer de l’alcool de façon compulsive au cours d’un total cumulé de près de 80 sessions de 30 minutes chacune. Après habituation à consommer de l’alcool (environ 60 sessions), 6 sessions seront associées à des stimuli pour associer la recherche d’alcool à un signal négatif et ainsi distinguer les rats compulsifs ne pouvant pas stopper leur consommation d’alcool malgré ce signal, de ceux non compulsifs. Des animaux utilisés dans ce projet auront une chirurgie du cerveau (sous analgésie et anesthésie générale en deux sites, pour une durée d’opération n’excédant pas 40 minutes) qui, permettront au bout de trois semaines, d’injecter à 4 reprises (une fois tous les 2 jours) des drogues permettant d’étudier les mécanismes de régulation de la prise compulsive d’alcool (durée d’injection n’excédant pas 5 minutes). Les animaux seront hébergés en cages individuelles au cours de cette recherche pour une durée de 129 à 138 jours.
Impact sur les animaux
L’effet du modèle de consommation d’alcool que nous allons utiliser et l’hébergement individuel des animaux pour cette expérimentation induisent des effets indésirables chez l’animal, augmentant son niveau d’anxiété mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Des nuisances sont attendues liées à la procédure de chirurgie, la procédure d’injection intracérébrale aiguë et à la procédure des stimuli aversifs. Des effets indésirables sont également attendues pour ce qui est des injections dans l’abdomen et/ou sous-cutanées des traitements antalgiques et anesthésiques.
Devenir
Les animaux ayant suivi l'ensemble des expériences auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses. Cependant, dans notre projet, nous estimons à vingt pour cent au maximum les animaux ne satisfaisant pas au critère comportemental (appétence pour l'alcool) nécessaire à la poursuite des expériences. Ceux-ci seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. La décision sera prise en concertation avec le vétérinaire réfèrent et/ou un membre de la Structure chargée du Bien Être des Animaux
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation d’un comportement compulsif de prise d'alcool (comportement pour lequel on observe une continuation de la prise en dépit des conséquences négatives, un des critères de l’addiction).
Réduction
Chez les animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool différents scores d’activité́ comportementale seront relevés et en fin d'expérimentation, après la mise à mort des animaux, les cerveaux seront prélevés pour être analysés. Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe estimé sur la base de procédures similaires. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool sera traité au cours de sessions distinctes et successives pour n’avoir à suivre simultanément qu’un nombre restreint d’animaux à la fois.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans les conditions répondant aux critères légaux relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Nous serons cependant obligés de les maintenir en hébergement individuel par rapport à la procédure expérimentale, mais en cages ouvertes, ce qui limitera toutes nuisance associée à un isolement plus strict. Ils seront hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations (pendant une semaine) afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux contentions et aux manipulations. Les chirurgies du cerveau seront réalisées sous anesthésie générale, après analgésie préalable des sites d’incision. Les yeux seront protégés du dessèchement par application d’un gel ophtalmique. La température de l’animal sera maintenue constante par une couverture chauffante. En post-opératoire les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Des injections d’eau glucosée seront réalisées pour faciliter le processus de récupération post-chirurgical. Les douleurs post-opératoires seront prévenues par un antalgique. L’intégrité du processus cicatriciel en post-opératoire sera renforcé par application d’une solution iodée après suture de la peau. A leur réveil les animaux seront retournés dans leur cage. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites adaptés permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être animal.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré́ de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux de neurones sur lesquels portent notre étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les registres comportementaux explorés sont facilement appréhendables dans cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (de 8 à 10 semaines, de 200 à 240 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui pourront, pour certaines, prendre plusieurs mois.
Impact de l’anesthésie associée à des inhibiteurs antitumoraux sur l’efficacité de la résection chirurgicale dans le glioblastome et sur les caractéristiques des rechutes sur la souris et le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 192
Des cellules de glioblastome sont implantées dans le cerveau de chaque animal, puis la tumeur est en partie retirée par une seconde chirurgie, avant cinq jours de radiothérapie et quatre à cinq semaines de chimiothérapie. 384 souris et 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la tumeur peut s'accompagner de nécrose, de cachexie et de perte de poids, et que les molécules testées, nouvelles par définition, peuvent produire des effets délétères inconnus. L'objet réel est de comparer les anesthésiques employés pendant la chirurgie du glioblastome, et le résumé annonce un suivi des signes cliniques et des points limites liés à la croissance tumorale et à la radiothérapie sans en donner un seul seuil.
Objectifs
Le glioblastome (GB) est une tumeur cérébrale primaire de très mauvais pronostic. Le traitement standard comprend une résection chirurgicale suivie d’une combinaison de radiothérapie et chimiothérapie et enfin de plusieurs cycles de chimiothérapie. Malgré ce traitement agressif, la rechute est quasi systématique, conduisant à une survie médiane des patients de l’ordre de 18 mois post-diagnostique. La procédure chirurgicale implique une anesthésie générale qui est classiquement réalisée avec le propofol. Il existe actuellement une forte interrogation sur les effets de l’anesthésie sur l’évolution de la pathologie cancéreuse et, par conséquent, le choix du protocole d’anesthésie à utiliser dans ce contexte. Les études cliniques sont peu nombreuses et souvent rétrospectives. En revanche, les études précliniques qui sont de plus en plus nombreuses semblent souligner un effet antitumoral du propofol. Le domaine de l’onco-anesthésie a débuté par des études cliniques rétrospectives critiquables méthodologiquement et des études in vitro qui ont mis en évidence de propriétés antitumorales du propofol dans différents types de tumeurs). Dans cette étude, nous souhaitons associer cet anesthésique à nos inhibiteurs afin de voir le gain de survie sur des animaux ayant subit la même prise en charge que les patients.
Bénéfices attendus
Les glioblastomes sont responsables de nombreux décès, à ce jour, une résection de tumeurs avec un traitement adapté permet une survie des patients de 6.9 à 14.6 mois. L’objectif est donc de prolonger ces délais, mais aussi et surtout améliorer le confort des patients. A ce jour les traitements pour les patients souffrants (GB) incluent la chirurgie (pour un peu plus de 60% des cas) et la combinaison de radio- et chimiothérapie (principalement appliquée par l’utilisation de l’agent alkylant temozolomide (TMZ). L’utilisation du propofol et d’un inhibiteur passant la barrière hématoencéphalique et potentialisant la combinaison radio- et chimiothérapie et ceux en diminuant les doses de TMZ ont pour objectif d’améliorer la survie, mais aussi le confort de vie des patients.
Procédures
Lors de l'implantation tumorale nous réalisons une analgésie en sous-cutanée (2 secondes) 30 minutes avant l’anesthésie qui elle est en intrapéritonéale (2 secondes) puis nous procédons à l’implantation intracérébrale de cellules tumorales (10 minutes). La suture de la peau est réalisée à la fin de l’implantation avec du fil de suture (2 minutes). Lors de la résection tumorale, nous procédons à une analgésie en sous-cutanée (2 secondes) 30 minutes avant l’anesthésie qui elle est en intrapéritonéale (2 secondes) et à l’injection dans la veine caudale (2 secondes), puis nous réalisons la chirurgie afin de réduire la tumeur (15 minutes). La suture de la peau est réalisée à la fin de l’implantation avec du fil de suture (2 minutes). Pour les traitements, les animaux subissent de la radiothérapie pendant 5 jours (2 minutes par irradiation) de la chimiothérapie en intrapéritonéale toutes les semaines hors week end pendant 4 à 5semaines (2 secondes) des injections intrapéritonéales d’inhibiteurs antimoraux toutes les semaines pendant 4 à 5 semaines (2 secondes)
Impact sur les animaux
Stress lié à l’anesthésie par agent chimique en inhalation (ex: isoflurane) lors des administrations/imageries. Le développement de tumeurs chez la souris et le rat pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associée ou non à de la nécrose, cachexie, perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (i.p=intrapéritonéale / s.c=sous cutanée/ iv =intra-veineux) (douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les procédures chirurgicales d'implantation de cellules et les procédures chirurgicales d'exérèse induiront des douleurs suite à l'incision et à la cicatrisation.
Devenir
En fin de procédure les organes seront prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux inhibiteurs, ce projet est réalisé chez la souris et le rat, car il n’existe pas de méthode de substitution (in-vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les cancers. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : classiquement 12 par groupe en fonction de l’effet thérapeutique attendu. L’analyse statistique sera par la comparaison des groupes d'animaux en fonction du traitement réalisé. Afin de mener à bien notre projet, nous souhaitons tester 4 inhibiteurs différents sur ces trois modèles d'animaux avec 7 groupes de 12 animaux par groupe soit un nombre total de 192 souris immunodéprimées, 192 immunocompétentes et 192 rats.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • des conditions d'hébergement garantissant la non-contamination des animaux immunodéficients • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, notamment liés à la croissance tumorale, liés à la radiothérapie (diarrhée) et/ou liés à l'utilisation de traitements de références et novateurs. • Un protocole d'anesthésie adapté à la chirurgie. • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie (exérèse tumorale) et la période post-opératoire et un suivi postopératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.
Choix des espèces
Dans cette étude nous allons tester de nouvelles molécules, afin d'améliorer la survie et le confort des animaux tout en combinant radiochimiothérapie. L’utilisation des modèles souris, déjà en place dans le laboratoire sera complétée par celle de rat, avec pour but des approches confirmatoires (modèles différents) mais aussi l’utilisation d’animaux modifiés. Nous utiliserons des souris et des rats de 8 à 10 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs semaines dans un modèle immunocompétent ou immunodéprimé, donc l’implantation sur des jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.
Diplôme universitaire de microchirurgie
- Enseignement supérieur
840 rats vont être anesthésiés, opérés sous microscope, puis tués avant tout réveil. Chaque animal ne subit qu'une intervention, d'une durée pouvant atteindre trois heures, sur laquelle des chirurgiens qualifiés ou en formation et des vétérinaires s'exercent aux sutures de vaisseaux et de nerfs. Aucune connaissance n'est produite : il s'agit de la partie pratique d'un diplôme universitaire de microchirurgie, après des séances sur vidéo, sur substituts et sur pièces anatomiques. Le porteur présente cette formation comme "indispensable" et cite le credo de la Haute Autorité de santé, "jamais la première fois sur le patient", sans que la protection ainsi revendiquée s'étende aux 840 rats opérés.
Objectifs
Ce diplôme universitaire (DU) a pour but l’enseignement de la microchirurgie (chirurgie qui permet de pratiquer avec un microscope opératoire et grâce à des instruments spéciaux des interventions très précises sur des organes de petites dimensions) dans le cadre de spécialité chirurgicales, pour des chirurgiens qualifiés ou en formation et des vétérinaires. Ce DU concerne de nombreuses spécialités : chirurgie maxillo-faciale, plastique, orthopédique, ophtalmologique, Orl, urologie, pédiatrie mais aussi les vétérinaires. Les applications de la microchirurgie sont nombreuses : réimplantation de membre, transplantation d’organe, réparation de lésions nerveuses et vasculaires, et les cas de reconstructions. Cette activité nécessite une formation spécifique en dehors de la formation au bloc opératoire. Après de nombreuses séances d’observation vidéo, de chirurgie sur substituts et pièce anatomiques, il est encore nécessaire de recourir à des séances de formation avec des animaux pour se retrouver dans la situation d’un tissu vivant, mobile et vascularisé et de pouvoir contrôler la perméabilité vasculaire.
Bénéfices attendus
L’acquisition des compétences à la dissection et à la suture sous microscope est grandement facilitée et sécurisée tant en chirurgie humaine que vétérinaire après une initiation suivie d’un entrainement solide sur modèle vivant. Il s’agit d’une formation indispensable pour tous chirurgiens ou vétérinaires qui se destinent à pratiquer l’une au l’autre des techniques microchirurgicales. Les compétences acquises seront applicables dès la fin de la formation.
Procédures
Les animaux sont susceptibles d’être soumis à de la contention, à une procédure d’anesthésie par injection ou par voie gazeuse, et à des procédures chirurgicales. Même si différentes techniques microchirurgicales seront enseignées à l'occasion de cette formation, chaque animal ne suivra qu'une seule procédure chirurgicale qui sera sans réveil et d'une durée n'exédant pas 3h00.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles pouvant être observés sont : contention, douleur et/ou stress liés à la réalisation de l'anesthésie des animaux (par injection ou voie gazeuze). Par ailleurs, compte tenu du caractère « formatif » de ce projet, aucune des techniques opératoires étudiées ne se clôturera par le réveil de l’animal qui pourrait l’exposer à des complications post-opératoires telles que des douleurs, des hémorragies ou la formation de caillots sanguins. Néanmoins, demeure présent en cours d’intervention, le risque de survenue d’un problème anesthésique (ralentissement cardiaque, difficulté respiratoire), d’une hypothermie, ainsi que celui d’une rupture vasculaire.
Devenir
Afin d'éviter aux animaux utilisés dans ces travaux pratiques d'être exposés à des complications post-opératoires, l'ensemble des animaux sont euthanasiés avant leur réveil.
Remplacement
Préalablement aux travaux sur les animaux, différentes techniques alternatives, ne faisant pas appel à l’utilisation d’animaux, sont mise en place. En effet, l’acquisition de la gestuelle de base en microchirurgie sera réalisée grâce à des travaux pratiques sur substituts, et pièces anatomiques, en remplacement de l’animal. L'acquisition des gestes de base par des méthodes alternatives est un pré-requis obligatoire à l'apprentissage sur animaux.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux est rendue possible par la mise en place de phase successive d'acquisition des techniques microchirurgicales : d’abord sur substituts et pièces anatomiques et enfin sur animaux, d’une part. Et d'autre part, lorsqu’une procédure chirurgicale est réalisée, plusieurs techniques microchirurgicales pourront, si cela est possible, être réalisées et/ou enseignées au cours de cette même intervention (même période anesthésique). Toutefois, chaque animal ne sera soumis qu’à une seule procédure chirurgicale et ne participera pas à plusieurs interventions distinctes. Le nombre d’animaux est limité au minimum (1 animal par étudiant par séance de TP x 12 séances de TP/an, x14 étudiants/an, x5 ans = 840 animaux). L’utilisation de substituts et pièces anatomiques lors des premières séances de TP permet d’acquérir les compétences de base en microchirurgie sans recourir directement à l’animal, contribuant ainsi à réduire le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Ce n'est qu'après la validation de l'acquisition de la gestuelle de base, que les étudiants pourront continuer leur apprentissage sur des animaux. L’entraînement sur substituts et pièces anatomiques lors des premières séances de TP contribue au raffinement des procédures, en garantissant la maîtrise des gestes de base avant leur application sur l’animal. Afin d’assurer le bien-être de ceux-ci, ils seront hébergés dans des conditions de température, d’humidité et de ventilation optimales. Ils bénéficieront d’un enrichissement varié : - tactile (buchette, litière foisonnante, tube en carton), - sociale (groupe sociaux stables), - visuel (cages transparente) - et sonore (fond musicale). Par ailleurs, toutes douleurs interventionnelles seront exclues par l’utilisation d’anesthésique et d’analgésique. Il est à noter qu’aucun animal ne fera l’objet de plus d’une procédure chirurgicale ni ne sera réveillée au terme de cette procédure. De plus, des points limites ont été définis permettant de stopper immédiatement la chirurgie et de mettre fin à la vie d'un animal si cela s'avérait nécessaire (problème respiratoires, hemorragie, lésion d'un organe).
Choix des espèces
"Jamais la première fois sur le patient", tel est le credo de la haute autorité de santé. Il est bien évident que pour des raisons de sécurité, l'apprentissage des techniques microchirurgicales ne peut s'effectuer sur le patient. Ce type de chirurgie nécessite de travailler in vivo pour maitriser les problèmes liés au sang (thrombose, hémorragie, hémostase…) et pour vérifier la perméabilité des sutures. L’animal de prédilection est le rat, tant pour sa robustesse à l’anesthésie, que pour ses dimensions et son anatomie. En effet la taille de ses vaisseaux en particulier abdominaux et carotidiens, sont comparables aux structures vasculaires observées chez l’homme. Les rats utilisés seront de jeunes adultes (rats de 7 à 9 semaines). Leur taille étant adaptée au matériel chirurgical utilisé. Et de constitution suffisamment robuste pour supporter sans difficulté une anesthésie de 3 à 4 heures.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Un cathéter est implanté dans le duodénum de chaque rat au cours d'une anesthésie d'au moins 45 minutes, pour administrer des molécules candidates directement dans l'intestin en contournant l'estomac. 725 rats vont être utilisés, 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 100 un niveau modéré, 25 étant anesthésiés puis tués sans réveil. Ils subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins par 24 heures, jusqu'à trois administrations par jour pendant cinq jours, et un hébergement individuel pouvant durer huit jours, en cage à métabolisme pour certains. Tous sont tués, faute de pouvoir réutiliser des animaux dont le cathéter se bouche, alors que le porteur écrit qu'"aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n'est attendue" et que les points limites limitent la nuisance "à un niveau de gravité modéré au maximum".
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale de caractérisation de nouvelles entités en vue de la première administration chez l’homme, ou l’animal pour les médicaments vétérinaires. L’objectif du projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et/ou les concentrations tissulaires et/ou l’excrétion d’entités thérapeutiques chimiques ou biologiques après administration chez le rat par la voie intraduodénale permettant ainsi le shunt de l’estomac. Ceci facilitera l’étude d’entités thérapeutiques gastros sensibles notamment. Dans la recherche préclinique et la recherche de candidats, ces paramètres sont essentiels pour la sélection et l’évaluation des candidats médicaments. Les entités testées sont préalablement analysées lors de tests in-vitro. Une première sélection est ainsi réalisée pour n’administrer aux animaux que des entités avec des caractéristiques favorables en terme pharmacocinétique. Ces études préliminaires permettent d’objectiver les processus d’absorption, de dégradation, de distribution et d’élimination de chaque entité afin de prédire le comportement de ces entités chez l’homme ou l‘animal. Une chirurgie a été développée pour implanter un cathéter au niveau du duodénum et ainsi administrer une entité thérapeutique directement dans le duodénum en shuntant l’estomac.
Bénéfices attendus
A court terme, les expérimentations de ce projet permettront de déterminer les paramètres essentiels pour l’avancée du développement préclinique pour les entités testées. Elles peuvent aussi aboutir à l’identification des principaux métabolites et déterminer leur éventuelle toxicité. Ces résultats permettront de sélectionner les candidats potentiels ainsi que les doses et les voies d’administration les plus adaptées. A long terme, les entités sélectionnées constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme ou à l’animal dans le cadre de médicaments vétérinaires.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux : •Procédure chirurgicale de pose de cathéter intraduodénale et veineux : o1 anesthésie gazeuse de 45 minutes minimum par animal oAdministration par voie sous-cutanée d’analgésique et anti-inflammatoire. Durée 30 secondes sur animaux anesthésiés. Unique. Mise en place d’une couverture analgésique sur une période de 3 jours post-opératoire o2 administrations par voie sous-cutanée d’une solution d’hydratation. Durée 30 secondes sur animaux anesthésié. • Hébergement individuel post-chirurgie : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques o Sur animal vigile : Durée 30 secondes. Unique ou répété max 2 à 3 fois par jour sur une durée maximale de 5 jours. • Prélèvements de sang : o Via le cathéter : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o En microsampling : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 6 fois sur 24h. o En phase terminale : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. o Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne interne en vigueur. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. • Hébergement individuel post-chirurgie ou post-traitement : o Cage individuelle avec enrichissement complet (matériaux de nidification et bâton à ronger) avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 10 jours. Durée de l’hébergement individuel maximale de 8 jours. o Pour certaines études, Cage individuelle à métabolisme avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 12 jours. Durée de l’hébergement individuel maximale de 24h consécutives.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont liés aux gestes techniques d’administration (maximum 3 fois sur 5 jours pendant 30sec) et de prélèvements (maximum 8 fois 30sec sur 24h), à l’acte chirurgical (maximum 1 heure) ainsi qu’aux contraintes d’hébergement individuel. Aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n’est attendue par l’application des procédures de ce projet ou en lien avec les candidats-médicaments testés. Toutefois, la chirurgie peut amener de l’inconfort per et post-opératoire, compensé par une analgésie et anesthésie adapté (effets modérés). Et dans ces phases précoces de développement de candidat-médicaments, des effets secondaires non prédictibles peuvent survenir : perte de poids, hypo- ou hyperthermie, comportement anormal (animaux hypo- ou hyperactifs), vocalisations. Tout effet observé sera noté selon une grille spécifique et donnera lieu à une action adaptée à la gravité des signes ; les points limites anticipés permettent de limiter la nuisance à un niveau de gravité modéré au maximum.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Ces animaux ayant subis une chirurgie de pose de cathéter, il n’est pas possible de réutiliser les animaux pour de nouvelles études en effet la perméabiliité des cathéter est limité dans le temps.
Remplacement
De nombreux tests in silico et in vitro existent et permettent de sélectionner les entités d'intérêt uniquement sur la base de leurs caractéristiques pharmacocinétiques, notamment l'absorption et le métabolisme. Il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques d'un composé d'intérêt. Seul un modèle animal peut permettre de caractériser ces entités et discriminer celles qui pourront être envisagées pour un traitement chez l’homme ou l’animal.
Réduction
Les entités thérapeutiques auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro permettant de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). Cette approche préalable permet de réduire fortement le nombre d’entités à tester. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée. Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes, et ainsi de réduire le nombre d‘animaux. Le nombre minimal d’animaux par cohorte de traitement est réduit au minimum scientifique, c’est-à-dire 3 animaux. Ce nombre suffit pour avoir des données assez robustes pour présélectionner des candidats pour la phase pré-clinique
Raffinement
Les animaux seront dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Après réalisation des chirurgies, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages conformes à la réglementation pour permettre une bonne récupération post-chirurgicale et éviter qu’ils ne s’abiment les sorties de cathéters ou les plaies en cicatrisation. Ces cages seront équipées d’enrichissement et matériaux adaptés. Suite à l’administration de l’entité thérapeutique, dans les cas où les animaux seront hébergés individuellement dans des cages à métabolisme pour permettre le recueil des excrétas, ce temps de recueil sera limité à 24h consécutives et un temps de récupération suffisant sera appliqué avant la réalisation d’un nouveau recueil d’excrétas en cage à métabolisme pour limiter le stress des animaux. Un contact olfactif et visuel sera maintenu entre tous les congénères. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire désigné ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Des critères d'arrêt anticipés seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Le projet sera mis en œuvre par du personnel qualifié et habilité conformément à la réglementation en vigueur et ayant reçu une formation en Chirurgie Expérimentale. Une procédure spécifique permettra de continuer à travailler sur le raffinement notamment de la technique chirurgicale, de l’hébergement et de la collecte d’échantillon en vue de l’appliquer dans le cadre des études, une fois validé par le vétérinaire désigné, la Structure en charge du bien-être animal et le comité éthique de l’Etablissement utilisateur.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les stratégies de sélection de candidat, en réalisant des essais de pharmacocinétique préclinique. L’intérêt du modèle a été démontré dans plusieurs publications scientifiques. Le choix de l’espèce est dicté par le fait que le rat facilite par sa taille, la pose d’un cathéter intraduodénale et la pose simultanée d’un cathéter veineux. De plus, cela permet de répondre à des impératifs scientifiques : comparaison de résultats pharmacodynamiques et pharmacocinétiques chez la même espèce animale, homologie de récepteur de l’espèce choisie avec le récepteur humain. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée.
Implication d’une voie cérébrale dans la modulation de profils exacerbés de consommation et recherche de cocaïne chez le Rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tous tués en fin d'expérience pour prélever leur cerveau, destiné à des analyses moléculaires ou à l'enseignement universitaire de neuroanatomie, 673 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est implanté à demeure dans leur veine jugulaire, une partie subit en plus une chirurgie intracérébrale, puis ils consomment de la cocaïne quelques heures par jour, cinq jours par semaine pendant cinq semaines. Après quatre semaines de sevrage, ils sont replacés face aux signaux lumineux et sonores associés à la drogue pour mesurer leur comportement de recherche. Le porteur reconnaît que la douleur postopératoire résiste aux anti-inflammatoires et qu'un traitement aux opiacés est exclu dans une étude sur l'addiction, quand les cibles thérapeutiques annoncées sont renvoyées au moyen terme.
Objectifs
Le présent projet s'intéresse notamment à l'implication, dans le comportement de consommation et/ou de recherche de cocaïne, d'une voie de communication dans le cerveau qui participe de façon prépondérante au contrôle des processus liés aux émotions et à la motivation. Plus précisément, ce projet veut d'une part tester si des changements de l'activité de cette voie impactent la consommation volontaire de cocaïne puis sa recherche après sevrage, et d'autre part examiner si le comportement de consommation et/ou recherche de cocaïne peut lui-même modifier cette voie. A l'heure actuelle, la littérature est très pauvre concernant cette voie pourtant intéressante dans le domaine de l’addiction, et devient inexistante si on s'intéresse à des protocoles expérimentaux conduisant les animaux à développer un comportement de consommation de cocaïne mal contrôlé qui, ensuite après sevrage, génère un comportement de recherche de drogue exacerbé. L'hypothèse formulée ici est que la voie qui nous intéresse est fondamentale dans l'expression de ces comportements de consommation et de recherche de cocaïne exacerbés qui modélisent les difficultés rencontrées par les toxicomanes à contrôler leur consommation. Si elle est confirmée, elle participera à une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux mis en jeu dans l'addiction. Le modèle utilisé ici est basé sur un test comportemental qui permet au rat de consommer lui-même volontairement la drogue. Cette approche présente l'avantage d'exposer l'animal à la drogue de façon très rapide (le passage au cerveau e fait en quelques secondes) et de façon dépendante du comportement volontaire de l'animal, qui a la liberté de ne pas consommer, ce qui lui confère une haute valeur de modélisation de la pathologie. Par ailleurs, nos modèles, qui soumettent les animaux à des protocoles d'accès particuliers à la drogue, peuvent les conduire à consommer des quantités importantes de drogue ou à la consommer de façon très intense, comme cela est observé chez les cocaïnomanes, et permettront ainsi de mettre en évidence des modifications tissulaires, notamment au sein de la voie cérébrale qui nous intéresse, susceptibles de se produire dans la pathologie humaine.
Bénéfices attendus
Les connaissances actuelles sur l’addiction sont considérables, mais force est de constater que les traitements actuels manquent d'efficacité, notamment en raison de l’utilisation de modèles animaux imparfaits. L'étude que nous proposons devrait permettre, de par la comparaison des modifications cérébrales induites chez des rats consommant la cocaïne de façon moins contrôlée que dans des conditions standard, de mettre en lumière, à moyen terme, des cibles de nouvelles approches thérapeutiques. Par ailleurs, la mise en évidence de l'implication potentielle d'une voie cérébrale nouvelle dans ces modèles de consommation et recherche exacerbées de cocaïne participera à susciter l'intérêt d'étudier une structure cérébrale jusqu'ici peu examinée et dont les caractéristiques neuronales ou moléculaires offriront peut-être, à long terme, de nouvelles approches pharmacologiques.
Procédures
Tous les animaux de ce projet sont soumis à une intervention chirurgicale (45 min max) qui permet d'implanter, de façon définitive, un système de cathéter accessible de l'extérieur de l'animal et qui se termine dans la veine jugulaire. Certains animaux recevront également, par chirurgie intracérébrale (1h30 max) des administrations de séquences de gènes permettant ultérieurement l'expression locale d'un récepteur artificiel. Tous les animaux de ce projet sont soumis à un test comportemental, quelques heures / jour, 5 jours / semaines pendant 5 semaines, où ils pourront consommer la cocaïne de façon totalement volontaire par le biais du cathéter préalablement implanté. Cette phase de consommation doit être suivie d'une phase de sevrage de 4 semaines. L'expérience se termine par une évaluation du comportement de recherche de cocaïne (30 min) provoquée par l'exposition de l'animal à des signaux (lumineux et sonores) qu'il a pu associer aux effets de la drogues durant la phase de consommation. Cette séance est immédiatement suivie, chez une partie des animaux, par une évaluation du comportement de recherche de drogue par l'exposition de l'animal à la drogue elle-même (30 min).
Impact sur les animaux
1/ Chirurgies - La technique permettant la consommation volontaire de cocaïne nécessite une chirurgie vasculaire chez tous les animaux pour implanter à demeure un cathéter intraveineux. Une partie des animaux subit en outre une chirurgie intracérébrale pour, ultérieurement, pouvoir moduler l’activité de la voie cérébrale d’intérêt. Donc, une douleur post-opératoire (résistante aux anti-inflammatoires) pourrait être ressentie transitoirement, d'autant qu'un traitement aux analgésiques forts (opiacés) ne peut être envisagé dans le cadre d'une étude sur l'addiction. 2/ Isolement - Après implantation du cathéter, un isolement de maximum 24h est nécessaire pour protéger les cicatrices et optimiser la récupération de l'animal. 3/ Vulnérabilité infectieuse - Au-delà des actes invasifs nécessaires à la chirurgie vasculaire, les animaux sont ensuite connectés et déconnectés de façon quotidienne de l'appareillage permettant la consommation de solution de cocaïne. Ainsi, le milieu intérieur de l'animal est exposé à l'environnement extérieur de façon répétée. Malgré toutes les précautions qui pourront être prises en termes d'asepsie, il existe un risque d'infection par des agents pathogènes (surtout bactériens), essentiellement en raison de l'interdiction de traitement antibiotique préventif. 4/ Sevrage à la cocaïne - Suite à la phase de consommation de cocaïne, les animaux sont soumis à une phase de sevrage. Même s'il n'existe aucun syndrome reconnu de sevrage physique à la cocaïne, des symptômes psychologiques, comme un niveau accru de réaction aux stimuli anxiogènes, peuvent être mis en évidence. Même si nous nous appliquons à ne pas soumettre les animaux à des situations anxiogéniques, cette éventuelle nuisance n'est pas traitée car le sevrage et ses conséquences font partie intégrante des processus addictifs et leur traitement pharmacologique pourrait induire des biais d'interprétation des résultats. 5/ Modulation de la voie cérébrale d'intérêt - La voie de communication cérébrale qui nous intéresse est connue pour être inhibée par des stimuli récompensants et plutôt activée dans des situations aversives. Même s'il n'est pas démontré que l'activation de la voie est un médiateur du ressenti aversif, l'activation pharmacogénétique que nous envisageons est susceptible de générer transitoirement un état dysphorique.
Devenir
Tous les animaux de ce projet sont mis à mort à la fin des expériences car les cerveaux doivent ensuite être prélevés pour analyses moléculaires ou tissulaires ou bien pour utilisation dans le cadre d’enseignement universitaire de neuroanatomie (principe de réduction).
Remplacement
A l'heure actuelle, les études in vitro et in silico dans le domaine de l'addiction existent mais elles présentent les limites inhérentes à leur nature, c'est-à-dire l'impossibilité, pour les premières, d'envisager l'aspect intégré de la pathologie et, pour les secondes, une sur-simplification des systèmes biologiques associée à un manque de prise en compte de la variabilité interindividuelle due aux multiples facteurs mis en cause dans la pathologie. L'addiction étant un trouble psychiatrique qui nécessite le fonctionnement du cerveau en situation intégrée dans un organisme vivant et vigile doté de ses particularités propres, elle requiert aujourd'hui encore l'utilisation d'animaux dans sa modélisation préclinique. Notre projet visant à étudier l'implication, dans l'addiction à la cocaïne, d’une voie cérébrale mise en jeu dans les émotions et la motivation, processus hautement variables et sous l'influence de l'organisme entier, il nécessite donc l'emploi d'animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est calculé au plus juste pour pouvoir déterminer d’éventuelles différences statistiquement significatives avec un minimum d’animaux. Pour cela, des calculs mathématiques dédiés à l’estimation prospective d’effectifs nécessaires aux études scientifiques sont employés.. Dans la mesure du possible, chaque animal est son propre contrôle. Par ailleurs, chaque procédure expérimentale est réalisée sur plusieurs cohortes succesives d'animaux, de sorte que les cohortes initiales peuvent donner des indications pertinentes sur la suite des expériences à mener (réitérer ou arrêter), notamment en utilisant les tests statistiques les plus adaptés aux données recueillies pour déterminer les analyses avec le plus de puissance possible. L’utilisation de groupes témoins est réduite au strict minimum.
Raffinement
Les animaux sont soumis aux tests comportementaux durant leur période d’activité naturelle pour limiter au maximum la perturbation de leur sommeil. La manipulation des animaux commence une semaine après leur arrivée et est ensuite obligatoirement quotidienne. Seules les personnes assurant les expérimentations (maximum 2 personnes) manipulent les animaux. Les actes chirurgicaux sont réalisés dans une pièce dédiée, avec constitution de champs stériles et utilisation de matériel à usage unique ou stérilisable, et tant que possible en travail d’équipe permettant au chirurgien de ne pas s’extraire du champ stérile. La qualité de l’anesthésie est vérifiée fréquemment. La température interne des animaux est contrôlée. Dans la mesure du possible, les chirurgies seront regroupées en une seule intervention. Les cicatrices sont enduites d’une pommade cicatrisante qui, en outre, empêche le contact direct des agents pathogènes et irritants avec l’épiderme. Un isolement post-opératoire de quelques heures est appliqué afin de protéger les cicatrices de l’animal et de quantifier les comportements alimentaire et de boisson d’eau. L’analgésie pendant et après la chirurgie est couverte. Les animaux sont examinés quotidiennement avec, tant qu’elles sont apparentes, une attention particulière portée aux cicatrices, systématiquement désinfectées. Les conditions d’asepsie durant les tests et lors de la manipulation des animaux sont validées par la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le vétérinaire référent et scrupuleusement suivies pour éviter les infections. Les tests comportementaux sont réalisés dans une pièce dédiée à laquelle les animaux sont habitués. La première exposition de l’animal à la chambre de test est une séance d’habituation pour éviter un stress de l’animal combiné aux effets de la drogue. La passation des animaux dans les tests est organisée de sorte qu’aucun animal n'est isolé, en attente dans sa cage. La mise à mort est le plus souvent immédiate et sans aucune souffrance grâce à l'administration intraveineuse de l’agent euthanasiant par le biais du cathéter préalablement implanté. De façon générale, le bien-être des animaux est fréquemment vérifié à l’aide d’une grille d’évaluation individualisée indiquant les points limites de différents paramètres adaptés aux procédures (comportement, poids, pelage, cicatrices…). En cas d’altération, cela fait obligatoirement l’objet d’interventions adaptées.
Choix des espèces
Le Rat représente un choix intéressant pour la modélisation préclinique de l’addiction. Sur un plan évolutif, les rongeurs appartiennent à l’ordre des mammifères, parmi ceux disponibles en laboratoire, le plus proche de celui des Primates. Le Rat s’impose par l’existence de très nombreuses données neuroanatomiques et comportementales solides sur les processus addictifs qui ont permis de mieux les comprendre chez l’Homme. Doté de capacités cognitives élaborées, le Rat développe facilement des comportements complexes permettant d’étudier des aspects précis de l'addiction. Enfin, sur un plan pratique, la durée de vie des cathéters intraveineux implantés à demeure est moins importante chez la Souris que chez le Rat et peut sérieusement compromettre la tenue des expériences sur le long terme (plusieurs semaines). Les rats arrivent au laboratoire âgés de 3 semaines. Débutant le comportement au moins 3 semaines plus tard, ils sont alors dans l'adolescence et entrent dans l'âge adulte. Cette période de vie chez le rat correspond à une période de vulnérabilité accrue de l'être humain (phase adolescence/post-adolescence) vis-à-vis de la dépendance aux drogues.
Impact au cours du temps de la stimulation du nerf vague sur la pression artérielle, intracrânienne, la neuro-inflammation et la récupération motrice dans un modèle de lésion cérébrale chez le rat (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à trois chirurgies par animal et trois heures sur la table d'opération : 720 rats subissent une lésion du cortex moteur, une dissection du nerf vague et, pour une partie d'entre eux, l'implantation d'une électrode et de capteurs de télémétrie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 80 rats et modéré pour 640, tous tués à l'issue pour prélever le cerveau. Chaque animal passe trois tests de motricité, cylindre, stepping et open field, avant et après la lésion, et 160 rats voient leur pression artérielle enregistrée cinq minutes par jour pendant 31 jours. Le porteur retient le rat parce que sa taille et sa stabilité cardiovasculaire donnent des résultats moins variables que chez la souris, ce qui permet selon lui de réduire le nombre d'individus utilisés.
Objectifs
Chaque année en France, environ 150 000 personnes sont victimes d’un traumatisme crânien. 30% d’entre elles sont hospitalisées pour des lésions cérébrales consécutives à un choc. Par sa position anatomique, le cortex moteur est plus exposé aux lésions traumatiques que d’autres régions corticales. Les dommages dans cette région cérébrale vont entrainer des déficits moteurs avec une récupération fonctionnelle limitée. Chez la souris ayant subi une lésion cérébrale traumatique dans le cortex moteur, la transplantation cellulaire est une approche thérapeutique prometteuse. Néanmoins, l’efficacité de la greffe et la survie des neurones greffés nécessitent d’être optimisées. De plus, durant ces 10 dernières années, la stimulation du nerf vague (utilisée depuis plus de 20 ans en tant que traitement non pharmacologique de l’épilepsie chez l’Homme) est également apparue comme une thérapeutique prometteuse pour le traumatisme crânien. La question est donc de savoir, à long terme si une stimulation du nerf vague permet d’améliorer l’efficacité de la thérapie cellulaire dans un modèle de lésion corticale traumatique afin d’envisager une transposition de cette approche chez l’humain. La question à moyen terme est d’évaluer l’impact de stimulation du nerf vague sur la récupération motrice et cérébrale. Après un traumatisme crânien, la surveillance de la pression intracrânienne et artérielle est cruciale pour évaluer l'état neurologique du patient. Ainsi, en mesurant simultanément la pression artérielle et le rythme cardiaque par électrocardiogramme, nous pourrons déterminer si leurs fluctuations pendant la stimulation du nerf vague sont prédictives de la récupération motrice et cérébrale L’objectif de ce projet est donc de tester, chez le rat, les effets de la stimulation du nerf vague sur la lésion corticale traumatique tout en mesurant en continu la pression artérielle, l’activité cardiaque grâce à la télémétrie. Nous mesurerons les fluctuations de ces paramètres ainsi que des différents paramètres cérébraux afin de tester leur implication dans la récupération motrice après une lésion traumatique corticale.
Bénéfices attendus
La comparaison des effets d’une stimulation chronique ou aiguë du nerf vague sur l’inflammation cérébrale et périphérique, ainsi que sur la récupération motrice fonctionnelle et ananatomique et cérébrale permettra à moyen terme la mise au point d’un protocole efficace pour le traitement d’une lésion corticale traumatique. De plus, les paramètres cardiovasculaires évalués par télémétrie après stimulation constitueront, à moyen terme des marqueurs prédictifs précieux, qui pourront être utilisés à des fins de diagnostics précoces et de traitements personnalisés.
Procédures
240 rats subiront une lésion traumatique corticale et une dissection du nerf vague (2 chirurgies, 45 minutes). 80 subiront une lésion traumatique, une dissection du nerf vague (2 chirurgies, 45 minutes) et une implantation de capteurs de télémétrie (1 chirurgie, 1h30) ET DES PRELEVEMENTS SANGUINS, SOUS ANESTHESIE GAZEUSE, AVANT LA CHIRURGIE DE LESION CORTICALE, 24H ET 7 JOURS APRES LA CHIRURGIE (3 PRELEVEMENTS, 5 MINUTES/PRELEVEMENT. 240 rats subiront une lésion traumatique corticale, une dissection du nerf vague et une implantation d'une éléctrode sur le nerf vague gauche (2 chirurgies,1h30) . 80 rats subiront une lésion traumatique corticale, une dissection du nerf vague, une implantation d'une éléctrode sur le nerf vague gauche et une implantation de capteurs de télémétrie (3chirurgie, 3 heures) ET DES PRELEVEMENTS SANGUINS, SOUS ANESTHESIE GAZEUSE, AVANT LA CHIRURGIE DE LESION CORTICALE, 24H ET 7 JOURS APRES LA CHIRURGIE (3 PRELEVEMENTS, 5 MINUTES/PRELEVEMENT). Les 720 rats du projets subiront 3 tests de motricité allant de 3 à 30 minutes, qui seront réalisés sur 2-3 jours. Ils subitont ces tests une fois avant et une fois après la lésion traumatique. 80 rats subiront une stimulation du nerf vague tous les jours minimum durant 3 jours jusqu'à maximum 31 jours. 160 rats subiront un enregistrement de leur fréquence cardiaque et leur pression artérielle pendant 5 minutes, tous les jours, pendant 31 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables seront ceux induits par l’anesthésie générale, la chirurgie crânienne et la chirurgie de placement des électrodes et des capteurs. La chirurgie entraine une douleur modérée, diminuée par l’utilisation d’antalgique. L’anesthésie générale pourra entrainer un inconfort transitoire au réveil et une légère perte de poids ponctuelle. La lésion du cortex moteur entraine potentiellement une légère diminution de la capacité de préhension de la patte antérieure droite. LES PRELEVEMENTS SANGUINS POURRAIENT PROVOQUER UN STRESS DU A LA CONTENTION ET LA MANIPULATION NECESSAIRES AVANT LA MISE SOUS ANESTHESIE GENERALE, LE RISQUE D’HEMATOME EST FAIBLE POUR LES PRELEVEMENTS REALISES AU NIVEAU DE LA VEINE CAUDALE D’autres nuisances pourront également être produites comme durant les tests de motricité où les animaux seront placés seuls dans ces dispositifs, ce qui pourrait générer un léger stress transitoire pendant 30 secondes (pesée) et 10 minutes (test du cylindre, stepping, open field). a stimulation est indolore mais pourrait occasionner une légère gêne. Lors des stimulations du nerf vague et des mesures de télémétrie, les animaux seront isolés pendant la durée de la stimulation (15min) et les mesures télémétriques (5 minutes). Les animaux stimulés de manière chronique s’habitueront au dispositif, le stress devrait donc diminuer au cours des jours d’expérimentation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par des méthodes réglementaires pour des prélevements notamment de cerveau.
Remplacement
L’objectif du projet est d’analyser dans le temps les effets in vivo (grâce à des mesures de paramètres tels que la pression artérielle, et l’électrocardiogramme par la technique de télémétrie et des analyses comportementales) d’une stimulation du nerf vague après une lésion traumatique du cortex moteur. Ceci ne peut être actuellement modélisé ni in vitro ou ni in silico. De ce fait, cette étude pourra être réalisée uniquement sur l’animal entier et vivant afin de visualiser l’effet bénéfique de cette approche thérapeutique.
Réduction
Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques, nous avons calculé qu'il est nécessaire d’avoir 20 animaux par lot. Nous avons 36 lots, soit un total de 720 rats. Des lots sont équivalents (même groupe expérimental) avant la mise à mort. On pourra donc regrouper leurs résultats comportementaux, le nombre d’animaux par lot est donc défini par les analyses post-mortem (histologie et biologie moléculaire, 20 animaux par lot). De nombreuses études ont montré un impact du cycle hormonal féminin sur l’activité du nerf vague, donc chaque lot sera constitué de 10 mâles et 10 femelles,or si des analyses préliminaires avec 5 mâles et 5 femelles par lot, ne montrent pas de différence entre les 2 sexes, les lots seront alors réduit à 10 animaux (5 mâles et 5 femelles). De plus, des lots permettront de contrôler l’impact de la répétition du test sur la motivation des animaux. Si avec le lot, pour lesques il y a 10 jours d’écart entre les test comportementaux pré et post-lésion, on n’observe pas d’effet « répétition du test », les autres lots ne seront pas utilisés.
Raffinement
Avant l’expérimentation les animaux seront acclimatés à l’animalerie et à l’expérimentateur afin de réduire le stress le jour de l’expérimentation. L’expérimentateur manipulera les animaux les jours précédant l’expérimentation. Les animaux seront mis habituation dans la pièce avant toute expérience de comportement. Puis, durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou le stress. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe de 2 dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : stick de bois à ronger et tunnel). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et monitoring de la température corporelle et utilisation d’un coussin chauffant. De plus, les chirurgies seront réalisées par des expérimentateurs compétents et expérimentés à la fois pour la lésion Corticale Traumatique, la dissection du nerf vague et l’implantation de l'électrode et des capteurs de télémétrie afin que les gestes soient précis et efficaces permettant une chirurgie dans les meilleures conditions possibles pour l’animal. Un traitement antalgique sera poursuivi pendant 3 jours post-opératoire. Durant toute la procédure, le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière selon une grille de score (évaluation journalière durant les 7 jours post-chirurgie, évaluation hebdomadaire en pré-chirurgie et 7 jours après la chirurgie) qui permet le suivi des points limites gradés, stricts et précis et qui définit également des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention sera pris en charge sans délai.
Choix des espèces
Le rat est le meilleur modèle de rongeurs pour l’implantation d’une électrode de stimulation dans le nerf vague. En effet, la plupart des études de stimulation du nerf vague ont été réalisées chez cette espèce pour des raisons techniques de localisation et d’isolement du nerf vague. De par sa taille et sa stabilité cardiovasculaire plus importante par rapport à la souris, les résultats obtenus varient peu d’un individu à l’autre, ce qui permet de réduire le nombre d’individus à utiliser pour les études statistiques. Des rats mâles et femelles seront utilisés car la lésion corticale traumatique touche aussi bien les hommes que les femmes. De plus, de nombreuses études ont mis en évidence un impact du cycle hormonal féminin sur le fonctionnement du nerf vague, c’est pourquoi il semble important d’étudier et de comparer les 2 sexes.
Evolution des réseaux impliqués dans la fonction sexuelle après lésion de la moelle épinière chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
Pour cartographier les réseaux de neurones de la fonction sexuelle chez des animaux devenus paraplégiques, 225 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Chacun subit deux chirurgies d'une heure, une lésion de la moelle épinière puis, quinze jours plus tard, une injection de virus traceur, avant d'être perfusé quatre jours après. Quatre-vingt-dix rats sont soumis à des tests de fonction érectile de trente minutes, par réflexe de dorsiflexion, stimulation du pénis ou injection d'un composé inducteur, et soixante à des tests d'éjaculation par stimulation mécanique ou injection. Le porteur affirme que la stimulation du pénis est sans douleur en s'appuyant sur la bibliographie, tout en reconnaissant qu'une irritation reste possible, et prévoit la mise à mort de tout animal dont les signes de douleur persistent au-delà de quarante-huit heures.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière sont un problème de santé important, avec une incidence annuelle de 15 à 52.5 cas par million, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Ces lésions causent une paralysie et une perte de sensations bien connues, mais également une dysfonction du système autonome, qui est la partie du système nerveux qui régule les fonctions autonomes telles que la respiration, les battements du coeur ou encore la digestion. Ces dysfonctions autonomes sont, entre autres, des dysfonctions cardio-vasculaires, génito-urinaires, gastrointestinales… et altèrent considérablement la qualité de vie ainsi que l’espérance de vie du patient. Des études de qualité de vie ont montré que pour la majorité des paraplégiques, la récupération de la fonction sexuelle augmenterait drastiquement leur qualité de vie. Les réseaux neuronaux impliqués dans la fonction sexuelle ne sont pas encore bien compris, il est donc important d'étudier ces réseaux dans la physiologie et dans la pathophysiologie de manière à déterminer avec plus de précision de nouvelles cibles thérapeutiques, afin de restaurer la fonction sexuelle chez les paraplégiques.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Les études de qualité de vie montrent que la restauration de la fonction sexuelle chez les paraplégiques et les tétraplegiques améliorerait considérablement leur qualité de vie. Par ce projet, nous espérons en savoir plus sur les mécanismes neuronaux de la fonction sexuelle, de manière à trouver un traitement compatible avec leurs deficits.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à deux chirurgies d’une durée maximale d’une heure chacune. Ils auront d’abord une lésion de la moelle épinière, puis, quinze jours plus tard, recevront une injection de virus avant d’être perfusés quatre jours après cette injection. Quatre-vingt-dix rats seront évalués pour la fonction érectile juste avant la perfusion : 30 seront testés pour le réflexe de dorsiflexion du pénis (réflexe évaluant la fonction sexuelle, durée maximale : 30 min), 30 seront testés à l’aide d’une stimulation douce du pénis (30 min max), et 30 seront testés après l’injection d’un composé connu pour induire une érection (30 min max). Soixante rats seront évalués pour la fonction éjaculatoire juste avant la perfusion : 30 seront testés après l’injection d’une molécule connue pour induire une éjaculation (30 min max) et 30 seront testés à l’aide d’une stimulation mécanique (30 min max).
Impact sur les animaux
La lésion de la moelle épinière va induire chez les animaux les mêmes problèmes que ceux rencontrés par les patients : des difficultés locomotrices du train arrière pouvant être largement compensées par les pattes avant et une cage d'hébergement adaptée. Les injections de virus peuvent conduire à de légères douleurs. L'infection au niveau des sutures est rare mais possible. L'utilisation de l'anesthésie gazeuse peut induire des anomalies cardiovasculaires et respiratoires qui seront monitorées visuellement lors des chirurgies. Les injections peuvent induire un léger stress transitoire, mais les composés injectés sont décrits dans la littérature pour ne pas induire d'effets délétères aux doses choisies. La contention des animaux peut également engendrer un stress chez l'animal. Enfin, la stimulation du pénis est sans douleur, les paramètres de stimulation proviennent de la bibliographie. Cependant, une irritation du pénis est possible.
Devenir
L'expérience que nous réalisons avec le virus nous permet de tracer les réseaux de neurones impliqués dans la fonction sexuelle. Afin de visualiser ces réseaux, nous avons besoin d'euthanasier les animaux pour récupérer les tissus d'intérêt.
Remplacement
Les réseaux neuronaux impliqués dans la fonction sexuelle étant pas ou peu connus, aucune modélisation n'est possible, donc l'utilisation d'animaux est indispensable. De plus, cette fonction est possible grâce à l'intéraction de multiples systèmes : hormonal, sensoriel, autonome et moteur. L'étude de cette fonction nécessite donc un organisme entier.
Réduction
Afin de reduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, plusieurs étapes de cette pré-étude seront faites sur les mêmes animaux. Le nombre d'animaux utilisés dans chaque procédure a été déterminé de manière à avoir des résultats statistiquement significatifs, avec les tests adaptés, et le moins d'animaux possible. En cas de surestiation du nombre d'animaux dans une procédure, nous n'inclurons évidemment pas d'animaux supplémentaire dans la procédure.
Raffinement
Pour une pratique plus éthique, les chirurgies ont été mises au point préalablement sur des cadavres récupérés auprès d’autres chercheurs. Cette formation a été réalisée sous la tutelle de notre vétérinaire. Les premières chirurgies seront également effectuées en sa présence afin de limiter les erreurs pouvant engendrer des douleurs. Une analgésie pré-opératoire est prévue, ainsi qu’une analgésie post-opératoire pendant trois jours. Les animaux seront surveillés quotidiennement, et des soins appropriés seront apportés en cas de signes de mal-être ou de douleur, avec un contact du vétérinaire et de la structure de bien-être animal le jour même ou le lendemain selon la gravité. Si un animal présente des signes de douleur persistants au-delà de 48 h, ou sur recommandation du vétérinaire, il sera euthanasié. Des points limites ont été définis et seront systématiquement appliqués pour garantir l’arrêt immédiat des procédures en cas de signes de souffrance ou de détresse non contrôlables. L’environnement des animaux sera enrichi avec des tunnels et du matériel de nidification. Pour la contention, une phase d’habituation quotidienne avec récompense sera mise en place avant le début de l’expérimentation.
Choix des espèces
Le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologique reste malgré ses différences proches de celle l'humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies. De plus il existe de nombreux points communs entre le rat et l'humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière. Enfin nous avons choisi le même modèle que sur l'ensemble des précédents projets scientifiques. Nous utiliserons des animaux adultes car ils doivent être sexuellement actifs (8 à 10 semaines au début des expérimentations)
Modèles expérimentaux de dégénérescence rétinienne induite par une ischémie reperfusion transitoire
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Évaluer l'efficacité et la tolérance de traitements de la rétine, et former du personnel à des gestes professionnels, ces deux finalités se superposent ici. 1 100 rats vont être utilisés, dont 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et sont tués à l'issue pour analyse des yeux. Un œil par animal subit soit le pincement des vaisseaux et des nerfs qui l'irriguent, soit une élévation de sa pression interne, pendant trente à soixante minutes sous anesthésie, puis des injections dans ou autour de l'œil une à deux fois par semaine et des collyres jusqu'à huit fois par jour. Une centaine d'animaux écartés de l'étude pour un défaut de l'œil repéré avant le début des procédures sont réorientés vers d'autres expériences.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de mettre en place et d’utiliser des modèles expérimentaux afin de mieux comprendre les dommages que peut subir la rétine (la partie de l’œil qui capte la lumière) lorsqu’elle manque temporairement de sang, comme cela peut arriver dans certaines maladies de l’œil. Ce type de problème, appelé ischémie rétinienne, est lié à plusieurs maladies comme le glaucome, la rétinopathie diabétique ou l’occlusion d’une artère de la rétine. Ces maladies peuvent entraîner une perte de vision. Ces modèles, utilisant des rats, permettent de bloquer temporairement le flux sanguin vers la rétine, puis le rétablir. Ces techniques permettent d’observer les réactions de l’œil, comme le stress, l’inflammation et la mort de certaines cellules. Les premières cellules touchées sont celles qui envoient les signaux visuels au cerveau. Ensuite, d’autres types de cellules de la rétine sont affectées selon la durée du manque de sang. Des cellules de soutien dans l’œil réagissent aussi, ce qui aggrave l’inflammation et les dégâts. Ces modèles aident à comprendre les mécanismes en jeu dans les lésions de la rétine. Ils servent aussi à tester des traitements potentiels pour protéger les cellules de l’œil, réduire l’inflammation ou le stress, avant de passer à des essais chez l’humain. En résumé, ce projet fournit des outils précieux pour mieux comprendre comment la rétine est endommagée lors d’un manque de sang, et pour développer de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est de développer des modèles expérimentaux fiables permettant d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements destinés à protéger ou réparer la rétine après une lésion. La recherche médicale évolue rapidement, et il est essentiel de pouvoir tester ces traitements dans des conditions rigoureuses, tout en respectant les principes du bien-être animal. Grâce à ces modèles, il sera possible de simuler des atteintes rétiniennes similaires à celles observées chez l’humain, comme dans le glaucome ou certaines maladies vasculaires de l’œil. Cela permettra d’observer précisément l’effet des traitements sur les cellules de la rétine et de mesurer leur impact à l’aide d’outils non invasifs d’imagerie et d’électrophysiologie par la mesure de l’activité électrique de la rétine. Ces études contribueront à identifier les molécules les plus prometteuses, à ajuster les doses et à mieux comprendre les mécanismes d’action, tout en garantissant une approche éthique et encadrée.
Procédures
Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à différentes interventions expérimentales, réparties sur une période de 1 à 4 semaines selon les résultats obtenus avec les traitements testés. Concernant les procédures chirurgicales d’induction de la pathologie, deux méthodes seront utilisées, chacune pratiquée une seule fois sur un œil par animal. La première consiste à pincer les vaisseaux et les nerfs qui vascularisent et innervent l’œil. La seconde consiste à augmenter la pression dans l’œil. Ces procédures, réalisées sous anesthésie générale et locale, durent entre 30 et 60 minutes. Concernant les évaluations, différents examens seront réalisés une fois par semaine comme la mesure de l’activité neuronale de l’œil, l’évaluation anatomique par imagerie optique et biomicroscopie. Les deux premiers examens nécessitant une immobilisation complète de l’animal seront réalisés sous anesthésie générale, et regroupés dans une même session pour limiter le nombre d’anesthésies. Chaque examen dure quelques minutes. L’administrations des traitements se feront par : 1. L’applications de gouttes. Cette procédure nécessite une contention légère, d’une durée d’1 à 2 minutes et réalisée 3 fois par jour avec un maximum de 6 à 8 fois par jour. 2. Les injections sous-cutanées, intramusculaires ou intrapéritonéales. Ces procédures, également très rapides (1 à 2 minutes) sont réalisées sur animal vigile. 3. Injections intra- ou péri-oculaires sont réalisées sous anesthésie locale et générale si nécessaire, à une fréquence de 1 à 2 fois par semaine. Ces procédures durent environ 5 minutes par animal et nécessitent l’utilisation d’un microscope chirurgical. Des prélèvements biologiques seront peut-être nécessaires afin de doser le principe actif ou des marqueurs de la maladie. Pour cela, des prélèvements sanguins ponctuels pourront être réalisés et ne dépassent pas 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables anticipés dans le cadre de ce projet sont considérés comme modérés. L’expérience acquise lors d’études antérieures, ainsi que les données issues de la littérature scientifique, indiquent que les manifestations les plus fréquentes incluent : 1. une rougeur conjonctivale liée à une inflammation locale modérée lors d’injections ou d’administrations, 2. un léger saignement réversible au site d’injection, ou d’incision, 3. un trouble transitoire ou une opacification de la cornée. L’élévation de la pression intraoculaire induite dans ces modèles sera transitoire et réversible, et ne devrait pas générer de douleur manifeste après le réveil de l’animal. Les examens et les administrations nécessitent une contention brève des animaux, pouvant induire un stress ponctuel de quelques minutes. Des mesures spécifiques seront mises en place pour limiter cet impact (habituation, manipulation douce, environnement calme). Certaines procédures, telles que les injections intra ou péri-oculaires ou les examens nécessitant une immobilisation prolongée, seront réalisées sous anesthésie légère, afin de garantir le confort de l’animal. Ces anesthésies peuvent occasionner une gêne transitoire ou un léger saignement, mais ne présentent pas de risque significatif à long terme.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Mais les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure (estimé à environ 10%, hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens de baseline au niveau de l'œil avant le début de l’étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie.
Remplacement
L’œil est un organe très complexe, composé de nombreuses parties (cornée, cristallin, rétine…) qui interagissent entre elles et avec le reste du corps. Il subit en permanence des variations mécaniques, chimiques et biologiques qui influencent son fonctionnement et sa réaction aux traitements. Des techniques comme les cultures cellulaires, les organoïdes ou les simulations informatiques existent, mais elles ne peuvent pas reproduire toutes les interactions présentes dans un œil vivant. Par exemple, elles ne simulent pas correctement les effets sur l’ensemble du corps, les variations de pression dans l’œil ou bien les réactions complexes liées à des maladies comme le glaucome. C’est pourquoi les modèles animaux sont ici encore indispensables car ils permettent premièrement de reproduire plus fidèlement les conditions du glaucome. Deuxièmement, de tester l’efficacité et la tolérance de nouveaux traitements dans un organisme vivant. Troisièmement d’étudier les effets à long terme sur la rétine et le nerf optique dans un environnement complet.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques, tout en garantissant une analyse statique fiable des résultats. En fonction des résultats, les outils statistiques à notre disposition permettront, le cas échéant, d’ajuster encore à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs stratégies complémentaires seront mises en œuvre : Utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie (imagerie rétinienne, etc.), permettant de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, sans nécessité de mise à mort à chaque point d’analyse. Chaque fois que cela est scientifiquement pertinent, les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Afin l'optimisation des protocoles expérimentaux permettra de limiter la variabilité interindividuelle et maximiser la robustesse des résultats.
Raffinement
Un suivi quotidien rigoureux des animaux sera mis en place tout au long des études, afin de détecter précocement tout signe de stress, d’inconfort ou d’effet indésirable lié aux procédures expérimentales. Ce suivi permettra d’intervenir rapidement si nécessaire, dans le respect des points limites prédéfinis, conçus pour être précoces, prédictifs et adaptés à la pathologie étudiée. Ces points limites visent à minimiser toute douleur potentielle et à garantir une prise en charge rapide et éthique. Les animaux seront hébergés en groupe, dans des cages enrichies contenant nourriture et eau en libre accès et à volonté, ainsi que des éléments d’enrichissement environnemental (abris, matériaux à ronger) favorisant leur bien-être psychologique et comportemental. Les examens réalisés pour évaluer la pathologie sont non invasifs et comparables à ceux pratiqués en ophtalmologie humaine ou vétérinaire. Lorsque l’immobilité de l’animal est requise pour garantir la qualité des mesures, une anesthésie légère pourra être administrée, dans le seul but d’assurer le confort de l’animal et de limiter le stress. Ce projet a été soumis à l’évaluation d’un comité d’éthique compétent, et sera étroitement suivi par la structure en charge du bien-être animal au sein de l’établissement. Toutes les procédures seront réalisées par un personnel formé et expérimenté, dans le strict respect des réglementations en vigueur et des principes éthiques de l’expérimentation animale.
Choix des espèces
L'espèce sélectionnée pour ce projet présente des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques largement documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, en particulier dans le contexte des pathologies oculaires telles que le glaucome. Ces espèces sont couramment utilisées dans les modèles expérimentaux validés de glaucome et d’hypertonie oculaire notamment. Leur emploi repose sur une expérience accumulée dans la communauté scientifique, garantissant la reproductibilité des résultats et la comparabilité avec d’autres études précliniques. Les animaux seront des jeunes adultes âgés au minimum de 6 semaines pour les rats correspondant à la maturité de la rétine.
Évaluation de la sécurité préclinique des candidats médicaments chez les rongeurs et les non rongeurs
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 3600
Chiens : 400
Cochons : 320
Macaques à longue queue : 960
Quinze prises de sang en un mois, citées en exemple, et l'administration répétée d'un candidat médicament pendant deux mois au plus : 9 600 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, soit 4 320 souris, 3 600 rats, 960 macaques à longue queue, 400 chiens et 320 cochons. Plus rarement, des non-rongeurs sont opérés pendant environ deux heures pour recevoir un implant vasculaire ou de télémétrie. La plupart sont tués pour une analyse anatomo-pathologique des organes, 300 sont déclarés réutilisés et 60 adoptés, et le porteur réserve la réutilisation à des non-rongeurs dont l'étude ne demande pas cette analyse. Il s'agit d'études de toxicité exploratoires, menées avant les études réglementaires pour repérer tôt les candidats "les plus prometteurs" et, selon le porteur, "concentrer les investissements" sur eux. Le porteur fonde le choix des espèces sur les lignes directrices internationales, qui imposent un rongeur et un non-rongeur, chien, miniporc ou primate non humain.
Objectifs
Objectifs du projet Le développement d'un médicament nécessite plusieurs années de Recherche et Développement avant sa mise sur le marché. Les études précliniques de sécurité, réalisées en amont des essais cliniques, sont indispensables pour évaluer l'innocuité des candidats médicaments conformément à la réglementation exigeant une évaluation sur deux espèces mammifères : un rongeur et un non-rongeur (hormis cas particulier où une seule espèce est pertinente, par exemple pour certains anticorps). GLOBALEMENT, TOUTES ESPECES CONFONDUES, UN TOTAL D'ENVIRON 50 ETUDES EST REALISE CHAQUE ANNEE. Objectif principal : Réaliser des études de sécurité préclinique exploratoires pour évaluer les potentiels effets indésirables des candidats médicaments en amont des études réglementaires. Finalités : -Définir les effets toxiques potentiels des candidats médicaments -Identifier précocement les candidat médicament les plus prometteurs -Caractériser la toxicocinétique du candidat médicament -Soutenir la prise de décision en optimisant le design des études réglementaires (ex : choix d'espèces, doses, organes cibles, profil de risque) Méthodologie : Suivi clinique et biologique des animaux après administration unique ou répétée du candidat par voies d'administration cliniquement pertinentes, incluant : -des prélèvements de fluides biologiques (par exemple, sang, urines, liquide cérébro-spinal), -des évaluations fonctionnelles optionnelles (par exemple, cardiovasculaire, neurologique, immunitaire), -une approche intégrée permettant la réduction du nombre d'études.
Bénéfices attendus
L'un des bénéfices de ce projet est d'améliorer la protection des volontaires sains et patients et d'optimiser le développement pharmaceutique grâce à l'identification précoce des risques et la compréhension du profil toxicologique avant les études réglementaires et essais cliniques. Cette approche permet de concentrer les investissements sur les candidats les plus prometteurs, conduisant à une réduction significative des échecs dans les phases ultérieures de développement et une amélioration globale de l'efficacité du processus. Le second bénéfice est de fournir des informations critiques pour optimiser le protocole, la qualité et la pertinence des études réglementaires, permettant une sélection éclairée des espèces, des doses et des paramètres à surveiller. Cela se traduit par une estimation préliminaire des marges de sécurité, offrant une première évaluation du rapport entre doses efficaces et doses toxiques. L'identification précoce des organes cibles permet la détection des systèmes biologiques potentiellement sensibles, tandis que la définition de biomarqueurs permet d'identifier des indicateurs biologiques clés pour le suivi ultérieur. Ce projet apporte une valeur ajoutée scientifique et stratégique en permettant l'exploration des mécanismes de toxicité et la compréhension précoce des effets indésirables. Il facilite la prise de décision grâce à des données préliminaires qui orientent les choix de développement. L'approche éthique est renforcée par l'optimisation du nombre d'animaux utilisés dans les phases ultérieures. La flexibilité inhérente au projet permet d'ajuster rapidement les stratégies de développement, améliorant l'efficacité globale du processus et la réactivité face aux nouvelles données. Le projet intègre systématiquement plusieurs méthodes alternatives en amont dans notre stratégie d'évaluation, comme la modélisation informatique et les cultures cellulaires, permettant l'élaboration de protocoles complets pour déterminer le mode d'action des candidats médicaments, tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés. Le développement de nouvelles technologies comme l'analyse vidéo automatique et l'utilisation d'implants pour un monitoring continu ouvre de nouvelles perspectives (exemple : enregistrement et analyse en continu de paramètres cardiologiques sur animal vigile). Ces innovations permettront l'acquisition de nouveaux paramètres dans les études, alimentant des bases de données de référence comme celle des groupes contrôles.
Procédures
Les animaux vigiles seront concernés par l’administration unique ou répétée (quotidienne ou hebdomadaire) du candidat médicament, possibles par différentes voies (le plus souvent intra-veineuse ou orale), au cours de l’étude sur une durée maximale de 2 mois. Dans la majorité des études, les prélèvements réalisées sont des prélèvements de sang (ex : 15 prélèvements sur une durée d’un mois). Ils peuvent être complétés par des prélèvements d’autres fluides biologiques, associés à une contrainte légère de quelques minutes, qui seront nécessaires pour évaluer différents paramètres en début et fin d’étude ; leur fréquence et leur volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie (entre 15 et 30 minutes) quand ils sont invasifs (par exemple moëlle osseuse, liquide cérébrospinal). Des mesures comme par exemple, la température corporelle (avec puce électronique), le poids (2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. Plus rarement, une procédure chirurgicale pourra être pratiquée chez les non-rongeurs afin de mettre en place un implant vasculaire ou de télémétrie pour mesurer par exemple les ECG et la pression artérielle (durée d’intervention sous anesthésie générale-analgésie d’environ 2 heures).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables seront limités à une contrainte modérée. L’administration du composé lui-même peut provoquer une altération de l’état général se traduisant par exemple par une baisse d’activité, une perte de poids, des modifications de la température corporelle et du comportement. Les nuisances liées à la procédure (contention, administration, prélèvements de fluides ou tissus biologiques, etc.) se traduisent par un stress, une douleur de courte durée. Dans les rares cas où une chirurgie sera pratiquée, elle est susceptible d’entrainer dans les 48 heures post-opératoires une douleur légère, une baisse d’appétit et une légère baisse d’activité.
Devenir
Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus, la quantification de l’exposition tissulaire du candidat médicament et/ou l’analyse de l’impact sur la cible. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.
Remplacement
Les études sur animal vivant demeurent indispensables car aucun modèle alternatif ne reproduit actuellement la complexité d'un organisme entier. Seul l'animal permet d'observer les interactions entre systèmes physiologiques (cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, etc.) et les effets systémiques des candidats médicaments. Cette approche est essentielle pour détecter des toxicités résultant d'interactions complexes entre organes, de métabolisations successives ou d'effets cumulatifs impossibles à modéliser intégralement in vitro. Plusieurs méthodes alternatives sont systématiquement intégrées en amont dans notre stratégie d'évaluation : Modélisation in silico : algorithmes prédictifs anticipant les propriétés toxicologiques des molécules basées sur leur structure chimique et caractéristiques physico-chimiques. Cultures cellulaires avancées : cultures primaires ou lignées cellulaires spécifiques pour évaluer la cytotoxicité et les mécanismes d'action moléculaires. Organes sur puce (organ-on-chip) : dispositifs microfluidiques reproduisant partiellement la structure et fonction d'organes spécifiques (foie, cœur, rein, barrière hémato-encéphalique) pour étudier les effets organotypiques. Organoïdes : cultures tridimensionnelles mimant l'architecture tissulaire et certaines fonctions d'organes pour évaluer des toxicités spécifiques. Modèles ex vivo : tissus isolés pour étudier des effets localisés. Pour les produits biologiques (anticorps monoclonaux, protéines thérapeutiques, thérapies cellulaires et géniques), des défis supplémentaires existent : Spécificité d'espèce : nombreux produits biologiques présentant une spécificité d'espèce limitant le choix des modèles animaux pertinents. Tests de réactivité croisée : évaluation in vitro de la liaison croisée sur tissus humains et animaux pour sélectionner les espèces appropriées. Immunogénicité : réponses immunitaires indésirables difficilement modélisables in vitro. Modèles humanisés : animaux génétiquement modifiés exprimant les cibles humaines pour améliorer la prédictivité. Les approches alternatives sont systématiquement utilisées en amont pour : réaliser un premier criblage des candidats médicaments, éliminer précocement les composés présentant des signaux de toxicité évidents, orienter la conception des études in vivo en identifiant les organes potentiellement cibles, caractériser plus finement les mécanismes de toxicité observés in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (données bibliographiques et historiques, lignes directrices internationales et internes), et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les éventuels effets adverses. Les tests statistiques utilisables sont dépendants des paramètres étudiés, et peuvent être par exemple, une analyse de variance ou un test de tendance. La mise en place d’études combinant l’acquisition et l’analyse de paramètres de sécurité, pharmacodynamie et pharmacocinétique permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, l'utilisation d'animaux témoins n'est pas systématique et fait l'objet d'une réflexion approfondie en fonction des objectifs spécifiques de chaque étude. Par ailleurs, le recours à des bases de données contenant des données historiques d'animaux témoins se développe de plus en plus. Ces données constituent ce que l'on appelle des "groupes témoins virtuels" et permettent des comparaisons pertinentes sans nécessiter de nouveaux animaux témoins. Enfin, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le Vétérinaire clinicien, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés. La réduction est aussi renforcée par l’absence d’utilisation d’animaux contrôle, palliée avec les données virtuelles de groupe contrôle.
Raffinement
Pour certains gestes techniques ou l'utilisation de dispositifs de contention, une phase de désensibilisation/d'habituation est systématiquement mise en place en amont de l'étude. Cette approche vise à réduire significativement le stress de l'animal. Chaque manipulation est associée à un renforcement positif sous forme de récompenses physiques (caresses, encouragements vocaux) et/ou alimentaires, en fonction de la compatibilité avec le protocole d'étude. Les interventions chirurgicales sont réalisées en condition maximale d’asepsie avec la mise en place d'une analgésie multimodale pour assurer le confort de l'animal. Un suivi clinique quotidien permet une détection précoce de tout signe de douleur, d'inconfort ou de détresse. Des critères d'arrêt anticipés, supervisés conjointement par le Directeur d'étude et le Vétérinaire clinicien, sont établis pour garantir que les animaux ne subissent pas de contrainte supérieure à un niveau modéré. Pour l’ensemble des espèces, l'environnement des animaux est enrichi par la diffusion d'un fond sonore adapté dans les zones d'hébergement et les aires de jeux (si applicable). Pour améliorer la surveillance, des systèmes de vidéosurveillance dédiés sont utilisés pour les chiens, les miniporcs ou les rongeurs (cages digitales). En complément de leur alimentation quotidienne, les primates non humains reçoivent des enrichissements alimentaires distribués individuellement à la main, dès leur arrivée afin de favoriser l'établissement d'une relation de confiance entre l'animal et l'expérimentateur. Pour certaines études, la surveillance des rongeurs est renforcée par l’utilisation de cages équipées de caméras. Afin de minimiser le stress lors des manipulations et à améliorer leur bien-être, les souris sont délicatement prises en coupe dans les mains. Pour les rats en particulier, des séances de « chatouilles » mimant le jeu social naturel des rongeurs sont régulièrement pratiquées avant et pendant l'étude.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est défini par : -Les lignes directrices internationales définissant que les études de Toxicologie Générale doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rat, souris, génétiquement modifiés ou non) et chez le non rongeur (chien, mini-porc ou primate non humain) -Les données scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le véhicule envisagé et les données disponibles (pharmacocinétique, métabolisme et de toxicologie). L’espèce utilisée doit être pertinente et est essentiellement fonction de la similitude du profil métabolique et des effets biologiques attendus chez l’Homme, afin de permettre l’extrapolation des données acquises à l’espèce humaine. Le choix de l’espèce non rongeur peut dépendre également de la modalité thérapeutique. Dans certain cas particulier (par exemple pour les anticorps), une seule espèce peut être pertinente. Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes, pour répondre aux exigences de la réglementation internationale et aux spécificités découlant des différents programmes de recherche.
Evaluation de traitements dans le cadre de la douleur inflammatoire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Rats : 4400
Cochons d'Inde : 360
6 520 animaux non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 4 400 rats, 1 760 souris et 360 cobayes, et 2 520 d'entre eux dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une inflammation leur est provoquée par administration d'un réactif ou par une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes, puis leur douleur est mesurée par des stimulations tactiles ou thermiques appliquées jusqu'à la réaction de retrait, jusqu'à quinze fois. Le porteur indique que cette douleur inflammatoire dure de plusieurs jours à plusieurs mois selon le modèle, ce qui exclut selon lui de garder les animaux en vie. Sur le remplacement, il conclut que les méthodes sans animaux ne reproduisent pas l'interaction des organes "au sein du corps entier" et que l'étude d'analgésiques "nécessite l'utilisation d'animaux présentant des symptômes de cette nature".
Objectifs
La douleur inflammatoire chronique est un problème majeur de santé publique, affectant des millions de patients dans le monde. Elle est fréquemment associée à des pathologies telles que, par exemple, l'arthrite rhumatoïde. Ces douleurs, souvent résistantes aux traitements actuels, impactent considérablement la qualité de vie des patients et représentent une charge importante pour les systèmes de santé. Face à cette problématique, le développement de nouveaux traitements plus efficaces et mieux tolérés est une priorité en recherche biomédicale. Cependant, pour garantir leur pertinence clinique et leur sécurité, il est essentiel de passer par des étapes précliniques rigoureuses utilisant des modèles animaux validés. L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'efficacité et la sécurité de nouveaux traitements destinés à soulager la douleur inflammatoire en utilisant des modèles précliniques chez le rat, la souris et le cobaye.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inclut dans le processus de développement de nouveaux traitements contre les douleurs inflammatoires. Le développement de nouveaux traitements pourrait offrir des solutions plus efficaces et mieux tolérées pour les patients souffrant de douleurs inflammatoires chroniques, une condition souvent résistante aux thérapies actuelles. Une meilleure gestion des douleurs inflammatoires chroniques pourrait réduire la dépendance aux traitements opioïdes, diminuer les effets secondaires associés et améliorer la qualité de vie des patients, tout en réduisant les coûts pour les systèmes de santé. Les données générées permettront de sélectionner les traitements les plus prometteurs pour des études cliniques ultérieures, en s'assurant de leur efficacité et de leur sécurité dans des modèles précliniques pertinents.
Procédures
Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée (1 fois sur un traitement aigu, en général max 10 sur un chronique). En cas de nécessité d'implanter un cathéter, la chirurgie dure environ 30 à 60 minutes. L'induction de l'inflammation sera réalisée par administration d'un réactif (environ 1 minute, sous contention ou sous anesthésie) ou par une phase de chirurgie (de l'ordre de 30 à 45 minutes, sous anesthésie). Le comportement général des animaux sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de 5 à 15 minutes) et des tests comportementaux (réaction à des stimuli tactiles ou thermiques, de l'ordre de quelques secondes à 5 minutes). Chaque test sera, en général, limité à 1 à 15 occurrences max (si le modèle est conservé plusieurs semaines). Le comportement général des animaux sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de quelques minutes) et des tests comportementaux (réaction à des stimuli tactiles ou thermiques, de l'ordre de quelques secondes à 5 minutes). Des prélèvements sanguins (en général 2 au total sur l'étude, et maximum 10) pourront être réalisés (durée de l'ordre de la minute, sous anesthésie légère ou non).
Impact sur les animaux
Les animaux dans ce projet (à l'exception des animaux témoins, sans induction de pathologie) vont développer une douleur de type inflammatoire, qui peut se manifester par une hypersensibilité à la douleur ou une douleur spontanée, sur plusieurs jours à plusieurs mois en fonction du modèle. Les manipulations réalisées au cours des procédures peuvent entraîner un stress le temps de l'administration de réactif, de substance, ou lors du test (e.g. stimulation tactile au niveau d'une patte) ou du prélèvement sanguin, notamment du fait de la contention. Malgré les soins péri-opératoires (incluant un analgésique), il est possible que la chirurgie (le cas échéant) entraîne une douleur post-opératoire au site concerné. Les tests comportementaux basés sur la stimulation tactile ou thermique d'une zone potentiellement douloureuse peuvent entraîner une douleur aigue au moment du test (la stimulation est arrêtée dès la réaction de retrait de l'animal).
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de l'étude, car ils sont soumis à une douleur inflammatoire se développant sur plusieurs jours et pouvant durer plusieurs mois, ce qui ne permet pas leur maintien en vie dans de bonnes conditions. De plus, dans la très grande majorité des cas, des prélèvements post-mortem seront nécessaires pour compléter les données de l'étude et avoir une vision globale de l'effet des traitements.
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction au sein du corps entier, ce qui est un point particulièrement important dans ces modèles car le développement des douleurs inflammatoires repose également sur l'interaction entre les aires touchées et le système immunitaire des patients. Ces conditions spécifiques ne peuvent actuellement pas être reproduites in vitro, et l'étude de l'efficacité des traitements analgésiques ou anti-inflammatoires nécessite l'utilisation d'animaux présentant des symptômes de cette nature. Cependant, dans la majorité des cas les traitements médicamenteux étudiés dans le cadre de ce projet ont été sélectionnés au cours d'études in vitro et/ou in silico avant leur évaluation chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Pendant la phase chirurgicale (le cas échéant), les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des modèles largement employés pour étudier une grande variété de douleurs de type inflammatoire, notamment pour du screening de médicaments mais aussi pour des études plus ciblées sur un aspect pathologique précis. Dans le cas des cobayes, il peuvent être privilégiés pour l'étude de traitements contre une ostéoarthrite induite mécaniquement (chirurgicalement) du fait de fortes similitudes histologiques entre ce modèle et ce qui est observé en clinique humaine dans le cas de l'ostéo-arthrite idiopathique primaire. Dans le cadre de ce projet, des souches transgéniques pourront être utilisées notamment si elles présentent des gènes humanisés permettant l'étude de certains candidats médicaments visant spécifiquement certaines voies humaines. Après le sevrage (âge minimum 4 semaines), en général autour de 2-3 mois (jeunes adultes), afin d'étudier les traitements chez des animaux présentant un système immunitaire mature. Potentiellement animaux plus âgés (à partir de 6 mois) car des symptômes spontanés d'ostéo-arthrite peuvent apparaitre à ce stade dans certaines souches.
Évaluation préclinique d’un vecteur innovant de thérapie génique ciblant spécifiquement les cellules musculaires dans la dystrophie musculaire de Duchenne.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les rats utilisés portent une mutation reproduisant la dystrophie musculaire de Duchenne, maladie qui affaiblit progressivement les muscles jusqu'aux atteintes respiratoires et cardiaques. 112 d'entre eux vont être utilisés, dont 16 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour tester un vecteur de thérapie génique injecté dans le muscle ou dans la veine. 80 rats subissent trois injections sous la peau, deux prélèvements derrière l'œil, une injection intramusculaire et une injection intraveineuse. La plupart sont tués avant l'apparition des symptômes les plus graves, deux groupes étant au contraire suivis jusqu'aux stades avancés de la maladie pour mesurer leur survie.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique rare et grave qui touche environ un garçon sur 3 500. Elle est causée par des anomalies du gène codant la dystrophine, une protéine essentielle au bon fonctionnement des muscles. En l'absence de dystrophine, les muscles s’affaiblissent progressivement, entraînant une perte de la capacité à marcher, puis des difficultés respiratoires et cardiaques. Cette maladie conduit malheureusement, le plus souvent, à un décès prématuré à l’âge adulte jeune. Actuellement, aucun traitement curatif n’existe. Plusieurs pistes thérapeutiques sont à l’étude dans le monde. L’une d’elles consiste à utiliser des vecteurs viraux, c’est-à-dire de petits « transporteurs » dérivés de virus, pour introduire dans les cellules musculaires une version corrigée ou adaptée du gène. Le défi est particulièrement important, car le gène de la dystrophine est le plus long connu chez l’être humain et présente de nombreuses formes de mutations. Une approche prometteuse consiste à concevoir des versions plus courtes, mais fonctionnelles, de la dystrophine, telles que la microdystrophine. Ces protéines peuvent compenser, au moins partiellement, l’absence de la forme complète. Jusqu’à présent, les recherches ont principalement utilisé des vecteurs viraux classiques, obtenant des résultats encourageants chez l’animal, mais sans bénéfice clinique démontré chez l’humain. Ce projet propose d’explorer une autre approche : l’utilisation de vecteurs viraux capables de transporter de longues séquences génétiques et de s’intégrer de manière stable dans le génome des cellules. Dans des études préliminaires menées sur un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), cette stratégie a permis la production de microdystrophine et a démontré un potentiel d’amélioration de la fonction musculaire. L’objectif est désormais de tester cette approche en un modèle animal proche de la physiopathologie humaine. Pour ce faire, la proposition est de : 1) mesurer l’efficacité de cette stratégie à court, moyen et long terme dans les muscles squelettiques ; 2) vérifier si elle permet non seulement de prévenir, mais aussi d’atténuer les symptômes à différents stades de la maladie. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le potentiel des vecteurs lentiviraux dans la thérapie génique de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) et d’ouvrir la voie à de futures applications chez l’être humain.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à confirmer l’efficacité et la sécurité d’une approche thérapeutique contre la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’objectif est de démontrer que cette protéine, la microdystrophine, peut assumer une partie des fonctions de la dystrophine normale, renforçant ainsi la structure et le fonctionnement des muscles. Si cette approche s’avère efficace, les bénéfices attendus toucheront directement deux aspects essentiels pour les patients : la mobilité et la fonction respiratoire, qui constituent les principales complications de la maladie. Si les résultats sont positifs, cette thérapie pourrait être proposée, dans des études ultérieures, à des patients à différents stades de l’évolution de la maladie, et pas seulement à ceux diagnostiqués précocement : très tôt (avant l’apparition de symptômes sévères) ou plus tard (lorsque les signes sont déjà installés). Les bénéfices attendus de ce projet sont nombreux : Un renforcement musculaire pourrait contribuer à retarder la perte de la capacité à marcher. Une amélioration de la fonction respiratoire, visant à réduire l’un des principaux risques vitaux associés à la DMD. Une applicabilité plus étendue, avec un potentiel d’efficacité à différents stades de l’évolution de la maladie. Bien qu’il s’agisse encore d’une recherche préclinique, ce projet constitue une étape majeure vers le développement d’une thérapie génique pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). S’il s’avère concluant, il pourrait ouvrir la voie à de futurs essais cliniques chez l’humain, dans l’espoir d’améliorer la qualité de vie et l’espérance de vie des patients ainsi que de leurs familles.
Procédures
Dans ce projet, les animaux seront soumis à différents types d’interventions selon la procédure. - 16 animaux recevront une injection sous-cutanée (s.c.) et une injection intramusculaire (i.m.) dans chacune des pattes arrière (soit 2 injections i.m. par animal). - 16 animaux recevront une injection s.c. et une injection intraveineuse (i.v.). - 80 animaux recevront 3 injections s.c., 2 prélèvements par voie rétro-orbitaire (r.o.), 1 injection i.m. et 1 injection i.v. Les injections sous-cutanées (s.c.) et intramusculaires (i.m.) sont effectuées en moins d’une minute, tandis que les prélèvements rétro-orbitaires (r.o.) et l’injection intraveineuse (i.v.) prennent chacune moins de cinq minutes. Les injections sous-cutanées (s.c.) sont réalisées pour l’administration des anesthésiques, tandis que les traitements par des vecteurs lentiviraux sont effectués par voie intramusculaire (i.m.) ou intraveineuse (i.v.).
Impact sur les animaux
Des études antérieures réalisées avec ce type de vecteur lentiviral sur d’autres modèles animaux n’ont révélé ni toxicité ni effets secondaires significatifs. Sur cette base, aucun effet indésirable particulier n’est attendu dans le cadre de ce projet. Deux types d’injections seront réalisés : la première consiste en une injection unique directement dans un muscle de chaque patte. Comme toute injection intramusculaire, elle peut provoquer une légère douleur locale. Cependant, ces injections seront effectuées chez des rats encore jeunes (4 semaines), à un stade précoce de la maladie où les muscles sont peu affectés. L’impact négatif attendu est donc très limité. La seconde consiste en une injection dans la veine de la queue, comparable à une prise de sang, et elle ne devrait pas entraîner de gêne particulière. La plupart des animaux seront suivis jusqu’à un âge compris entre 10 semaines et 4 à 9 mois, puis mis à mort avant l’apparition des symptômes les plus graves de la maladie, afin de limiter autant que possible leur souffrance liée à l’évolution naturelle de la pathologie. Seuls deux groupes (un groupe traité et un groupe témoin non traité) seront inclus dans une étude de survie. Ces animaux recevront leur traitement à l’âge de 4 semaines et seront suivis jusqu’aux stades avancés de la maladie. Ils pourront alors présenter des symptômes importants, mais bénéficieront d’une surveillance quotidienne attentive ainsi que de mesures de soutien appropriées pour atténuer leur inconfort. Aucun test supplémentaire susceptible de provoquer douleur ou stress ne sera réalisé durant cette période. L’ensemble du protocole a été conçu pour minimiser au maximum les nuisances pour les animaux, tout en permettant d’obtenir des données scientifiques essentielles à l’évaluation de cette approche thérapeutique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les échantillons nécessaires aux analyses génétiques, histologiques et moléculaires.
Remplacement
Les dystrophies musculaires de Becker et de Duchenne touchent plusieurs organes interconnectés (muscles, cœur, cerveau, tube digestif). Préalablement aux essais précliniques sur les animaux issus de nos lignées modèles, l’efficacité des thérapies testées a été démontrée sur des cultures de cellules musculaires. Aucun produit n'est testé chez nos animaux sans connaissance d'un mécanisme biologique robuste, préalablement établi. L'approche innovante de la stratégie proposée ici consiste à cibler spécifiquement le muscle plutôt que tout autre organe, permettant de réduire la dose administrée et la toxicité virale sur certains organes tels que le foie. Le développement de la stratégie est à l'étape de la validation in vivo, incluant l'analyse de la biodistribution du vecteur qui doit être mené à l'échelle de l'organisme entier. Une partie de la démonstration de l'efficacité ciblée de la stratégie a été validée sur un modèle animal de plus petite taille et le présent projet est la dernière étape chez l'animal visant à confirmer l'innocuité de ce vecteur viral de dernière génération et son efficacité en condition réelle, c'est-à-dire sur un organisme mammifère sévèrement atteint par la maladie que le traitement vise à corriger, y compris dans la complexité de la réponse de l'organisme à l'administration du traitement.
Réduction
L'équipe de recherche qui a généré les animaux a accumulé beaucoup d'expérience sur cette lignée. Lors des essais précliniques, traiter moins de 10 individus permet d'obtenir des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur d'un candidat médicament sur l'évolution de la maladie. Des tests statistiques ont été réalisés et ont permis de réduire le nombre moyen d'animaux nécessaires pour répondre à la plupart des questions biologiques posées lors des expérimentations. Pour les objectifs de ce projet, nous avons mis en place en place une série de procédures en cascade qui permettra de n'utiliser que les animaux nécessaires selon la progression réelle du projet.
Raffinement
Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés en douceur très régulièrement. Les animaux sont hébergés à deux ou plus et le milieu est enrichi. La douleur est prise en charge tout au long des procédures, y compris de manière préventive avant les traitements, grâce à l’utilisation de molécules destinées à la sédation et anti-douler. Afin d’anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués quotidiennement en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage et yeux), leur comportement (mobilité) et l’état général de l’animal (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont prises : surveillance renforcée (biquotidienne) et mesures médicamenteuses visant à atténuer ou supprimer la douleur.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la même classe que l'être humain. Cette proximité évolutive en fait un modèle apprécié. Il partage de nombreux aspects anatomiques et physiologiques avec l’humain, notamment pour la constitution et le fonctionnement des organes ainsi que les processus métaboliques. Les récents outils génétiques ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculaires. Les modèles de rat miment ce type de maladies humaines de manière très fidèle, tout en conservant les atouts des rongeurs avec une courte durée de gestation, une taille raisonnable et une longévité compatible avec l'étude dans un temps raisonnable d'effets à long terme des médicaments testés sur des individus âgés. Il est un excellent complément aux autres modèles.