Rats
Consommation d’alcool à l’adolescence et mémoire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Alcoolisés par injections intrapéritonéales répétées pendant leur adolescence, 240 rats sont ensuite soumis à des tests de mémoire dans un labyrinthe en Y, dix minutes d'exploration libre puis cinq minutes de test. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour la moitié d'entre eux et modéré pour l'autre, et aucun rat ne sort vivant du protocole. Le porteur écrit qu'aucune nuisance n'est attendue en dehors de la douleur locale de la piqûre, tout en prévoyant une grille de perte de poids graduée jusqu'à 40 % et l'arrêt du traitement au premier signe de douleur avérée. Les cerveaux sont prélevés après les tests d'apprentissage, pour des analyses neurochimiques.
Objectifs
Mettre en évidence chez le rat adolescent les conséquences d'une exposition à l'alcool à des fréquences différentes sur la plasticité synaptique bidirectionnelle, mécanismes cellulaires des apprentissages et de la mémoire, dans l'hippocampe. Déterminer la durée des perturbations pour savoir si les effets de l'alcool sont irréversibles et s'ils dépendent de la fréquence d'exposition. Identifier les cibles moléculaires responsables des effets de l'alcool afin de savoir si la fréquence d'exposition engage des cibles différentes pour des effets potentiellement différents. Faire le lien entre les perturbations électrophysiologiques et les capacités d'apprentissages des animaux exposés à l'alcool. Ce dossier est déposé afin de terminer le projet de l'autorisation précédente car il nous reste les protocoles d'apprentissages à effectuer. Nous avons à ce jour utiliser 1100 animaux sur les 3800 prévus parce que nous avons affiné nos protocoles d'injection d'éthanol aux animaux (voir ci-dessous) et que nous avons rencontrés de nombreux problèmes techniques ralentissant l'obtention des résultats prévus initialement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si la fréquence d'exposition à l'alcool à des effets specifiques sur les mécanismes de la mémoire et sur les capacités d'apprentissages chez le rat adolescent. Ce projet repondra egalement à la question de la réversibilité des effets d' alcoolisations répétées à différentes fréquences à un âge adolescent, pendant la periode finale de maturation cérébrale, et donc permettra de préciser les messages de prévention à destination des jeunes consommateurs.
Procédures
Les interventions que subiront les animaux après les procédures d'injection d'alcool consistent en trois tests comportementaux, tous basés sur la curiosité spontanée des rongeurs à explorer leur environnement. Les injecitons d'alcool en i.p. durent de 1 à 2 sec car les volumes restent faibles. Ces injections sont toujours suivis d'un massage au lieu d'injeciton et d'une observation de l'animal pendant quelques minutes (jusqu'à l'endormissement). Les tests comportementaux durent, par animal, 10 min pour la phase de déambulation libre dans le labyrinthe en "Y" puis de 5 min pour la phase de test (quel bras vat-il choisir?). Entre les deux, l'animal est remis en cage.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance n'est attendue sur l'animal en dehors d'une douleur locale lors de l'éxécution du geste de piquer l'animal
Devenir
A l'issue des procédures indiquées, les animaux seront testés dans des tâches d'apprentissages afin de mesurer leur capactité mnésique et leur flexibilité cognitive. A la suite de ces tests, les animaux seront euthanasiés. Le cerveau sera prélevé pour analyses neurochimques
Remplacement
Pour ces denriers tests comportementaux, nous sommes dans l'obligation d'utiliser l'animal car il s'agit de compléter des études neuropharmacologiques et electrophysiolgoiques précédemment effectuées ex vivo sur une tranche cérébral d'hippocampe. Ces expérinces ici réalisées in vivo chez l'animal intact et libre de ses mouvemetns permettent donc de vérifier nos résultats obtenus sur une partie seulement du cerveau. AInsi, il pourra être établis qu'un mécanisme neuronal observé de manière précise ex vivo a une réalité physiologique en modulant le comportement de l'animal. Il n’existe pas à ce jour de méthode de substitution si l’on veut étudier les mécanismes neuronaux de la mémoire. En effet, les signaux que nous étudions ne sont générés que si les neurones sont organisés en réseau fonctionnel qui inclus donc l’ensemble des types cellulaires du système nerveux central (neurones + glie), ainsi que les voies d’entrées et de sortie des informations mnésiques. Il faut donc au minimum une partie de l’Hippocampe à notre disposition dans un modèle semi-intégré. D’autre part, il nous faut avoir accès au fonctionnement du neurone dans son environnement biophysique et physiologique afin de déterminer les acteurs cellulaires des effets de l’alcool et notamment les cibles membranaires sur les neurones, ce qui ne peut être obtenus sur une culture de cellules. LEs études proposées ne peuvent se faire que sur un mammifère qui possède un hippocampe comparable à celui de l'Homme. Le rongeur étant l'espèce utilisée dans les travaux précédents du laboratoire et des autres équipes mondiales avec lesquelles les résutlats de ces travaux seront partagés et discutés, et qui utilisent également le rat, il n'est donc pas possible de remplacer l'espèce utilisée dans le contexte des études proposées.
Réduction
Le nombre d'animaux déterminée pour cette demande d'autorisation de projet scientifique a été calculé en se basant sur l'expérience du laboratoire en terme d'études comportementales sur animaux vigiles. Ce nombre bénéficie églament de notre expérience récente sur ce projet qui a démontré des résultats avec moins d'animaux que ce qui était prévu au départ puisque nous avons à ce jour utilisé 1100 animaux sur les 3850 prévus parce que nous avons affiné nos protocoles d'injection d'éthanol aux animaux notamment.
Raffinement
Le raffinement pour diminuer les angoisses sera assuré par un hébergement enrichi (stimulations sensorielles),en groupe (activités sociales) et en présence de musique dans la pièce de stabulation. Toutes les mesures seront mises en oeuvre afin de limiter souffrance et douleurs éventuelles. Les cages sont pourvues de litière en quantité suffisante, de rouleaux de carton (jeux, cache), de litiére foisonnante (nidification) et d'une cache surélevée en plastique pouvant servir de refuge ou autre. Nous pouvons ajouter que le déroulement de ce projet nous a permis d'observer des résultats significatifs après un nombre d'injections d'alcool inférieur à ce que nous avions prévu au départ, participant de fait au mieux-être des animaux. Les points limites sont les suivants: en cas de douleur avéré lors de la répétition des injections, le traitement s'arrêtera aussitôt et l'animal recevra immédiatement et pendant 3 jours consécutifs, du paracétamol (200 mg/kg) dans l'eau de boisson (vol de 30 ml consommé par jour par individu). L'animal sera réintégré au protocole s'il va mieux sinon il sera écarté définitivement. Score 0 1 2 3 pour Perte de poids de 0-10% 10-20% 20-30% 30-40%, respectivement. Un score de 3 observé une fois est irrémédiable et conduit à écarter l'animal de l'étude. Un score de 2 pendant 2 jours consécutifs et malgré notre intervention (arrêt du traitement) sera églament rédhibitoire. Un score de 1 aménera à suspendre le traitement et à observer la récupération de l'animal sans plus d'intervention; une aggravation de sa situaiton (score 2) aménera à l'écarter définitivement du protocole expérimental.
Choix des espèces
L’utilisation de rongeurs se justifie de par 1) leurs similitudes morphofonctionnelles au niveau cérébral par rapport aux humains. Ces animaux sont capables d'apprentissage et ressentent les effets de l'alcool au même titre qu'un humain et les mécanismes de la mémoire décryptés chez ces rongeurs sont considérés être les mêmes chez l'Homme, 2) les études au niveau international déjà effectuées par d’autres équipes et 3) notre propre expérience puisque nous avons déjà publié avec des rongeurs dans le cadre de projets équivalents. Ce présent projet est une continuation et une extension de ces études publiées car nous n'avons pas répondu à toutes nos interrogations. Il est reconnu que dans la population humaine, les jeunes femmes consomment de l’alcool au moins autant que les hommes mais scientifiquement, il existe beaucoup moins de connaissances fondamentales sur les mécanismes mnésiques perturbées chez les animaux femelles même si de nombreux articles indiquent une plus grande sensibilité des femelles aux effets de l’alcool. C’est ce que nous déterminerons entre autres ici dans le cadre d’une consommation excessive et de courte durée. La maturation sexuelle ayant lieu au cours de la puberté il est important de pouvoir déterminer le rôle de cette période sur la sensibilité à l’alcool.
Encapsulation Ilots de Langerhans: Evaluation de l’efficacité in vivo de la transplantation d’ilots de Langerhans humains encapsulés dans une matrice d’hydrogel chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 500
Évaluer pour un sponsor l'efficacité d'un implant d'hydrogel contenant des îlots de Langerhans humains conduit à utiliser 2 000 souris et 500 rats dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués en fin de projet pour récupération des tissus, des organes et du sang. Les implants sont posés ou retirés par chirurgie intrapéritonéale sous anesthésie d'une heure, avec administrations de glucose par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse, jeûnes pouvant aller jusqu'à six heures, et hébergement individuel sans enrichissement pendant deux heures pour la collecte d'urine et de fèces. Le point limite est fixé à plus de 20 % de perte de poids, ou à un maintien au-delà de 15 % pendant plus de trois jours. Le nombre d'animaux par groupe, de 5 à 15, est établi sur les données du sponsor.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité in vivo de la transplantation d’ilots de Langerhans humains encapsulés dans une matrice d’hydrogel sur une souche de souris immunodéficiente. L’implant est à base d’hydrogel conçu pour le traitement curatif du diabète de type 1 par thérapie cellulaire. En cas de diabète de type 1, les cellules bêta des îlots de Langerhans sont détruites par un mécanisme auto-immun. La transplantation d’îlots de Langerhans est le seul traitement curatif. Cette technique est pratiquée dans différents pays. Cependant, elle se heurte à un obstacle majeur : elle nécessite l’utilisation de traitements immunosuppresseurs lourds (comme toute allogreffe) présentant des effets indésirables importants. L’implant, une matrice immuno-protectrice contenant des îlots de Langerhans, améliore significativement les protocoles actuels de transplantation :
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité in vivo de la transplantation d’ilots de Langerhans humains encapsulés dans une matrice d’hydrogel chez la souris ou le rat.
Procédures
DDes implants intrapéritonéaux pourront être posés ou retirés par chirurgie. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Des injections ou administration de glucose pourront être réalisées par voie oral, intrapéritonéale ou intraveineuse (durée des injections de quelques secondes). Suite à ces administrations ou injections où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun durant 6h au maximum. Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination du composé administré. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement durant une à deux heures (maximum 2heures). En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie.
Impact sur les animaux
Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit (glucose ou autres). Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.
Devenir
Les animaux seront mis à mort lorsque le constat aura été fait que la greffe des ilots de Langerhans est acceptée ou non par les animaux et que l’évaluation de la fonctionnalité des ilots aura été appréciée. Les animaux ayant été greffés ne seront pas réutilisés pour d’autres procédures ou projets.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot sera déterminé sur la base des expériences déjà menées par le sponsor, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue. Un minimum de 5 animaux par groupe devra être inclus (avec un maximum de 15 animaux par groupe). L’utilisation de tests ou d’outils statistiques sur les paramètres mesurés en cours d’étude permettront limiter le nombre d’animaux engagés dans ce projet
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 15% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 15 et 20% du poids : les animaux seront réhydratés avec un soluté de remplissage 1 fois par jour. Une perte de poids de plus de 20% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 15% constituera un point limite. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les poses et retraits d’un implant seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait par animal. Les voies chirurgicales et poses et retraits d’implants seront réalisés par du personnel extensivement formé à la technique. Pour les implants intrapéritoneaux (pose ou retrait), sera ajouté un analgésique administré avant la chirurgie en sous cutané et/ou un anesthésique local en sous cutané au niveau de la zone d’incision avant l’incision. En fonction de la nature des implants, une couverture antibiotique large spectre pourra être mise en place en per et post opératoire. En fonction de la douleur associée à leur pose, une couverture par anti inflammatoire non stéroïdiens sera potentiellement mise en place. Suite aux chirurgies, de la nourriture sera placée en fond de cage pour faciliter l’alimentation. Le comportement des animaux sera surveillé pour évaluer la nécessité de mettre en place une collerette. Les sutures seront nettoyées si besoin. La glycémie sera monitorée au cours des premières heures suivant la pose des implants. En cas d’hypoglycémie (par excès d’insuline synthétisé par les ilots), de la nourriture sera ajoutée, de l’eau sucrée pourra être donné au animaux anisi que des injections de glucose en sous cutanée.
Choix des espèces
La souris et le rat seront privilégiés pour évaluer la pharmacocinétique in vivo de la transplantation d’ilots de Langerhans humains encapsulés dans une matrice d’hydrogel, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation du diabète. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte permettant la réalisation de la chirurgie dans des conditions optimales. Les animaux adultes pourront mieux supporter la chirurgie et les injections ainsi que les potentiels effets secondaires des composés ou dispositifs à tester.
Formation réglementaire des personnels participant aux procédures expérimentales sur Rongeurs et Lagomorphes
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 40
Lapins : 40
80 souris, 40 rats et 40 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des séances de travaux pratiques impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est contenu vigile, examiné, gavé pour les rongeurs, puis anesthésié pour subir deux à quatre prélèvements veineux et une à deux injections par voie intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse et intradermique ou sous-cutanée, les lapins recevant en plus un cathéter à l'oreille et un tatouage. Le porteur compte un animal par participant pour les souris, un pour deux participants pour les rats et les lapins, et signale l'accident anesthésique comme effet indésirable le plus fréquent. Les rats et les lapins tués servent ensuite à une séance de dissection anatomique.
Objectifs
La licence professionnelle dont le présent projet décrit la partie pratique sur animaux de laboratoire est un diplôme inter-universitaire de niveau bac+3. Il s’agit d’une formation spécifique destinée aux personnes appliquant les procédures expérimentales sur animaux vivants.Elle vise à former des spécialistes sensibilisés à l’éthique en lien avec l’utilisation des animaux à des fins scientifiques . D’un volume total de 550 heures, cette formation comporte une partie d’un volume de 150 heures portant sur les aspects liés à l’animal parmi lesquelles 50 heures environ sont consacrées à des travaux pratiques.
Bénéfices attendus
Dans le cadre des formations obligatoires des personnes appelées à intervenir dans des projets de recherche impliquant des animaux, il est indispensable que les apprenants pratiquent sur des animaux vivants les actes techniques autorisés par cette formation les plus courants. Depuis le début de 2016, une séance de travaux pratiques sur des modèles inertes (mannequins de rats, modèles d'oreilles de lapins, ...) est organisée préalablement aux séances de travaux pratiques sur animaux vivants objets de la présente demande d'autorisation de projet. Cette séance permet d’acquérir la maitrise technique des gestes avant de les pratiquer sur des animaux vivants et de réduire ainsi le risque d’infliger une douleur, un stress ou une lésion à un animal (Raffinement). Il demeure que la réalisation ou l'observation d'actes pratiqués sur l'animal vivant est une partie essentielle à la qualité de la formation des personnels ayant à les réaliser dans leur activité professionnelle, garantissant ainsi des gestes en conditions réelles techniquement mieux réalisés, plus sereinement, cela au bénéfice de l’animal, de l’expérimentateur et de l’expérimentation. Ces séances sont animées par un nombre conséquent d’encadrants (un encadrant pour six participants) très expérimentés, motivés par la transmission de leurs savoir-faire et très attentifs au bien-être des animaux.
Procédures
Les animaux, vigiles, sont soumis à la contention, un examen général, pour les souris et les rats à un gavage (5 min) et une injection pour l'induction de l'anesthésie générale (environ 20 min), puis sous anesthésie générale à 2 ou 4 prélèvements veineux (10 min), la réalisation de 1 à 2 injections de chacune de ces voies (intra-musculaire, intra-péritonéale, intraveineuse et intra-dermique ou sous cutanée, 20-30 min environ), et pour les lapins à la mise en place d'un cathéter à l'oreille (5 min) et la réalisation d'un tatouage (5 min).
Impact sur les animaux
La contention des animaux et la réalisation des premiers gestes avant anesthésie induisent un stress des animaux. L'administration de l'analgésique et de l'anesthésique peut engendrer une douleur légère au moment de la piqûre. L’effet indésirable le plus fréquent est un accident anesthésique chez un rat, une souris ou un lapin.
Devenir
Les rongeurs et les lapins sont mis à mort à l’issue de la séance car aucune utilisation ni aucun replacement ne peut être envisagé pour ce nombre d’animaux, après réalisation de plusieurs gestes dont des prélèvements rétro-orbitaires et après rupture de leur statut sanitaire lors de cette séance. Les rats et les lapins mis à mort sont ensuite utilisés pour une séance de dissection.
Remplacement
Il en va du bien-être des animaux ultérieurement manipulés par nos participants dans leur exercice professionnel qu'ils aient pratiqué ou au minimum vu pratiquer la plupart des gestes courants et peu invasifs pouvant être utiles à la réalisation de projets de recherche. Pour cette raison, les animaux vivants ne peuvent être remplacés intégralement par des modèles inertes. Toutefois, nos participants commencent toujours par pratiquer les mêmes gestes sur des modèles en silicone.
Réduction
Ce projet nécessite pour 5 ans l’utilisation d’un total de 80 souris,40 rats et 40 lapins au maximum. Le nombre d'animaux utilisés correspond à une souris par participant, un rat et un lapin pour 2 participants, ce qui est le minimum pour que la qualité de l'apprentissage soit suffisante. Par ailleurs, les rats et les lapins mis à mort lors du TP d’administrations et prélèvements sont ensuite utilisés lors de la séance de dissection pour l’anatomie.
Raffinement
La douleur, le stress et le risque de lésion sont réduits au maximum grâce un entrainement des participants sur modèles inertes, à un encadrement nombreux et de qualité, tourné vers l’accompagnement des participants et le respect des animaux, et au fait que les gestes les plus douloureux ou stressants sont réalisés sous anesthésie générale. Les protocoles d’analgésie et d’anesthésie sont optimisés pour les gestes réalisés. L’accent est mis tout au long des travaux pratiques sur le respect des animaux et la réalisation des gestes dans les meilleures conditions possibles. L’objectif est clairement énoncé aux participants que ces travaux pratiques doivent leur servir à réaliser par la suite l’ensemble de ces gestes nécessaires dans les meilleures conditions possibles pour le respect de l’animal et la pertinence des résultats scientifiques. Des points limites précoces sont mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Le rat, la souris et le lapin sont les modèles les plus pertinents pour le module rongeurs-lapin, de par la fréquence de leur utilisation et leur différence de taille qui permet d’appréhender la variation des gestes techniques. Les animaux commandés sont des souris d’environ 16 semaines (environ 30 g) ,des rats de 6-7 semaines (250-300 g), et des lapins. Les animaux sont choisis pour leur couleur blanche qui facilite la détection des veines caudales, leur calme et leur taille adaptée aux manipulations. Adultes pour les souris (16 semaines), jeunes adultes pour les rats (6-7 semaines), jeunes adultes pour les lapins (environ 4 à 6 mois). Les animaux sont ainsi de taille suffisante sans être trop gras (ce qui rendrait l’anesthésie plus difficile et donc dangereuse), avec une bonne homogénéité des lots pour faciliter la gestion anesthésique.
Test d’une nouvelle molécule pour le traitement de l’hypogonadisme hypogonadotrope chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Quarante-deux injections sous-cutanées par animal, dont une par jour cinq jours par semaine pendant huit semaines, après deux injections d'antagoniste de la GnRH espacées de six semaines pour supprimer la production hormonale. 32 rats mâles sont utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger pour 8 d'entre eux et modéré pour 24, tous tués pour prélèvement d'organes. L'enjeu déclaré est de montrer qu'une molécule développée par l'équipe restaure la spermatogenèse et la fertilité dans une maladie qui touche un homme sur 5 000 et impose aujourd'hui cinq injections par semaine pendant six à vingt-quatre mois. Les 24 mâles traités sont ensuite mis à l'accouplement avec des femelles que le résumé ne compte pas dans ses effectifs, sans que la descendance obtenue soit davantage chiffrée.
Objectifs
L'hypogonadisme hypogonadotrope est une maladie qui touche 1 individu sur 5000. Les hommes qui en sont atteints ont des taux circulants d'hormone lutéinisante (LH) et d'hormone folliculo-stimulante (FSH) très bas. La conséquence directe de cette perturbation hormonale est, entre autre, une spermatogenèse altérée : ces hommes sont infertiles. Lorsqu'ils souhaitent avoir un enfant, ils sont traités par des hormones de substitution pendant environ 6 à 24 mois. Ces traitements sont longs et fastidieux car ils nécessitent 5 injections par semaine pendant toute la durée du traitement. Nous avons développé une molécule capable de traiter l'hypogonadisme avec une meilleure efficacité, ce qui réduit considérablement la durée du traitement. Nous voudrions dans cette expérimentation démontrer que les mâles traités avec notre molécule ont récupéré une spermatogénèse normale quantitativement et qualitativement, restaurant une fertilité normale qui leur permet d'avoir une descendance, et que cette descendance est normalement constituée et elle-même fertile.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : - valider l'efficacité de notre molécule dans un modèle d'hypogonadisme hypogonadotrope acquis, sur la restoration de la spermatogénèse. - valider l'innocuité de notre molécule sur la fonction de reproduction en générale : les animaux traités sont-ils capables de s'accoupler, et les spermatozoïdes produits avec notre molécule sont-ils fertiles ? La descendance ainsi obtenue est-elle elle-même fertile ?
Procédures
Injection sous-cutanée : 2 injections d'antagoniste du GnRH (gonadotropin-releasing hormone) espacées de 6 semaines, puis 1 injection par jour, 5 jours par semaine, pendant 8 semaines, soit 42 injections au total. Deux injections d'antagoniste du GnRH espacées de 6 semaines. La procédure dure environ 10 secondes au total entre la sortie de l'animal de sa cage et le retour dans la cage.
Impact sur les animaux
La nuisance sur les animaux sera liée aux injections journalières de produit : les injections en sous-cutanée peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection et les contentions peuvent engendrer du stress.
Devenir
Les 8 animaux contrôles (4+4) seront euthanasiés pour prélèvement des organes et analyse. Les 24 animaux traités pendant 8 semaines seront gardés pour être mis en accouplement. Suite à l'accouplement, les animaux traités seront euthanasiés pour prélèvements d'organes.
Remplacement
Nous avons démontré l'efficacité de notre molécule in vitro sur différents modèles cellulaires, et in vivo chez le rat. Nous avons mis au point ce modèle hypogonadisme chez le rat pour éviter d'hypophysectomiser les animaux. Etant donné la lourdeur d'une telle procédure pour les animaux et l’incertitude des résultats, nous nous sommes orientés vers des modèles moins invasifs et non douloureux pour l'animal.
Réduction
Nous avons estimé le nombre d'animaux au plus juste afin d'avoir une différence statistique.
Raffinement
Les conditions d'hébergement des animaux ne seront pas modifiées. Il y aura un enrichissement du milieu par ajout de copeaux (permet aux animaux de former des nids), et de jouets. Dans le but de réduire le stress des animaux, si les copeaux et jouets ne sont pas abimés ou souillés, ils ne seront pas remplacés durant le change hebdomadaire de litière. Afin de réduire au minimum les nuisances sur leur bien-être, les animaux seront observés par les manipulateurs et le personnel de l’animalerie au minimum une fois par jour. Cette évaluation de la santé et du comportement des animaux permettra de déceler toute souffrance liée aux injections ou au stress. Pour cela, un arbre décisionnel sera utilisé avec trois niveaux pour chacun des paramètres observés : signe absent, signe modérément présent, signe évident. Il inclura la posture, la consommation d’aliments et d’eau, les fluctuations de poids, l’état du pelage, le comportement de toilettage, le comportement social et des éléments d’expression faciale (contraction orbitaire, aplatissement du nez/des joues ou changements des oreilles). En cas d'atteinte des points limites pré-définis, l'expérimentation sur cet animal sera immédiatement interrompue. Afin de raffiner nos procédures, une récompense alimentaire de type morceau de pomme ou de carotte sera donnée aux animaux après chaque manipulation. Etant donné que les animaux seront deux par cage, un morceau sera mis à chaque extrémité de la cage afin d’éviter les conflits pour l’accès à cette nourriture. Lorsque l’animal est sorti de sa cage pour l’injection, un chiffon est posé sur sa tête. Cela apaise les animaux et réduit le stress pendant l’injection.
Choix des espèces
Nous avons mis au point ce modèle animal qui nous permet d'étudier l'impact de notre molécule. Etant donné que nous allons étudier l'impact de notre molécule dans le traitement de l'hypogonadisme hypogonadotrope de l'homme, nous allons traiter des rats mâles. Ces mâles seront ensuite mis en accouplement avec des femelles, qui elles, ne seront pas traitées. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte puisque nous allons traiter des mâles pour améliorer leur spermatogénèse et estimer leur capacité à se reproduire et engendrer une progéniture saine.
Elevage de rongeurs développant un modèle d’immunodéficience (2/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 3000
Expédiés vers d'autres établissements, utilisés sur place ou mis à mort au titre de la gestion de l'élevage, 904 000 rongeurs, dont 901 000 souris et 3 000 rats, sont élevés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Ces animaux naissent immunodéficients, donc sans défense contre les microorganismes, et sont maintenus derrière des barrières sanitaires pour que cette fragilité ne se déclare pas. Une partie subit une biopsie sur animal vigile pour génotypage, et des femelles gestantes peuvent être transportées avant le dernier tiers de la gestation. Le porteur écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée pour fixer ces effectifs, et renvoie au savoir-faire de l'établissement et à ses données historiques.
Objectifs
Dans le développement de la recherche pour traiter les maladies humaines, les modèles de souris dépourvues d’un système immunitaire, c’est-à-dire des éléments du sang permettant de lutter contre les infections et les tumeurs sont devenus de plus en plus nombreux. Ce sont des souris immunodéficientes, donc dépourvues d’un système de défense contre des éléments étrangers au corps de la souris. Grâce à un système immunitaire très faible, ces modèles de souris peuvent recevoir des morceaux d’organes, des morceaux de cancers, ou les éléments du sang d’autres espèces comme l’Homme sans que ces éléments étrangers soient attaqués et détruits par le système de défense de la souris. Le but de ce projet est d’élever ces modèles de souris immunodéficientes afin de pouvoir les utiliser dans des projets qui peuvent imiter toutes sortes de maladies humaines. Ces animaux pourront servir par exemple à comprendre comment certaines maladies fonctionnent, à chercher des nouveaux traitements contre le cancer. Ces animaux peuvent aussi servir à reconstituer dans le corps de la souris un système de défense contre les microbes (système immunitaire) provenant de l’Homme pour étudier des maladies touchant le système immunitaire humain, ou pour trouver des traitements utilisant ce système de défense humain. De nouvelles méthodes dans le domaine de la lutte contre le cancer utilisent justement le système de défense humain et lui apprennent à attaquer les cancers afin de les détruire. Cela peut donc être reconstitué dans le corps de la souris, avec un système immunitaire humain, et un cancer humain, avant d’être testé chez des personnes atteints de cancer. Ces animaux dépourvus de système de défense contre les éléments étrangers sont susceptibles de développer dans la nature des maladies, c’est pourquoi elles sont élevées dans des conditions particulières de propreté afin qu’elles ne soient pas malades. Les animaux issus de cet élevage pourront servir dans notre établissement à créer certains modèles, comme les modèles avec un système immunitaire humain, ou alors pourront être directement redirigés vers d‘autres centre de recherche qui pourront les utiliser dans le cadre de leurs recherches spécifiques, comme la recherche contre le cancer ou la recherche sur les maladies du système immunitaire humain. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux présentant des déficiences immunitaires à divers degrés et par des voies différentes provoquées par la délétion qualitativement ou quantitativement d'un ou plusieurs gènes. Certains modèles sont génétiquement modifiés afin de les rendre plus immunodéficients et de leur permettre de tolérer des tissus ou des cellules d’autres espèces, notamment humains. Ces modèles de souris et de rats permettent de reconstituer un système immunitaire humain, et permettent la greffe de tissus humains, comme des tissus tumoraux, au plus proche de la maladie humaine, et sont donc très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques dans le domaine de la cancérologie et de l’immunité.
Procédures
Les souris et les rats sont immunodéficients donc sans certaines cellules de l’immunité impliquées dans la défense de l’organisme contre les microorganismes extérieurs (pathogènes, opportunistes). Ces animaux sont maintenus dans des structures avec un niveau sanitaire élevé (SOPF signifiant sans une liste de pathogènes et d'opportunistes) afin de ne pas développer de phénotype dommageable. Pour certains animaux, une biopsie est réalisée sur animal vigile pour son génotypage. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, EU1 pour l'élevage et EU2 pour les prestations de sciences de la reproduction (accouplement, fécondation in vitro, et cryopréservation des gamètes).
Impact sur les animaux
Les animaux sont immunodéficients et sont donc particulièrement sensibles aux organismes extérieurs (microorganismes pathogènes, opportunistes) pouvant amener des infections et une dégradation de leur état.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur ou utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort (gestion de l'élevage).
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal. En effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de cancers ou de maladies auto-immunes ou de maladies infectieuses, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
L’hébergement est réalisé dans des conditions sanitaires élevées SOPF, c’est-à-dire exemptes d’organismes pathogènes ou opportunistes. Dans ces conditions, les animaux ne déclarent pas de pathologie liée à leur immunodéficience. Un hébergement standard est réalisé (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Pour des lignées particulièrement fragiles, un enrichissement complémentaire est mis en place (matériel de nidification supplémentaires) et les densités au sevrage peuvent être diminuées. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Une attention particulière est apportée aux barrières sanitaires et aux contrôles sanitaires permettant de garantir le statut sanitaire SOPF nécessaire au maintien en bonne santé de ces souches immunodéficientes. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris et des rats sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Neuroprotection dans le syndrome de déficit en GLUT1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Implantés d'électrodes d'électroencéphalogramme dès l'âge de 14 jours, puis porteurs de mini-pompes osmotiques remplacées chaque mois, 200 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes. S'y ajoutent trois ponctions lombaires, trois examens par résonance magnétique sous anesthésie et un test de dépression associé à une restriction alimentaire. Il s'agit de tester des esters de cétones et du lactate comme substituts au régime cétogène chez un modèle de déficit en GLUT1, maladie rare dont un quart des patients ne répond pas à ce régime. Le porteur retient le rat plutôt que la souris parce que le modèle murin ne fait pas de crises d'épilepsie et parce que l'imagerie par résonance magnétique gagne en résolution sur un animal plus gros.
Objectifs
La diffusion du glucose à travers les barrières tissulaires est facilitée par une famille de protéines dont le transporteur de glucose de type 1 (GLUT1). Le syndrome de déficience en GLUT1 est un syndrome de défaillance énergétique cérébrale causée par une altération du transport du glucose à travers les barrières du tissu cérébral. Cette maladie rare est caractérisée par une épilepsie pédiatrique résistante aux traitements, un retard de développement et des troubles moteurs complexes. Les patients sont traités efficacement avec des thérapies diététiques cétogènes (régime riche en graisses) qui fournissent un carburant supplémentaire, à savoir des corps cétoniques (composés produits par le foie lors de la dégradation des acides gras), pour le métabolisme énergétique du cerveau. Cette thérapie est inefficace pour 1/4 des patients. Le projet vise à tester l'efficacité de l'apport de nouvelles sources énergétiques : des esters de cétones (permettant une cétose (brulûage des graisses pour produire de l'énergie) thérapeutique plus rapide que le régime cétogène) et le lactate, sur un modèle de rat génétiquement réprimé pour GLUT1.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une neuroprotection de l'administration des esters de cétones ou du lactate, permettant de s'affranchir du régime cétogène. En effet, ce régime contraignant est souvent mal vécu par les patients. Si ces stratégies s'avèrent neuroprotectrice et peuvent remplacer ce régime, des études plus approfondies pourraient permettre la mise en place d'un protocole d'administration d'esters de cétones ou de lactate, améliorant la qualité de vie de ces patients.
Procédures
Les animaux subiront les interventions suivantes : - biopsie de la queue pour génotypage : 1 fois, 5 min - mise en place du système d'enregistrement EEG, sous anesthésie gazeuse : procédure chirurgicale , réalisée 1 fois, durée 20 min - implantation des mini-pompes osmotiques permettant de délivrer le lactate, sous anesthésie gazeuse : procédure chirurgicale, réalisée 1 fois par mois, 10 min. - injection intrapéritonéale : 2 fois, quelques secondes - ponction lombaire : prélèvement sur animaux anesthésiés , réalisés 3 fois, durée 10 min - prélèvements pour dosages biologiques : 4 fois, quelques secondes - examens par résonance magnétique nucléaire : examen non-invasif sous anesthésie gazeuse , réalisé 3 fois, durée : 45 min. gavage pré-IRM, réalisé 2 fois, durée 30 sec. La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements moteurs (1 fois, 10 min), de réflexes (3 fois, 5 min) et de mémoire (1 fois, 5 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (1 fois, test sur 4 jours).
Impact sur les animaux
La biopsie de la queue réalisée pour le génotypage entraînera une douleur légère de courte durée. L'implantation des mini-pompes osmotiques pourra entraîner une douleur modérée. Les prélèvements pour les mesures biologiques pourraient entraîner une nuisance légère. Les anesthésies (pose EEG et examens IRM) pourraient induire une détresse cardio-respiratoire, mesurée grâce à un capteur placé sous l'animal, du fait de la variabilité de la sensibilité aux anesthésiques. Une anesthésie prolongée pourrait mener à la déshydratation de l'animal. Suite à l'opération, la plaie suturée pourrait s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser (risque faible). Les différents tests comportementaux pourraient induire stress et anxiété pour les animaux. Lors du test de comportement de dépression, la nécessité d'une restriction alimentaire pourrait entraîner une perte de poids et être une situation angoissante pour les animaux (nuisance modérée).
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem (n = 200)
Remplacement
Des modèles cellulaires de déficit en GLUT1 existent, cependant, ces modèles s'affranchissent de la (patho)physiologie de l'organisme entier. Le but final de ce projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, ce projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de pouvoir envisager une application rapide chez l'Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle.
Réduction
Une réduction des animaux est rendue possible par le fait que l'imagerie par résonance magnétique est une technique d'investigation non-invasive qui permet un suivi des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les différences intergroupes seront mises en évidence par des tests statistiques.
Raffinement
Au niveau de l'hébergement, les animaux seront acclimatés à leur arrivée et seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Les chirurgies (implantation des pompes osmotiques, pour le groupe traité avec du lactate et mise en place des systèmes d'enregistrement d'électroencéphalogramme, ponction lombaire) seront réalisées sous anesthésie avec une antalgie adaptée. Les règles d’asepsie seront respectées. Une surveillance accrue, des soins post-opératoires et des mesures de gestion de la douleur seront réalisés. Une évaluation objectivée de l’état des animaux avec l’utilisation de grille d’évaluation/fiche de suivi, suivie de soins en cas de détection de souffrance seront mis en place. Pour les imageries par résonance magnétique sous anesthésie, un monitoring de la respiration sera mené afin de prévenir tout arrêt cardiorespiratoire. Tout au long de l’étude, les points limites adaptés et gradés seront appliqués, avec si nécessaire une prise de décision de mise à mort.
Choix des espèces
Il existe un modèle du syndrome de déficit en GLUT1 chez la souris mais ce modèle en présente pas de crises d'épilepsie. De plus, l'imagerie par résonance magnétique est une technique non-invasive mais qui présente une faible sensibilité : plus les modèles sont gros et meilleure est sa résolution. Le rat est donc un modèle plus approprié que la souris. Les animaux seront utilisés de 14 jours de vie à 125 jours. Les dispositifs d'enregistrement d'électroencéphalogramme seront implantés à 14 jours de vie afin de pouvoir monitorer dès le sevrage les effets des différents traitements. Les animaux seront suivis jusqu'à 125 jours pour mesurer les effets des différents traitements sur le court et le long terme afin d'optimiser le pouvoir translationnel du projet.
Elevage avec identification et génotypage invasifs
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 1000
Produits sur place, dans une trentaine de lignées de souris et une lignée de rat, 20 000 souris et 1 000 rats âgés de 7 à 21 jours vont être identifiés et génotypés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque nouveau-né reçoit un tatouage digital ou une puce sous-cutanée, puis l'extrémité de sa queue est amputée, sans anesthésie ni analgésie locale, le porteur indiquant qu'un produit appliqué au bout de la queue serait léché par la mère. Hémorragie, rejet du nouveau-né par la mère et modification du comportement liée à la douleur figurent parmi les effets indésirables reconnus, présentés comme très rares. Les animaux au génotype recherché partent en expérimentation ou en reproduction, les autres sont réorientés vers d'autres projets ou vers la formation, et ceux qui ne trouvent aucun emploi sont tués.
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de génotyper l'ensemble des animaux génétiquement altérés produits dans notre Etablissement Utilisateur, le génotypage permettant d'identifier les animaux porteurs d'une modification génétique d'intérêt. Il s’agit d’un double geste technique invasif qui consiste en un tatouage digital ou en l’implantation d’une puce d’identification, suivi d’une biopsie de queue réalisé sur animal âgé de 7 à 21 jours. Cette demande d’identification et de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres demandes d'autorisation de projet) - sélectionner les animaux d'entretien des colonies - sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences, les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo. Cette demande couvre environ une trentaine de lignées de souris et une lignée de rat.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure d’identification et de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt, à la fois pour l'élevage, la formation, le maintien des compétences, les prélèvements d'organes ou de tissus pour études ex vivo. L’identification par tatouage/pucage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; - d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Les animaux identifiés et génotypés sont soumis 1) à l'implantation en sous-cutané d'une puce ou en un tatouage digital ) 2) à une bisopsie du bout de la queue. L'implantattion d'une puce est réalisée une seule fois et le geste dure une dizaine de seconde. Le tatouage est réalisé une seule fois et la contention dure de 30sec à 1 min. La bisopsie de queue est réalisée une unique fois et dure 5sec.
Impact sur les animaux
le tatouage ou l'implantation d'une puce d'identification et la biopsie de queue peuvent entraîner une légère douleur. La contention de l'animal durant ces gestes peut être source de stress. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : hémorragie, rejet du nouveau-né par la mère, modification du comportement liée à la douleur.
Devenir
Les animaux ayant un génotype d'intérêt partirons en expérimentation ou seront utilisés pour perpétrer l'élevage. Les animaux dont le génotype n'a pas d'intérêt scientifique seront utilisés dès que possible dans d'autres projets ou pour formation. Les animaux ne pouvant être utilisés dans les projets, les formations ou l'élevage seront euthanasiés.
Remplacement
A ce jour, les prélèvements non invasifs à base de salive ou de poils ne permettent pas de procéder à l'identification d'animaux génétiquement modifiés de façon fiable. Un doute sur les résultats conduirait à la nécessité de procéder à nouveau à des prélèvements. Une erreur se traduirait par la mise en accouplement d’animaux n’ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : une augmentation du nombre d’animaux produits inutilement ; la naissance d’animaux non viables ; l’utilisation d’animaux génétiquement sans intérêt dans des projets expérimentaux induisant des résultats erronés et non exploitables (si l’erreur n’est pas détectée précocement). Il est donc indispensable de recourir à une méthode fiable. Or il n’existe pas actuellement de méthodes non invasives aussi performantes que les tatouages/puçage et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’Etablissement et l'équipe de zootechnie établissent les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’Etablissement. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel approprié permettant un geste rapide et précis dans le respect des conditions d’asepsie établies dans l’Etablissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Sur nouveau-nés pas de médication envisagée car tout anesthésique local serait difficilement applicable au bout de la queue et serait ensuite léché par la mère, ce qui engendrerait des effets indésirables. Dans la balance bénéfice risque, ce sont les gestes maitrisés et les instruments appropriés qui sont garant du raffinement de la procédure pour limiter toute douleur, souffrance et stress. Des points d'attention précis (points limites gradés) et des mesures conservatoires adéquates sont établis en cas notamment de saignement, rejet de la mère ou perte d'appétit. Si les actions misent en place n'ont pas les résultats escomptés, l'équipe de zootechnie prends la décision sans délai de mise à mort d'un animal. Les animaux sont hébergés dans une animalerie agréée avec eau et nourriture ad libitum, dans des conditions de température et d'hygrométrie contrôlées, avec un cycle jour/nuit de 12h. Ils sont hébergés en groupe sociaux avec un enrichissement adapté pour reproduire les comportements naturels (tunnel/dômes pour se refugier, pelote de bois pour la nidification, bâtons à ronger) et leur bien-être est évalué quotidiennement par des personnels formés et compétents.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est le modèle rongeur. La souris et le rat représentent une espèce de référence pour l’étude du système nerveux central chez les vertébrés supérieurs. L’organisation du système nerveux du rongeur permet une extrapolation raisonnable des résultats obtenus à l’espèce humaine. Par ailleurs, les rongeurs peuvent être manipulés génétiquement, fournissant des outils essentiels à la compréhension des mécanismes neurobiologiques et des mécanismes neuronaux impliqués dans de nombreuses maladies et déficits cognitifs. Grâce aux modèles transgéniques, il est aussi possible de relier les données de la génétique humaine des maladies à l'altération de molécules/récepteurs spécifiques dont la fonction peut être analysée avec des modèles précliniques de ces maladies. Les rongeurs sont donc des animaux sur lesquels les évaluations comportementales dans le domaine des neurosciences sont faciles à conduire et maitrisées au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille dont l'élevage est facilement réalisable et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l'animalerie de l'unité. Pour la plus grande majorité des lignées, les animaux sont identifiés et génotypés entre 7 et 21 jours, âge où les gestes sont réalisés plus facilement et plus rapidement car la contention est plus facile. La biopsie est également plus aisée à cet âge et moins douloureuse car le cartilage n'est pas encore complètement formé. A cet âge : - les animaux sont aisément manipulables ; - le cartilage est souple ; - les groupes sociaux constitués sont stables. Toutefois, certains animaux peuvent être identifiés et génotypés précocement si les projets expérimentaux auxquels ils sont destinés l’exigent. Nous éviterons autant que possible l’identification et le génotypage d’animaux adultes avec ces méthodes.
Rôle de la protéine PAM dans un modèle murin de choc septique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une échographie cardiaque toutes les trente minutes, pendant quatre à seize heures d'anesthésie générale ininterrompue : 144 rats vont être utilisés, 72 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 72 sous anesthésie sans réveil. Soixante-douze d'entre eux subissent une chirurgie destinée à provoquer une infection abdominale qui les fait basculer en choc septique après seize heures, avec baisse de la mobilité et des interactions sociales. Tous sont tués pour prélever cerveau, cœur, poumons, reins, foie, rate et peau, le projet cherchant à savoir si une protéine protège les vaisseaux sanguins, avec une étude humaine qui "pourrait être débutée dans les 5 ans". Le rat a été retenu parce que ses vaisseaux et son cœur sont plus gros que ceux de la souris, ce qui facilite la pose des cathéters et l'échographie.
Objectifs
En cas d’infection, certains patients présentent une inflammation excessive qui met en jeu leur pronostic vital. Quand les systèmes de régulation physiologique sont débordés, on dit que le patient est en choc septique. Il s’agit d’une infection sévère qui nécessite le transfert des patients en réanimation. C’est une pathologie grave avec une mortalité élevée. Le choc septique est marqué par une hypotension sévère liée à une dysfonction des vaisseaux sanguins qui deviennent trop dilatés et laissent fuir une partie du contenu des vaisseaux. Les patients présentent également une atteinte du cœur qui se contracte trop faiblement. Ces 2 processus entrainent une baisse majeure de l’apport de sang aux organes. Les organes ne reçoivent alors plus assez d’oxygène. Cela entraine un état de défaillance de l’ensemble des organes induisant le décès du patient. Les médicaments actuellement utilisés (antibiotiques, médicament pour augmenter la tension artérielle) ne jouent pas sur l’atteinte des vaisseaux sanguins. Notre équipe étudie le rôle d’une protéine qui joue un rôle dans le maintien de la stabilité des vaisseaux. L’objectif de ce projet est de savoir si cette protéine permet de diminuer l’atteinte des vaisseaux dans un modèle de choc septique chez le rat. Nous voulons déterminer si la supplémentation en cette protéine protègerait de l’inflammation, puis nous évaluerons si cette protéine peut servir comme traitement dans le choc septique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux définir le rôle de la protéine d’intérêt dans le choc septique et potentiellement être utilisée comme un nouveau médicament dans l’infection grave. Une étude chez l’Homme pourrait être débutée dans les 5 ans.
Procédures
144 animaux auront 1 chirurgies sous anesthésie générale. 72 une chirurgie pour provoquer une infection et 72 une chirurgie contrôle. 144 animaux auront la mise en place de 2 cathéters en regard du cou, réalisé sous anesthésie générale. 144 animaux auront des échographies cardiaques toutes les 30 minutes pendant la durée de l’étude (4 heures ou 16h), l’animal est laissé durant toute cette période sous anesthésie générale. 144 animaux auront des prélèvements sanguins répété, via l’un des cathéter mis dans le cou, les prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale, sans nécessité de ponction spécifique. 144 animaux auront des prises de pressions artérielle, celle-ci est mesurée en continu via l’un des cathéters du cou, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
L’injection intrapéritonéale, par une aiguille fine dans le ventre de l’animal (anesthésie et analgésie) entrainent une douleur légère. Par ailleurs, l’anesthésie générale provoque un état confusionnel durant environ 2h. La chirurgie réalisée pour entrainer l’infection est responsable, à court terme de douleur en regard de la cicatrice et à moyen terme d’une infection responsable d’une diminution de la mobilité et une diminution des interactions sociales. Pendant les 16 premières heures, l’animal présente des signes d’infections non sévère puis après 16 h, il rentre dans un état de choc septique avec une infection grave, avec notamment une diminution de la contraction du cœur.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures, la mises à mort suivie est de prélèvements d’organes (cerveaux, cœur, poumons, reins, foie, rate, peau) necessaire pour des analyses ultérieures
Remplacement
L’infection et ses conséquences sont des phénomènes complexes résultants de l’interaction de différents types cellulaires soumis à de multiples interactions encore partiellement connues. L’approche in vitro ne permet pas de rendre compte de façon fiable de ces différentes interactions entre les organes. Le modèle utilisé sera celui le plus validé à l’heure actuelle pour l’étude du sepsis. Il permet d’étudier de façon optimale la réponse de l’organisme à l’infection.
Réduction
Les procédures d’exploration physiologiques permettent un suivi longitudinal, sur la durée, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux utilisé et augmente la puissance statistique. Le calcul du nombre d'animaux par groupe prend en compte la variabilité inter individuelle des animaux par rapport à la sévérité de l’infection et la dysfonction du cœur. Cette variabilité a été diminuée par la standardisation de la chirurgie entrainant l’infection via l’utilisation d’outil calibré permettant une chirurgie reproductible. Cela diminue le nombre d’animaux qui ne sont pas inclus dans l’étude, car il ne présente pas de signe d’infection. En post mortem, l’ensemble des organes sont prélevé et pourront être utilisé pour des recherches futur
Raffinement
45 minutes avant la chirurgie, L’animal est traité par un analgésique puissant. L‘ensemble des manipulations invasives sont réalisées sous anesthésie générale. L’analgésie est balancée avec l’utilisation d’anesthésique local en fin de procédure. Durant l’anesthésie, les animaux sont placés sur une table chauffante. En post-opératoire, les animaux sont réchauffés et réhydratés. Après leur réveil, les animaux sont replacés en cage individuelle, avec accès libre à l’eau et à la nourriture. La douleur est surveillée et si besoin l’analgésie sera renforcée. Des points limite seront surveillé, notamment durant le monitorage de l’animal, si la pression artérielle est trop basse, l’animal sera euthanasié avant d’atteindre une phase agonique. Cela permettra notamment de récupérer les organes de l’animal et ainsi pouvoir exploiter les résultats, nous diminuons ainsi le nombre d’animaux utilisé Des points limites ont été établis
Choix des espèces
L’étude de la pression artérielle et de la fonction cardiaque est plus aisée chez le rat que la souris. La mise en place des cathéters artériels et veineux est plus facile (taille des vaisseaux supérieur) chez le rat et l’échographie cardiaque est plus facile (taille du cœur supérieur). Nous utiliserons une souche de rat non consanguine permettant de plus facilement généraliser les résultats. Des rats mâles de 10-12 semaines, pesant entre 300 à 500g seront utilisés. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Humain
Modèle expérimental d’alopécie chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rats : 2640
Tués à l'issue pour prélever la peau et le sang en quantité incompatible avec la survie, 2 640 souris et 2 640 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après épilation du dos, chaque animal reçoit une injection par jour pendant cinq semaines, les mâles en recevant deux de plus par semaine, avant une ponction de sang intracardiaque sous anesthésie. Irritation de la zone épilée, dermatite et perte de poids figurent parmi les effets attendus, et le porteur écrit pourtant qu'à sa connaissance ce modèle ne provoque pas de souffrance chez les rongeurs, raison pour laquelle aucun analgésique n'est prévu. Les substances testées appartiennent à des clients de l'établissement, qui réclament des données in vivo pour justifier des essais cliniques chez l'être humain.
Objectifs
L’objectif de cette étude sera de tester plusieurs substances et traitements de nos clients contre l’alopécie de ainsi que des médicaments de références sur un modèle de régénération capillaire, à la suite d’une épilation chez le rongeur. Aujourd’hui, les facteurs qui participent à la perte de cheveux n’ont pas été entièrement identifiés et les traitements cliniques utilisés actuellement ne sont pas efficaces pour tous les types de perte de cheveux. Pour cette raison, la recherche préclinique en dermatologie est très active afin d’identifier de nouveaux produits naturels (extraits de plantes) ou synthétiques capables d’améliorer l’alopécie.
Bénéfices attendus
Le but de notre étude est de quantifier l’effet d'un traitement chronique avec des candidats médicaments sur la régénération capillaire des rongeurs. Le but ultime est donc d'identifier les candidats médicaments les plus prometteurs, qui seront ensuite testés chez le patient dans les différentes phases cliniques. Cela permettra de trouver de nouveaux médicaments plus satisfaisants pour soigner les patients touchés par l’alopécie.
Procédures
Les animaux seront sujets aux interventions suivantes : a) Uniquement pour les mâles : 2 injections/semaine pendant 5 semaines ; durée de l’injection 30 secondes b) Pour mâles et femelles : 1 injection/jour, tous les jours pendant 5 semaines ; durée de l’injection 30 secondes. c) Pour mâles et femelles: prélèvement de sang en intracardiaque sur animal anesthésié; 1 seule fois juste avant l'euthanasie. Durée 1 minute.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter : une pilo-érection, une perte de poids plus ou moins importante, une irritation plus ou moins importante sur la zone épilée, une dermatite. Les animaux seront un peu stressés pendant les administrations des candidats médicaments, qui dureront en moyenne 30 secondes par animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale. En effet, pour nos études il est nécessaire d'euthanasier les animaux pour effectuer des prélèvements de peau et de sang en quantité importante, incompatible avec la survie.
Remplacement
Pour les études sur l’alopécie, il est possible d’utiliser des cultures cellulaires spécifiques, par exemple les cellules papillaires dermiques de cheveux humains. Bien que ces modèles soient utiles pour étudier le mécanisme d’action d’un candidat médicament et donner une première confirmation d’un possible effet d’amélioration de l’alopécie, il sera ensuite nécessaire de tester le produit chez l’animal, afin de déterminer un effet dose-réponse et aussi tester les excipients, différents pour chaque voie d’administration (exemple voie topique ou orale). De plus, les tests in vivo sont absolument nécessaires afin de déterminer la vitesse de croissance des poils à la suite des traitements médicamenteux. Pour cette raison les études chez le rongeur sont assez longues (4-5 semaines). Nous avons déjà été réalisé en amont des études de cultures cellulaires. Nos clients souhaitent maintenant effectuer des études in vivo sur rongeur. Si les résultats obtenus s’avèrent positifs, cela leur permettra de justifier des essais cliniques chez les humains.
Réduction
Le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental sera au maximum de 12, étant donné la variabilité interindividuelle. Le nombre de lots est déterminé en fonction du nombre des doses à tester pour chaque molécule. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux seront comparés entre eux en utilisant le test statistique le plus approprié.
Raffinement
Chaque espèce aura sa propre pièce d’hébergement. Les animaux seront hébergés 3 à 6 par cage afin de pouvoir interagir et entretenir des liens sociaux avec leurs congénères, tout en gardant un espace suffisant. Trois différents types d’enrichissement seront intégrés dans les cages d'hébergement. Les responsables de l'application des procédures, de la manipulation et du bien-être des animaux, est une technicienne en recherche et développement expérimentée et formée pour reconnaitre tout signes éventuels de stress, douleurs et inconfort. Elle pèsera et observera les animaux tous les jours (du lundi au dimanche), pour déceler les mauvais signes cliniques et remplira quotidiennement une fiche de suivi par animal. La zootechnicienne, en charge de la surveillance et du change des animaux, observeras également les animaux une fois par jour (du lundi au vendredi) et s'assurera que tous les animaux disposent assez d'aliment et d'eau de boisson. Les animaux, pendant l’anesthésie, seront toujours disposés sur un tapis chauffant. A notre connaissance, ce modèle expérimental ne provoque pas de souffrance chez le rongeur, donc nous n’avons pas prévu d’utiliser des analgésiques pendant l’expérimentation. En accord avec le vétérinaire responsable, un scoring des signes cliniques sera mis en place afin de suivre l’état de santé des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques de souffrance seront euthanasiés, en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont utilisés très fréquemment dans les études sur l’alopécie. Cela est justifié par la croissance rapide des poils des rongeurs et par la facilité à quantifier la quantité de poil poussé sur le dos après rasage, en particulier pour les souris à poil noir ou marron. Les souris seront âgées de 7 semaines car à ce stade de développement, la plus grande partie des poils est synchronisé dans la phase telogène. Donc, en rasant les poils à ce stade, on réduit la variabilité inter-individuelle du cycle de croissance des poils.
Enseignements pratiques de physiologie animale et de pharmacologie : apprentissage des savoir-faire en expérimentation animale
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 85
Pour illustrer des cours de physiologie et de pharmacologie devant des étudiants de licence, 265 souris et 85 rats sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Les rats reçoivent la pose de cathéters, des injections et un prélèvement de sang par la carotide, les souris étant utilisées pour l'initiation aux injections intrapéritonéales et sous-cutanées. Aucun calcul statistique ne justifie ces effectifs, fixés pour former 175 étudiants par an. Le principal risque décrit tient au dosage de l'anesthésique, un réveil prématuré en pleine séance ou au contraire un arrêt cardio-respiratoire, et le porteur admet qu'il arrive qu'un animal meure pendant une séance.
Objectifs
L’objectif est principalement d’inculquer aux étudiants des notions d’expérimentation animale requises dès la troisième année de licence de biologie et d’autre part d’illustrer les cours théoriques de physiologie animale et de pharmacologie par des applications techniques concrètes réalisées sur le rat et la souris.
Bénéfices attendus
Acquisition des techniques de base d’expérimentation animale sur animal vigil (préhension, contention et techniques d’injections les plus courantes) et sur animal anesthésié (pose de cathéters, prélèvement carotidien).
Procédures
Après une analgésie préopératoire, les rats seront anesthésiés dès leur entrée dans la salle de TP, puis pose de cathéters, injections et prélèvement unique de sang par le cathéter carotidien. Chez les souris après analgésie/anesthésie, initiation aux techniques d’injections intra¬péritonéale et sous-cutanée. La nuisance principale est un réveil prématuré de l’animal lors de la séance d’expérimentation ou au contraire une surcharge anesthésique induisant un arrêt cardio-respiratoire de l’animal. Selon les cas, l’enseignant réajuste la dose d’anesthésique.
Impact sur les animaux
Le stress à la contention est minimisé par l'apprentissage de la réglementation et de l'éthique lors d'une séance de présentation en cours magistral et d'une démonstration préalable par l'enseignant. Un apprentissage sur un modèle d'imitation (maquette inerte conçu avec un matériau qui confère la sensibilité spécifique d'un animal vivant) permet d'acquérir les compétences nécessaires pour manipuler et réaliser les gestes de routine d'expérimentation (injection et pose de cathéter), réalisé par la suite sur un animal vivant. Cet entrainement dans une séance qui précède la séance d'expérimentation sur l'animale vivant permet de réduire le stress de l'étudiant et chez l'animal. L'effet indésirable, bien que rare, est l'arrêt cardio-respiratoire de l'animal sous anesthésie. Une réanimation est donc réalisée par l'enseignant avec un contrôle du débit d'anesthésiant, mais il arrive qu'un animal meurt pendant une séance d'expérimentation.
Devenir
Procédures sans réveil, compte tenu des manipulations expérimentales et des injections réalisées par les étudiants, les animaux ne peuvent pas être réutilisés. Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure par l’enseignant.
Remplacement
Afin d’acquérir les compétences techniques d’expérimentation animale (contention et techniques chirurgicales) , les étudiants s’entraineront sur des modèles de rats en plastique. Cette initiation leur permettra de se familiariser avec les structures anatomiques et les gestes techniques sans avoir recours à l'animal.
Réduction
Le nombre d'animaux choisi est le nombre minimal permettant d'acquérir les techniques de base en expérimentation animale afin de sensibiliser et former nos étudiants, qui pour la majorité d’entre eux sont destinés à poursuivre leur carrière dans le domaine de la recherche en laboratoire sur le vivant. La première approche est réalisée sur une maquette dans le but d’une acquisition des compétences techniques requises avant leur réalisation sur animal vivant dans la demi-journée qui suit. Cette étape permet de réduire le nombre total d’animaux pour cette formation. Aucune statistique n’est requise pour l’ensemble des procédures proposées. Au bilan, nous utilisons 85 rats et 265 souris pour la formation de 175 étudiants par an.
Raffinement
Pour l’ensemble des procédures, les animaux sont anesthésiés afin d’empêcher toute douleur ou souffrance de l’animal en fonction des gestes réalisés et jusqu’à leur mise à mort à la fin de l’expérimentation. Pour la première séance d’expérimentation sur le rat, l’initiation au préalable sur des modèles plastiques permet de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux anesthésiés/analgésiés. En cas d'atteinte des points limites lors des expérimentations, les animaux en question sont mis à mort par l'enseignant.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les modèles animaux les plus utilisés en recherche et le choix d’animaux jeunes adultes permet une manipulation plus aisée et un meilleur contrôle de l’anesthésie.
Etude de performance chez le rat d’un nouveau traitement de reminéralisation dentaire en développement
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Gavées au bisphénol A pendant les 21 jours de gestation puis les 21 jours d'allaitement, des rates transmettent à leur descendance une hypominéralisation de l'émail dentaire, et leurs petits sont gavés à leur tour pendant neuf jours. 234 rats vont être utilisés, 34 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 200 un niveau léger, tous tués pour récupérer leurs dents. Un vernis est appliqué au pinceau sur les dents sous quinze minutes d'anesthésie, une seule fois, puis deux séances d'imagerie aux rayons X vérifient la reminéralisation, l'objectif étant de comparer un nouveau produit fluoré et sa version sans fluor à trois produits déjà commercialisés. Le porteur qualifie de légères les nuisances attendues et écrit que l'administration de bisphénol A "ne devrait pas engendrer des effets secondaires au regard de la concentration administrée", alors que c'est précisément elle qui abîme l'émail des animaux.
Objectifs
Les hypominéralisations de l’émail dentaire, observées au cours du développement telles que l'hypominéralisation molaires incisives, touchent aujourd’hui près d’un enfant sur cinq en France et à travers le monde. Elles engendrent des défauts inesthétiques, des douleurs impactant la vie quotidienne et les actes de soins particuliers. Elles sont associées à un risque accru de caries, conduisant à termes à la perte des dents. Une prise en charge adéquate dès le diagnostic posé s’impose et doit être suivie tout au long de la vie, engendrant des coûts personnels et sociétaux colossaux au regard du nombre de personnes touchées et de la nécessité d'un traitement sur des décennies. L’objectif de ce projet est d’évaluer la performance de reminéralisation de l’émail d’un nouveau produit fluoré ainsi que d’une autre formulation de ce même produit sans fluor. Puis de comparer leur performance avec celle d’autres produits déjà disponibles sur le marché. Pour cela, nous disposons d’un modèle de rat présentant des hypominéralisations de l‘émail dès la naissance après exposition chronique, dès la conception, au bisphénol A à des doses environnementales. Ces rats seront traités soit par le nouveau produit en développement, soit par un des trois produits déjà mis sur le marché. Il n’y a, à ce jour, aucune preuve scientifique d’éfficacité de ces produits sur le traitement et la prévention de ces lésions, d’où l’interêt de développer un nouveau produit permettant la prise en charge de cette pathologie. Ce projet permettra donc de proposer de nouvelles stratégies de reminéralisation des tissus dentaires fortement attendues par les patients et les dentistes, et plus généralement les enfants dans le cadre préventif des caries. Ce projet permettra également d’accroitre les connaissances sur 1/ l'étiologie et les caractéristiques des hypominéralisations de l’émail, 2/ les mécanismes chimiques de reminéralisation et 3/l’approche thérapeutique pour une meilleure prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
Avec une prévalence française et mondiale moyenne des hypominéralisations développementales acquises (regroupées sous le terme de molaire incisive hypominéralisation) de 15%, soit près d’un enfant sur 5 atteint dans le monde, l‘enjeu est colossal. En effet, cette pathologie dentaire très répandue ayant des conséquences négatives dans la vie des patients : défauts esthétiques, douleurs, caries. Ces patients, jeunes au moment du diagnostic, requièrent des traitements et suivis tout au long de leur vie, engendrant des coûts économiques et sociaux importants. Mettre au point une solution de prévention ou, à défaut, un traitement clinique innovant permettrait de soigner des millions d’enfants à travers le monde et limiter les impacts négatifs de cette pathologie. Notre étude permettra d’apporter des preuves pré-cliniques démontrant que la démarche thérapeutique proposée permet une reminéralisation de l’émail dentaire plus efficace qu’avec les produits actuellement disponibles. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucune preuve pré-clinique ou clinique de l’efficacité des traitements dentaires déjà commercialisés sur la reminéralisation de l’émail des patients atteints de molaire incisive hypominéralisation.
Procédures
Les animaux seront soumis au gavage d'une solution de bisphénol A, ainsi qu'à l'application à l'aide d'un pinceau fin de vernis dentaire sous anesthésie pendant 15 minutes. Le gavage se deroulera chez la mère gestante pendant toute la durée de la gestation et du sevrage (21 jours + 21 jours, soit 42 jours), puis chez la descendance pendant 9 jours. Une seule application de 30 secondes des produits sera administrée, sur la surface des dents de la progéniture. Ils seront également anesthésiés pendant 15 minutes deux fois afin d'effectuer l'analyse imagerie aux rayons X et de contrôler la reminéralisation in vivo.
Impact sur les animaux
Les animaux seront gavés tous les jours par des expérimentateurs ayant l’habitude de ce geste qui reste néanmoins une source de stress. Dans la deuxième partie de l’expérience, les dents des rats (molaires et incisives) sont traitées par l’application au pinceau fin de produits d’intérêt nécessitant d'anesthésier les animaux. Les nuisances attendues principalement liées à l’anesthésie et à la contention sont légères. Une hypothermie pendant l’anesthésie peut avoir lieu. Les seuls actes invasifs pratiqués sont le gavage et les injections d’anesthésique (l’application du produit étant réalisée sous anesthésie), ainsi que l’administration orale de bisphénol A, qui ne devrait pas engendrer des effets secondaires au regard de la concentration administrée.
Devenir
Les animaux de tous les lots d'études seront mis à mort afin de pouvoir récupérer et caractériser leur dents.
Remplacement
Concernant les recherches sur les dents, et sur l’émail dentaire en particulier, les modèles d’investigation in vitro ne sont pas satisfaisants actuellement car ils ne reproduisent pas la physiologie de la dent. En effet, des techniques in vitro de déminéralisation de l’émail existent, avec des cycles de pH, mais elles restent insuffisantes car elles ne permettent pas d’obtenir un émail déminéralisé comme en clinique. Seule la surface de l’émail est déminéralisée, ce qui reste très insuffisant pour mettre en place un traitement de réparation ou même de prévention. En effet, les lésions de type "molaire incisive hypominéralisation" sur dents extraites humaines sont difficilement accessibles car elles sont souvent trop sévères et très souvent associées à des caries profondes lors d'une extraction dentaire. L’utilisation du modèle de rat présenté ici permettra d’évaluer l’efficacité et l’utilisation du nouveau traitement dentaire dans des conditions se rapprochant de celles en clinique chez l’homme.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre nécessaire d’animaux dans cette étude, chaque échantillon collecté sera analysé par un maximum d‘approches techniques selon une séquence définie : les analyses non destructrices d'abord (µ-CT, fluorescence), puis les observations microscopiques et analyses chimiques in situ, puis nano- et micro-dureté. Les techniques nécessitant la destruction des échantillons (dosages quantitatifs des éléments ou analyses histologiques post-déminéralisation) seront effectuées en dernier. Le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'avoir un test statistique significatif est de 6 par groupe, mais le nombre d'animaux prévu est de 10 par lot d’étude et par sexe, afin de parer à de petites portées deséquilibrées et de conserver néanmoins une puissance statistique en cas de perte inopinée d’animaux. Des analyses statistiques seront conduites sur l’ensemble des résultats obtenus dans cette étude avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Pendant toute la durée de l'étude, l'application des points limites stristes et spéciphiques au projet sera respecté. Par ailleurs, les rats seront anesthésiés lors de l’application du traitement dentaire pour éviter tout stress de l’animal, et leur phase de réveil sera encadrée sur un tapis chauffant pour éviter toute hypothermie. Chaque rat sera pesé avant toute acte (gavage de bisphénol A, application produit ou scan aux rayons X) afin d’avoir un suivi régulier de leur poids et ainsi identifier toute baisse de poids pouvant indiquer un stress important chez l’animal. Les animaux seront observés régulièrement par les expérimentateurs, pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress et nous avons raffiné la méthodologie par l’introduction de points limites dont l’atteinte entraînera la mise à mort anticipée de l’animal. Une période d’acclimatation d’une semaine avant l’entrée dans le protocole est accordée aux animaux. Pendant l’application du traitement, les animaux seront monitorés de manière visuelle (fréquence respiratoire, hydratation par test du pli de la peau). Durant toute la durée de l'anesthésie et jusqu’à réveil complet, les rats seront maintenus sur tapis chauffant. Les animaux seront hébergés par groupe de 3 dans les conditions standards d’hébergement ; eau et nourriture contrôlé (ad libitum). De plus, chaque cage sera identifiée, et les rats initialement hébergés ensemble (3 rats/cage) le resteront du début à la fin du protocole.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale retenue dans le cadre de cette étude car un modèle utilisant cet espèce permet de mimer le ''molaire incisive hypominéralisation'' humain chez le rat. Bien que la denture du rat soit différente de l’humain, le processus de développement dentaire suit une séquence similaire à l’humain. Le modèle d’incisive à croissance continue est même un atout car il permet de récapituler toutes les étapes du développement des dents sur un même échantillon. De plus, la gestation ainsi que l’odontogenèse chez le rat est rapide (jeune adulte 30 jours après la naissance) et permet donc de raccourcir la durée de l’étude.
Implication de l’aldostérone sur le syndrome cardiorénal chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
720 rats vont être utilisés, 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 600 un niveau modéré, chacun pouvant passer par l'ablation d'un rein en deux opérations espacées de dix jours, dix semaines de régime provoquant une insuffisance rénale ou un diabète, une échocardiographie, vingt-quatre heures seul en cage à métabolisme, cinq séances de mesure de pression artérielle et le port d'un gilet d'électrocardiogramme. Tous sont tués en fin de procédure pour les analyses de sang et d'organes. Le porteur décrit une perte de poids et d'appétit, une diurèse augmentée, des douleurs et des risques d'infection après la chirurgie, et de rares détresses cardiorespiratoires sous anesthésie. Il annonce que ce nombre de 720 rats "permet de s'assurer de la faisabilité du projet" sans donner de calcul de puissance, et prévoit d'arrêter l'étude si les premières expériences ne confortent pas son hypothèse.
Objectifs
Les comorbidités cardiovasculaires de l’insuffisance rénale chronique (IRC), ce qu’on appelle le syndrome cardiorénal, sont dramatiques et impactent la survie des patients. La prévalence de l’insuffisance rénale chronique en Europe est près de dix pour cent. Il est important de comprendre les mécanismes sous-jacents des interactions entre rein et coeur, mais également d’identifier des thérapeutiques permettant de limiter ces comorbidités. Les données recueillies chez l’Homme et l’animal montrent que l’aldostérone joue un rôle critique dans le remodelage rénal et cardiaque via l’inflammation et la fibrose. La modulation de l’inflammation dans les organes affectés (rein, coeur) peut également jouer un rôle critique dans le maintien au long cours du remodelage rénal et cardiaque. Les objectifs du projet sont d'étudier de nouvelles cibles thérapeutiques du syndrome cardiorenal, en particulier le role de l'aldostérone. Notre hypothèse est que la modulation de la signalisation de cette hormone aura un effet benefique sur le syndrome cardiorenal en cas d'insuffisance rénale chronique.
Bénéfices attendus
L’insuffisance rénale chronique (IRC) dont la prévalence est d’environ 10 pourcent en europe, selon les pays, a des conséquences cardiovasculaires majeures avec une morbidité et mortalité importantes. Ce lien rein-coeur est appelé syndrome cardiorénal. Le but du projet est de comprendre les conditions et mécanismes par lesquels l'aldostérone et son récepteur, sont impliqués dans le syndrome cardiorénal. Pour cela, l’efficacité d’un antagoniste pharmacologique de l'aldosterone synthase sera étudié lors d'une insuffisance rénale chronique induite par deux méthodes differentes, en particulier les effets sur l'inflammation et la fibrose tissulaire au plan rénal et cardiovasculaire. Ces résultats permettront de proposer des alternatives thérapeutiques aux patients souffrant de syndrome cardiorénal.
Procédures
Les animaux sous soumis à diverses interventions. Pour induire une insuffisance rénale chronique, l’ablation d’un rein est réalisée par chirurgie sous anesthésie et avec une prise en charge analgésique avant, pendant et après l’opération (20 min, 2 fois à 10 jours d’intervalle) ou les animaux sont mis sous régime alimentaire spécial avec administration d’un régime induisant une insuffisance rénale ou un diabète (animal vigil, en continu sur 10 semaines maximum). L'induction du diabète nécessitera une injection intrapéritonéale (1 fois, 1 minute) et un suivi mensuel de la glycémie par un prélèvement sanguin de faible volume (3 foix maximum, 1 minute). L'exploration de la maladie cardiaque comporte une échocardiographie sous anesthésie gazeuse (15 min, 1 fois). Pour recueil des urines (une fois pendant 24h) un hébergement individuel temporaire est nécessaire (animal vigile). La mesure de la pression artérielle est réalisée cinq fois sur 5 jours consécutif pendant 15 min (animal vigile). Un électrocardiogramme non invasif par un système de télémétrie par gilet (une fois, durée 15 min) est réalisé (animal vigile). Des prélèvements sanguins sont effectués une fois après 1 mois d'insuffisance rénale chronique (1 minute) chez l’animal vigile. L’euthanasie est réalisée en fin de période expérimentale après analgésie et anesthésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables notoires seront 1) la baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie (chirurgie rénale, échocardiographie) 2) la douleur et les risques d’infection suite à l’intervention chirurgicale, 3) les conséquences de la maladie rénale chronique (perte de poids, perte d’appétit, diurèse augmentée), 4) le régime alimentaire spécial incluant le traitement pharmacologique avec l’eplerenone peut entrainer une perte de poids et modifier la mobilité et le comportement des animaux, 5) l’hébergement individuel temporaire dans les cages à métabolisme pourra engendrer un stress 6) le stress lié à la manipulation et la contention durant la prise de pression artérielle ou l’installation des gilets pour l’électrocardiograme 7) le stress et la douleur légère de courte durée au site de prélèvement de sang avec un risque minime d'hémorragie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car des analyses biochimiques sanguines (composition, molécules pro-inflammatoires) ainsi que des analyses sur organes prélevés sont obligatoires pour mener à bien ce projet.
Remplacement
Cette recherche est de type fondamentale. Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez le rat afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude intégrée et multi-organes de l’activation du récepteur minéralocorticoïde par l aldosterone et de la signalisation sous-jacente dans le syndrome cardiorénal. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.
Réduction
Le nombre total d’animaux utilisés sera de 720 rats. Ce nombre permet de s'assurer de la faisabilité du projet tout en mettant en évidence des différences statistiques entre les résultats de nos différents groupes. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft et batonnet en bois. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés. Lors des anesthésies, la température interne est suivie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour limiter l’hypothermie, et une attention particulière est portée pour la période de réveil pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. La douleur post-opératoire sera prise en charge par une analgésie et des croquettes hydratées seront déposées au fond de la cage pour faciliter l’alimentation. La prise alimentaire ainsi que le poids seront contrôlées pendant les traitements, incluant l’administration d’eplerenone, et les analyses métaboliques, avec une pesée hebdomadaire. L’hébergement individuel temporaire dure 24h pour le prélèvement d’urines et fèces. Une période d’habituation est mise en oeuvre et les animaux sont placés le jour (pendant 3 jours) dans la cage métabolique, et retournent la nuit dans leur cage. Enfin, certaines analyses cardiovasculaires seront réalisées sous anesthésie, d’autres après habituation, afin de réduire le stress des animaux. Des points limites suffisamment précoces ont été définis.
Choix des espèces
L'espèce rat a été choisie car c'est un modèle établi pour le développement de maladies cardiovasculaires et rénales. De plus nous disposons d'un modèle de rats génétiquement modifiés permettant d'exprimer l'aldostérone synthase humaine à la place de l'aldostérone synthase endogène de rat et tester ainsi les nouveaux inhibiteurs de l'aldostérone synthase qui ne sont actifs que sur l'aldostérone synthase de primates. Les animaux males et femelles sont utilisés à l’âge adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.