Rats

Mesurer la puissance paralysante de formulations de toxine botulique, destinées au traitement de la spasticité comme à des usages cosmétiques, occupe ici 4 650 souris et 1 550 rats. Tous vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous seront tués, par prélèvement intracardiaque, le dernier jour. La toxine est injectée dans le muscle du mollet sous anesthésie, ce qui provoque une paralysie plus ou moins marquée des membres postérieurs, une perte de poids et des difficultés à atteindre la mangeoire, puis chaque animal passe dix à trente tests d'écartement des orteils sur cinq à vingt-cinq jours. Le porteur indique que des cultures de neurones humains ont été proposées comme alternative sans être validées par la communauté scientifique ni par les autorités, et conclut que l'étude ne peut se faire que sur animaux vivants.

Objectifs

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) sont utilisées depuis près d’un demi-siècle dans le traitement des troubles liés à une contractilité musculaire excessive. Elles sont classiquement utilisées dans le soulagement des troubles du mouvement tels que la dystonie et la spasticité, ainsi que pour des fins cosmétiques. En plus les formulations dérivées de BoNTs bénéficient à un éventail beaucoup plus large de patients souffrant de vessie hyperactive, de dysfonction érectile, d’arthropathie, de douleurs neuropathiques et de cancer. La recherche de nouvelle formulation de BoNTs est très active en ce moment et il est nécessaire de mettre au point de test in vivo rapides mais précis, pour évaluer l’efficacité de différents types de BoNTs, autant naturels que recombinants. L’objectif de cette étude est de réaliser une évaluation in vivo de l’efficacité de molécules thérapeutiques à base de neurotoxine botulique nouvellement développées ; le protocole expérimental consiste à exécuter le test du score d’abduction des orteils (DAS) chez le rongeur. La puissance d’une préparation de neurotoxine botulique (BoNT) donnée peut être évaluée régulièrement en utilisant le test DAS, qui mesure la réduction de la force musculaire des doigts de la patte après injection de BoNT dans le muscle squelettique de la patte arrière chez les rongeurs. Il est bien connu en littérature que les rats ont des sensibilités différentes aux différentes types de toxines botuliques par rapport à la souris. Selon le type de toxine étudié, il sera donc nécessaire d’utiliser l’espèce animale la plus sensible entre le rat et la souris.

Bénéfices attendus

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) sont utilisées dans le traitement des troubles liés à une contractilité musculaire excessive. Ils sont classiquement utilisés dans le soulagement des troubles du mouvement tels que la dystonie et la spasticité, ainsi que pour des fins cosmétiques. En plus les formulations dérivées de BoNTs bénéficient à un éventail beaucoup plus large de patients souffrant de vessie hyperactive, de dysfonction érectile, d’arthropathie, de douleurs neuropathiques et de cancer. La recherche de nouvelle formulation de BoNTs est très active en ce moment et il est nécessaire de mettre au point de test in vivo rapides mais précis, pour évaluer l’efficacité de différents types de BoNTs. Nos études vont participer à la recherche et la mise en place de ces nouvelles formulations de toxine botulique et aider dans le futur les patients atteint de ces troubles.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs test DAS (test du score d’abduction des orteils) entre 10 à 30 tests, sur une durée de 5 à 25 jours. La durée d'un test DAS est de 3 minutes. Les animaux seront soumis également à une seule injection en intra-musculaire de toxine botulique sous anesthésie. La durée de cette intervention est de 10 minutes. Et pour finir les animaux seront soumis à un seul prélèvement en intra-cardiaque, le dernier jour d'expérimentation. La durée de cette intervention est de 15 minutes.

Impact sur les animaux

À la suite de l'injection dans le muscle gastrocnémien, avec la toxine botulique, les animaux vont développer une paralysie des membres inférieures plus ou moins élevées ; les animaux risquent également de présenter une perte de poids, des poils piqués, la présence d'un excédent de porphyrine. Une difficulté à atteindre la mangeoire risque d'être présent, mais pour permettre à l'animal de se nourrir et de boire, une alimentation spécifique sera mise en place.

Devenir

Etant donné la réalisation d'un prélèvement de sang et des muscles, les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'intracardiaque.

Remplacement

A ce jour, à cause de la complexité de la structure protéique de la toxine botulique, il n’y a pas de test in silico validés pour effectuer un criblage des effets paralysant des différentes toxines botuliques et de ses dérivés. Afin de tester un grand nombre de dérivés de la toxine botulique, des modèles in vitro alternatif à l’expérimentation animale ont été proposé par le passé, en utilisant des cultures cellulaires de neurones humains. Toutefois ces modèles in vitro ne sont pas encore validés par la communauté scientifique ni par les autorités régulatoires, car ne sont pas capables de prédire exactement les effets des toxines botulique chez l’homme ou l’animal, donc l’étude ne peux se faire que sur animaux vivants.

Réduction

Le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental sera de 6 à 10 animaux, étant donné la variabilité interindividuelle que nous pourrions rencontrer. Le nombre de groupes est déterminé en fonction du nombre des doses à tester pour chaque molécule. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux (entre 5 à 31 groupes expérimentaux, nombre d'animaux par groupes égal à 6 à 10) seront comparés entre eux en utilisant des tests statistiques appropriés. Pour déterminer le chiffre exact d’animaux par groupe, cela dépendra des premiers résultats des premiers animaux, le chiffre 10 ne sera pas dépassé. Nous utiliserons les tests statistiques les plus appropriés afin d'analyser nos données.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les cages sont de type IVC (cage individuelles ventilée pouvant contenir plusieurs animaux par cage) en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés 5 ou 6 par cage pour les souris et 2 ou 3 par cage pour les rats, en fonction de leur poids corporel et ainsi permettre aux animaux de pouvoir interagir et entretenir des liens sociaux avec leurs congénères, tout en gardant un espace suffisant. Des morceaux de coton, des igloos, des tunnels et des bâtonnets en bois seront intégrés dans les cages d'hébergement. Après les intra-musculaires, quelques croquettes d'aliment seront placées dans le fond de la cage et de la pâté humide sera également donnée, au cas où les animaux n'arrivent plus à s'alimenter et la taille des tétines des biberons seront ajustées en conséquence. Des tapis chauffants seront utilisés pendant la durée des anesthésies et les réveils des animaux. Les responsables de l'application des procédures, de la manipulation et du bien-être des animaux, sont une technicienne en recherche et développement et un ingénieur, tous deux expérimentés et formés pour reconnaitre tout signes éventuels de stress, douleurs et inconfort. Ils observeront les animaux tous les jours (du lundi au dimanche), pour déceler les mauvais signes cliniques et remplirons quotidiennement une fiche de suivi par animal. La zootechnicienne, en charge de la surveillance et du change des animaux, observeras également les animaux une fois par jour (du lundi au vendredi) et s'assurera que tous les animaux disposent assez d'aliment et d'eau de boisson.

Choix des espèces

Les rongeurs sont utilisés très fréquemment en recherche préclinique pour les études utilisant de la toxine BONT/A, dans le cadre d’amélioration de la contractibilité musculaire. Les paramètres physiologiques et pathologiques liés aux problèmes de contractilité musculaire sont très bien caractérisés chez les rongeurs, ce qui facilite la comparaison des résultats entre différents laboratoires. Les rats et les souris seront utilisés, car ces espèces sont largement utilisées pour ce type d’étude (nombreuses références bibliographiques). D’autres modèles expérimentaux, notamment, le chien, le chat et les primates, posent de nombreux problèmes éthiques et d’infrastructures d’hébergement. Adultes, entre 6 et 12 semaines ; car les adultes possèdent des membres inférieurs plus gros et cela permet une meilleure visualisation de la patte et donc le résultat du DAS est plus optimal. Les animaux adultes sont aussi plus résistants face à la perte de poids et aux différents signes cliniques.

Un rat qui cumule hypothermie, prostration et plus de 20 % de perte de poids sur plusieurs jours est tué. 600 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour récupérer tissus et sang. Rendus obèses et diabétiques par un régime hypercalorique servi de la sixième à la trente-deuxième semaine de vie, ils reçoivent des composés une à deux fois par jour, subissent cinq prises de sang précédées chacune de six heures de jeûne, l'implantation d'un cathéter dans la veine fémorale, puis une perfusion continue de 210 minutes appelée clamp. La société qui porte le projet dispose déjà d'une plateforme in vitro pour ce type d'étude, mais affirme que ces modèles ne sont pas un miroir assez fiable de la complexité de l'organisme.

Objectifs

Le diabète a touché 8,5% de personnes de plus de 18 ans dans le monde. 90% des personnes diabétiques sont atteintes de diabète de type 2, forme de diabète associé à l’obésité. Le nombre de personnes diabétiques ne cesse d’augmenter. Le diabète a des conséquences dramatiques sur le fonctionnement de certains organes comme le foie, le système nerveux, les reins ou le cœur et certaines de ces conséquences sont mortelles. Le diabète de type 2 se caractérise par deux phases, la phase de résistance à l’insuline où les niveaux plasmatiques d’insuline sont très élevés pour essayer de contrer l’hyperglycémie puis au fur et à mesure les cellules sécrétant l’insuline se fatiguent, ne sont plus capables de répondre et meurent. On parle alors de phase de dépendance à l’insuline. Plus le diabète de type 2 est traité précocement, moins les conséquences sont dramatiques. Ainsi, il est important de développer des thérapies qui ciblent la phase de résistance à l’insuline. Pour se faire, les animaux rendus obèses par l’ingestion d’un régime gras sur plusieurs semaines constituent le meilleur modèle préclinique pour valider ces thérapies. En effet, l’ingestion d’un régime gras chez la souris ou le rat se traduit par la mise en place d’une résistance à l’insuline. La résistance à l’insuline peut être évaluée de différentes manières : en réalisant des tests de tolérance à l’insuline et au glucose mais la technique la plus précise reste la technique dite "clamp" car elle permet la mesure de la sensibilité à l’insuline au niveau des différents organes et de façon bien précise, en utilisant de la radioactivité. Ainsi, au cours de ce projet, des rats seront rendus obèses puis traités ou non par des molécules et leur résistance à l’insuline sera évaluée par des tests de tolérance puis un "clamp".

Bénéfices attendus

Par cette étude, de nouveaux traitements ciblant la résistance à l’insuline et donc les phases précoces du diabète peuvent être trouvés. Ceci permettra d’éviter les complications induites lors des phases avancées du diabète et d’augmenter les taux de survie des patients.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez le rat, un régime hypercalorique sera mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 32 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Cinq prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (avant traitement et 2, 4, 6 et 8 semaines après traitement) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang se fait sur animal vigile et libre de ses mouvements, il est préalablement habitué à ce geste. La prise de sang dure environ 2 minutes par animal, et nécessite que l'animal ait un jeun de 6h. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectués après 6 semaines de traitement, ces tests durent 120 minutes. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. L’implantation d’un cathéter à demeure dans la veine fémorale : la chirurgie est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. Une manipulation de 210 minutes appelée « clamp » est réalisée après 8 semaines de traitement. Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue.

Impact sur les animaux

1 – Un régime hypercalorique sera mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 32 semaines), cela va induire une obésité et un diabète de type 2. Les animaux se déplacent un peu moins mais ils gardent un bon état général. 2 – Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3 - Pour mesurer les consommations alimentaire et hydrique, les animaux seront hébergés en cage individuelle pendant la durée du traitement, cela est impactant pour les rats qui ont un caractère grégaire. 4 – Les mises à jeun (6h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress, notamment pour des animaux diabétiques. 5 –La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. 6 – La chirurgie (implantation du cathéter fémoral) est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. L’anesthésie et la cicatrisation sont plus difficiles chez un animal diabétique. 7 – Clamp : Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue. Cette manipulation terminale peut être source de stress. 8- Nous mesurerons de nombreuses fois la glycémie par microprélèvement en bout de queue, l'extrémité de la queue sera désinfecté à la vétédine en fin de manipulation. Cependant, du fait du diabète, certains animaux peuvent avoir des complications (queue hypersensible, infection).

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (comptage des radioéléments, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...).

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. D’ailleurs, la société possède aujourd’hui une plateforme in vitro pour y répondre. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les étapes de la procédure seront réalisées sur le même animal. Des étapes de screening sont réalisées afin d’obtenir des groupes homogènes et les animaux ayant les meilleurs critères permettant d’avoir des données fiables et exploitables en fin d’étude et d’éviter de répéter plusieurs fois la dite étude. Nous effectuerons des tests statistiques, le nombre de données par groupe nécessaire pour être statistiquement robuste et donc pouvoir conclure sur l’effet d’un traitement est de 10 en fin de clamp.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rats de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Le bout de la queue des rats sera observé de près car le diabète peut induire des complications au niveau de la cicatrisation. De la vétédine sera appliquée après chaque fin de manipulation. Après la chirurgie, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points limites suivants sur plusieurs jours : hypothermie, prostration, perte de poids >20%, ce dernier serait euthanasié. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de soluté de réhydratation est envisagée (5 ou 10mL/kg). En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques. Des mises au point de chirurgie "double cathétérisation" permettant d'éviter les multiples mesures de glycémie à la queue sont en cours de discussions.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le rat Sprague-Dawley : Sans régime gras, cette souche de rat possède un poids corporel important et est plus à même à développer une obésité marquée lorsqu’elle est placée sous régime gras. Le rat est une espèce adaptée pour l’étude de la résistance à l’insuline par clamp puisque les données obtenues sont assez homogènes. La chirurgie pour la mise en place du cathéter impacte très peu l'obésité et la résistance à l'insuline. Les animaux sont mis sous régime à partir de 6 ou 8 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

Des souris nude dépourvues de système immunitaire et des rats ZDF porteurs d'une mutation qui les rend diabétiques dès le plus jeune âge : le projet repose sur des animaux construits pour être malades. 80 souris et 208 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des hydrogels implantés sous la peau, les rats subissent une craniotomie de trente minutes avec pose d'un implant osseux, et une partie d'entre eux une thoracotomie terminale que le porteur qualifie lui-même de geste douloureux. Tous sont tués pour retirer les implants et prélever les calvarias, afin de mesurer la formation osseuse et la vascularisation autour du matériau.

Objectifs

Le diabète de type 2 (DT2) est un problème de santé publique. On compte 537 millions de personnes diabétiques dans le monde et environ 4 millions en France. Outre plusieurs complications cliniques, les patients atteints de DT2 présentent une fragilité osseuse avec un risque accru d’ostéoporose, de fracture osseuse et d'altération de la réparation osseuse. Parallèlement à l'augmentation de la prévalence du DT2, on observe une augmentation du nombre de patients atteints de DT2 nécessitant et subissant des interventions chirurgicales orthopédiques/orofaciales, avec un taux élevé de complications et une augmentation inévitable de la charge et des coûts socio-économiques. À ce jour, la réparation osseuse dans l'environnement compromis du DT2 reste très difficile, et des recherches supplémentaires sont nécessaires pour développer des stratégies efficaces, y compris des thérapies cellulaires. Les cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse par leur capacité à s’auto-renouveler et à se différencier à des cellules qui forment l’os (ostéoblastes) et /ou par des facteurs qu’ils secrètent (sécrétome et vésicules extracellulaires) et qui stimulent la formation des vaisseaux sont proposées pour réparer des défauts osseux. Cependant, le diabète caractérisé par un taux élevé de glucose dans le sang, perturbe la fonction de ces cellules et la réparation de l’os. L’utilisation de ces cellules pour réparer et l’intérêt de leur produit de sécrétions dans la réparation de l’os diabétique restent peu étudiés. L’objectif du projet répond au besoin scientifique et clinique de mieux connaitre et optimiser la réparation de l’os diabétique. Il vise à évaluer la capacité à former l’os (potentiel ostéoformateur) et des vaisseaux sanguins (potentiel angiogénique) du sécrétome et des vésicules extracellulaires de cellules stromales mésenchymateuses dans le but d’améliorer la réparation osseuse chez le rat diabétique. L'hypothèse sous-jacente au projet de recherche proposé est que cela constitue une alternative de choix à la thérapie cellulaire pour réparer l’os diabétique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en biothérapie. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes de réparation osseuse chez le diabétique de type 2. Par ailleurs, il fournira des informations sur l’effet bénéfique ou pas du sécrétome et des vésicules extracellulaires comparé à celui des cellules stromales mésenchymateuses dans la réparation de l’os diabétique. A long terme un tel projet permettra de mettre sur pieds des stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients diabétiques qui présentent des accidents du squelette avec une perte osseuse importante ou nécessitant la pose d’implants.

Procédures

Pour les souris: 1-Implantation sous cutanées (72 + 8 souris de marges) d'hydrogels ( 1X ; durée ~30 min) 2- Imagerie (24 + 8 souris de marges) micro-scanner in vivo (4X; durée 15 min) Pour les rats : 1- craniotomies avec implantation d’un hydrogel ostéoinducteur (168 rats ZDF + 10 rats ZDF imprévus et 24 rats ZL + 6 rats ZL imprévus) (1X, durée 30 min) ; 2- Imagerie (56 rats ZDF + 5 rats ZDF imprévus et 8 rats ZL + 3 rats ZL imprévus) micro-scanner in vivo (5X; durée 15 min) ; 3- Infiltration du réseau vasculaire (56 rats ZDF + 5 rats ZDF imprévus et 8 rats ZL + 3 rats ZL imprévus) par un agent radio-opaque (1X; durée 30 min)

Impact sur les animaux

L’implantation sous cutanée chez les souris nudes peut entrainer des effets indésirables tels que : douleur, hémorragie, stress, oedème. La chirurgie sur calvaria de rat peut également entrainer un comportement anormal causé par une hypertension intracrânienne. Ces effets indésirables seront potentiellement observés en per-opératoire et post-opératoire immédiat (jusqu’à 3 jours). Une complication éventuelle est l’infection cutanée, susceptible d’entrainer de la douleur et de la souffrance chez les animaux. Elle constitue un point limite de l’étude car pouvant être l’origine de faux positifs (un des critères d’étude étant l’inflammation locale). L’anesthésie chez les souris et les rats, nécessaire à l’imagerie non invasive en microscanner va également entrainer du stress au moment de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil.

Devenir

Les souris seront toutes mises à mort et les explants retirés pour évaluer la réponse tissulaire (formation osseuse, inflammation et angiogenèse) en site sous cutané (ectopique) afin d’identifier les conditions pertinentes à tester en site osseux (orthotopique). Les rats seront tous mis à morts aux temps terminaux et les calvarias seront prélevées pour l’étude de la formation osseuse, de la vascularisation et de l’inflammation au niveau des défauts osseux. Justification de la mise à mort : prélèvement des implants pour évaluer la réponse tissulaire et la formation de l’os autour de ces implants.

Remplacement

La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel, orchestré et complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoïde, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages ostéoblastes/ cellules endothéliales par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Cependant ces modèles sont dénués de système vasculaire. Or, la formation d’un hématome au tout début de la cicatrisation osseuse joue un rôle essentiel dans celle-ci. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier l’apport de cellules souches et le sécrétome dans la cicatrisation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Compte tenu des écarts constatés pour les différents paramètres de la réparation osseuse étudiés par notre équipe, le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'avoir des résultats valident en respectant le principe de réduction des 3 R est de 6 animaux /groupe /temps / type d’analyse. Pour tenir compte des éventuelles pertes lors des procédures ce chiffre est porté à 8 animaux/groupe /temps/ type d’analyse. Pour étudier le potentiel à former des vaisseaux sanguins et de l’os en sous cutané, quatre implants seront posés par animal afin de réduire le nombre total de souris nécessaire pour obtenir des groupes de 8 par condition. Par ailleurs, l’inflammation et l’angiogenèse seront étudiés sur les mêmes animaux, permettant de réduire leur nombre et de maximiser la contribution de celles-ci. Dans la même visée de réduction du nombre d’animaux, seules les conditions pertinentes (meilleur potentiel ostéoinducteur et faible inflammation) seront testées pour les procédures chez le rat. De plus, l’os de calvaria prélevé lors de la chirurgie à J0 sera utilisé comme contrôle T0. Par ailleurs, la réparation osseuse et la vascularisation seront étudiées par différentes techniques (biologiques, imagerie multimodale) au sein du même animal, permettant de maximiser la contribution scientifique de l'animal mis à mort.

Raffinement

Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans les protocoles expérimentaux. Au cours des chirurgies (avec champs et instruments stériles) un gel oculaire sera appliqué dans les yeux des animaux pour éviter leur dessèchement. Ils seront placés sur tapis chauffant pour limiter les pertes thermiques. Pour les implantations sous-cutanées, une analgésie préventive sera mise en place par injection sous cutanée (SC) 20 minutes avant la chirurgie. Les animaux seront ensuite anesthésiés par injection intra-péritonéale (IP) puis le dos sera rasé et désinfecté avec une solution antiseptique à large spectre. Une analgésie post-opératoire se fera par injection SC pendant 2 à 3 jours après l’opération. Pour les implantations intra-osseuses, une analgésie pré- et post-opératoire se fera par une injection SC ainsi qu’une antibiothérapie préventive. Après chirurgie, les animaux seront hébergés, seuls en cage jusqu’au lendemain matin dans une pièce dédiée avec température ambiante à 26° puis remis en conditions standards d’hébergement. Pour l’imagerie micro-scanner in vivo, les souris et les rats seront anesthésiés par voie gazeuse et seront surveillés jusqu’à leur réveil. À la suite des procédures chirurgicales, les expérimentateurs observeront les animaux deux fois par jour les 3 premiers jours post-opératoires puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. Des critères définis et scorés au préalable sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques à la procédure permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal. Les mesures retenues pour les atténuer et/ou les supprimer seront appliquées si nécessaire. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée par les zootechniciens. Pour un groupe d’animaux, l’injection d’un agent de contraste intracardiaque en point terminal nécessitera une thoracotomie qui est un geste douloureux. En conséquence, les rats recevront une prémédication analgésique par injection SC avant anesthésie par voie gazeuse jusqu’à immobilité totale de l’animal puis une IP d’un anesthésique générale couplé à un analgésique.

Choix des espèces

La souris nude nRI de 9 semaines sera utilisée pour l’évaluation en dehors d’un site osseux du potentiel des cellules souches mésenchymateuses et de leurs produits de secrétions à induire la formation des vaisseaux sanguins et de l’os. Possédant un système immunitaire déficient, la souris nude est la candidate de choix pour apprécier les mécanismes d’intégration d’implant sans crainte d’une réaction de rejet immunitaire. Nous étudions le diabète de type 2 (incidence élevée chez l’Homme) pour lequel les modèles animaux proposés ne présentent pas de surmortalité, et ne requièrent pas de soins spécifiques. Afin de garantir l’homogénéité et la reproductibilité, nous avons opté pour un diabète d’origine génétique à savoir le rat ZDF (Leptr -/-) de 24 semaines, car ce modèle de diabète mime fidèlement le diabète de type 2 comme chez l’humain, depuis son mode d’installation jusqu’aux complications associées incluant les complications osseuses. De plus, nos études précédentes sur le même modèle animal ont montré qu’ils pouvaient vivre en animalerie jusqu’à un âge avancé sans nécessiter des soins particuliers et qu’ils supportaient relativement bien les procédures du protocole. Les rats Zucker LEAN (ZL) de 24 semaines ne présentent pas de mutation Leptr -/- et ne développent pas spontanément de diabète ils sont des contrôles de choix.

Un score de grimaces faciales décide de la mise à mort des rats dont la douleur dépasse le seuil fixé. 70 rats, moitié mâles moitié femelles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le porteur prévoit de les proposer ensuite à la réutilisation par d'autres équipes. Chacun reçoit sous anesthésie une injection de carraghénine dans le coussinet d'une patte arrière, qui déclenche un œdème douloureux culminant trois à cinq heures plus tard, puis subit neuf séances de contention pour mesurer le gonflement au pied à coulisse et au pléthysmographe. Le projet sert un fabricant qui a modifié la formulation de sa crème antihistaminique pour en réduire le coût et cherche à convaincre l'Agence du médicament de maintenir l'autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

Les crèmes anti histaminiques sont indiquées spécifiquement pour le traitement local des démangeaisons, notamment les piqûres d'insectes. Dans le cadre d'une évolution commerciale, un fabricant a modifié la formulation de sa crème et souhaite réaliser une étude pour la valider directement auprès de l’Agence du médicament sans refaire une demande d’autorisation de mise sur le marché complète (le principe actif étant le même). L'objectif est d’obtenir des preuves d’efficacité du produit nouvellement formulé et ainsi pouvoir convaincre les autorités de santé de maintenir la commercialisation du produit et demander une modification d'autorisation de mise sur le marché chez l'Homme. Le projet vise à comparer l'efficacité de la nouvelle formulation de cette crème avec celle de l'ancienne. Cette évaluation sera effectuée dans un modèle d'inflammation de la patte chez le rat, induisant un œdème, une rougeur et une démangeaison. Les critères d'évaluation incluent le développement de l'œdème au niveau de la patte, la présence de rougeur, ainsi que le comportement de l'animal (grattage, morsure, signes de douleur) qui ne peut être remplacer par d’autres études in vitro. Ce projet nécessitera l’utilisation de 70 rats, 50%-50% de mâles et de femelles.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à pouvoir maintenir la commercialisation d’une crème anti histaminique. En effet, l’ancienne formulation ne pourra perdurer du fait des couts élevés de ces composés et des difficultés associées d’approvisionnement. Le bénéfice de la validation d’une nouvelle formulation à laquelle participe cette étude est important. Ce bénéfice est de pouvoir maintenir un accès aux soins par un produit de nouveau manufacturable (sans limite d’approvisionnement) et moins onéreux dans sa nouvelle formulation. Cela passe par la diminution du tarif du produit pour le patient et un meilleur approvisionnement vis-à-vis des composants du produit. Au final, le médicament sera plus accessible aux populations précaires en particulier dans les pays en développement (ex : Afrique) dans lesquels ce produit est justement fortement utilisé au vue d’une susceptibilité accrue aux piqures d’insecte. Le second bénéfice est le maintien d’un traitement peu onéreux pour améliorer le confort des patients ne pouvant se procurer un soin plus couteux (corticoïdes par exemple qui engendreraient des problèmes sanitaires et effets secondaires).

Procédures

Les animaux (n=70) seront soumis à une injection sous cutanée de carraghénine dans une patte arrière, suivie d’une application de crème ou injection intrapéritonéale de solution injectable sur le site d’intérêt, le tout sous anesthésie générale. La durée de cette intervention sera de 10 minutes environ. Pour chaque mesure de l’œdème et prise de photographie de la patte (i.e. T0, T0+, T1h, T2h, T3h, T4h, T5h, T6h et T24h), chaque animal sera maintenu en contention le temps de la mesure du volume de l’œdème à l’aide du pied à coulisse et du pléthysmographe et la photo, soit environ 5 minutes par temps de mesure (soit 9 fois).

Impact sur les animaux

L’induction d’une inflammation dans la patte arrière par injection de carraghénine entraîne une inflammation, des rougeurs et un œdème, pouvant être douloureux et induire un stress à l’animal. L’œdème induit par la carraghénine se développe en 2 phases ; la première 30 min après injection, la seconde commence à la fin de la première heure et dure jusqu’à 3h après injection. Le pic de l’œdème est entre 3 et 5 heures après injection. Les traitements pharmacologiques sont administrés en une seule application, juste après l’injection de carraghénine, par application locale de la crème sur la zone d’intérêt ou par injection intrapéritonéale.

Devenir

A la fin de la procédure (T24h après injection), les animaux feront l’objet d’une analyse clinique, seront immédiatement traités par analgésiques jusqu’à rétablissement total de leur état de santé et seront proposés à la réutilisation pour les expériences d’autres utilisateurs. Aux vues de ce qui est décrit dans la littérature pour ce modèle, l’ensemble des animaux seront sortis de l’étude en ayant pleinement recouvert leur état de bien-être et seront disponibles pour la réutilisation. Néanmoins, au cours de la procédure, si des signes de souffrance de l’animal apparaissent et si les points limites sont atteints, celui-ci sera mis à mort. Le niveau le plus élevé de sévérité sera considéré pour ces animaux (sur le score de comportement). Les mesures cinétiques de la taille et du volume de l’œdème s’arrêteront au moment du sacrifice mais les données précédentes seront intégrées aux résultats.

Remplacement

Le présent projet ne peut pas être réalisé en remplaçant l’animal par des méthodes alternatives (comme des cellules) puisqu’il s’agit ici de tester l’efficacité symptomatique d’un traitement pharmacologique par le biais de l’observation du comportement animal, du développement d’un œdème et d’un changement de couleur de peau en réponse à l’induction d’une inflammation. Aucun modèle cellulaire ne peut le remplacer. Une réflexion sur une étude de diffusion de la nouvelle formulation a été réalisée mais ne pourra pas suffire à elle seule à convaincre les autorités de santé. Aussi l’objectif visant à évaluer l’effet anti-démangeaison du produit par modification du comportement des animaux ne peut pas se faire par ces modèles alternatifs, or c’est le mode d’action principal du produit et l’objectif principal.

Réduction

Un petit nombre d’animaux seront d’abord utilisés pour mettre au point et vérifier les protocoles : qualité/efficacité de la molécule inflammatoire, volumes de crème applicable, prise en main des dispositifs de mesure de volume, réaction des animaux. Selon les résultats obtenus, l’étude pourra s’arrêter à cette étape. Si l’étude se poursuit, le modèle et la formulation actuellement commercialisée seront validés en première intention. Si, et seulement si, les résultats sont concordants avec les connaissances actuelles la nouvelle formulation et son efficacité seront mesurés. S’assurer de l’efficacité de la nouvelle formulation lors de cette étude permet de s’affranchir d’une nouvelle demande d’autorisation de mise sur le marché chez l’Homme, nécessitant un nombre beaucoup plus important d’animaux.

Raffinement

Pendant la période de stabulation, les animaux seront hébergés en groupes (2/cage), dans un environnement enrichi et leur bien-être sera vérifié quotidiennement. Pendant le protocole expérimental, les rats seront toujours répartis 2 par cage, leur litière sera remplacée par de la litière douce non abrasive, et seront identifiés pour les besoins de l’expérimentation par une marque au feutre sur la queue différente entre les 2 animaux d’une même cage au moment de la procédure (soit pendant 24h). L’induction de l’inflammation dans les coussinets de la patte et l’application locale de la crème ou l’injection de la molécule seront réalisées sur animaux anesthésiés afin de limiter la douleur et le stress. Aussi, durant toute la durée de la procédure, à savoir 24h, une surveillance accrue sera réalisée pendant les 6 premières heures après induction de l’inflammation, intervalle le plus critique dans ce modèle, avec la présence permanente d’une personne les observant. L’apparition de signes de douleur et l’atteinte des points limites (score de comportement et de grimaces faciales) seront particulièrement surveillés. Les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet en quelques minutes puisqu’il sera présent lors de l’expérimentation. Le modèle utilisé peut paraitre douloureux vis-à-vis de la zone d’injection mais une autre partie du corps n’est pas envisageable pour mesurer précisément la taille de l’œdème par des mesures de volumes d’eau déplacés (rendu possible ici en plongeant la patte dans un pléthysmographe). Finalement, si nous ne mesurons pas le volume, nous perdrions en précision de mesure et donc en puissance statistique.

Choix des espèces

La majeure partie des études expérimentales utilisant un modèle d’inflammation à la carraghénine pour tester l’effet de différents traitements pharmacologiques est réalisée chez le rat. En effet, le rat répond très bien à cette procédure expérimentale et développe un œdème inflammatoire quantifiable et dont l’effet des traitements peut être significativement démontré. C’est le modèle de référence dans les publications. L’utilisation du rat, de par sa taille bien plus grosse que la souris, rend l’induction de carraghénine au centre du coussinet de la patte arrière plus facilement reproductible, et la quantification de la taille de l’œdème au pied à coulisse et au pléthysmographe est beaucoup plus précise et fiable. Les animaux seront commandés à l’âge de 8 semaines (env 300g) et utilisés après 1 semaine de stabulation afin d’utiliser des animaux adultes.

Fournir aux chercheurs des lots d'animaux au génotype vérifié : c'est l'objet déclaré d'un projet qui porte sur 119 170 souris et 660 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit un seul prélèvement, un poinçon dans l'oreille en routine, parfois un morceau de queue entre quatorze et dix-sept jours de vie, très rarement une prise de sang. Le porteur décrit des nuisances "légères et brèves" tout en listant inflammation, œdème, hématome et saignement au point de prélèvement, et l'effectif de 119 830 animaux n'est appuyé par aucun calcul. Une partie part vers d'autres établissements pour y être expérimentée, une autre sert à l'élevage, et les animaux dont le génotype ne convient pas aux croisements ou dont la fécondité baisse sont tués.

Objectifs

Notre établissement héberge dans ces animaleries différentes lignées de souris et de rats génétiquement altérées pour le compte de chercheurs externes au laboratoire. Ce projet a pour objectif de décrire les méthodes de prélèvement d’échantillons biologiques (tissu, sang) pour les contrôles génétique (génotype) d’animaux en élevage. Ces analyses permettent de surveiller et préserver la qualité génétique des modèles élevés dans notre unité afin de fournir aux chercheurs les lots expérimentaux maîtrisés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages avec divers enrichissements. Le prélèvement invasif pour le génotypage est dissocié de l’intervention d’identification. Le génotypage ne sera pas systématique lorsqu’il s’agit de lignées maintenues à l’état homozygote. Nous prélèverons ainsi uniquement les reproducteurs. Le prélèvement sanguin n'est pas utilisé fréquemment pour le génotypage et sera utilisé uniquement pour les protocoles particuliers. L’expérience de notre unité dans la gestion de colonies permet de réaliser ces techniques rapidement par du personnel qualifié, réduisant ainsi au minimum le stress et les nuisances associés à la manipulation de l’animal. Par ailleurs, les animaux seront suivis tous les jours et, si lors de la surveillance journalière un animal présente des signes cliniques suite au prélèvement, une grille d’évaluation de signes cliniques sera appliquée par les zootechniciens, et la vétérinaire et/ou la SBEA sera sollicitée pour la mise en place de mesures supplémentaires de raffinement (par exemple : enrichissement supplémentaire, croquettes humides et/ou aliment gélifié déposés dans la cage).

Bénéfices attendus

Les prélèvements décrits sont effectués pour les analyses qui permettent de surveiller et préserver la qualité génétique des modèles élevés dans notre établissement afin de fournir aux chercheurs les lots expérimentaux maîtrisés.

Procédures

Un seul prélèvement par animal sera réalisé pour génotypage : - de tissu par poinçon (oreille, en routine) ou à l’aide d’un ciseau (oreille en routine, queue exceptionnellement), ou - de sang, très rarement (par la veine en sub-mandibulaire). Si les résultats obtenus ne sont pas clairs pour interprétation, nous referons l’analyse sur l'échantillon prélevé qui sera conservé. Si les résultats ne sont pas concluants après ce deuxième test, un échantillonnage supplémentaire (oreille ou sang) sera exceptionnellement effectué sur le même animal. Dans ce cas, il y aura a minima une semaine d’écart entre les deux prélèvements sur le même animal. Ces interventions durent moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

La manipulation pour les prélèvements peut provoquer un léger stress chez l'animal. Les signes cliniques (inflammation, œdème, hématome, saignement) sur le site de prélèvement sont possibles mais le plus souvent évités si la biopsie est bien exécutée. La biopsie de l’oreille (réalisée en routine) provoque moins d’inconfort que celle de la queue parce qu’elle ne touche pas un tissu osseux. La biopsie de l'oreille ne sera jamais effectuée chez les souris âgées de moins de 2 semaines compte tenu de la petite taille de leurs oreilles. La biopsie de la queue sera effectuée seulement si la biopsie de l'oreille ne convient pas à l'étude (justification scientifique) et après l'avis favorable de la SBEA. Cette technique pourra être effectuée seulement chez les jeunes souris (âgées de 14 à 17 jours) pour éviter de toucher aux vertèbres distales ayant atteint la maturité, et la taille de l’échantillon prélevé devra être la plus petite possible pour permettre le génotypage. Le prélèvement sanguin n'est pas utilisé fréquemment et sera réalisé pour des analyses particulières. Le volume prélevé dépendra du poids de l'animal et, compte tenu du risque de choc hypovolémique chez les jeunes animaux, sera réalisé uniquement sur des animaux âgés de 2 mois ou plus. Les prélèvements ne sont réalisés qu’une fois par animal et durent moins de 30 secondes. Les nuisances liées à ces techniques seront légères et brèves. L’expérience de notre unité dans la gestion de colonies permet de réaliser ces techniques rapidement par du personnel qualifié, réduisant ainsi au minimum le stress et les nuisances associés à la manipulation de l’animal.

Devenir

Une partie des animaux portant le génotype d’intérêt sera expédiée dans d’autres établissements utilisateurs pour expérimentation. Une autre partie des animaux sera utilisée pour l’élevage ou l’expérimentation dans notre établissement. Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort si non nécessaires pour maintenir l’élevage (e.g. si génotype sans intérêt pour les schémas de croisements, surplus, ou si leur fécondité est réduite du fait de leur âge). Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation seront mis à mort.

Remplacement

Les modèles de souris et de rats concernés par ce projet générique sont inscrits dans différents projets scientifiques extérieurs à notre laboratoire. Les porteurs de projets apporteront dans chacune de leurs DAP d'utilisation des précisions sur les alternatives non animales disponibles et expliqueront pourquoi elles ne peuvent pas être utilisées aux fins du projet.

Réduction

Le prélèvement pour génotypage sera réalisé uniquement sur les animaux reproducteurs lorsqu’il s’agit de lignées maintenues à l’état homozygote et ne sera pas systématique pour les autres lignées, mais limité aux besoins de l’élevage ou de l’expérimentation pour les EU destinataires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages de taille réglementaire avec divers enrichissements (tunnel et/ou dômes en polycarbonate transparent rouge, frisure de papier kraft et/ou du celluron et/ou des granulés ou bois de rongeage). Les animaleries de notre unité ont un contrôle sanitaire périodique. Les prélèvements pour les analyses durent moins de 30 secondes. Nous réaliserons en routine uniquement le prélèvement à l’oreille. Le prélèvement de la queue et du sang n'est pas utilisé fréquemment pour le génotypage et sera utilisé uniquement pour les protocoles particuliers. Le génotypage ne sera pas systématique lorsqu’il s’agit de lignées maintenues à l’état homozygote. Nous prélèverons ainsi uniquement les reproducteurs. L’expérience de notre unité dans la gestion de colonies permet de réaliser les techniques de prélèvements rapidement par du personnel qualifié, réduisant ainsi au minimum le stress et les nuisances associés à la manipulation de l’animal. Par ailleurs, si lors de la surveillance journalière un animal présente des signes cliniques suite au prélèvement, une grille d’évaluation de signes cliniques sera appliquée par les zootechniciens, et la vétérinaire et/ou la SBEA sera sollicitée pour la mise en place de mesures supplémentaires de raffinement (par exemple : enrichissement supplémentaire, croquettes humides et/ou aliment gélifié déposés dans la cage, soin sur le site du prélèvement).

Choix des espèces

La souris et le rat sont parmi des modèles d'animaux les plus utilisés dans la recherche en raison de leurs nombreuses similitudes avec l’homme. De plus, le choix de ces modèles est dépendant des protocoles déjà existants et décrits dans la littérature permettant ainsi des échanges internationaux au sein de la communauté scientifique. Les justifications techniques et scientifiques détaillées pour chaque lignée utilisée seront apportées dans les projets « utilisateurs » (DAP spécifique). Une partie des animaux sera utilisée pour les croisements dès l’âge de deux mois et ce jusqu’à un âge où le taux de fécondité est maintenu stable selon la souche. Une autre partie sera utilisée dans notre établissement ou envoyée dans d’autres établissements pour expérimentation selon l’âge d’utilisation dans de différents projets scientifiques. Les animaux en élevage pourront être prélevés pour les analyses à différents âges selon la technique utilisée : - 15 jours ou plus pour le prélèvement à l'oreille (ne sera jamais effectué avant cet âge compte tenu de la petite taille des oreilles) - entre 14 et 17 jours pour le prélèvement de la queue (pour éviter de toucher aux vertèbres distales ayant atteint la maturité) - 2 mois ou plus pour le prélèvement de sang (compte tenu du risque de choc hypovolémique chez les jeunes animaux).