Rats
Mise au point de techniques d’imagerie et de spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire in vivo chez le rongeur sain
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Rats : 50
Trois à quatre séances d'IRM de deux heures chacune, sous anesthésie gazeuse, avec injection d'un produit de contraste : 50 souris et 50 rats en bonne santé passent par ce protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le projet ne porte sur aucune maladie, il sert à mettre au point des séquences d'imagerie, et le porteur annonce comme retombée de "faire progresser les recherches de nos partenaires et de nos clients". Il décrit cette imagerie comme non invasive, indolore et sans nuisance attendue, tout en programmant la mise à mort de chaque animal. Le seuil qui la déclenche n'a rien de médical : les rats sont tués quand ils atteignent 500 grammes et les souris 45 grammes, poids au-delà desquels ils ne rentrent plus dans l'appareil disponible en routine.
Objectifs
Un modèle animal permet d’étudier dans des conditions contrôlées de laboratoire les causes, les processus et les traitements éventuels d’une pathologie. Il doit présenter des similitudes avec la pathologie humaine correspondante en termes de symptômes et de mécanismes physiopathologiques. Une grande partie des connaissances en biochimie, physiologie ou pharmacologie ont été acquises grâce à l’étude des modèles animaux. Dans ce contexte, l’imagerie et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) sont des techniques d’investigation non irradiantes, non invasives, n’entrainant pas de douleur ou de souffrance chez l’animal anesthésié. L’application de ces méthodes in vivo chez le petit animal permet la caractérisation et la compréhension de modèles de pathologies, tant d’un point de vue anatomique que fonctionnel. Elle permet également la validation préclinique de nouvelles molécules à visée thérapeutique et l’étude des mécanismes d’action de médicaments actuellement utilisés. Le premier avantage de l’imagerie RMN in vivo est la possibilité de suivre des phénomènes biologiques complexes chez un animal au décours de sa pathologie et donc d’utiliser moins d’animaux que lors d’approches in vivo invasives. Le second avantage de l’imagerie RMN in vivo tient au fait que les technologies utilisées (aimants RMN, produits de contraste) sont identiques à celles utilisées chez l’Homme, permettant ainsi une recherche biomédicale translationnelle. Or la mise au point de cette approche nécessite régulièrement de nouvelles séquences d’acquisition et méthodologies qui doivent être développées, évaluées et optimisées sur des animaux avant d’être applicables dans des projets de recherche. Ainsi les objectifs principaux du projet mené sur des rongeurs sont : • d’optimiser les paramètres d’acquisition de séquences existantes afin de les adapter au mieux au modèle biologique et à ses spécificités ; • de développer et mettre au point de nouvelles techniques d’imagerie et de spectroscopie RMN.
Bénéfices attendus
Le développement et la validation de nouvelles méthodes en imagerie et spectroscopie RMN contribuent à faire progresser les recherches de nos partenaires et de nos clients
Procédures
L’examen RMN est effectué sur un équipement dédié aux investigations chez le rongeurs sous anesthésie . Les animaux sont placés dans un système permettant de les réchauffer et de suivre leurs constantes physiologiques (température, fréquence respiratoire) pendant les 2h que dure l’IRM. Nous estimons que 3-4 examens RMN sous anesthésie seront réalisés sur un animal au cours du projet, avec un intervalle minimum d'une semaine entre 2 anesthésies.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles liées à l'injection d'un produit de contraste (réduites car l'injection est effectuée sous anesthésie). Aucune nuisance liée à l'imagerie in vivo n'est attendue.
Devenir
Les animaux seront utilisés pour plusieurs examens IRM, ils seront mis à mort lorsqu'ils auront atteint un poids de 500 G pour les rats et 45 G pour les souris (poids limite compatible avec nos équipements RMN disponibles en routine).
Remplacement
Avant d’être appliqués dans le cadre de pathologies d’intérêt, les développements méthodologiques et instrumentaux dédiés à l’imagerie in vivo du petit animal doivent être validés in vivo.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux: - dans la mesure du possible, un maximum d’étapes nécessaires au développement méthodologique et instrumental sera réalisé sur fantôme ; - les animaux ayant subi une anesthésie gazeuse seront utilisés pour plusieurs examens RMN. Chaque examen sera espacé d’au moins 1 semaine. Un animal pourra être évalué plusieurs fois jusqu’à ce qu’il ait atteint un poids de 500g pour les rats et 45g pour les souris, poids limites compatibles avec les équipements RMN disponibles en routine. Aucune analyse statistique n’est envisagée en routine pour les validations des développements méthodologiques. Cette validation sera appréciée par la capacité à répondre à la question posée et la reproductibilité de la méthode sera évaluée chez 3-5 animaux.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant une période suffisante lors de leur arrivée. Ils seront hébergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress, dans une pièce thermorégulée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois par semaine. Il faut considérer que les animaux seront habitués à être manipulés par l’expérimentateur et observés quotidiennement, ce qui permet de déceler des signaux de stress, de douleur ou d'inconfort. L’IRM est non invasive et effectuée sous anesthésie et suivi physiologique continu : installation de l'animal dans un berceau dédié avec suivi en continu de la température corporelle (utilisation d’un système de chauffage intégré dans le berceau dont la température est contrôlée et adaptée en fonction de la température de l’animal) ; monitoring de la fréquence respiratoire pendant toute la procédure (ce qui permet d'adapter la profondeur d'anesthésie). Ce monitoring permet de déceler un problème (fréquence respiratoire irrégulière et en baisse, température en baisse malgré le chauffage), ainsi l'acquisition peut être interrompue avant l'atteinte des points limites définis pour l'imagerie, l'anesthésie arrêtée et l'animal réveillé sous surveillance de l'expérimentateur.
Choix des espèces
Un modèle animal permet d’étudier dans des conditions contrôlées de laboratoire les causes, les processus et les traitements éventuels d’une pathologie. Il doit présenter des similitudes avec la pathologie humaine correspondante en termes de symptômes, de mécanismes physiopathologiques et/ou de traitements. Le rat et la souris sont très souvent utilisés comme modèle. Les modèles rongeur de pathologies sont obtenus par des méthodes physiques, chimiques et pharmacologiques ou par sélection de lignées spécifiques. De nombreux modèles génétiquement modifiés ont également été obtenus par ajout ou retrait de gènes (souris knock-in ou knock-out). Finaliser le développement et/ou la mise au point les méthodes RMN in vivo chez l’animal permettra de réaliser les expérimentations dans des conditions similaires aux futures études. Travailler chez le rat ou la souris offre la possibilité de confronter nos résultats avec une littérature abondante. Au début des expérimentations, les rats et les souris sont utilisés au stade de jeune adulte avec des poids de 200-250 g et 16-20g, respectivement. Au vu du caractère non invasif de la RMN, les animaux anesthésiés pourront être utilisés plusieurs fois et serviront à la validation de plusieurs procédures. Cependant, pour des contraintes matérielles (optimisées pour des rats d’un poids < 500 g et des souris d’un poids < 45 g) et pour nous affranchir des biais dus à des changements dans le métabolisme qui se développeraient plus tard dans la vie de l’animal, les rats seront utilisés jusqu’à ce qu’ils atteignent un poids de 500g et les souris un poids de 40-45g. Avant l'atteinte de ces poids limites, nous estimons à 3-4 anesthésies à l’isoflurane par animal avec un intervalle d’au moins 1 semaine entre chaque évaluation.
Etude des effets de candidats médicaments dans un modèle préclinique d’hypertension artérielle pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Des rats sont rendus malades d'une hypertension artérielle pulmonaire par l'injection d'un composé qui freine la formation des vaisseaux, puis par trois semaines dans une enceinte appauvrie en oxygène, humide à plus de 80 % et plus bruyante que leur salle habituelle. 1 920 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 1 800 rendus malades et 120 témoins. Pendant six semaines au plus, ils peuvent recevoir un candidat médicament une à deux fois par jour, par gavage ou injection, avant une ouverture du thorax sous anesthésie pour mesurer les pressions dans le cœur et l'artère pulmonaire, puis une mise à mort par surdose. Le porteur prévoit que 15 % des rats malades meurent de la maladie en cours de protocole, et jusqu'à 40 % quand la phase suivant l'enceinte dure plus de trois semaines. Il invoque aussi la "validation de la formation aux techniques de mesures de pressions" pour recourir à des rats vivants.
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie cardiovasculaire et pulmonaire rare et grave : sa prévalence dans la population générale en France est estimée à 15 cas par million et la survie médiane sans traitement après diagnostic est inférieure à 3 ans. Elle se caractérise par l’augmentation des résistances artérielles pulmonaires, responsable d'une hypertension, et aboutit à une insuffisance cardiaque. Cette maladie peut survenir de cause inconnue, dans un contexte familial ou compliquer l’évolution de certaines pathologies (insuffisance cardiaque). En identifiant et en traitant les patients le plus tôt possible, il est possible de retarder la progression de l'HTAP. Malheureusement, cette maladie est souvent mal diagnostiquée et traitée, car les symptômes initiaux sont légers et peu spécifiques (essoufflements, lipothymie et asthénie). Si les options thérapeutiques ont progressé ces dix dernières années et ont permis d'améliorer les conditions de vie des malades, la prise en charge de l'HTAP demeure incomplète car ne prolonge pas significativement le durée de vie après diagnostic. Ainsi, la recherche de médicaments ciblant de nouveaux mécanismes physiopathologiques reste un enjeu majeur pour les années à venir. Les tests de nouvelles molécules doivent se réaliser sur des modèles animaux suffisamment prédictifs de la maladie, afin d’optimiser la sélection des candidats médicaments qui entreront en phase clinique. Le modèle présenté d'HTAP chez le rat, induit conjointement par l’administration d'un composé diminuant la formation de vaisseaux sanguins et par une hypoxie (diminution des apports en oxygène) chronique, est un modèle qui reproduit l'ensemble des caractéristiques physiopathologiques décrites chez l'Homme, à savoir une atteinte vasculaire qui est associée à long terme avec le développement d'une insuffisance cardiaque droite. De plus, les traitements actuellement proposés chez l'Homme montrent des résultats bénéfiques significatifs dans ce modèle. Ainsi, ce modèle d'HTAP représente un modèle préclinique de choix pour l’étude de l’HTAP. Ce modèle nous permettra d’évaluer, chez le rat, l’efficacité de nombreux candidats médicaments qui s’intéressent à des mécanismes d’actions connus (atteintes vasculaires) et des cibles thérapeutiques nouvelles (atteintes cardiaques). Ce modèle nous permettra également une meilleure compréhension des mécanismes mise en jeu dans la maladie afin d’améliorer la prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
L’HTAP est une maladie rare et grave pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitements curatifs efficaces. Si les traitements prescrits actuellement, essentiellement des vasodilatateurs, permettent une amélioration de la qualité de vie des patients et une prolongation de la survie en freinant l’évolution de la pathologie, la moitié des patients décèdent dans les sept ans qui suivent le diagnostic. Compte-tenu de l’évolution de l’HTAP dans ce modèle animal qui mime fidèlement la maladie humaine, la réalisation d’études précliniques utilisant des candidats médicaments novateurs apparait primordiale pour mettre en évidence de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, à terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.
Procédures
Une injection sous-cutanée (S.C.) du composé diminant la formation des vaisseaux est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines avant de retourner en condition de normoxie (conditions d'hébergement classique) durant 0 à 6 semaines. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). Des injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Durant la normoxie, des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse. A la fin du protocole, une chirurgie sous anesthésie gazeuse et analgésie est réalisée afin de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant.
Impact sur les animaux
Les animaux sont soumis à une anesthésie gazeuse et reçoivent une injection sous-cutanée pour induire une hypertension artérielle pulmonaire. Ils sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines. L’humidité dans l’enceinte est supérieure à 80%. En hypoxie, les animaux présentent une prise de poids ralentie de 50% par rapport à une stabulation conventionnelle à cause du stress et de l’asthénie provoqués par la déplétion en oxygène. De plus, le confinement dans l'enceinte d'hypoxie génère un inconfort, indépendamment de l'hypoxie elle même, via une humidité élevée et un risque d'accumulation d'ammoniaque et de CO2. De plus, le niveau sonore est plus élevé dans les caissons hypoxiques que dans les salles d'hébergements classiques pouvant engendrer du stress et de l'inconfort pour les animaux.A la fin de ces 3 semaines d’hypoxie, ils retournent dans la pièce d’hébergement conventionnelle pendant 0 à 6 semaines, période pendant laquelle la pathologie va s’aggraver et devenir irréversible. A long terme, les animaux peuvent mourir de la pathologie. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). Ces administrations répétées peuvent êtres associées à des risques de fausses route, d'irritation ou de lésions de l'oesophage (PO), et d'irritations (I.P., S.C.). Des injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Des anesthésies gazeuses seront potentiellement réalisées au cours du protocole afin de réaliser des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi. A la fin du protocole, les animaux sont anesthésiés afin de réaliser un acte chirurgical qui permet de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux HTAP seront mis à mort afin de récupérer des organes pour des analyses de tissus (cœurs, poumons, artères pulmonaires) et/ou des analyses de morphologie des organes (pesée des deux ventricules du cœur). Les mesures de pressions dans le ventricule droit sont également trop invasives pour envisager un réveil des animaux. Un prélèvement de tissu sur les animaux Sham (non porteurs d'un HTAP) est nécessaire pour comparer aux conséquences cardiovasculaires des animaux porteurs de la maladie.
Remplacement
S'il existe un certain nombre de modèles de culture de cellules musculaires lisses, ces modèles in vitro sont utilisés en première intention (modèles de screening) et sont utilisés uniquement pour tester des activités moléculaires et identifier des voies de signalisation. Ces modèles cellulaires in-vitro ne permettent pas de tester l'efficacité d'un candidat médicament sur l'aspect de la restauration hémodynamique et morphologique mais sont utilisés en amont afin de sélectionner les meilleurs candidats à tester sur nos modèles in vivo. La validation de la formation aux techniques de mesures de pressions nécessite d’avoir recours à des animaux vivants car les phases critiques de l’approche chirurgicale reposent sur les risques hémorragiques qui peuvent entraîner des mesures de pression faussées, voir la mort de l’animal.
Réduction
Pour chaque groupe avec une HTAP, le nombre d'animaux nécessaire par groupe est fixé à 11. Ce nombre a été déterminé par un calcul de N, sur la base de données obtenues préalablement et prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Basés sur les données historiques dans ce modèle d’HTAP, un pourcentage de perte de 15% est attendu jusqu’à 3 semaines de normoxie, correspondant aux animaux qui meurent au cours du protocole à cause du développement de la pathologie. Le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe en début d’étude est donc de N=13. Lorsque le protocole inclus une période de normoxie supérieure à 3 semaines (jusqu’à 6 semaines), le nombre d’animaux par groupe est fixé à N=18 car le développement de la pathologie entraîne une mortalité plus importante des animaux (jusqu’à 40% de perte). Généralement, le groupe contrôle négatif (non malade) n’est composé que de 6 animaux car il y a peu de variabilité des paramètres cardiovasculaires étudiés. Ainsi, 1800 rats HTAP sont prévus dans le cadre de cette procédure et 120 rats Sham. Des échantillons de plasmas et/ou de tissus d'animaux sont prélevés à l'issue de certaines séries expérimentales et conservés pour pouvoir être utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche (par exemple recherche d’un récepteur cible présent dans le plasma ou dans les tissus cardiaques ou vasculaires). L'utilisation de ces banques de tissus pour d'autres projets de recherches permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés car il permet de réduire le nombre de séries expérimentales réalisées.
Raffinement
l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. L'administration du composé induisant la pathologie est réalisée sous anesthésie gazeuse. Pendant les 3 semaines d'hypoxie, les animaux sont hébergés dans des grandes cages en plexiglass prévues à cet effet avec une sciure particulièrement absorbante (8 animaux par cages). Les caissons d’hypoxie sont ouverts et nettoyés tous les jours. De la chaux sodée est placée dans le caisson pour absorber le C02 et changée tous les jours, de l'acide borique permet d'absorber l'ammoniaque générée par les urines et est remplacé toutes les semaines ; et des absorbeurs d'humidité sont présents pour absorber l'humidité assurant des conditions correctes pour les animaux. La ventilation des caissons peut également être adaptée à l’aide d’aérations présentes sur les caissons dont l’ouverture et la fermeture peut être ajustée pour diminuer une humidité excessive. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation du bien-être animal. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Des points limites spécifiques au protocole sont également établis (présence de plaies cutanées, fausse route…) Si des prélèvements de sang sont réalisés au cours du protocole, les animaux sont anesthésiés. Une anesthésie locale est également réalisée. Les rats sont placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température, et une réhydratation est réalisée en injectant en S.C. 3 fois le volume prélevé en NaCl ou Ringer Lactate. Si des injections en voie I.V. sont réalisées, les animaux sont anesthésiés avec une analgésie locale et contôle de la température corporelle. Les mesures hémodynamiques réalisées en fin de protocole se font sur animaux anesthésiés ayant reçus une injection préalable d'analgésiant au minimum 30 minutes avant la première incision. Pour chaque anesthésie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux
Choix des espèces
Même si de nombreuses espèces animales sont concernées, la majorité des modèles d’HTAP ont été développés chez le rat adulte parce qu’il permet d’obtenir, après induction de la pathologie, des données hautement reproductibles. De plus, les rats présentent des modifications cardiovasculaires similaires à l’homme : modifications des pressions, remodelage vasculaire et cardiaque, perte de fonction. Finalement, ce modèle d'HTAP développé chez le rat représente un modèle de référence pour l’étude de l’HTAP car la progression de la pathologie est continue au cours du temps et mime ainsi l’évolution délétère de la maladie observée chez l’homme. Des rats de 4/6 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés pour ce modèle. Ce modèle est sensible à l’âge et des animaux plus âgés ne présentent pas le même développement de la pathologie.
Mise en place d’une décompensation spontanée de la cirrhose et d’un modèle d’ACLF suite à une induction de la cirrhose par un agent hépatotoxique et d’un désordre métabolique.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Jusqu'à 44 administrations d'un produit toxique pour le foie, deux fois par semaine pendant 22 semaines, par gavage ou par injection dans l'abdomen : c'est ce que subissent des rats arrivés au laboratoire à quatre semaines, pour reproduire une cirrhose puis sa décompensation aiguë. 8 140 rats sont concernés, dont 4 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous sont tués à l'issue. Le porteur annonce des animaux en état de choc et en détresse cardio-respiratoire dans les heures qui suivent l'induction, écarte l'analgésie au motif qu'elle introduirait un biais, et écrit viser une gravité "jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique". Dans les études de survie, le délai jusqu'à la mort compte comme donnée, et c'est l'atteinte du point d'arrêt anticipé qui vaut déclaration de la mort de l'animal.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche destiné à identifier de nouvelles molécules permettant de traiter la cirrhose à stade très avancé ou une ACLF (acronyme d’Acute on Chronique liver Failure ou décompensation aiguë de la cirrhose) La cirrhose se définit par l'accumulation excessive de fibrose conduisant à la dégénérescence du foie.
Bénéfices attendus
Le pronostic des patients cirrhotiques est variable en fonction de la cause et de son contrôle et de la présence de décompensations. L’ascite réfractaire survient chez 5-10 % des patients cirrhotiques, avec un taux de mortalité de plus de 50 % à 2 ans. Souvent, elle s’associe à d’autres complications comme l’infection spontanée du liquide d’ascite. Lors de la phase terminale de cette décompensation et suivant la qualité de vie du patient, l’espérance de survie en dehors d’une transplantation hépatique n’est que de quelques mois. Dans le cadre de l’ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour des défaillances multiples et de préserver le capitale hépatocitaire des patients. La perte de fonctionnalité du foie durant cette période conduit à un décès du patient de façon précoce. Les traitements actuels sont purement symptomatiques et ne visent qu’à limiter les risques liés à l’hypertension portale, les surinfections, les risques d’hémorragie ou au contraire de thrombose et sont proposés au cas par cas, ce de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons développer visent à agir sur les différents mécanismes conduisant à une réfractarité de l’ascite, la perméabilité de la paroi intestinale et les productions d’ammoniaque à l’origine de l’encéphalopathie pour la décompensation traditionnelle. Elles visent à agir sur les différentes voies à l’origine de la défaillance multiple (inflammation, immunitaire, métabolique et vasculaire) dans le cadre de l’ACLF.
Procédures
Période d’induction : Décompensation spontanée selon les procédures : Jusqu’à 44 administrations par gavage ou par administration intrapéritonéale de composé chimique hépatotoxique, à raison de 2 fois par semaines pendant 22 semaines (15 secondes) ou jusqu’à 44 administrations par administration intrapéritonéale de composé chimique hépatotoxique à raison de 2 fois par semaines pendant 22 semaines (15 secondes). Sur les procédures de caractérisation de chacun des agents inducteurs (procédure 1 et 2), les animaux pourront subir jusqu’à 6 prélèvements de sang à la veine sublinguale intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3minutes). En dehors de ces deux procédures, les animaux subiront un prélèvement de sang intermédiaire à la veine sublinguale intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3minutes). Pour les études de type ACLF, les animaux subiront une administration intrapéritonéale, par voie intraveineuse ou par gavage des agents inducteurs (15 secondes). Pour les études avec test de composés, en dehors de la phase d’induction de la cirrhose et de l’ACLF, les animaux pourront subir jusqu’à 10 administrations par gavage, voie intrapéritonéale ou intraveineuse (15 secondes). Dans certains cas, les 4 administrations avec un volume plus important en intrapéritonéale se fera sous anesthésie (durée 1 minute), avec 4 drainages du dialysat à raison d’une fois par jour (15 minutes) sous anesthésie générale. L’administration intraveineuse pourra être faite par infusion lente à l'aide d'un perfuseur (durée 120 minutes).
Impact sur les animaux
L’induction de la fibrose n’induit pas de douleur mais un inconfort et un stress passager lié à la contention nécessaire pour le gavage ou l’administration intrapéritonéale des agents, l’habituation au geste estompe rapidement ce stress. La gêne est présente mais pas accompagnée d’une analgésie chez l’humain. Les animaux présentant de l’ascite semblent présenter des signes de gêne de posture lorsque celle-ci est abondante sans pour autant présenter des signes de douleurs (grimace scale). L’administration massive d’alcool produisent les effets d’une ivresse importante (perte d’équilibre, ataxie). L’ACLF est un épisode grave chez le patient dont le pronostic vital est engagé. Le modèle animal présente, par voie de conséquence, lors de l’induction de l’ACLF des signes d’inconfort manifestes. L’administration unique ou répétée des agents inflammatoires ont des effets notoires sur les animaux dans les heures qui suivent les inductions. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux présenteront ces symptômes à des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Dans les situations d’études de survie où le délai jusqu’à la mort est une donnée clé de la procédure, le recours au point d’arrêt anticipé sera appliqué et c’est à ce moment précis que sera déclarée la mort de l’animal. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
L'intégralité des animaux sera mis à mort à l'issue des procédure afin de pouvoir étudier les biomarqueurs circulant, histologique ou transcriptionnelle permettant de caractériser la pathologie et l'efficacité d'une molécule.
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Les pathologies étudiées étant multi-organes, le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et « global », capable de métaboliser les principes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans un système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevant. Ces études pilotes nous permettront de caractériser et d’écarter les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". La connaissance de la variance de ces biomarqueurs permet de définir un effectif théorique à l'aide d’un test statistique qui associe variance et probabilité d'atteinte d'un seuil de significativité. Cette approche statistique permet d'affiner les effectifs et de réduire donc les nombres d'animaux qui seraient surévalués et non nécessaires à l'obtention d'un résultat biologique relevant. Une priorité sur le développement sera accès par rapport à la prépondérance observée chez l’homme : infection (LPS), consommation excessive d’alcool et/ou intoxication médicamenteuse (APAP), le développement des autres agents précipitants sera envisagé qu'au cas où ceux-ci ne donneraient pas les résultats escomptés. Dans le cas d’administrations de composés par voie veineuse en aigue ou en répétés, peuvent se présenter des difficultés techniques et nous oblige parfois à augmenter les effectifs de façon à combler les pertes.
Raffinement
Les rats sont hébergés par paire, l’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teintés en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Pour les études menées sur les rats avec une présensibilisation au phénobarbital et induction au composé hépatotoxique, nous utiliserons des animaux de 4 semaines à l'arrivée (75-100 gr) âge préconisé dans la littérature, c’est en effet lorsque les rats ont atteint un poids de 100gr environ que l'effet du phénobarbital est le plus efficace. L'ensemble des autres études (sans présensibilisation au phénobarbital) sera réalisé sur de jeunes adultes, à savoir 6 à 7 semaines (250 à 300 g) à l'arrivée. Les traitements induits aux animaux affectent essentiellement la fonction hépatique et produisent des modifications métaboliques. Il est nécessaire de les appliquer sur un organisme développé, qui puisse mettre en place des mécanismes de réparation et de défense. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent (microbiote bien établi) et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer notre modèle expérimental.
Enseignement de techniques chirurgicales chez le Porc, le Mouton, le Lapin, le Rat et la Souris
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 4000
Lapins : 100
Cochons : 750
Moutons : 100
Former des internes en chirurgie, des vétérinaires et des scientifiques aux gestes de base mobilise ici 5 950 animaux non-humains, dont 4 000 rats, 1 000 souris, 750 cochons, 100 moutons et 100 lapins. 4 950 d'entre eux sont opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil, les 1 000 autres étant utilisés pour l'apprentissage du gavage, des injections et de la contention, dans des procédures classées en souffrance légère. Chaque animal peut rester une demi-journée à une journée entière sous anesthésie pendant que se succèdent laparotomies, thoracotomies, sutures et anastomoses digestives ou vasculaires, le porteur indiquant faire passer le maximum d'étudiants sur chacun. Les souris viennent de l'élevage maison, écartées pour n'avoir pas le bon génotype, et les rats sont achetés "réformés" chez des fournisseurs, c'est-à-dire déjà destinés à être tués.
Objectifs
Le but est d'aider à la formation médicale pratique initiale des étudiants en médecine (internes des spécialités chirurgicales essentiellement, externes) et des étudiants en sciences (dès le Master 2). Nous assurons également la formation chirurgicale continue auprès des chirurgiens, des vétérinaires et des scientifiques dans le cadre des formations à la chirurgie expérimentale ainsi que pour concevoir ou réaliser des procédures expérimentales obligatoires pour toute personne pratiquant un acte chirurgical chez l'animal de laboratoire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont que les étudiants en chirurgie soient formés aux techniques chirurgicales de bases afin d'avoir toutes les compétences nécessaires à leur activités en fin de cursus, que les chirurgiens ou vétérinaires en activité se forment aux nouvelles techniques chirurgicales et que les scientifiques apprennent les bonnes pratiques et gestes avec les différents modèles animaux (contention, gavage, injection intrapéritonéale, intraveineuse,...) encadrés par des personnes compétentes afin de pouvoir poursuivre leurs recherches dans les meilleures conditions pour eux et pour l'animal (Raffinement).
Procédures
Une partie des petits mammifères (rats et souris) serviront à l'enseignement des gestes de base tels que gavage, injection intrapéritonéale, intraveineuse, contention. Pour les autres et les grands mammifères, les formations visent à former les futurs chirurgiens, gynécologues, vétérinaires et toute personne réalisant des procédures expérimentales chez l'animal. Ces enseignements sont axés sur la maîtrise des gestes chirurgicaux de base tels que la suture ou l'hémostase pour les scientifiques. Les internes des spécialités chirurgicales seront davantage formés sur les sutures, l'hémostase, les anastomoses digestives, les anastomoses vasculaires ainsi que la coelioscopie. En fonction du geste à acquérir, l'animal pourra rester d'une demi journée à une journée sous anesthésie générale (avec vérification des constantes en permanence).
Impact sur les animaux
Pour les gestes réalisés de classe légére (procédure 1), une contention de courte durée sera pratiquée (moins de 1 minute). Lors des injections, une douleur légère de très courte durée est possible au site d'administration. Un léger saignement après les injections, très vite contenu par simple pression digitale, est également possible sans douleur associée. Une couverture analgésique locale sera appliquée pour réduire la douleur qui pourrait être engendrée par les injections (xylocaïne en spray 5%). Pour les procédures 2 et 3 (sans réveil), les interventions chirurgicales consisteront en des laparotomies/thoracotomies essentiellement avec techniques chirurgicales digestives et thoraciques. Les animaux seront tous sous traitement analgésique avec utilisation de dérivés morphiniques (buprénorphine et fentanyl) pour optimiser la prise en charge de la douleur jusqu'à leur mise à mort.
Devenir
A la fin de la procédure 1, étant une procédure légére, les animaux sont réutilisés pour les procédures 2 et 3 (sans retour à l'hébergement entre les deux). Les animaux des procédures 2 et 3 seront anesthésiés puis systématiquement euthanasiés à la fin des procédures. Etant des procédures chirurgicales nécessitant l'apprentissage de l'euthanasie ou des procédures chirurgicales trop importantes ne permettant pas leur réutilisation, l'euthanasie a été décidé comme l'issue la plus favorable.
Remplacement
Dès que possible et en 1ère intention, nous aurons recours à des peaux artificielles, des pelvi-trainers, des mannequins rats et souris, à la technique de la double horloge pour la microchirurgie ainsi qu'à des simulateurs de chirurgie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour certaines formations nous sommes également en contact avec des abattoirs qui nous livrent des pièces anatomiques (pieds de porc pour les sutures, périnée de truie pour les sages femmes) afin d'éviter de commander des animaux.
Réduction
Toutes les souris utilisées lors des formations sont des souris provenant de l'élevage de l'animalerie Eops destinées en temps normal à l'euthanasie car elles n'ont pas le génotypage souhaité. En ce qui concerne les rats nous essayons dès que possible de réutiliser des rats en fin de protocole ou nous commandons des rats dits "réformés" chez les fournisseurs, c'est à dire des rats voués à l'euthanasie car incompatibles avec les protocoles de recherche. Enfin, nous faisons passer le maximum d'étudiants sur chaque animal pour réduire au maximum le nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement favorable à leur bien-être et répondant à leurs besoins physiologiques et éthologiques (cycle jour/nuit - 12h/12h ; nourriture et eau ad libitum; enrichissements) les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Une période de 10 jours d'adaptation sera appliquée à chaque animal. Les manipulations seront effectuées ou encadrées par du personnel formé et habitué à ce genre de geste. Si une anesthésie est nécessaire les animaux seront systématiquement prémédiqués en intra-musculaire ou en intra-péritonéale. Le relais anesthésique est assuré par un gaz anesthésiant (0,5 à 2,5%). Seuls les grands animaux (porcs et brebis) seront intubés. Dès l'anesthésie maintenue, les animaux recevront un analgésique par voie sous-cutanée ou intra-péritonéale. Si nécessaire, pour les procédures de classe légère, un traitement à base d'anesthésique local sera pratiqué pour lutter contre la douleur in situ.
Choix des espèces
Le porc et le mouton ont été choisis pour des raisons anatomiques (similarités avec l'homme). Les rats, souris et lapins ont été choisis pour la formation à la chirurgie expérimentale (espèces utilisées par les étudiants dans leurs recherches) ou pour l'apprentissage des anastomoses vasculaires en ce qui concerne les rats (similarité avec l'homme). Nous prendrons des porcs charcutiers juvéniles et des miniporcs adultes pour une raison de taille. En ce qui concerne les moutons, rats, souris et lapins, nous prendrons des individus adultes pour des raisons anatomiques et de taille étant manipulés lors de travaux pratiques. Cela permet aussi de faciliter cette manipulation des petits mammifères par les étudiants.
Excitabilité des neurones épineux striataux chez des animaux compulsifs pour l’alcool
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Isolés en cage individuelle, 272 rats sont conditionnés à boire de l'alcool au cours de quelque 80 sessions de trente minutes étalées sur une vingtaine de semaines. Six de ces sessions s'accompagnent de stimuli aversifs, destinés à séparer ceux qui continuent de boire malgré le signal négatif de ceux qui s'arrêtent, et le porteur classe l'isolement combiné au modèle de consommation comme un impact sévère, qui concerne 200 animaux sur 272. Vient ensuite une chirurgie d'une quarantaine de minutes, avec des injections dans deux à quatre sites du cerveau, avant trois semaines d'attente puis la mise à mort et le prélèvement des cerveaux. Les 40 rats qui ne boivent pas assez pour rester dans l'étude sont proposés pour des formations à l'expérimentation animale.
Objectifs
Démontrer qu’en modulant spécifiquement l’activité de certaines populations de neurones sensibles à la dopamine (une substance active du cerveau) dans le cerveau - par des approches génétiques chez le rat - on peut moduler une prise compulsive d’alcool (une consommation irrépressible d’alcool en dépit des conséquences négatives que ces prises d’alcool peuvent avoir sur l’individu).
Bénéfices attendus
Comprendre une partie des mécanismes liés à la prise compulsive d’alcool en lien avec le rôle de la dopamine dans le cerveau. La prise compulsive d’alcool est à la base de nombreux troubles psychiatriques et comprendre son fonctionnement est un préalable indispensable au développement de stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces.
Procédures
La production des animaux transgéniques nécessitera une biopsie de tissus. La recherche envisagée s’étale sur une durée d’environ 20 semaines. Des rats adultes seront conditionnés à consommer de l’alcool de façon compulsive au cours d’un total cumulé de près de 80 sessions de 30 minutes chacune. Après habituation à consommer de l’alcool (environ 60 sessions), 6 sessions seront associées à stimuli aversifs pour associer la recherche d’alcool à un signal négatif et ainsi distinguer les rats compulsifs ne pouvant pas stopper leur consommation d’alcool malgré ce signal, de ceux non compulsifs. Les animaux utilisés dans ce projet auront ensuite des injections dans le cerveau (chirurgie sous analgésie et anesthésie générale d’injections en deux à quatre sites, pour une durée d’opération n’excédant pas 40 minutes) qui permettront au bout de trois semaines d’étudier les mécanismes de régulation de la prise compulsive d’alcool.
Impact sur les animaux
La production des animaux transgéniques nécessitant un génotypage par biopsie d’oreille peut induire une douleur légère de courte durée. L’effet du modèle de consommation d’alcool que nous allons utiliser et l’isolement des animaux pour cette expérimentation sont à considérer comme ayant un impact d’ordre sévère sur l’animal, augmentant son niveau d’anxiété mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Des nuisances modérées sont attendues liées à la procédure de chirurgie d’injection et à la procédure des stimuli aversifs. Des nuisances légères sont attendues pour ce qui est des injections dans l’abdomen et/ou sous-cutanées des traitements antalgiques et anesthésiques.
Devenir
Les animaux ayant suivi l'ensemble des expériences auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses histologiques. Cependant, dans notre projet, nous estimons à vingt pour cent au maximum les animaux ne satisfaisant pas au critère comportemental (appétence pour l'alcool) nécessaire à la poursuite des expériences. Ceux-ci seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. La décision sera prise en concertation avec le vétérinaire réfèrent et/ou un membre de la Structure chargée du Bien Être des Animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation d’un comportement compulsif de prise d'alcool (comportement pour lequel on observe une continuation de la prise en dépit des conséquences négatives, un des critères diagnostic des addictions).
Réduction
Chez les animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool différents scores d’activité́ comportementale seront relevés et les analyses des cerveaux de ces mêmes animaux prélevés en fin d’expérimentation permettront de déterminer également les pourcentages de neurones préférentiellement activés en fonction de nos conditions expérimentales. Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe estimé sur la base de procédures similaires. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool sera traité au cours de sessions distinctes et successives pour n’avoir à suivre simultanément qu’un nombre restreint d’animaux à la fois.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans les conditions répondant aux critères légaux relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Nous serons cependant obligés de les isoler par rapport à la procédure expérimentale, mais en cages ouvertes, ce qui limitera toutes nuisance associée à un isolement plus strict. Ils seront hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations (pendant une semaine) afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux contentions et aux manipulations. Les chirurgies du cerveau seront réalisées sous anesthésie générale, après analgésie préalable des sites d’incision. Les yeux seront protégés de la dessication par application d’un gel ophtalmique. La température de l’animal sera maintenue constante par une couverture chauffante. En post-opératoire les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Des injections d’eau glucosée seront réalisées pour faciliter le processus de récupération post-chirurgical. Les douleurs post-opératoires seront prévenues par un antalgique. L’intégrité du processus cicatriciel en post-opératoire sera renforcé par application d’une solution iodée après suture de la peau. A leur réveil les animaux seront retournés dans leur cage. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Le suivi quotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et des points limites adaptés.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré́ de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux de neurones sur lesquels portent notre étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les registres comportementaux explorés sont facilement appréhendables dans cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (de 8 à 10 semaines, de 200 à 240 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui pourront, pour certaines, prendre plusieurs mois.
Caractérisation chémogénétique des astrocytes dans le phénomène de vasomotion en condition inflammatoire chez le rat in vivo
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun passant trois semaines dans le projet et trois anesthésies générales. La première chirurgie consiste en des injections d'outils de modification génétique directement dans le cerveau, la deuxième en un amincissement du crâne suivi d'une nouvelle série d'injections intracérébrales, la troisième séance étant une heure et demie d'imagerie par ultrasons. Le porteur décrit des douleurs modérées et de légers saignements possibles après les opérations, qu'il qualifie d'évènements rares. L'objet est de confirmer le rôle des astrocytes dans la vasomotion cérébrale, les retombées annoncées pour les maladies du système nerveux restant au conditionnel et sans échéance.
Objectifs
La vasomotion est un phénomène naturel où les vaisseaux sanguins alternent spontanément entre contraction et relaxation, créant une sorte de pulsation lente. Bien que ce mécanisme soit connu, son rôle précis reste encore mal compris. Dans une étude précédente, nous avons identifié pour la première fois un lien direct entre la vasomotion et l’inflammation cérébrale, mettant en évidence que ce phénomène est influencé par certaines cellules du cerveau appelées astrocytes, particulièrement en situation d’inflammation. Nous émettons l’hypothèse que l’inflammation amplifie la vasomotion grâce à l’action de ces astrocytes. L’objectif de ce projet est de confirmer le rôle de ces cellules dans le contrôle de la vasomotion cérébrale, tant en conditions normales que pathologiques. Pour cela, nous utiliserons une méthode d’imagerie fonctionnelle basée sur les ultrasons, permettant de mesurer et cartographier les variations du flux sanguin cérébral. Par ailleurs, nous utiliserons un outil de pointe pour moduler directement l’activité des astrocytes grâce à des récepteurs artificiels activables seulement par une molécule spécifique. Ces technologies nous permettront de mieux comprendre comment ces cellules participent à la régulation de ce phénomène cérébral.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels pour les maladies du système nerveux central ne répondent pas pleinement aux besoins des patients (faible efficacité, effets secondaires conséquents), ce qui met en évidence l’importance d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques. Parmi ces pistes, cibler des cellules non neuronales, comme les cellules gliales, apparaît comme une stratégie prometteuse. Ces cellules, qui constituent environ la moitié des cellules du cerveau humain, jouent un rôle central dans le fonctionnement du cerveau et représentent des cibles intéressantes pour le développement de nouvelles thérapies. Les résultats espérés de ce projet pourraient ouvrir de nouvelles perspectives pour comprendre et traiter les maladies du système nerveux central, notamment celles liées à l’inflammation ou à la dégénérescence du cerveau.
Procédures
Le temps d’inclusion dans le projet pour chaque animal sera de 3 semaines, durant lequel le rat sera anesthésié 3 fois afin de réaliser 2 interventions chirurgicales et 1 session d’imagerie fonctionnelle comme décrites ci-dessous : • 1 intervention chirurgicale pour des injections intracérébrales d’outils de modification génétique (durée : 1h30), réalisée sous anesthésie générale et analgésie. • 1 intervention chirurgicale pour un amincissement du crâne (durée : 60 minutes) associé à des injections intracérébrales de molécules (durée : 30min), réalisé sous anesthésie générale et analgésie. • 1 examen d’imagerie (durée 1h30), réalisé sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
Lors des différentes étapes de ce projet (interventions chirurgicales et session d’imagerie fonctionnelle), les animaux pourront ressentir une légère détresse le temps que l’anesthésie soit opérationnelle. Lors des interventions chirurgicales, les animaux pourront être sujets à une inflammation locale, des douleurs modérées, et/ou de légers saignements, restant toutefois des évènements rares.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser les confirmations et les analyses post-mortem des tissus cérébraux, nécessaires à la validation et l’interprétation des résultats.
Remplacement
L'objectif étant d'identifier et de caractériser le rôle des astrocytes dans ce phénomène de vasomotion (un phénomène biologique complexe impliquant des interactions entre cellules vasculaires, gliales et neuronales), l'utilisation d'un modèle in vitro ou in silico n'est ni pertinente ni cohérente avec les connaissances scientifiques actuelles.
Réduction
Le nombre de groupes de l’étude a été réduit au minimum nécessaire afin de répondre à une hypothèse spécifique. Quand cela est rendu possible, les animaux sont utilisés pour plusieurs acquisitions d’imagerie afin de limiter le nombre total d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé, grâce à notre expérience en imagerie fUS, sur la base de calcul de puissance statistique compte tenu de la taille des effets observés, de la variabilité de la mesure hémodynamique, ainsi que de l’efficacité relative des transductions virales qui seront réalisées.
Raffinement
Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille de score et des points limites adaptés. La douleur sera réduite au maximum par l’administration d’analgésiques dès l’apparition de signes. En cas de signe de détresse, la procédure serait interrompue et si nécessaire, la mise à mort serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boîtes ou cylindres.
Choix des espèces
Le rat est fréquemment recommandé pour les études utilisant des dispositifs d'imagerie, car il représente un modèle animal pour lequel des données précliniques existent déjà, incluant l'administration de LPS et l'emploi des différentes techniques utilisées dans ce projet. Par ailleurs, lors de notre étude précédente, ce modèle a été utilisé afin de démontrer le lien direct entre la vasomotion et la neuroinflammation, constituant une base solide à cette nouvelle étude. Des rats adultes seront utilisés pour étudier les contributions des astrocytes dans le phénomène de vasomotion au sein de réseaux neurogliaux pleinement matures, dans des conditions expérimentales identiques à celles de notre étude précédente, afin d'assurer la robustesse et la comparabilité des résultats.
Travaux pratiques d’expérimentation animale et de pharmacologie en BUT
- Enseignement supérieur
Rats : 18
Réutilisées d'une séance de travaux pratiques à la suivante après au moins trois jours de récupération, puis tuées quand elles ne sont plus utiles, 3 125 souris et 18 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des étudiants apprennent sur eux la préhension, le marquage à la queue, la contention et l'injection intrapéritonéale, avec jusqu'à trois tentatives de piqûre par souris, lors de séances de trente minutes à deux heures. Les 18 rats reçoivent quatre injections intramusculaires d'immunisation avant d'être saignés à blanc sous anesthésie, leur sang alimentant les travaux pratiques d'immunologie de toute la promotion. Cinq séances sur animaux ont été supprimées et remplacées par de la vidéo et de la réalité virtuelle, ce qui fait passer l'effectif de 823 à 18 rats, le porteur jugeant toutefois "nécessaire" de maintenir des séances sur animaux vigiles.
Objectifs
Les enseignements d'expérimentation animale et de pharmacologie, répartis sur les trois années du BUT, ont pour objectif de former les étudiants au métier de technicien de laboratoire et de les préparer à la manipulation des petits animaux de laboratoire (rongeurs). Les étudiants doivent acquérir les connaissances théoriques et techniques indispensables à la manipulation des petits animaux de laboratoire au cours d'un projet de recherche, dans un contexte d'étude pharmacologique.
Bénéfices attendus
Au cours de leurs trois années de formation, les étudiants en BUT vont acquérir progressivement et durablement les connaissances théoriques et techniques indispensables à la manipulation des petits animaux de laboratoire au cours d'un projet de recherche, dans un contexte d'étude pharmacologique.
Procédures
Au cours de ce projet, les souris seront manipulés par des étudiants en formation, sous la surveillance permanente de personnel qualifié. Les interventions prévues sur les souris vigiles sont : préhension des souris (tunnel ou cupping), marquage des souris à la queue, pesée des souris pour détermination du volume d’injection, contention et injections intrapéritonéales (maximum 3 tentatives d'injection par souris), tests comportementaux (criblage de candidats médicaments anxiolytiques - 3 tests de chacun 3 min). La manipulation des animaux au cours de ces séances de travaux pratiques sur souris vigiles dure entre 30 min et 2h, en fonction des procédures. Au cours de ce projet, les rats seront manipulés par des techniciens habilités. Les interventions prévues sur les rats sont : préhension, marquage à la queue, contention et injections intra-musculaires pour immunisation (1 primo-injection et 3 rappels), prélèvement de sang total par exsanguination après prémédication et anesthésie. Ces interventions sur les rats sont de courte durée (5 à 30 minutes maximum).
Impact sur les animaux
Les étudiants de BUT, qui manipuleront les animaux, sont en formation et doivent acquérir les bons gestes techniques. L'apprentissage préalable des gestes sur vidéos puis mannequin-peluche de souris et sur peau artificielle, permettra de préparer les étudiants aux différents gestes. Toutefois, un stress peut être ressenti par l'animal. Une douleur peut être induite en cas de geste mal effectué lors des injections. Les formateurs qualifiés seront vigilants, afin de permettre au maximum la réalisation d'un geste correct. Le nombre de tentatives d'injection sera limité à trois pour chaque souris.
Devenir
Les souris sont réutilisées à des fins pédagogiques les jours suivants, après un temps de récupération d'au moins trois jours. Si les souris ne sont pas réutilisées, elles sont euthanasiées. Les rats sont euthanasiés. Du sang et des organes pourront être récupérés sur les animaux euthanasiés pour d'autres travaux pratiques.
Remplacement
Les enseignements d'expérimentation animale et de pharmacologie en BUT ont été totalement réorganisés. Cinq séances de travaux pratiques sur animaux ont été supprimées et remplacées par des TP en méthodes alternatives. Quatre de ces séances de travaux pratiques, impliquant la pose de cathéters sur modèle rat (trachée, jugulaire, carotide, vessie, cholédoque et duodénum) ont été remplacées par un apprentissage de la pose de cathéter par assistance vidéo puis en réalité virtuelle (Virtual3R). Une séance de travaux pratiques sur modèle Souris impliquant la nage forcée des animaux a été remplacée par une séance de TP par assistance vidéo. Il est cependant nécessaire maintenir des séances de formation sur animaux vigiles, afin de préparer correctement les étudiants à la manipulation des petits animaux de laboratoire (rongeurs) dans le cadre de leur futur métier de technicien de laboratoire.
Réduction
Les enseignements d'expérimentation animale et de pharmacologie en BUT ont été totalement réorganisés. Cinq séances de travaux pratiques sur animaux ont été supprimées et le nombre d'animaux dans les TP conservés a été réduit au maximum, ce qui nous a permis de réduire fortement le nombre d'animaux utilisés dans nos enseignements. Dans les DAP précédentes, encore en vigueur, correspondant aux enseignements d'expérimentation animale et de pharmacologie, un total de 823 rats et 4015 souris étaient prévus sur 5 ans. Cette nouvelle DAP prévoit 18 rats (réduction de 97,8% des rats) et 3125 souris (réduction de 22 % des souris) sur 5 ans.
Raffinement
Les rats seront hébergés à raison de 3 rats par cage pour limiter le phénomène dominant/dominé. Les souris seront hébergées en groupe, avec un matériel de nidification suffisant, pour limiter les pertes thermiques. Les animaux seront hébergés dans une animalerie contrôlée selon la réglementation en vigueur (température, ventilation, hygrométrie, photopériode) et dans le respect de la méthode des 3R, avec un enrichissement adapté à chaque espèce animale. Le milieu sera enrichi en objets permettant aux animaux de créer un environnement propice à leur développement et à leur épanouissement. Les soins seront apportés par du personnel qualifié (concepteur et applicateur des procédures expérimentales), dans le respect du bien-être animal. La nourriture sera en quantité suffisante pour que les animaux aient un accès à volonté. La surveillance quotidienne effectuée au sein de l’animalerie par le personnel qualifié, permettra de vérifier l'état sanitaire des animaux utilisés. En cas de douleur ou de fièvre suite à une procédure, un antalgique antipyrétique sera administré. Si l'animal est toujours douloureux ou fiévreux au bout de 3 jours, un avis du vétérinaire référent sera demandé. Le vétérinaire décidera de la médication nécessaire à l’animal et de la suite à donner au protocole (interruption définitive/poursuite). Par ailleurs, les enseignements d'expérimentation animale et de pharmacologie en BUT ont été totalement réorganisés. Les étudiants sont formés à la réglementation, à l'éthique animale, au bien-être animal avant toute formation aux gestes techniques. Puis, les étudiants sont formés aux gestes techniques sur souris à l'aide de vidéos, de mannequins peluches de souris et de peaux artificielles, préalablement à la manipulation sur souris vigiles. Au cours de la réalisation des gestes techniques par les étudiants, les formateurs qualifiés sont vigilants, afin de permettre au maximum la réalisation d'un geste correct. Le nombre de tentatives d'injection est limité à trois pour chaque souris.
Choix des espèces
Les étudiants du BUT sont formés sur souris, car la plupart des manipulations sur animaux en laboratoire sont réalisées sur modèles souris (plus petit mammifère utilisable). La récupération du sérum des animaux après immunisation est réalisée sur modèle rat, car cela permet d'avoir un prélèvement de sang total en volume suffisant pour la réalisation de travaux pratiques d'immunologie pour toute la promotion d'étudiants. Stade adulte : la taille et le poids des souris et des rats adultes sont nécessaires pour les expérimentations à mener.
Circuits neuronaux responsables de la genèse du signal directionnel des cellules du thalamus
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués par perfusion intracardiaque à l'issue. Chacun subit une chirurgie stéréotaxique de 45 à 90 minutes pour recevoir des vecteurs viraux dans le cerveau, et 90 d'entre eux portent ensuite un plot d'enregistrement de 5 à 10 grammes fixé sur le crâne, ce qui impose un hébergement individuel pendant environ six mois. Ils sont maintenus en restriction alimentaire pour qu'ils cherchent leur nourriture dans une arène, deux sessions par jour, pendant des mois selon la qualité du signal électrophysiologique. L'équipe compte utiliser les mêmes rats comme leurs propres témoins, avec et sans stimulation laser, une réduction du nombre d'animaux qui selon elle "n'augmente que marginalement les désagréments".
Objectifs
L’objectif principal est de comprendre comment l’activité des cellules dites ‘directionnelles’ est générée à partir des informations vestibulaires périphériques . Les cellules directionnelles sont des neurones présents dans le thalamus antérieur mais également dans d’autres structures corticales, qui s’activent lorsque la tête du rat pointe vers une direction précise. Ces cellules permettent à l’animal de s’orienter dans son environnement. Leur activité, particulièrement dans le thalamus, est sous le contrôle des informations provenant du système vestibulaire périphérique dans l'oreille interne. Ces informations vestibulaires sont vehiculées aux cellules directionnelles par deux structures du tronc cérébral: le noyaux supragénual et le noyau tegmental dorsal. Ces noyaux représentent le circuit responsable de la genèse des signaux directionnels thalamiques puisque la lésion de chacun de ces noyaux provoque une disparition de la modulation directionnelle des cellules directionnelles. Toutefois, leur rôle spécifique n’est pas connu. En parallèle de ces noyaux, la subdivision vestibulaire du cervelet (communément appelé vestibulo-cervelet) pourrait contribuer également à l'activité directionnelle puisque son activité pourrait générer un signal de vitesse de rotation de la tête centré sur le référentiel externe gravitationnel. L’objectif de notre projet est d’étudier le rôle exact des différentes composantes de ce circuit sur le contrôle des cellules directionnelles thalamiques. Pour cela nous allons réaliser des enregistrements électrophysiologiques de ces cellules chez des rats en comportement. Puis nous allons effectuer des perturbations de l'activité des structures cérébrales précitées, nous permettant de tester le rôle nécessaire et/ou suffisant de leur fonctionnement pour l’expression à la fois du comportement et de l’activité des cellules directionnelles. Ces trois approches (comportement, enregistrements et perturbations) forment une triade permettant de proposer des schémas interprétatifs solides sur la genèse des signaux directionnels, pouvant potentiellement aboutir à une vision d’ensemble de la contribution des signaux vestibulaires à la capacité de s'orientater dans l'espace.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à expliquer comment les signaux vestibulaires sont véhiculés aux structures cérébrales dont l'activité est nécessaire pour s'orienter correctement dans l'espace. Ceci permettra de mieux comprendre la nature et l'origine des déficits d'orientation spatiale et de mémoire qui sont générallement observés chez des patients ayant des atteintes du système vestibulaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux interventions principales: une procédure chirurgicale et une procédure comportementale couplée à l'enregistrement neuronal. La procédure chirurgicale a une durée comprise entre 45 et 90 minutes environ, en fonction de la présence ou absence de l'étape d'implantation du plot d'enregistrement. Pour la procédure comportementale, les animaux sont d'abord maintenus doucement par l'experimentateur pour permettre le brachement du cable d'enregistrement sur le plot. Cette étape a une durée de 30-60 secondes. Afin de minimiser le stress des animaux, ils sont habitués à cette legère contention avant et après la chirurgie, au cours des séances quotidiennes de manipulation. Puis ils sont introduit dans le dispositif comportemental. Chaque session comportementale a une dure de 20-30 minutes, durant lequel le rat doit explorer une arène ou une plateforme circulaire à la recherche de nourriture, à raison de 2 sessions par jour. Cette procédure peut perdurer pendant des mois, en fonction de la qualité du signal électrophysiologique.
Impact sur les animaux
Nuisance attendues : - la chirurgie stéréotaxique, sous anesthésie générale profonde, d'une durée comprise entre 45 et 90 minutes, entraîne une lésion et du stress. Cette chirurgie permet d’injecter les vecteurs viraux dans les structures cibles (N=100, tous les rats) et d’implanter les électrodes dans le thalamus antérieur (N=90 rats). 90 rats seront soumis à l’enregistrement de l’activité neuronale au cours de deux tests comportementaux (chacun ayant une durée de 30 minutes maximum) qui seront effectués 1 fois par jour (avec un délai de 2 heures environs entre les deux tests). - le plot d'enregistrement implanté en chronique entraîne une gêne modérée de par son encombrement et son poids (5-10 g), et impose un hébergement individuel pour préserver sa fonctionnalité. Il y a donc une restriction des interactions sociales durant environ 6 mois. De plus, Il y a donc un isolement social, et un protocole de contrôle alimentaire ayant pour but de motiver les animaux à l'obtention de récompenses alimentaires, et qui entraîne une faim modérée, qui est satisfaite lors des séances comportementales. - la manipulation pour le branchement du câble d'enregistrement nécessite une légère contention de l'animal pendant quelques secondes uniquement. - en fin d'expérimentation, les animaux sont mis à mort par perfusion intracardiaque, sous anesthésie et analgésie adaptée.
Devenir
A la fin des expériences tous les animaux seront mis à mort. Cette décision découle des objectifs de l'expérimentation, à savoir la réalisation des contrôles histologiques pour vérifier la bonne expression des opsines dans les strcutures cérébrales cible et la correcte implantation des électrodes. Elle est donc prise par les responsables du projet en accord avec la Structure du Bien Etre Animale (SBEA) de l'institut de recherche.
Remplacement
La nature même des expériences ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elles reposent sur l'étude du comportement des rats, ce qui ne peut pas être realisé à partir de modèles in vitro ou des modèles artificiels (basés sur des simulations sur ordinateur). Du fait du caractère invasif des procédures (injections intra-cérébrales virales, implantation d'électrodes) elles ne peuvent pas non plus être conduites chez l'humain.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux utilisés reflète la recherche d’un juste équilibre entre la nécessité de répliquer les observations pour obtenir des résultats statistiquement valables (les phénomènes étudiés pouvant présenter une variabilité interindividuelle importante, notamment dans l’étude du comportement) et celle de réduire la taille des effectifs. Pour cela nous allons utiliser une stratégie qui consiste en l’utilisation des mêmes animaux pour analyser les effets à la fois comportementaux et neuronaux des inhibitions optogénétiques. Les rats seront ainsi leur propre témoin en comparant les résultats obtenus durant les périodes avec et sans stimulation laser. Cette stratégie présente un réel bénéfice en terme de réduction du nombre d’animaux et en terme de pertinence scientifique et statistique tout en n’augmentant que marginalement les désagréments pour les animaux. Le nombre d’animaux ici présenté a été estimé sur la base de nos expériences antérieures à la fois sur le comportement et l'enregistrement de l'activité neuronale, et sur un test de puissance statistique permettant de reduire au maximum le nombre d'animaux tout en ayant suffisamment de données pour une inférence statistique valide.
Raffinement
Les animaux sont habitués à la manipulation et à la salle d’expérimentation pendant 10 jours avant le début du protocole expérimental afin de diminuer leur stress. La chirurgie stéréotaxique pour effectuer les injections intra-cérébrales couplées aux implantations d’électrodes est optimisée pour réduire la durée de l’opération (environ 45-90 min). La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique morphinique puissant à action prolongée est administré en préopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire est administré en début d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal. Les animaux ne présentent pas de signes de souffrance ni de stress après réveil de l’anesthésie gazeuse. Le personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Une grille d’évaluation clinique adaptée est mise en place pour déterminer les points limites adaptés et mettre en place des actions
Choix des espèces
La majorité des études portant sur la caractérisation des cellules directionnelles ont été réalisés chez le rat. De plus, notre travail s’inscrit dans la continuité d’études antérieures (publiées et en cours d’analyse) réalisées chez la même espèce. On pourra ainsi se baser sur des connaissances bien établies pour poursuivre ce projet et ainsi éviter de multiplier les expériences et l'utilisation d'un grand nombre d'animaux. Les animaux seront testés à l'âge adulte. A cette âge les réseaux neuronaux sont suffisament matures et l'activité des cellules directionnelles bien stable. Peu d'études se sont intéressés à la caractérisation des propriétés des cellules directionnelles au cours du développement, alors que la grande majorité des travaux publiés ont été effectués chez des rats adultes. Ceci nous permet de se réferer à un grand nombre de données connues, reduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaire pour réaliser notre projet.
Formation sur les techniques d’administration et de prélèvement de sang chez le rongeur
- Formation professionnelle
Rats : 400
550 souris et 400 rats vont être utilisés pour que des expérimentateurs apprennent des gestes sur eux, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, tous tués à l'issue et certains réutilisés d'une session à l'autre. Pendant deux semaines, chaque animal reçoit du solvant par gavage jusqu'à dix fois, ou par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse caudale ou rétro-orbitaire, puis subit des séries de une à trois ponctions sanguines sur vingt-quatre heures. Des femelles gestantes et des souriceaux nouveau-nés sont inclus, et les prélèvements au sinus rétro-orbitaire ne cessent définitivement que lorsque l'œil apparaît mi-clos, asséché ou collé. Les mannequins de formation existent mais "ne permettent pas d'appréhender l'intégralité des gestes" ni de reproduire le comportement d'un animal vigile, ce dont le porteur conclut que l'emploi d'animaux non-humains est "indispensable".
Objectifs
Pour permettre une avancée des programmes de Recherche et Développement, qu’ils soient internes ou pour des clients, des études in vivo sont effectuées. Dans ces études, le profil pharmacocinétique et les propriétés pharmacologiques de nouvelles molécules sont évalués. Leur but ultime est de répondre à un besoin thérapeutique non comblé pour diverses pathologies. Ces études sont menées chez le rongeur (souris ou rats). Elles nécessitent l’emploi de diverses techniques d’administration et de prélèvement de sang pour étudier les molécules d’intérêts qui auront été préalablement sélectionnées sur la base de tests in vitro. Une bonne réalisation de l’ensemble de ces gestes apparaît donc comme étant primordiale. L’objectif de ce projet est de former et de valider tout expérimentateur présentant un besoin pour une ou plusieurs techniques d’administration et/ou de prélèvement non maîtrisée(s) ou un maintien de compétences.
Bénéfices attendus
Le stress chez l’animal peut avoir un impact majeur sur la qualité des résultats obtenus. De par une formation et une validation du personnel en amont, ce projet permettra de réduire le stress et la souffrance animale pouvant être causés par un geste mal réalisé. Ainsi, il contribuera à raffiner les techniques, préserver le bien-être animal, augmenter la robustesse des résultats dans les programmes de Recherche et Développement et à réduire in fine le nombre d’animaux nécessaires dans les études in vivo.
Procédures
1/ Administration de solvant pendant 2 semaines soit par gavage oral, soit par injection sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse (1 fois/jour maximum) : 10 fois pour la voie orale, 6 fois pour la voie sous-cutanée, intrapéritonéale et intraveineuse caudale, 4 fois pour la voie intraveineuse rétro-orbitaire, durée : quelques secondes 2/ Micro-prélèvements de sang réalisés sur animal vigile, une série d’1 à 3 ponction(s) sur 24 heures (veine caudale, submentale ou saphène), 2 ou 3 séries maximum sur une période de 2 ou 4 semaines, durée : quelques secondes 3/ Prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse à la veine subclavière, jugulaire ou au sinus rétro-orbitaire, 1 ou 2 prélèvement(s) maximum sur une période de 2 ou 4 semaines, durée : environ 2-3 minutes 4/ Anesthésie gazeuse pour les prélèvements sanguins puis la mise à mort, une fois dans une procédure, durée : environ 5 minutes
Impact sur les animaux
Au cours d’une session de formation chez le rongeur (souris ou rat), les effets indésirables associés aux différentes techniques d’administration et de prélèvement sont : - un inconfort lié au geste - un stress lié à l’anesthésie, seulement pour certaines voies d’administration/prélèvement - un hématome au point de ponction lors d’un prélèvement de sang
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale.
Remplacement
À ce jour, les mannequins de formation (souris et rats) ne permettent pas d’appréhender l’intégralité des gestes requis dans nos études in vivo, tous les stades de développement d’un animal, ni même de mimer le comportement d’un animal vigile au cours de sa manipulation. C’est pourquoi, l’emploi d’animaux est indispensable. À noter qu’en amont de toute formation, les personnes à former prendront connaissance des différents gestes à réaliser par le biais de vidéos, bibliographie et/ou procédures.
Réduction
Pour chaque session de formation, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant d’atteindre l’objectif fixé : une validation du personnel aux différents gestes techniques. Il sera fonction du nombre de personnes à former par an. De plus, pour certaines procédures, sous réserve de l’absence de signes cliniques et dans le respect des exigences réglementaires, les animaux issus d’une session de formation pourront faire l’objet d’une réutilisation, ce qui participera à diminuer le nombre d’animaux.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant toute manipulation. Hébergement : Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (enrichissement jetable ou autoclavable). Pour les femelles gestantes, un enrichissement adapté à la nidation sera fourni. Durant la période périnatale, les changes seront limités au maximum afin de ne pas perturber la mise bas ou l’interaction mère-petits. Si le nouveau-né reste à l’écart de la mère, il faudra impérativement le remettre dans le nid. Administration et prélèvement : Afin de palier l'inconfort lié à certains gestes, un programme d'anesthésie sera effectué. En cas de signes de douleur, une analgésie sera réalisée et s’accompagnera d’un arrêt temporaire des administrations/prélèvements. Pour le sinus rétro-orbitaire, une goutte d’anesthésique local sera instillée sur l’œil de l’animal 1 à 2 minutes avant chaque administration ou prélèvement. Les administrations/prélèvements au sinus rétro-orbitaire seront définitivement arrêtés lors de l’observation d’un œil mi-clos/asséché/collé. Le traitement impliquera un nettoyage quotidien de l’œil à l’aide d’une compresse imbibée de sérum physiologique suivi du dépôt d’une goutte de gel ophtalmique jusqu’à la guérison de l’œil. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse pouvant être infligées aux animaux, une surveillance journalière ainsi que des points limites précoces et spécifiques ont été établis conduisant à la mise à mort anticipée de l’animal. Lors de la mise à mort, les animaux seront placés sous anesthésie profonde.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris et des rats à un stade adulte, de la même façon que dans la majorité des études in vivo des programmes de Recherche et Développement. Certains de nos modèles in vivo requièrent des souris au stade nouveau-né ainsi des souriceaux seront également employés.
Etude de la dépression corticale envahissante chez le rat vigile et anesthésié
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le crâne aminci et une canule posée au contact des méninges, 80 rats reçoivent des agents déclencheurs de migraine puis subissent des tests de sensibilité douloureuse de la face, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La chirurgie dure 45 minutes, après quoi chaque rat est isolé pour protéger le dispositif implanté, et tous sont tués à l'issue d'enregistrements menés sous anesthésie sans réveil. Le projet vise à obtenir des dépressions corticales spontanées chez le rat vigile, en comparant un groupe au crâne aminci et un groupe au crâne intact. Le porteur range la douleur induite par le modèle parmi les nuisances du projet, tout en présentant le test de sensibilité faciale comme limité puisque le rat est libre de ses mouvements et peut se soustraire à la stimulation.
Objectifs
Jusqu’à présent, l’obtention de la dépression corticale (CSD, activation massive des neurones puis inhibition de ces derniers) en recherche préclinique nécessite l’injection de chlorure de potassium (KCl). Le KCl va déclencher une activation suivie d’une inhibition des neurones similaire à celle qui se produit dans le cerveau lors d'une crise de migraine avec aura (phénomène neurologique où le patient perd une partie de son champ visuel). Cependant, notre objectif serait d’obtenir des CSD spontanées après une sensibilisation du cortex, comme c’est le cas chez les migraineux. Des collègues ont mis en évidence que l’amincissement de l’os crânial provoquait des activations semblables à celles que l’on voit lors des CSD. Dans ce projet, nous voulons mettre au point un modèle d'enregistrement de CSD chez le rat vigile en comparant le modèle où on crée une sensibilisation en amincissant l’os crânial vs un modèle où l’os n’a pas été aminci.
Bénéfices attendus
A moyen terme, ce projet a pour but d’améliorer les outils existants dans la recherche pré-clinique pour étudier la physiopathologie de la migraine avec aura. Si nous arrivons à identifier de nouveaux acteurs ainsi que leurs rôles, cela nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. A plus long terme, ces études peuvent aider à développer de nouveaux traitements pour soulager les patients souffrant de migraine avec aura.
Procédures
Les interventions dans ce projet sont prévues sur une durée maximale de 3 semaines. 1/ Injections intrapéritonéales afin d'induire l’anesthésie pour la chirurgie. 2/ Réalisation d'une chirurgie (durée 45min). 3/ injection d'agents migraineux sur les méninges à travers la canule sous anesthésie générale brève à l’isoflurane. 4/ Le test de sensibilité cutanée sur la face du rat.
Impact sur les animaux
Les nuisances identifiées pour le bien-être des animaux sont : la chirurgie (implantation des canules, amincissement de l’os) qui provoque une douleur post-opératoire, la sensibilité douloureuse liée au modèle de migraine la séparation des animaux après la chirurgie.
Devenir
Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par par des enregistrements chez l’animal anesthésié sans réveil : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. Ainsi dans chaque lot, nous aurons 10 animaux. Notre expérience nous a appris que nous avions environ 20% de pertes d’animaux à cause de la chirurgie, de la perte des canules ou encore des canules qui pourraient se boucher ou encore la perte du signal de courants corticaux, ou des vis d'enregistrement. A cela s’ajoute l’effet discriminant lors du test de sensibilité de la face et de la réponse électrique des neurones entre les différents groupes. Une fois l’expérience chez l’animal vigile terminée, nous réaliserons des enregistrements chez l’animal anesthésié pour obtenir plus de données et éviter un nouveau groupe d’animaux.
Raffinement
Les nuisances identifiées sur le bien-être des animaux sont : la douleur engendrée par les chirurgies, la douleur engendrée dans le cadre du modèle, et la séparation des animaux après la mise en place de la canule sur les méninges. Afin de réduire la douleur de la chirurgie, un traitement antalgique sera donné pendant 3 jours. La cornée est protégée pendant la chirurgie. Par ailleurs, la chirurgie est effectuée sous anesthésie générale, les animaux sont placés sur une couverture chauffante pendant tout le temps de la chirurgie. Le zone d'incision est désinfectée avec une solution antiseptique et elle sera la plus petite possible. La chirurgie est réalisée par une personne expérimentée pour qu’elle dure le moins de temps possible. Nous veillons à ce qu’il n’y ait aucune hémorragie à la fin de la chirurgie. Les animaux sont gardés dans la pièce de chirurgie en observation jusqu'à leur réveil complet. Concernant la douleur générée par le test de sensibilité de la face, nous en limitons la durée et l’intensité au minimum et l’animal a la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les animaux seront ensuite observés tous les jours par l’expérimentateur. Ils seront pesés tous les jours, leur vitalité sera vérifiée (déplacement, alimentation, état général, comportement douloureux). Avant chirurgie, les animaux sont hébergés dans des conditions standard. Pour améliorer le bien-être des animaux, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher avant la chirurgie. Après l’implantation de la canule, les animaux auront un hébergement individuel afin de protéger les dispositifs expérimentaux. Les rouleaux seront remplacés (protection des dispositifs expérimentaux) par des feuilles de sopalin blanc et des lanières de papier kraft pour permettre aux animaux de faire un nid. Au cours de l'expérimentation, les animaux seront observés tous les jours pour déterminer la présence ou non d’un ou plusieurs points limites adaptés à notre expérimentation. Selon notre arbre décisionnel, nos points limites seront considérés comme les critères d’arrêt des souffrances des animaux et entraineront la mise à mort de l’animal après une sédation.
Choix des espèces
Le rat de souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 7-12 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.
Evaluation de candidats médicaments dans des modèles de neurodégénérescence chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2417
Un lot d'animaux déjà lésés est conservé pour tester deux substances à la suite, à trois doses, ce que le porteur présente comme une utilisation continue. 3 437 rongeurs vont être utilisés, 1 020 souris et 2 417 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, tous tués à l'issue parce que les symptômes neurodégénératifs induits sont jugés incompatibles avec un maintien en vie. Les modèles reposent sur des injections de substances neurotoxiques, des chirurgies cérébrales de 30 à 60 minutes, une alimentation contenant un composé toxique pendant cinq semaines, puis jusqu'à trois heures de tests moteurs par jour pendant huit semaines. Le porteur décrit des déficits moteurs et mnésiques ainsi qu'une agressivité transitoire de trois semaines après administration du neurotoxique du modèle Alzheimer, et affirme que les candidats les plus prometteurs sélectionnés sur cultures de neurones doivent ensuite être éprouvés sur des animaux.
Objectifs
Le projet consiste à évaluer l'efficacité de nouveaux candidats à inhiber l'apparition de symptômes moteurs ou cognitifs (traitement neuroprotecteur et neurorégénérateur) sur des modèles animaux mimant des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques ou une lésion cérébrale telle qu'une ischémie cérébrale. Ces maladies à un stade avancé sont invalidantes, voire mortelles en fonction de la position du caillot au niveau cérébral. Il n’existe, à ce jour, aucun traitement pour stopper la progression de la maladie de Parkinson ou d'Alzheimer ou protéger les cellules lors d'une ischémie cérébrale. Des traitements thrombolytiques utilisés rapidement après l'apparition d'une ischémie cérébrale permettent de désagréger le caillot formé et rétablir la circulation sanguine. Des traitements symptomatiques sont également utilisés lors de poussées inflammatoires dans la sclérose en plaques ou pour limiter les symptômes (remplacement de la dopamine chez les parkinsoniens et augmentation des niveaux d'acétycholine pour la maladie d'Alzheimer). Des traitements immunomodulateurs sont également utilisés pour diminuer la fréquence des poussées et la progression de la sclérose en plaque. La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité et l'espérance de vie des patients. Pour ce faire, les troubles neurologiques peuvent être induits par l'administration d'une substance chimique neurotoxique par voie orale, par voie systémique, directement au niveau intra-cérébral ou par une action mécanique (occlusion d'une artère cérébrale par exemple).
Bénéfices attendus
La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de maladies neurodégénératives ou ayant subi une accident vasculaire cérébral (AVC). A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitements curatifs pour lutter contre la maladie de Parkinson ou la maladie d'Alzheimer. Les médicaments disponibles sur le marché permettent de limiter les symptômes dans un premier temps mais leurs utilisations restent limitées car ils ne stoppent pas la progression des maladies. Les traitements disponibles pour limiter la progression de la sclérose en plaques ne permettent pas de stopper complétement la maladie. Les traitements thrombolytiques utilisés lors d'un AVC permettent de rétablir la circulation sanguine mais aucune thérapie n'est disponible pour limiter les séquelles physiques. Il est donc important de pouvoir proposer des modèles translationnels pour pouvoir tester de nouveaux candidats médicaments dans ces différentes pathologies très invalidantes.
Procédures
Pour chaque procédure, les candidats médicaments sont administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat médicament. Le modèles de maladie de Huntington est induit par l’administration chronique de la substance réactive sur 5 jours; chaque administration dure environ 1 à 2 secondes. Des tests comportementaux moteurs (durée max =60 minutes et entre 1 et 3 tests sur 1 à 5 jours) peuvent être réalisés avant euthanasie des animaux et prélèvement d'organes. Pour mimer la sclérose en plaque, les animaux sont nourris avec des aliments contenants la substance réactive sur une durée de 5 semaines. Des tests comportementaux moteurs peuvent être réalisés pendant ces 5 semaines (maximum de 3 tests sur 1 heure, 1 fois par semaine). A la fin des expériences, des prélèvements d'organes peuvent être réalisés après euthanasie des animaux. Certains modèles de la maladie d'Alzheimer, de Parkinson, des modèles de mort cellulaire ou d'accident vasculaire nécessitent une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. Cette intervention dure entre 30 et 60 minutes. Les animaux sont ensuite évalués dans différents tests moteurs (durée maximum = 3 heures par jour, 1 à 2 séries de tests par semaine sur 8 semaines maximum) ou non-moteurs (tests mnésiques réalisés quotidiennement pendant environ 1 h sur 4 à 5 semaines). Des prélèvements d'organes peuvent être réalisés après euthanasie des animaux. Pour chaque modèle, les animaux recevront une substance test de manière aigue ou de manière chronique au cours de l’expérience. Classiquement, les administrations par bolus durent de l’ordre de la seconde. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude (1 à 2 prélèvements avec au minimum une semaine d'intervalle, chaque prélèvement dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier ou de l'induction d'une anesthésie gazeuse. L'injection d'une substance neurotoxique peut induire une douleur post-opératoire chez l'animal. Des problèmes de cicatrisation peuvent également être observés, notamment si l'animal se gratte. Les modèles utilisés pour mimer certains aspects de la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington ou la sclérose en plaque peuvent induire des déficits moteurs légers à modérés (incoordination motrice). Dans les modèles de la maladie de Parkinson ou d'Alzheimer, les déficits attendus peuvent être d’ordre mnésique. Une agressivité transitoire peut être observée suite à l'administration de la substance neurotoxique dans le modèle de la maladie d'Alzheimer (comportement observé sur environ 3 semaines et qui diminue dans le temps). Certains tests mnésiques nécessitent un rationnement en nourriture pouvant causer un léger stress chez l'animal, mais pas de perte de poids (rationnement adapté pour éviter la perte de poids et récompense sous forme de nourriture donnée pendant le test). Le modèle d'accident vasculaire entraîne des déficits moteurs légers (difficulté à marcher, à coordonner les mouvements mais l'animal bouge quasiment normalement), modérés (réduction des déplacements) ou sévères (l'animal ne bouge presque pas).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences car ces modèles induisent des symptômes neurodégénératifs, incompatibles avec le maintien en vie des rongeurs dans de bonnes conditions.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives exploratoires permettant de screener un grand nombre de traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de limiter le nombre d'animaux utilisés et de sélectionner les meilleurs candidats médicaments. Ces tests ont été mis en place au laboratoire. Néanmoins, l'efficacité des traitements les plus prometteurs doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux), permettant l'évaluation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux, par exemple.
Réduction
Dans ce projet, des modèles cellulaires sont utilisés pour pouvoir séléctionner les meilleurs candidats médicaments et pouvoir limiter le nombre d'animaux à tester sur des modèles plus complexes. Dans le cas des études chez l'animal vivant, les substances à tester ont déjà subi une phase de sélection afin de réduire le nombre d'animaux vivants testés. Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées. Les données seront analysées statistiquement avec des tests appropriés. Enfin, pour certains tests, un lot d'animaux est lésé et est gardé pour tester plusieurs substances à la suite (utilisation continue pour tester 2 substances à 3 doses).
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Pour chaque phase chirurgicale, une anesthésie sera associée à un protocole d'analgésie avant le début de la chirurgie jusqu'à 48 heures après l'opération. Un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire. Une substance analgésique est également injectée au niveau de la zone à inciser au niveau du crâne. L’animal sera placé sur une couverture chauffante au début de l’anesthésie jusqu'à reprise de la marche pour maintenir sa température corporelle. Dans la plupart des modèles de neurodégénerescence, l'évaluation comportementale peut être complétée par des marquages histologiques au niveau cérébral afin de raffiner le modèle. Les animaux sont maintenus en groupe pendant toute la durée des expériences, avec un environnement enrichi dans les cages d'hébergement. Des points limites stricts ont été définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
Les études sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Par exemple, les substances anti-parkinsoniennes mises sur le marché ont été découvertes en utilisant des modèles pré-cliniques chez le rongeur. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études réalisées et aussi en fonction de la disponibilité de la molécule. On utilisera de préférence la souris lorsque la molécule est en quantité limitée. Dans certains cas, le modèle a été démontré pertinent que chez une espèce. Les animaux transgéniques inclus dans ce projet sont bien décrits dans la littérature et permettent de modéliser une maladie neurodégénérative d'ataxie-télangiectasie. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis la période post-sevrage jusqu'à l'âge adulte.
Distribution de nanoparticules de polyéthylène téréphtalate (PET) radiomarquées chez le rat après administration intratrachéale
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
L'exposition professionnelle aux nanoplastiques, sur les sites de recyclage ou en impression 3D, sert de motif à ce suivi de nanoparticules de plastique PET dans l'organisme. 40 rats, 20 femelles et 20 mâles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chacun est intubé et reçoit dans la trachée une solution de nanoparticules marquées au carbone 14, avant réveil par antidote, puis un séjour d'un à cinq jours en cage à métabolisme pour collecter urines et selles. Ils sont tués par groupes de quatre à 1 heure, 4 heures, 24 heures, 7 jours et 28 jours, pour mesurer la radioactivité du sang, des poumons, du foie, des reins, de la rate, du cerveau et des organes reproducteurs. Le porteur retient le rat comme l'espèce préconisée par les recommandations de l'OCDE en toxicocinétique.
Objectifs
Les nanoplastiques sont omniprésents dans l’environnement mais aussi sur certains lieux de travail (sites de recyclage, usines de production de textiles, entreprises d’impression 3D,…). Cependant peu de d’informations sont disponibles quant à leur devenir dans l’organisme à la suite de l’exposition des salariés. En milieu professionnel, l’inhalation est la voie majeure d’exposition à ce type de particules. Afin de suivre la distribution dans l’organisme, la méthode la plus sensible consiste à utiliser des particules radiomarquées. Ce projet a donc pour objectif d’étudier le devenir et la distribution dans l'organisme ainsi que l'élimination (toxicocinétique) sur une période maximale de 28 jours chez le rat de nanoparticules de polyéthylène téréphtalate (PET) marquées avec un traceur radioactif, le carbone 14. Cette analyse de toxicocinétique se fera après l'administration directe des nanoparticules dans le poumon de rats après intubation de l'animal sous anesthésie générale (administration par instillation intratrachéale).
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances nouvelles sur la toxicocinétique de nanoparticules de PET. Au-delà des données de biodistribution, il pourra aider à développer des modèles de toxicocinétique permettant de limiter le recours aux animaux de laboratoire. Il sera aussi une source d'information sur la potentielle dangerosité de ces nanoparticules administrées par voie pulmonaire dans d'autres organes que le poumon en fonction des quantités détectées.
Procédures
Cinq groupes de 4 rats femelles et cinq autres groupes de 4 rats mâles recevront, sous anesthésie (à l'aide de médicaments spécifiques), une solution contenant des nanoparticules marquées avec un traceur radioactif, le carbone 14 par instillation dans les voies respiratoires. Après l'administration, les rats seront réveillés grâce à une injection d'un médicament antidote spécifique. L'ensemble de l'expérience (anesthésie, instillation, et réveil des animaux) ne durera pas plus d'une heure. Les rats seront ensuite mis à mort à différents temps : 1 heure, 4 heures, 24 heures, 7 jours et 28 jours après l'administration des nanoparticules. Les animaux seront mis à mort dans le respect du bien-être animal. Divers fluides et organes (sang, poumon, ganglions lymphatiques proches des poumons, foie, reins, rate, cerveau, organes reproducteurs mâles et femelles) seront prélevés pour mesurer la radioactivité qu'ils contiennent. Les rats mis à mort 24 heures après l'administration de nanoparticules seront placés dans des cages spéciales (cages à métabolisme) pendant cette période post administration de 24 heures afin de collecter leurs urines et leurs selles. Ceux mis à mort après 7 jours ou 28 jours seront également placés dans le même type de cages pendant une période pouvant aller jusqu'à 5 jours, en fonction des niveaux de radioactivité observés dans leurs urines et leurs selles.
Impact sur les animaux
Au-delà de l’inconfort causé par l’anesthésie et l’instillation intratrachéale, le projet aura un impact limité sur le bien-être des animaux. Le placement en cage à métabolisme pendant 24 h ou jusqu'à 5 jours pour les temps post-exposition 7 jours et 28 jours consistera la plus grande source d’inconfort post-exposition. Il n’est pas attendu que la quantité de particules administrée ou la dose de radioactivité aient une incidence majeure sur la santé des animaux.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de collecter le sang et les tissus d’intérêt dans l’objectif de quantifier la radioactivité présente et ainsi estimer la biodistribution des nanoparticules.
Remplacement
A ce jour, en l’absence de connaissances suffisantes, il est nécessaire d’utiliser des animaux de laboratoire pour étudier la biodistribution dans l'organisme entier et l’excrétion de nanoparticules de PET. Ces travaux concourront cependant à développer des modèles mathématiques de toxicocinétique permettant à terme de limiter le recours à des animaux de laboratoire.
Réduction
Grâce au recours à des nanoparticules de PET radiomarquées, il ne sera pas nécessaire de disposer de groupes témoins pour analyser les résultats. Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum nécessaire pour pouvoir interpréter les résultats. Enfin, cette étude portera tout d’abord sur le temps 24 heures. Les temps plus courts (1 et 4 heures) ou longs (7 et 28 jours) ne seront réalisés qu’en fonction des résultats obtenus sur les temps courts et de la sensibilité de la méthode.
Raffinement
Les administrations par instillation intratrachéale seront réalisées sous anesthésie. En dehors de la période de 24 heures (ou éventuellement 5 jours pour les groupes 7 jours et 28 jours) en cage à métabolisme, les animaux seront hébergés par deux en présence d’enrichissement adapté (tunnel en polycarbonate rouge). Au vu des données de la littérature et de notre expérience, les procédures expérimentales utilisées dans ce projet ne sont pas considérées comme générant une souffrance sévère chez l’animal. Les points limites suivants seront cependant appliqués: 1) perte de poids supérieure à 20% au cours de la procédure; 2) modification de l'apparence physique (défaut de toilettage, piloerection importante); 3) altération de la respiration; 4) difficulté à se mouvoir et 5) détresse marquée lors de la manipulation. L’atteinte de points limite entrainera la mise à mort de l’animal dans le respect du bien-être animal. L'évaluation de cette atteinte de points limites sera réalisée au travers d'une grille de score.
Choix des espèces
Le rat de laboratoire possède un système pulmonaire relativement évolué présentant de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. Les données de toxicocinétique chez cette espèce sont extrapolables à l’être humain. Le rat est l’espèce préconisée dans les recommandations internationales (en particulier celles de l'OCDE) relatives à l'étude de la toxicocinétique des agents chimiques. Des animaux jeunes adultes de 10 semaines seront utilisés. Cela correspond à un stade du développement en accord avec les études de toxicologie qui requièrent des animaux jeunes et exempt de toute pathologie.