Rats

Fournir un modèle expérimental pour tester des traitements des complications oculaires du diabète : 2 180 souris et 2 180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils sont rendus diabétiques par une injection de streptozotocine qui détruit les cellules du pancréas produisant l'insuline, puis une kératopathie leur est provoquée sur un œil après huit à seize semaines de diabète. Le porteur indique qu'au bout d'un mois les rats malades pèsent 50 à 60 % du poids des rats témoins du même âge, et décrit les examens oculaires comme semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet. Les gouttes peuvent être administrées six à huit fois par jour et les injections dans l'œil une à deux fois par semaine, pour des études d'efficacité relevant en partie de l'usage réglementaire.

Objectifs

Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une cascade d’évènements impliquant des médiateurs de l’inflammation qui conduisent à la dégradation des cellules neuronales et des capillaires sanguins de la rétine.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine et de la cornée qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et preserver au mieux la visions des patients.

Procédures

L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection intrapéritonéale d’une molécule qui rend les animaux diabétiques. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à trois fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal ou au niveau de la mandibule. L'induction de la kératophatie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique après une période de 8 et 16 semaines de diabète, la procédure ne durera pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les animaux sont rendus diabétiques par injection de Streptozotocine. La streptozotocine détruit les cellules du pancréas qui ne produit plus d’insuline et ne peut plus controler la glycémie. L’hyperglycémie altère vaisseaux et nerfs avec une répercussion sur différents organes, comme la neuropathie, les troubles cardiovasculaires, la néphropathie, et la rétinopathie. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris et serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. Le recours à un modèle animal est nécessaire en raison de la physiologie particulière l'oeil composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen) en interaction les uns avec les autres. Le développement de la kératopathie diabétique ne peut être mimé par un modèle alternatif.Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, la litière sera changée plus fréquemment (1 fois par jour), et un biberon supplémentaire sera ajouté. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit sur ces espèces dans la littérature et l’apparition des signes cliniques recherchés de la cornée diabétique est bien documentée chez la souris pigmentée (Young L, et al 2014) ou le rat albinos. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabète conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.

Pour reproduire le syndrome des ovaires polykystiques et y tester des composés pharmacologiques, des souris et des rats reçoivent, certains dès 3 à 4 semaines d'âge, des hormones sexuelles ou d'autres molécules qui dérèglent leur équilibre hormonal, chaque jour ou par un dispositif sous la peau, pendant 1 à 24 semaines. 1072 rongeurs, 536 souris et 536 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs ovaires. Les rongeurs reçoivent en plus le composé testé, un témoin négatif ou une molécule de référence, un frottis vaginal par jour pendant au moins 14 jours et, selon les protocoles, des prises de sang et d'urine jusqu'à une fois par semaine. Selon le porteur, l'excès d'androgènes et les follicules immatures entraîneraient une infertilité et "ne devraient pas provoquer d'autres effets indésirables", mais il ne nomme ni les hormones ni les molécules employées. Il justifie le choix des rongeurs par le souci d'utiliser les espèces "les moins sensibles du point de vue neurophysiologique".

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la maladie hormonale la plus fréquente chez les femmes en âge de procréer, touchant environ une femme sur dix dans le monde. Il se caractérise par un dérèglement hormonal, une production excessive d’androgènes (comme la testostérone), des règles irrégulières et la formation de follicules inachevés dans les ovaires. Le SOPK est l’une des principales causes d’infertilité. L’origine du SOPK n’est pas clairement identifiée, mais elle est probablement multifactorielle (génétique, épigénétique, environnementale). Un lien est souvent rapporté entre l’excès d’androgènes, la résistance à l’insuline et l’obésité, avec environ 35 à 50 % des patientes avec un SOPK qui sont obèses. Les symptômes varient selon les personnes : pilosité excessive, perte de cheveux, acné, règles irrégulières ou absentes. Ces symptômes évoluent avec l’âge, l’hypersécrétion des androgènes aggravant la résistance à l’insuline. Le SOPK augmente aussi le risque de syndrome métabolique (surpoids, dyslipidémie, hypertension, troubles de la glycémie), conduisant à l’insulinorésistance, au diabète de type 2 et aux maladies cardiovasculaires. Il accroît également le risque de cancer de l’endomètre. Le SOPK est une maladie chronique, et actuellement incurable. La prise en charge des patientes vise à améliorer les symptômes par des changements de mode de vie et ou des traitements médicamenteux. La recherche médicale est donc très active, cherchant à comprendre les dysfonctionnements et à développer de nouveaux traitements, notamment des traitements curatifs. Des modèles animaux de SOPK sont décrits dans la littérature, principalement chez les rongeurs. Ceux-ci sont développés via des modifications génétiques, des manipulations environnementales (exposition au stress ou lumière constante) ou l’induction de taux élevés d’hormones sexuelles, parfois combinée à l’induction du diabète (lignée de rongeurs diabétiques ou alimentation riche en graisses (type Western ou High-fat-diet, HFD). Ce projet vise donc à développer des modèles animaux pertinents, afin de mieux comprendre la physiopathologie du SOPK et de contribuer à la recherche de nouveaux traitements, curatifs ou symptomatiques.

Bénéfices attendus

Selon l’Organisation mondiale de la santé, le SOPK est un problème de santé publique important et l’un des troubles hormonaux les plus courants chez les femmes en âge de procréer. La maladie touche environ 8 à 13 % des femmes en âge de procréer. Les effets biologiques et psychologiques du SOPK, en particulier ceux liés à l’obésité, à l’image du corps et à l’infertilité, peuvent entraîner des problèmes de santé mentale et une stigmatisation sociale. D’après l’Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm, dossiers SOPK), un des enjeux de la recherche sur le SOPK est le développement de nouveaux traitements qui permettraient de résoudre toutes les complications à la fois, en s’attaquant à la cause du problème et non à chacun des symptômes séparément. Ce projet de recherche permettrait la mise en place d’un modèle robuste et valide de SOPK chez le rat et la souris. Ensuite, l’évaluation de nouveaux traitements du SOPK sur ces modèles animaux, donc une preuve de concept préclinique, avant les essais chez l’homme.

Procédures

Pour l’induction du SOPK, les animaux vont recevoir un traitement par des hormones sexuelles ou autres molécules entraînant un déséquilibre hormonal. Ce sera une administration par jour par voie orale ou parentérale, ou via un dispositif sous-cutané permettant une libération prolongée, pendant 1 à 24 semaines. En plus, les animaux vont aussi recevoir une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et d’une molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 24 semaines). Des frottis vaginaux seront réalisés chez les animaux, une fois avant le début des traitements, puis une fois par jour pendant au moins 14 jours consécutifs afin de déterminer la présence de SOPK. Enfin, si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés jusqu’à une fois par semaine pendant la durée de l’étude. Chaque prélèvement, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes

Impact sur les animaux

L’administration des composés, la réalisation des frottis vaginaux et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress et/ou une sensation d’inconfort passager chez les animaux. L’excès d’hormones androgènes et la formation des petites follicules ovariens immatures entraîneraient une infertilité mais ne devraient pas provoquer d’autres effets indésirables chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, un prélèvement des ovaires est indispensable pour mettre en évidence le SOPK et l’efficacité ou non d’un traitement.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer l’efficacité d’un principe actif sur le SOPK. En effet, le syndrome est le résultat d’un ensemble de désordres hormonaux et tissulaires, faisant appel à l’axe hypothalamo-hypophysaire et atteignant en même temps le cerveau et les organes.

Réduction

La réalisation des études se fera de façon à limiter le plus possible le nombre d’animaux utilisés. Une étude pilote sera réalisée pour la validation du modèle. L’évaluation d’un nouveau traitement se fera seulement lorsqu’un modèle robuste et valide sera obtenu. Comme utilisé par les autres équipes de recherche dans la littérature, le nombre d’animaux par groupe sera entre 5 et 8 au début du projet. Ce nombre sera ensuite affiné après la récolte des premières données avec des tests statistiques. Des tests statistiques seront aussi réalisés pour comparer les paramètres mesurés dans les groupes d’animaux étudiés. Pour une petite population, le t-test non apparié sera utilisé pour les comparaisons 2 à 2 et une analyse de variance à 1 ou 2 facteurs pour les comparaisons multiples.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les animaux sont hébergés en groupe dans les cages (2 rats et jusqu’à 5 souris) afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Des points limites adaptés ont été fixés pour la réalisation du projet. L’atteinte d’un point limite sera signalé par le zootechnicien à un responsable des soins et au responsable du projet. Le cas échéant, si les symptômes sont réversibles, l’animal sera sorti de l’expérience et des procédures de soins peuvent être mis en place avant une éventuelle ré-inclusion dans l’étude. Si les symptômes sont irréversibles, l’animal sera euthanasié. Toute décision (sortie de la procédure en cours, soins ou euthanasie) sera prise en concertation avec le responsable du projet, le vétérinaire référent, et/ou le responsable de la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le responsable de la plateforme animalerie.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs, que ce soit le rat ou la souris, sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche dans les modèles de SOPK. En effet, les rongeurs ont aussi un axe hypothalamo-hypophysaire qui régule le taux hormonal, qui est essentiel dans l’étiologie du SOPK. Malgré l’absence de menstruation chez la femelle, le suivi du cycle œstral permet d’observer une perturbation de l’ovulation. De plus, le cycle oestral dure seulement 4 à 5 jours chez les rongeurs, permettant d’observer rapidement une perturbation ou l’efficacité d’un traitement. Les animaux seront utilisés à l’âge prépubère (3-4 semaines d’âge) ou à l’âge adulte. En effet, il a été décrit que l’excès d’hormones androgènes à l’âge prépubère, voire intra-utérin, reproduirait mieux les symptômes du SOPK qu’à l’âge adulte.

Enfermés seuls deux heures par jour pendant une semaine, le temps d'avaler un repas à base de viande, 180 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Sous anesthésie, deux prélèvements de sang sont faits dans la veine porte et dans l'artère abdominale, avec les contenus digestifs, avant la mise à mort. Le projet cherche à identifier les peptides libérés par la digestion des protéines à deux âges, et le porteur revendique par là une contribution au remplacement, les données devant servir à valider un modèle de digestion in vitro. Le rat est retenu pour son espérance de vie de vingt-quatre mois, deux groupes étant comparés à six et à dix-huit mois.

Objectifs

La digestibilité, mais surtout la vitesse de digestion, sont des déterminants importants dans l’optimisation de l’apport protéique chez les populations cibles telles que les seniors ou les malades chroniques. En plus de son rôle de fournir des acides aminés à l’organisme, la digestion des protéines alimentaires conduit également à la libération de peptides. Ces peptides sont l’objet de nombreuses études en raison de leur importance dans le déterminisme de l’effet santé des aliments. En effet, le peptidome, défini comme l’ensemble des peptides issus de la digestion des protéines, varie quantitativement et qualitativement tout au long du tractus digestif. Ce peptidome contient des peptides potentiellement bioactifs à propriétés antioxydantes, antihypertensives, ou encore anti-diabétiques. La question de l’altération des fonctions digestives au cours du vieillissement est clairement posée concernant la digestibilité des protéines alimentaires, mais son impact sur le peptidome biologiquement actif reste non exploré, ainsi que son rôle dans l’altération de certaines fonctions du tractus digestif ou organes périphériques. Une des raisons de ce peu d’information sur l’impact du vieillissement du tractus digestif sur la composition du peptidome est qu’il faut faire face à un verrou méthodologique qui est l’identification par spectrométrie de masse des peptides issus de la digestion, dans un milieu complexe, appelée peptidomique ou digestomique. Par ailleurs, des questions se posent également concernant les modèles pertinents pour étudier la digestion des protéines alimentaires et la libération des peptides, i.e. in vivo sur digestats à différents niveaux du tractus digestif ou in vitro sur digesteur artificiel.

Bénéfices attendus

A court terme, les prélèvements de contenus digestifs d’aliments marqués permettront de travailler sur la mise au point d’une méthode d’identification des peptides issus de la digestion, sans ambigüité avec les peptides endogènes. Ce point est un verrou méthodologique très important limitant grandement les études sur la digestion des aliments protéinés. A moyen terme, ce projet permettra d’obtenir des données physiologiques objectives sur le vieillissement de la fonction digestive ; il s’agit là d’un véritable verrou de connaissance pour lequel il y a très peu d’éléments de bibliographie. Lever ce verrou permettra d’approfondir les recherches sur les difficultés d’adaptation au cours du vieillissement des organismes à leur environnement ; des défauts d’adaptation pouvant potentiellement conduire à des dysfonctionnements métaboliques et fonctionnels des organes. Le long du tractus digestif, une altération et/ou diminution de l’efficacité de la digestion des aliments affecte la dégradation des aliments en nutriments, leur biodisponibilité et leur devenir métabolique. En conséquence, une moindre biodisponibilité en nutriments est un des éléments potentiellement explicatifs du développement de la malnutrition des séniors et augmenterait le risque de développement de pathologies associées au vieillissement. Il est en effet aujourd’hui admis que le besoin en acides aminés d’origine alimentaire est augmenté lors du vieillissement, et que l’apport en protéines alimentaires doit être supérieur à celui d’individus adultes plus jeunes. Les raisons sont multiples, et notamment d’origine métabolique, mais une altération de la digestion des protéines et de sa vitesse a été évoquée pour expliquer cela. In fine, la combinaison des résultats obtenus avec ceux obtenus in vitro en utilisant le protocole standardisé de digestion in vitro permettra à plus long terme de valider cette approche pour l’étude de la digestion chez l’âgé, et permettrait à l’avenir de s’affranchir de modèles in vivo sur animaux. Par ce biais, ce projet participe à apporter des éléments à un des piliers des 3R, le Remplacement.

Procédures

Les animaux seront hébergés en cages individuelles, 2h par jour pendant une semaine, le temps de manger un repas à base de viande. En fin d'expérimentation, après un repas ils subiront sous anesthésie et analgésie 2 prélèvements de sang (en veine porte et en artère abdominale) et de contenus digestifs. Après les prélèvements qui dureront moins de 10 minutes, les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les procédures nécessitent de contrôler la consommation alimentaire des animaux et requiert donc une mise en cage individuelle des animaux pour le temps du repas. Celle-ci sera faite 10-12 jours avant le protocole expérimental afin d’acclimater les animaux.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de procéder à des prélèvements de tissus et organes pour des analyses.

Remplacement

Le seul modèle de digestion in vitro repose seulement sur des recommandations sur des paramètres physiologiques (pH, concentration en enzymes, durée de vidange des compartiments digestifs) moyennés selon les informations issues de la bibliographie. Comme le mentionnent les auteurs eux-mêmes, des études sont nécessaires pour valider ce modèle in vitro chez le sénior et s’assurer que les adaptations du protocole de digestion in vitro sont bien représentatives de la physiologie digestive au cours du vieillissement. Il y a donc un réel besoin de données objectives quant à la physiologie digestive au cours du vieillissement afin de pouvoir valider le modèle in vitro et ainsi proposer une alternative fiable aux modèles animaux. Néanmoins, si nos résultats de tests de comparaison entre les données in vivo et in vitro sont concluants, nous pourrons utiliser, lors d’étude ultérieures, les modèles in vitro pour étudier la génération de peptides lors de la digestion chez les adultes jeunes et âgés, au moins lors des étapes de screening lors d’étude ultérieures.

Réduction

La mise en œuvre de la première procédure pour étudier la faisabilité de plusieurs conditions a été conçue pour réduire au maximum les effectifs de la seconde procédure, et notamment limiter les conditions Témoin (i.e repas sans protéines), si les résultats de marquage des protéines permettent de distinguer les peptides alimentaires des peptides endogènes, et donc permettent de s’affranchir du groupe ‘Témoin’.

Raffinement

A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à 2 par cage pour une période de deux semaines correspondant à la période d’habituation et d’acclimatation à l’animalerie. Les animaux seront hébergés dans des conditions standard d’animalerie conventionnelle, dans des cages de taille conforme à la réglementation (1800 cm3) et transparentes afin que les animaux puissent se voir et positionnées proches les unes des autres afin que les animaux puissent s’entendre et se sentir. Les animaux bénéficieront d'enrichissement de leur environnement : ils auront dans leurs cages des objets en inox : balles et tunnels en alternance pour continuer à susciter de l'intérêt Les animaux seront pesés 2 fois par semaine et observés quotidiennement, y compris le week-end et les jours fériés, par des animaliers expérimentés.

Choix des espèces

L’étude porte sur les modifications de la fonction digestive au cours du vieillissement. Pour cela, deux populations de rats seront comparées, âgées de 6 et de 18 mois.Les animaux seront des rats Wistar âgés de 6 mois (jeunes) et 18 mois (âgés). Le rat est un animal de référence dans les études sur le vieillissement de par son espérance de vie de 24 mois.

Le choix de l'espèce et du modèle dépend des demandes des clients : 3 151 souris et 3 151 rats, soit 6 302 animaux non-humains, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement des ovaires, du cerveau, du tissu adipeux et de l'utérus. Le syndrome des ovaires polykystiques est induit par létrozole ou par exposition hormonale avant la naissance, avec régime gras jusqu'à dix semaines, ovariectomie de trente minutes, frottis vaginaux quotidiens et administrations deux fois par jour. Les nouveau-nés mâles, écartés du protocole, sont réorientés vers l'apprentissage de gestes techniques. Le porteur écrit qu'aucun test statistique n'a servi à dimensionner les groupes, fixés à huit animaux par comparaison avec des publications.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments dans un modèle mimant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints du syndrome des ovaires polykystiques. En effet, actuellement, les traitements utilisés sont uniquement symptomatiques et l’évaluation de candidats médicaments traitant la pathologie dans son ensemble (origine du dysfonctionnement hormonal) serait bénéfique.

Procédures

Les animaux pourront recevoir des traitements de candidats médicaments et de létrozole par différentes voies d’administration pendant maximum 10 semaines de façon biquotidienne pour les voies per os, sous-cutanée et intrapéritonéale et de façon quotidienne pour les voies intraveineuse et intramusculaire. Pour le modèle hormonale, les femelles gestantes recevront des traitements hormonaux pendant 3-5 jours par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale. Les administrations étant réalisées par du personnel expert, ces gestes dureront de 30 sec à 1 min environ. Les nouveau-nés ne seront manipuler qu’au moment du sevrage pour pouvoir différencier les mâles des femelles. Les animaux seront pesés régulièrement et pourront être mis sous régime gras type « high fat » pendant maximum 10 semaines, subir une ovariectomie selon le protocole expérimental (environ 30 minutes de chirurgie). Des frottis vaginaux seront réalisés afin de connaître le cycle oestral des animaux, au maximum un frottis quotidien. Il faut environ 30 sec pour faire un frottis par animal. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude avec de petits volumes (1 goutte pour le glucomètre pour les analyses de tolérance au glucose ou à l’insuline prélevée à la queue de l’animal) ou des volumes un peu plus importants pour les études de pharmacocinétique (queue ou rétro-orbital ou submandibulaire…). Un prélèvement sanguin de petit volume durera environ 30 sec 1 minute. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin terminal plus important sera réalisé sous anesthésie ou sédation (environ 1 min pour prélever le volume terminal). Des tissus (ovaires, cerveau, tissu adipeux, utérus...) seront prélevés à la fin de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

Les contentions et administrations de substances répétées pourront générer du stress chez les animaux. De plus, certaines étapes du protocole pourront entraîner une douleur légère ou modérée (au point d’injection de l’aiguille, lors des chirurgies d’implantation de pellets ou d’ovariectomie). Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement du syndrome des ovaires polykystiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer le dysfonctionnement hormonal de cette pathologie en tenant compte des différents organes intervenants et des multiples hormones, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant, dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal pour les paramètres sanguins (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Ce modèle étant nouveau pour nous, une ou deux études pilotes pour mettre au point le modèle seront nécessaires dans un premier temps (test sur un nombre restreint d’animaux). Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement. Ce projet nécessite l’utilisation de femelles gestantes et seuls les nouveau-nés femelles seront gardés pour la suite des procédures expérimentales. Les nouveau-nés mâles pourront être utilisés pour d’autres dap (formation aux gestes techniques par exemple), permettant ainsi de diminuer l’utilisation du nombre d’animaux. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients.

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux sédatés seront placés sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie et recevront un analgésique (type buprénorphine) afin de limiter la douleur post-opératoire et un gel ophtalmique sera utilisé. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de leurs congénères. Nous avons établi des points d’intervention afin de limiter la douleur à son minimum : • Addition d’Aspen brick, de carré de coton, de tunnels et d’igloos en cas de bagarres entre animaux et séparation du dominant pendant quelques jours si nécessaire, • Mesure du poids des animaux régulièrement, • Arrêt des traitements en cas de perte de poids ≥ 20% du poids initial. Nous avons établi des critères qui mettront fin à l'expérimentation si nécessaire : • Altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de se nourrir, de s’alimenter, se mouvoir…), • Présence d’une souffrance/douleur (vocalisation, perte d’appétit, piloérection, prostration…), • Perte de poids ≥ 20% du poids initial sur 72h, Si l’état général de l’animal ne s’améliore pas et qu’aucune solution ne peut être apportée, ce dernier serait euthanasié.

Choix des espèces

Selon le mécanisme d’action et la cible du candidat médicament, le rat et/ou la souris pourront être utilisés. Le choix du modèle utilisé sera dépendant des demandes clients car les modèles SOPK induits par le létrozole ou par exposition hormonale prénatale sont bien décrits dans la littérature chez les deux espèces. Le SOPK débutant à l’adolescence lors de la puberté, ce modèle pourra être induit sur des animaux adultes ou prépubères (3 semaines) pour le modèle létrozole. De ce fait, nous utiliserons des animaux âgés d’au moins 3 semaines (animaux livrés avec leur mère car le sevrage ne sera pas terminé). Pour le modèle d’exposition prénatale aux hormones, nous utiliserons des femelles gestantes de 2-3 mois et les nouveau-nés femelles âgés de 21 jours minimum.

Du sang est injecté sous les méninges de rats anesthésiés pour reproduire une hémorragie cérébrale, avec pose d'une mini-pompe sous la peau du dos et d'une canule dans le ventricule cérébral droit, trente-cinq à quarante-cinq minutes de chirurgie. 112 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce des céphalées, des douleurs faciales et oculaires et des troubles de la vision, qui "peuvent se compliquer et mener à une perte de conscience de l'animal voire à un coma". Au quatorzième jour, tous les rats sont tués pour prélèvement du sang et du cerveau après fixation des tissus.

Objectifs

Le but de l'expérience est de déterminer si la molécule à tester peut réduire l'inflammation et la cicatrisation à l'intérieur et autour du cerveau après une hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) afin (1) d'améliorer le drainage glymphatique (système d'évacuation des fluides dans le cerveau) et (2) de réduire le développement de l'hydrocéphalie (augmentation de la pression cérébrale et élargissement des ventricules cérébraux) chez le rat Sprague Dawley.

Bénéfices attendus

L'hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) est un type d'accident vasculaire cérébral causé par un saignement dans l'espace sous-arachnoïdien situé entre le cerveau et les méninges. Les lésions cérébrales précoces consécutives à une HSA sont responsables d'une grande partie des handicaps à long terme chez les patients atteints d'HSA. En outre, ils sont plus susceptibles de souffrir de troubles neurodégénératifs et cérébrovasculaires plus tard dans leur vie. Les mécanismes des lésions cérébrales précoces comprennent l'inflammation, la mort cellulaire, l'accumulation de liquide cérébral et la rupture de la barrière hémato-encéphalique. Les traitements actuels sont chirurgicaux et empêchent les saignements ou réduisent la pression cérébrale (insertion d'une dérivation pour drainer le liquide du cerveau), il est donc nécessaire de développer des thérapeutiques alternatifs pour cibler les mécanismes de lésions cérébrales précoces de l'HSA. Cette étude pourrait mettre en évidence un effet via un thérapeutique sur la réduction de l'inflammation et la cicatrisation à l'intérieur et autour du cerveau après une hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) afin (1) d'améliorer le drainage glymphatique (système d'évacuation des fluides dans le cerveau) et (2) de réduire le développement de l'hydrocéphalie (augmentation de la pression cérébrale et élargissement des ventricules cérébraux). Cela permettrait ainsi de développer une stratégie thérapeutique moins lourde des hémorragies sous-arachnoïdiennes car sans intervention chirurgicale ni dispositif implanté à subir par le patient.

Procédures

Les animaux réaliseront un test comportemental (répété à J-1, J+1, J+7 et J+14 post chirurgie) visant à quantifier et à observer des différences (et donc d’observer une récupération fonctionnelle ou pas) entre les différents groupes sur des déficits sensoti-moteurs induits par le modèle de chirurgie d’hémorragie sous-arachnoïdienne. Un prélèvement de sang au niveau de la queue sera réalisé ces mêmes jours. A J0, ils seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter du sang sous les méninges, simulant ainsi une hémorragie sous arachnoïdienne. Une pose de cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour récupérer le sang à injecter. Cette chirurgie sera suivie de la pose d’une mini-pompe osmotique en sous-cutané dans le dos ainsi que de la pose d’une canule par stéréotaxie dans le ventricule cérébral droit. Une injection sous-cutanée de sérum physiologique sera réalisée pour contrer la déshydratation subie suite à l’anesthésie et à l’acte chirurgical. Cette phase de chirurgie prendra entre 35 et 45 minutes. A J1 et J14, les animaux anesthésiés seront placés au sein d’un IRM pour imagerie. Cette phase d’imagerie sera réalisée en 10 minutes. A J1, une analgésie complémentaire sera réalisée après le 1er test comportemental et en fin de journée. A J14, Une injection d’un traceur fluorescent sous les méninges sera réalisée. Pour se faire le même protocole que pour l’injection de sang sera réalisé (aucune pose de cathéter ne sera nécessaire pendant cette étape). Enfin, à la fin du projet a J14, les animaux seront mis à mort. Un prélèvement de sang sera réalisé avant fixation des tissus puis prélèvement.

Impact sur les animaux

Suite au modèle d’hémorragie méningée, les rats pourront présenter des déficits neurologiques (moteurs et cognitifs) susceptibles d'induire des céphalées, des douleurs faciales et occulaires ainsi que potentiellement des troubles de la vision, accompagnées donc d’un stress de l’animal. Ces symptômes peuvent se compliquer et mener à une perte de conscience de l’animal voire à un coma. À cette fin, une surveillance sera mise en place pour contrôler la douleur et le stress afin d'adapter la couverture analgésique. Une coupelle de granulés humidifiés pour offrir une meilleure transition vers l’alimentation solide sera disposée dans la cage suite à la chirurgie.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement de sang et du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Les alternatives n’utilisant pas d’animaux ne peuvent être utilisées en raison de la complexité clinique de l'HSA et des interactions des systèmes du corps intervenant, y compris les systèmes immunitaire et nerveux, qui ne peuvent pas tous être modélisés actuellement dans des modèles de culture cellulaire ou informatiques. La voie des fluides cérébraux, en particulier, est étroitement régulée pour maintenir la pression cérébrale, les fluides étant produits par les plexus choroïdes et évacués par le système glymphatique dans une autre partie du cerveau, c'est pourquoi la structure entière du cerveau dans une cavité fermée (crâne) est nécessaire pour évaluer la dynamique des fluides et le système glymphatique.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 12. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.

Raffinement

Les rats seront 2 par cage, isolés de tous bruits extérieurs, avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et bûchette de peuplier), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Une injection sous-cutanée de sérum physiologie sera réalisée après la chirurgie. La surveillance des animaux sera accrue pendant les premières heures de réveil. A J1, un analgésique sera administré en début et fin de journée. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera soit soigné jusqu’à amélioration ou mis à mort. Une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant les jours suivant l’opération : pesée des animaux et contrôle des points limites (2 fois par jour). Avant la mise à mort, les animaux seront mis sous anesthésie générale.

Choix des espèces

L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat (Rattus norvegicus) est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les animaux utilisés seront âgés de 3 mois soit un poids d’environ 500g pour les mâles et 300g pour les femelles. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’HSA.

Soumis à une ligature du nerf situé sous l'orbite, sous anesthésie générale, 400 rats sont ensuite testés tous les deux jours pendant soixante jours pour mesurer leur hypersensibilité de la face. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et tous les rats sont tués, une partie après une trachéotomie, une canulation de la carotide et de la jugulaire et une craniotomie menées sans réveil. Le projet vise à décrire la réorganisation du cortex somato-sensoriel dans une névralgie du trijumeau. Le porteur écrit que les résultats "ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mis à part le développement d'une allodynie faciale", allodynie qui est précisément la douleur que la ligature sert à produire.

Objectifs

Les douleurs neuropathiques faciales issues d'atteintes nerveuses périphériques se révèlent très difficiles à soulager et/ou guérir lorsqu'elle mettent en jeu une sensibilisation centrale, c'est à dire une modification du fonctionnement du système nerveux central induisant des douleurs spontannées (en l'absence de stimulus) ou suite à des stimuli non douloureux (caresses, brossage de dents...). Cela peut se produire dans le cadre de compression de nerfs faciaux comme observé dans la névralgie du trijumeau. Le but de ce projet est d'étudier la mise en place de la sensibilisation centrale dans le cortex somato-sensoriel primaire dans un modèle murin de neuropathie faciale.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de sensibilisation corticale impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont : • Injections intra-péritonéales (

Impact sur les animaux

Utilisant un modèle de douleur neuropathique, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse lors d'une stimulation tactile. Les résultats obtenus ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mis à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après ligature du nerf infra-orbitaire. Cependant, en parralèle de cette étude expériementale, une étude computationnelle basée sur les résultats expériementaux afin de modéliser les modifications corticales associées à la mise en place de la douleur neuropathique. Nous espérons que dans le futur, un tel modèle permettra de tester des hypothèses in silico afin de permettre de remplacer certaines expérimentations.

Réduction

Le nombre d’animaux a été établi par l'utilisation de tests statistiques préalables et en tenant comptee des divers risques liés aux différentes approches expérimentales (mauvaises injections, problème d’habituation lors des études comportementales, difficultés d'enregistrements). Ce nombre sera susceptible de changer si au cours de l’expérience nous observons une différence significative avant d’atteindre le nombre maximal d’animaux autorisés. Pour la partie comportement (A), consistant à valider que la ligature du nerf infra-orbitaire induit une allodynie faciale, nous allons utiliser 10 animaux par groupe (témoins mâle, ligature mâle, témoins femelle, ligature femelle). Pour les parties patch-clamp), nous allons utiliser 15 animaux par groupe (témoins mâle, ligature mâle, témoins femelle, ligature femelle) et par mesure effectuée. Pour la partie patch-clamp axonale ex vivo, nous allons utiliser 30 animaux par groupe (témoins mâle, ligature mâle, témoins femelle, ligature femelle). Nous avons prévu plus d'animaux pour ces expériences car les enregistrements axonaux étant très complexes, le taux de succès est plus faible que pour les autres enregistrements. Pour la partie enregistrements électrophysiologiques in vivo, nous allons utiliser 15 animaux par groupe (témoins mâle, ligature mâle, témoins femelle, ligature femelle).

Raffinement

Préalablement à toutes les études, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi (tunnel pour grignotage, enrichissement social) dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats sont préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, après la ligature du nerf infraorbitaire, le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone ligaturée, est poursuivie dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Le poids est mesuré quotidiennement. La nourriture sera humidifiée pour faciliter son absorption. Si la perte de poids excède 20% du poids initial, les animaux seront mis à mort. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.