Rats

Opérés trente minutes sous anesthésie pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure, 300 rats mâles et femelles s'administrent ensuite eux-mêmes de l'alcool par voie orale et de la cocaïne par voie intraveineuse, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'expérience dure cinq à six mois, avec un taux d'attrition que le porteur estime à 20 %, et il s'agit de mettre au point un modèle de polyconsommation qui n'existe pas encore. Il liste après la chirurgie des risques d'inflammation, d'infection, de plaies dues à un toilettage excessif et de lâchage des points de suture. Il écrit ensuite n'anticiper aucune nuisance particulière pendant l'auto-administration de cocaïne et d'alcool, tous les rats étant tués à la fin pour prélever leur cerveau.

Objectifs

La polyconsommation est la norme, et non l'exception, chez les utilisateurs de drogues. Elle peut prendre plusieurs formes mais elle implique presque toujours le co-usage d'au moins un produit licite (par exemple, ingestion d'alcool) et d'une substance illicite (par exemple, inhalation ou injection intraveineuse de cocaïne). L'objectif principal de ce projet vise à développer et valider un modèle animal de polyconsommation d’alcool et de cocaïne. Il s’agira d’étudier l'influence du co-usage d'alcool sur le développement, le maintien et l’abstinence de la prise de cocaïne chez le rat. Des rats mâles et femelles auront un accès concomitant à l'alcool (par voie orale) et à la cocaïne (par voie intraveineuse). Pendant cet accès concomitant, ils pourront co-utiliser les deux substances librement avant de s'installer dans un profil de polyconsommation donné parmi les nombreux possibles (6 au total, en incluant la possibilité d’un mono-usage d’alcool ou de cocaïne). Ce projet de recherche est conçu pour permettre la découverte et l’étude de différents profils de polyconsommation d’alcool et de cocaïne, de leur développement et de leur fréquence relative, notamment en fonction du sexe (Objectif 1). Ce projet devrait également fournir d’importantes informations sur l'influence du co-usage d'alcool sur le développement initial, le maintien (Objectif 2), l’abstinence et la rechute de la consommation de cocaïne (Objectif 3). Enfin, ce projet permettra aussi la collecte et le stockage de tissus cérébraux issus d’individus ayant développé différents profils de polyconsommation pour des analyses neuromoléculaires futures.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont essentiellement d’ordre scientifique. Le premier bénéfice sera la validation d’un modèle animal de co-usage d’alcool et de cocaïne. Un tel modèle n’existe pas actuellement. Les autres bénéfices attendus incluront le recueil d’informations uniques sur les différents profils de polyconsommation d’alcool et de cocaïne, sur leur développement, sur leur fréquence relative, notamment en fonction du sexe, et, à plus long terme, sur leurs corrélats moléculaires dans le cerveau. Enfin, ce projet devrait également fournir d’importantes informations sur l'influence du co-usage d'alcool sur le développement initial, le maintien et l’abstinence de la prise de cocaïne.

Procédures

Tous les rats seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure. Cette chirurgie est effectuée sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie chimique et sous analgésie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront testés dans des procédures dont le degré de gravité ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire…), il est possible que certaines nuisances ou effets indésirables puissent survenir suite à la chirurgie ou pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection ; une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée ; une perte des points de suture avant cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool mais les animaux seront sous surveillance pendant les premières séances de polyconsommation pour repérer et prévenir tout problème éventuel.

Devenir

Les animaux ayant complété toutes les procédures expérimentales seront mis à mort afin de prélever leurs cerveaux pour des analyses moléculaires futures.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles et femelles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal se justifie pour les raisons éthiques suivantes : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces relations causales et 2) les polyconsommations de substances dans l’addiction ne peuvent pas être récapitulées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à la bonne réalisation du projet sera réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis rationnel entre le principe de réduction, les contraintes expérimentales propres au projet et les différents objectifs à remplir. Pour répondre à chaque objectif du projet, il faudra deux cohortes de 50 rats chacune (une de mâles et une de femelles). Ce nombre permettra d’avoir assez d’individus répartis dans les nombreux profils de polyconsommation possibles (6 au total, en incluant la possibilité d’un mono-usage d’alcool ou de cocaïne), tout en tenant compte d’un taux d’attrition estimé à 20 pourcents après 5 à 6 mois d’expérience. Donc le nombre total d’animaux utilisés pour répondre aux trois objectifs du projet sera égal à 300 rats. Les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux seront logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies (30 min en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie (anti-inflammatoire non-stéroïdien), sous anesthésie chimique (mélange de kétamine et de xylazine) et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl) pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement. Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures pour faciliter l'accès à l’alimentation (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique (anti-inflammatoire non-stéroïdien). L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl). Enfin, si cela ne suffit pas au bon rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire (R. Norvegicus) constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche d’H. Sapiens d’un point de vue phylogénétique (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 millions d'années) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (par exemple, les invertébrés, à l’exception sans doute des céphalopodes) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (par exemple les primates non-humains). Les espèces invertébrées (par exemple, C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider certains mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux des drogues mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’être humain pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés seront tous de jeunes adultes en fin d’adolescence au début des expériences (âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction

Tester des candidats médicaments fournis par des clients, dont le porteur écrit ne connaître ni la nature ni les effets secondaires possibles : 2 160 rats sont utilisés pour cela dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leurs tissus. On leur provoque une prostatite ou une hypertrophie de la prostate, avec des chirurgies pour injecter des composés directement dans la prostate, poser des pompes osmotiques ou des cathéters vésicaux externalisés, après quoi ils passent jusqu'à 48 heures en cage individuelle. S'ajoutent jusqu'à 24 heures en cage à métabolisme, trois heures trente en cage de restriction pour la cystométrie et une heure de contention pour un test de douleur. Le porteur écrit qu'aucun test statistique n'a servi à calculer les effectifs, retenus à douze animaux par groupe sur la base de son expérience et de la littérature.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur des modèles mimant différentes pathologies de la prostate (prostatite, hypertrophie bénigne de la prostate). La population vieillissant, de nombreuses pathologies de la prostate chez l’homme engendrent des problèmes urinaires ayant un impact important sur le bien-être et la qualité de vie (problème de sociabilisation, sujet tabou…). Il est donc nécessaire de réaliser des études expérimentales pour cette thématique de recherche.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et/ou avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de pathologies de la prostate (prostatite et hypertrophie bénigne de la prostate).

Procédures

Les animaux seront traités avec des candidats médicaments ou des agents inducteurs de pathologie par des voies d’administration classiques. Ces gestes, réalisés par du personnel qualifié et ayant de l’expérience, seront rapides (environ 1 min) pour limiter la manipulation des animaux et la gêne occasionnée. Les animaux auront des chirurgies pour l’administration de composés directement dans la prostate ou via l’implantation de pompes osmotiques ou d’implants (chirurgie rapide, environ 15 min). Les animaux pourront avoir une chirurgie un peu plus longue (environ 30 min) avec l’implantation de cathéters externalisés (cathéter vésical et d’administration). Les animaux pourront avoir des prises de glycémie donc un léger prélèvement sanguin à la queue (1 goutte) étant très rapide (1 min) 2 fois par semine. Des prélèvements sanguins plus importants pourront être réalisés au cours des traitements selon les protocoles expérimentaux (geste rapide 1-2 min) sur animal vigile (1 fois par semaine maximum). Les animaux pourront être mis dans des cages à métabolisme pendant 24H maximum ou être mis dans des cages de restriction pour évaluer le profil mictionnel via la cystométrie (pendant 3H30). Après l’implantation de cathéters externalisés, les animaux seront mis dans des cages individuelles pendant 48H maximum. Les animaux subiront un test comportemental de douleur où ils seront dans des « cages » de restriction pendant 1 heure environ (30-45 min acclimatation pour que l’animal se calme et test de douleur pendant 15 min). Ce test comportemental sera réalisé avant l’induction de la pathologie et à différents temps après l’induction de la pathologie.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, ces modèles miment des pathologies prostatiques humaines, les animaux pourront ressentir les mêmes symptômes tels que des troubles urinaires, une douleur pelvienne. De plus, une chirurgie peut toujours entraîner une gêne post-opératoire lors de la cicatrisation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet car des tissus seront collectés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique réellement efficace pour le traitement des pathologies prostatiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience sur ces modèles et les publications scientifiques publiées, un nombre minimum de 12 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre deux groupes et des tests pour évaluer la différence entre plusieurs groupes (tests paramétriques ou non-paramétriques selon la normalité des groupes). Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) notamment pour le suivi mictionnel via l’utilisation de cages à métabolisme. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, morceau de bois…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée afin d’éviter toute hypothermie. Un antalgique sera administré pour diminuer la douleur des chirurgies. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Nous essayons d’utiliser des méthodes non invasives (test de comportement, cages métaboliques) et d’acclimater les animaux avant l’expérimentation aux différentes installations afin de limiter au maximum le stress des animaux. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Les différents modèles sont bien décrits chez le rat dans la littérature et permettent de mimer les 2 pathologies prostatiques non cancéreuses les plus diagnostiquées et impliquant des troubles urinaires et/ou douleurs engendrant une diminution non négligeable de la qualité de vie des patients. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 6 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

720 rats en croissance vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun passe la période expérimentale seul en cage, dont deux fois 24 heures en cage métabolique et deux fois trois jours en cage de calorimétrie, avec deux radiographies sous isoflurane, deux prises de sang de 500 microlitres à la queue et un transport en voiture jusqu'à une plateforme distante. Ils sont nourris de régimes volontairement déficients en acides aminés indispensables, pour chercher dans leurs urines et leur sang des marqueurs de cette carence. Le porteur affirme que mesurer la croissance et le comportement alimentaire "empêche" tout remplacement par des modèles cellulaires, et présente le rat comme un modèle de l'enfant dénutri.

Objectifs

La qualité de l’apport alimentaire en protéines des régimes alimentaires dépend de leur capacité à satisfaire les besoins en acides aminés (AA) indispensables (AAI) tout au long des cycles de vie. C’est une question majeure de sécurité nutritionnelle, principalement dans les pays en voie de développement, où l’apport protéique total est modéré, voire bas. Plus généralement, la connaissance de la qualité de l’apport alimentaire en protéine est primordiale pour comparer les différentes sources de protéines, notamment dans le cadre des discussions sur le rééquilibrage des sources alimentaires végétales et animales, et la recherche de sources alternatives de protéines. La composition en AAI est variable selon les sources protéiques. En effet, les protéines d'origines animales ont un profil homogène et équilibré en AAI, alors que les protéines de céréales et les protéines de légumineuses (comme le gluten) sont déficientes en certains AAI. Les profils de référence de besoin en AAI, utilisés pour l’évaluation de la qualité protéique, initialement déterminés à partir de données de bilan azoté, ont été révisés à la hausse (Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO)/Organisation mondiale de la santé (OMS),2007) sur la base de nouvelles méthodes, rendant plus sélectifs les critères de qualité des protéines. Cependant, ces valeurs révisées restent discutées. Ainsi, lors de son rapport sur le besoin en protéines et AA en nutrition humaine, le comité (FAO/OMS) a conclu qu’aucune méthode actuelle d’estimation du besoin en AAI n’est entièrement fiable et qu'iI est donc primordial de proposer de nouvelles approches complémentaires pour préciser les valeurs des besoins et d’évaluer le statut nutritionnel protéique des différentes populations. Pour cela, la FAO a recommandé le recours à l’usage d’outils tels que la métabolomique (ensemble des métabolites), qui a notamment été appliquée avec succès pour estimer le besoin en d’autres micronutriments. L’objectif de ce projet est d’identifier les variations des profils du métabolome urinaire et plasmatique comme biomarqueurs spécifiques de la déficience en AAI et à évaluer l’efficacité de la supplémentation pour valider les biomarqueurs identifiés. Ce projet fait suite à deux projets précédents pour lesquels nous avons identifié et validé des biomarqueurs urinaires pour trois des neuf AAI. Ce projet se déroulera sur 2 sites, dont une plateforme pour évaluer leur dépense énergétique et la composition corporelle.

Bénéfices attendus

L’identification et la validation de biomarqueurs du statut en AAI permettra, à terme, de mieux définir les besoins en acides aminés indispensables. Cela servira à affiner les politiques nutritionnelles et à mieux évaluer la qualité des sources protéiques. De plus, cette étude nous renseignera sur les effets d’une supplémentation en ces acides aminés indispensables après une phase de déficience. Ces effets n’étant que peu rapportés dans la littérature, ces informations seront très utiles, notamment pour l’étude de la sous-nutrition chez l’enfant avec retard de croissance.

Procédures

Durant la période expérimentale , les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire. Les animaux seront placés deux fois pendant la période expérimentale en cages métaboliques pendant 24h pour collecter les féces et les urines, et deux fois en cage de calorimétrie pendant 3 jours pour la mesure de dépense énergétique. La densité minérale osseuse et la longueur du tibia seront analysés par radiographie deux fois au cours de l'expérience après anesthésie gazeuse (anesthésie à l'isoflurane 2% pendant 10-15min). Deux prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine de la queue de 500μl chacun .A la fin de l'expérimentation, les animaux seront mis à mort et une injection de valine 13C sera réalisée 30 minutes avant l’euthanasie (150μmol/100g poids corporel), dans le but de mesurer la synthèse protéique.

Impact sur les animaux

Durant la période expérimentale, les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire et de leur dépense énergétique (cages de calorimétrie indirecte), ainsi que la collecte des urines et fécès (cages métaboliques), ce qui peut engendre un stress modéré dû à l’isolement des animaux. Les animaux seront transportés à la plateforme 3 jours avant d'effectuer les mesures, afin d’évaluer leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte et leur composition corporelle. La plateforme se situe à plusieurs km de l’unité de rechercheset le transport des animaux sera réalisée en voiture ce qui peut engendrer un stress modéré. Aussi, les prélèvements sanguins lors de la procédure 2 sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré. Une injection sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. L’anesthésie gazeuse permettra de réduire la douleur engendrée par l’injection.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser des analyses sur différents tissus cibles.

Remplacement

La nécessité de mesurer les conséquences de l'ingestion d’un régime à faible teneur en AAI sur le comportement alimentaire et les paramètres de la croissance (gain de poids et composition corporelle) empêche le remplacement de l'expérimentation animale par des modèles cellulaires ou moléculaires. Les résultats de ce projet permettront de mettre en place une étude clinique chez l’enfant dénutri. Ainsi, les objectifs de ce projet ne peuvent être atteints sans avoir recours à l’animal, le rat étant un modèle pour l'humain, en particulier pour la nutrition.

Réduction

A partir des données issues d’une étude précédente, nous avons déterminé qu’un effectif de 10 rats par groupe est le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garder une puissance statistique satisfaisante. Cette étude inclue 6 lots, correspondant à chaque AAI à étudier. L’expérimentation comprendra 80 animaux pour chaque AAI étudié.

Raffinement

Le projet impose l'hébergement des rats en cages individuelles (répondant aux normes en vigueur) pour la mesure précise de la consommation alimentaire. Les rats demeurent dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils continuent à échanger par vocalises, et ils les voient et les sentent, ce qui modère l’impact de l’isolement. De plus, les cages seront enrichies au moyen de différents objets (tunnel, d’une tasse renversée, …) . De plus, un enrichissement social est prévu : les animaux seront placés en cages collective tous les jours pendant 2 h (durant les mesures de poids corporel et de gaspillage alimentaire). Les prises de sang sont réalisées par un expérimentateur expérimenté pour cet acte technique. Des aiguilles spécifiques permettant un écoulement plus efficace du sang en sortie d’aiguille sont utilisées, ce qui permet de limiter la durée et le stress engendré par les prises de sang. Les animaux seront transportés à la plateforme en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : Les animaux seront regroupés en fonction des régimes en cages collectives de transport avec de l’eau en gelée et de la nourriture à disposition. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Comme l’humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus, l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’homme, le porc ou le rat pour étudier la qualité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Nous utiliserons ainsi des rats en croissance comme modèle de l'enfant en croissance.

3000 rongeurs, 1800 rats et 1200 souris, vont être utilisés, tous tués sous anesthésie sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur cautérise l'urètre sous anesthésie générale pour provoquer une incontinence, on leur implante des cathéters dans la vessie, la veine jugulaire ou l'estomac, puis on comprime leur abdomen par pressions croissantes jusqu'à ce qu'une goutte d'urine sorte, quatre fois de suite. Les molécules testées viennent de clients dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires possibles. Il qualifie ce test de compression de "non invasive", n'indique pas le nombre de jours de traitement et reconnaît qu'aucun calcul statistique ne fonde l'effectif de dix animaux par groupe.

Objectifs

L’incontinence urinaire d’effort est un des problèmes majeurs du vieillissement. Cette pathologie est souvent sous-évaluée car tabou mais a un impact important dans la qualité de vie des patients. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de candidats médicaments sur le mécanisme de fermeture de l’urètre et sur l’incontinence urinaire d’effort induite par cautérisation de l’urètre.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints d’incontinence urinaire.

Procédures

Les animaux vont subir des traitements de produits à tester. Chaque geste classique (type gavage, administration intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire…) étant réalisé par du personnel qualifié, ces derniers devraient durer environ 30 sec à 1 min par animal. Le nombre de jours de traitement étant dépendant de chaque protocole expérimental, nous ne pouvons pas indiquer le nombre d’intervention pour ces gestes. Les animaux vont subir une chirurgie (lésion de l’urètre) sous anesthésie générale qui devrait durer 30 min maximum. Pour les tests de Leak Point Pressure (LPP) ou test de point de fuite, des cathéters pourront être placés dans différents organes (vessies, veine jugulaire, intragastrique par exemple…). Ces chirurgies dureront environ 20 min et l’animal ne la subira qu’une fois. Le test de LPP se fait sous anesthésie générale (anesthésie sans réveil). Ce test consiste à appliquer des pressions croissantes sur l’abdomen de l’animal (principalement au niveau de la vessie) et d’arrêter ces pressions dès qu’une goutte d’urine apparaît. Chaque session de ce test dure environ 30 sec. Et un animal aura plusieurs sessions (environ 4) avec 10-15 min de repos entre chaque.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Cependant, certains clients nous informent de potentiels effets secondaires pouvant apparaître avec leurs molécules. Des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, des lésions et une légère douleur (douleur de l’aiguille). Le modèle physiologique de ce protocole mimant une incontinence urinaire, les animaux subiront les effets secondaires de cette pathologie (pertes fréquentes et incontrôlées d’urines).

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort car anesthésies avec un anesthésiant irréversible (sans réveil).

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’incontinence urinaire. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Pour évaluer l’effets de candidats médicaments, la méthode du LPP (link point pressure ou pression du point de fuite) est une méthode non invasive qui consiste à appliquer des pressions croissantes au niveau de la vessie de l’animal et d’observer une fuite urinaire. Cette méthode se réalise sur des animaux anesthésiés (anesthésie sans réveil), ne provoquant pas de douleur aux animaux. Cette méthode sera réalisée par du personnel qualifié et validé pour cette technique, ce qui permettra d’obtenir des résultats significatifs avec un nombre minimum d’animaux. Aucun test statistique n’est réalisé pour définir le nombre d’animaux par groupe, mais avec notre recul et notre expérience, nous savons que n=10 animaux par groupe est le minimum nécessaire pour avoir des résultats significatifs. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre deux ou plusieurs groupes. Nous pensons réaliser 3 études par an chez le rat et 2 études par an chez la souris.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, nestlet…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de signes cliniques avant l’atteinte de points limites à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Des antalgiques seront utilisés pour les chirurgies afin de limiter la douleur. Les protocoles utilisés seront conformes aux recommandations des comités d'éthique et viseront à assurer le bien-être des animaux, en se référant aux "cinq libertés fondamentales" établies par l'Organisation mondiale de la santé animale. Cela implique : 1. que les animaux ont accès à une alimentation et à de l'eau en quantité et en qualité suffisantes 2. que nous prenons des mesures pour minimiser la douleur, les blessures et les maladies chez les animaux. 3. que nous veillons à ce que les conditions de logement et d'environnement des animaux soient adaptées 4. que nous permettons aux animaux d'exprimer leurs comportements naturels et essentiels à leur bien-être 5. que nous prenons des mesures pour minimiser la peur et la détresse chez les animaux grâce à un entrainement pour les rendre à l'aise avec les gestes techniques, les supports de contention ou les appareils utilisés pendant l'expérience.

Choix des espèces

Notre expertise chez le rongeur et en particulier chez le rat dans les études urologiques ainsi que les informations de la littérature sont les raisons qui nous ont fait choisir le rat en priorité. Toutefois, ces procédures peuvent très bien être extrapolées chez le souris, selon la demande de nos clients (expérimentations déjà réalisées dans notre laboratoire). Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

Une injection de streptozotocine dans l'abdomen pour faire monter le sucre sanguin, quarante-huit heures d'attente, trois gavages d'eau ou de molécules extraites de la pomme, puis une anesthésie pour mesurer la réaction des vaisseaux. 100 rats Wistar vont être utilisés ainsi, tous tués à l'issue pour prélever leurs artères, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié seulement reçoit la streptozotocine, l'autre servant de comparaison, et le porteur attend de l'expérience une piste nutritionnelle contre les atteintes vasculaires du diabète. Il retient le rat parce qu'il fournit assez de tissu pour plusieurs dosages, ce qu'il compte comme une façon de limiter le nombre d'individus utilisés.

Objectifs

Ce projet aura pour objectif d’évaluer les effets de de l’augmentation du glucose sanguin sur la fonction vasculaire ainsi que les eventuels effets protecteurs de la consommation concommitante de molécules de pomme qui sont reconnus pour leur action bloquante sur les transporteurs du glucose. Nous chercherons donc dans un premier temps à voir l'effet du glucose sur les modifications de la protéine qui régule la fonction vasculaire et évaluer si l'ajout de bloqueurs des transporteurs du glucose permettent de réverser ces modifications.

Bénéfices attendus

Le projet doit apporter une meilleure connaissance des mécanismes de dysfonction vasculaire associée à une forte concentration de sucre dans le sang. L’étude de l’implication des mécanismes de modulation de la dysfoncion vasculaire médiée par l’augmentation de la concentration de glucose dans le sang permettra de mieux appréhender les altérations de ces tissus dans des pathologies telles que le diabète. Enfin l’utilisation de molécules de pomme permettra d’évaluer l’implication des différents transporteurs du glucose et d’éventuellement mettre en avant une stratégie nutritionnelle efficiente pour limiter les altérations liées au glucose

Procédures

La moitié des animaux recevra une injection intrapéritonéale de Streptozotocine (molécule permettant d’induire une hausse du glucose sanguin), 48 heures avant l'évaluation de la fonction vasculaire ou les prélèvements post-mortem. Les animaux avec une forte concentration de glucose dans le sang (streptozotocine) ou non seront soumis à une supplémentation orale aigue (3 traitements oraux) en eau ou en molécules issues des pommes. Une anesthésie sera réalisée et associée à une injection d’analgésique afin de réaliser des doses-réponses de molécules ayant un effet relaxant vasculaire.

Impact sur les animaux

L'induction d'une hausse de la concentration de glucose dans le sang par injection intra-péritonéale de Streptozotocine est une procédure pouvant entrainer des douleurs faibles au site d'injection. Suite à cette injection les animaux seront placés sous surveillance durant 2 heures puis seront surveillés quotidiennement. La supplémentation par voie orale (gavage) ainsi que l’induction de l’anesthésie gazeuse pouvant être source de stress ou de douleurs modérées pour l’animal, les animaux seront habitués au gavage par un manipulateur expérimenté.

Devenir

Afin de pouvoir évaluer les effets des différents transporteurs du glucose, nous devons réaliser des analyses sur les tissus des artères des animaux inclus ce qui nécessite la mise à mort des 100 rats Wistar en fin de procédure.

Remplacement

Ce projet visant à évaluer les effets du glucose sur les modifications des protéines vasculaires fait l’objet de différentes expérimentations. Des expérimentations in-vitro sont actuellement conduites pour évaluer les mécanismes de ces voies de signalisation. Par ailleurs, les études in-vitro nous ont permis d’évaluer l’intérêt de l’utilisation des 2 molécules de pomme que sont la phlorizine et la phlorétine dans la limitation des effets délétères liés au glucose. Cependant la balance entre les différentes modifications protéiques au niveau vasculaire est complexe et l’évaluation de l’effet de stratégies nutritionnelles nécessite l’utilisation de modèle in-vivo afin d’évaluer l’influence de ces différentes conditions. L’intégration d’expérimentations animales apparait donc comme nécessaire afin de compléter ce projet de recherche.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire afin de réaliser les mesures de réactivité vasculaire in-vivo tout en s’assurant de la répétabilité du résultat. Pour cela un nombre minimum de 10 animaux par condition apparait comme nécessaire. Des groupes doivent être conduits pour l’évaluations de nos différentes conditions sur la fonction vasculaire et d’autre groupes sont nécessaires pour quantifier les modifications protéiques au niveau de ces mêmes tissus.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés durant 7 jours après leur arriver à l’animalerie avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents points limites. Afin d’éviter toute douleur, les prélévements seront réalisés sous anesthésie associée à une analgésie.

Choix des espèces

Le rat est un modèle pertinent pour l’étude du système cardiovasculaire. De plus son utilisation permet d’obtenir des quantités de tissu suffisantes pour la réalisation de plusieurs dosages biochimiques permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Afin d'éviter des modifications liées au développement des animaux, les animaux seront utilisés à un stade mature (rats de 12 semaines) pour être représentatif d’une population adulte

L'abdomen ouvert sur sept centimètres, l'aorte incisée, un cathéter à ballonnet poussé jusqu'aux artères iliaques pour en abîmer la paroi : l'intervention dure environ 90 minutes. 480 rats vont être utilisés ainsi, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La lésion sert à provoquer un rétrécissement artériel sur lequel un gel de nanoparticules lipidiques sera testé, avec pour effets possibles une occlusion des artères et une thrombose. Le porteur ne donne aucun calcul pour l'effectif et se contente d'évoquer un "plan expérimental stéréotypé" permettant la puissance statistique voulue.

Objectifs

L'hyperplasie intimale (HI) est un phénomène complexe qui entraine la diminution progressive de la lumière du vaisseau sanguin puis son obstruction. Elle apparait après des gestes de chirurgie vasculaire comme un pontage ou encore une pose de stent. L'HI représente une des complications majeures non encore résolue à ce jour, de ces interventions chirurgicales pratiquées de manière courante. Ce phénomène survient rapidement après le geste initial : entre le 3ème et le 18ème mois. Ce phénomène considéré comme une "surcicatrisation" au niveau de la paroi artérielle conduit au rétrécissement de l'artère jusqu'à son occlusion, et nécessite une nouvelle intervention chirurgicale. Diverses approches ont été envisagées pour limiter le phénomène d’HI telles que l’utilisation de matériaux biocompatibles synthétiques pour remplacer les vaisseaux sanguins, ou alors l’utilisation d’endoprothèse modifiés en surface (stent enrobé par des agents thérapeutiques) lors d’une recanalisation. Cependant, ces approches thérapeutiques peuvent reconduire à l'apparition d'HI. Dans ce projet, nous cherchons à développer un biomatériau de type hydrogel de nanoparticules lipidiques contenant une substance thérapeutique capable de limiter ce phénomène d’HI. Le gel pourrait être appliqué sur la paroi externe des vaisseaux (le site d’intervention) par le chirurgien après la suture vasculaire. L'agent thérapeutique se trouvant dans le gel sera diffusé le long de la paroi des vaisseaux sur le long terme et limiterait l'HI, ce qui diminuerait considérablement le taux de réintervention chirurgicale. À travers les expérimentations animales, nous cherchons à démontrer l'efficacité de ce biomatériau de type hydrogel sur un modèle animal d'HI. Pour ce faire, nous allons induire l'HI par un geste chirurgical chez le rat puis appliquer le gel sur le site d'intervention. Après 1 à 4 semaines, nous étudierons les effets de l’hydrogel sur le développement de l’HI.

Bénéfices attendus

Le développement de l’hyperplasie intimale (HI) suite à une intervention chirurgicale des vaisseaux est un phénomène très fréquent. En fonction de type d’intervention, plus de 50% des patients peuvent développer l’HI. De nos jours, seul traitement étant réintervention chirurgicale, il est primordial de prévenir et de limiter son apparition. Le principe de cet hydrogel des nanoparticules lipidiques (NpL) est d’appliquer directement sur le site d’intervention à la fin de la chirurgie, ce qui ne nécessite pas une réintervention chirurgicale chez les patients. Par ailleurs, il est possible de moduler le temps de libération des substances à partir de l'hydrogel en modifiant la quantité des composants du gel. L’intérêt étant de limiter la surcicatrisation après la mise en place de la bonne cicatrisation, la libération de molécule thérapeutique peut être retardée dans le temps. De plus, grâce à ses composants biodégradables, il n’y a peu, voire pas de résidu après l’absorption par l’organisme. Notre hydrogel des NpLs présente donc une meilleure biocompatibilité par rapport à d’autres types de nanoparticules. Ce type d’hydrogel contenant une autre substance thérapeutique a déjà été étudié sur un cancer cérébral. Les résultats ont montré une amélioration de taux de survie chez les animaux cancéreux. Si les résultats de ce projet sont prometteurs, cela permettra de proposer une nouvelle thérapie pour l’HI et d’ouvrir la possibilité d’application de ce type d’hydrogel pour d’autres pathologies.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’induction d’hyperplasie intimale (HI) au niveau de l’aorte abdominale (incision) et des artères fémorales (lésion pariétale). L’intervention durera environ 90 min au total. Sous l’anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront des piqûres d’analgésiques en sous-cutanée en préopératoire. 15 min plus tard, l’abdomen sera incisé d’environ 7 cm. Les animaux des groupes « HI » subiront une petite incision au niveau de l’aorte abdominale et l’introduction de cathéter à ballonnet jusqu’aux artères iliaques pour une lésion pariétale. Après avoir retiré le cathéter, l’incision de l’aorte et l’abdomen seront refermées par des points de suture. De l’ouverture à la fermeture de l’abdomen, la durée estimée est d’environ 45-50 min. L’animal subiront une administration sous-cutanée d’analgésique en post-opératoire avant de retourner dans sa cage d’initial (environ 2h plus tard après l’intervention).

Impact sur les animaux

Au cours de leur vie, ils ressentiront des inconforts liés à la préhension et à la manipulation, qui seront minimisés par l’intervention d’un seul expérimentateur. Durant la procédure chirurgicale, les douleurs liées à l’intervention seront gérées et soulagées par l’administration des analgésiques. L’hypothermie sera également gérée par l’utilisation de tapis chauffant et d’une couveuse. Ils pourront ressentir l’angoisse liée à l’isolement pendant le rétablissement post-opératoire, qui durera au maximum une demi-journée. Il peut également y avoir des effets indésirables du modèle pathologiques d’HI tels que l’occlusion des artères et/ou la thrombose.

Devenir

Utilisation de tous les animaux pour récupérer les tissus artériels et étudier les effets de l'hydrogel sur le développement de l'hyperplasie intimale.

Remplacement

Dans ce projet, nous utilisons 5 nanoparticules (NpLs) différentes, ce qui leur donnent des caractéristiques physico-chimique différentes. La biocompatibilité et la capacité d’internalisation des NpLs varient en fonction de ces caractéristiques. Nous avons effectué des études sur des cellules (in vitro) pour définir une NpL parmi les 5 qui présente la plus faible toxicité et le meilleur taux d’internalisation dans les cellules. Suite à ces résultats, nous utiliserons la seule NpL définie pour des expériences sur les animaux (in vivo). En revanche, l’hyperplasie intimale (HI) étant due à des mécanismes et des processus de régulation complexe de l'organisme, il n’est pas possible de reproduire ces conditions pathologiques in vitro pour étudier l’efficacité de notre biomatériau d’hydrogel sur la pathologie. C’est pourquoi nous avons recours au modèle animal en choisissant le rat comme modèle classique de mammifère qui est également un modèle d’HI bien établi dans la littérature.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes.

Raffinement

Les animaux seront élevés en cages enrichies avec des cartons et des cabanes et sont surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les rats seront manipulés uniquement par l’expérimentateur du projet pour l’habituation à la préhension permettant de réduire le stress lié. Suite à l’intervention, une surveillance accrue sera mise en place par l'expérimentateur afin d'aller voir ces animaux opérés tous les jours pendant au moins une semaine, en plus de la visite quotidienne par les animaliers. Après l’opération, chaque animal sera mis individuellement dans une cage placée dans une couveuse réglée à 27°C pendant quelques heures pour le rétablissement post-opératoire puis sera remis avec d’autres rats en groupe social. L'isolement ne dépassera pas 24h. Afin de réduire au maximum les douleurs liées à l'intervention, les analgésiques seront administrés en préopératoire, post-opératoire et dans le cas d'apparition de signes cliniques. La pesée et l’évaluation de comportement et d'apparence selon la grille du score seront également effectuées pour d’assurer le bien-être de l’animal.

Choix des espèces

Les rongeurs sont recommandés par les agences de régulation du médicament (FDA, EMEA) comme première approche. L’utilisation des rats est préférable au vu du type d’intervention. Il aurait été très difficile d’effectuer ces interventions chez les souris à cause de leur petite taille. La perte liée à la chirurgie aurait été beaucoup plus importante chez la souris que chez le rat. Par ailleurs, le rat est le modèle animal d’hyperplasie intimale (HI) couramment utilisé et très bien établi dans la littérature. Chez l’Homme, les pathologies vasculaires surviennent à l’âge adulte. Les adultes sont donc sujets à recevoir des interventions chirurgicales des vaisseaux et sont susceptible de développer l’HI par la suite. De ce fait, nous travaillerons sur les rats adultes âgés de 18 à 24 semaines pour reproduire l’HI.

Pendant le test d'effort, les rats reçoivent des chocs électriques, l'épreuve étant arrêtée au bout de trois chocs en trente secondes ou de cinq chocs en une minute. 210 rats Wistar mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection unique déclenche chez eux une insuffisance cardiaque droite qui peut entraîner leur mort, puis un traitement est initié quatre semaines plus tard pendant dix ou soixante jours, avec IRM et échocardiographie sous anesthésie, mesure de la fonction rénale, test d'effort sur animal vigile, et enfin un cathétérisme cardiaque de vingt minutes sans réveil dont le porteur indique que l'animal peut mourir pendant l'examen. Les rats perdant plus de 15 % de leur poids sont tués, et le porteur retient de jeunes adultes de 200 à 220 grammes pour leur "meilleure résistance à la toxicité de la molécule".

Objectifs

Malgré des améliorations thérapeutiques majeures sur les 30 dernières années, l’insuffisance cardiaque (IC) reste associée à une mortalité et un taux de réhospitalisation à 1 an élevés. Les traitements actuellement disponibles sont efficaces pour améliorer la fonction ventriculaire gauche. Aucune thérapeutique n’a démontré son efficacité pour améliorer la fonction ventriculaire droite dans l’IC. Les gliflozines (ou SGLT2 inhibiteurs) sont des traitements qui ont récemment prouvé leur efficacité, administré seul ou en association avec des traitements classique de l’IC, pour réduire la mortalité cardiovasculaire et/ou le risque d’hospitalisation pour IC. L’effet sur la fonction ventriculaire droite de cette classe thérapeutique n’a jamais été étudié. Étant donné les mécanismes d’action connus de cette classe thérapeutique, nous faisons l’hypothèse que les gliflozines ont un effet bénéfique sur la fonction ventriculaire droite dans l’IC. En utilisant un modèle expérimental de dysfonction ventriculaire droite chez le rat, nous allons étudier si les gliflozines sont capables d’améliorer celle-ci et déterminer les mécanismes impliqués. Cela permettra d’approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués avec l’objectif de développer de nouvelles stratégies pharmacologiques pour améliorer la prise en charge et le pronostic des patients IC.

Bénéfices attendus

Le modèle utilisé et le design expérimental nous permettra d’étudier l’aggravation de la dysfonction ventriculaire droite ainsi que les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la progression de la dysfonction ventriculaire droite afin d’identifier/d’évaluer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les Rat Wistar subiront une injection unique d'une molécule qui entraine une dysfonction du ventrciule droit au J1 de l'étude. Puis 4 groupe aurons quatre semaines après induction de l’IC droite, un traitement sera initié puis mise à mort après 10 jours de traitement et 4 autre groupe aurons quatre semaines après induction de l’IC droite, un traitement sera initié puis mise à mort après 60 jours de traitement .Chaque injection de traitement serais de quelques secondes par animal. L'analyse des effets fonctionnels (IRM et échocardiographie cardiaque) qui sera effectuée sous anesthésie pour une durée de 10 minutes/rat. La fonction rénale sera évaluée sous anesthésie gazeuse 10 minutes/rat maximum pour l'injection du traceur fluorescent suivie d'un test à l'effort qui sera effectué sur les animaux vigiles. Le protocole invasif (cathétérisme cardiaque) sera réalise sur des animaux profondément anesthésiés et sera sans réveil(durée 20 minutes / rats ).

Impact sur les animaux

Les procédures sont classées modère . L'injection de la molécule entrainera potentiellement une dysfonction du ventrciule droit .Les deux procédures mènent à une insuffisance cardiaque. qui peut entraine le décès de l'animal. Les naissances des tests d'effort sont une fatigue de l'animal qui est évalué par des chocs électriques, mais tout cela est prise en compte avec une fiche procédure qui d'écrit les points limite du test. Arrêt du test à l'effort au bout de 3 chocs électriques en 30 secondes ou de 5 chocs électrique en 1 minute. On replace l'animal dans sa cage une fois le test fini ou les points limite définie dans le protocole dépasser. Pour le cathétérisme cardiaque, l'animal subira une chirurgie pour insertion d'un capteur de pression dans la carotide pour obtenir les pressions volume au niveau du coeur du rat, chaque animal sera mise à mort à la fin du test. Il se peut que l'animal décède lors du test ce cathétérisme cardiaque.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque série d’expérimentations suite au cathétérisme cardiaque pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Dans l’objectif de limiter le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous mettrons en place certaines expériences in vitro (tests de prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant, l’utilisation des animaux est rendue nécessaire, car il n’existe pas à ce jour de modèle d’IC in vitro et encore moins de modèle d’IC droite in vitro. Les études fonctionnelles in vivo de notre projet ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro à cause de la complexité de la pathogenèse de l’IC droite. En effet, des études dans notre modèle animal sont nécessaires pour comprendre les altérations globales cardiaques lors du développement de l’IC droite et son traitement (altérations simultanées des lymphatiques, des cellules immunitaires, des fibroblastes et du métabolisme des cardiomyocytes, modifications progressives de l’hémodynamique ventriculaire gauche et droite). Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque droite par échocardiographie, IRM, de la fonction rénale, de la capacité d'exercice. A la phase terminale nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de rats (n=24 par groupe) nécessaires afin de détecter une différence de 10%. Des résultats historiques obtenues lors des expériences précédemment effectuées dans le laboratoire ont démontré qu’un nombre de 24 animaux par groupe sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie/IRM. Il faut souligner que l’analyse répétée en échocardiographie ou en IRM sur le même animal au cours d’une étude permet également de diminuer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour démontrer un effet significatif. Concernant l’induction de l’IC droite, un suivi de la survie post-administration dune sera mis en place afin d’affiner et donc de limiter le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 par cage avec de l’enrichissement (Tunel, Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement contrôlé et stabilisé (température de 21°C , hydrométrie à 55% et luminosité à 100 lux avec une durée de cycle de lumière normal soit 12h/12h). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera observée avant le début des protocoles. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal est utilisé quand un animal présente un état de mal être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA . Les rats perdant plus de 15 % de leur poids seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les expériences in vivo, ne peuvent pas être remplacées par des études in-vitro, qui nécessite des études fonctionnelles et physiopathologiques sur un modèle intégré. Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous allons dans ce projet utiliser essentiellement des rats, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles. Chaque animal est identifié de façon individuelle par une puce d’identification Les rats mâles Wistar jeunes adultes (200-220 g) seront utilisés pour induire l’IC droite. Cet âge est justifié par la meilleure résistance des animaux à la toxicité de la molécule, permettant de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés.