Souris

Irradiées en corps entier puis greffées de moelle osseuse, 2592 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi l'implantation chirurgicale de mini-pompes et des échocardiographies sous anesthésie, pour étudier l'inflammation menant à une insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée. Le porteur indique avoir d'abord testé ses hypothèses sur des cultures de macrophages, mais affirme que la réponse inflammatoire ne s'appréhende que dans un "organisme entier". Toutes sont tuées par exsanguination en fin de protocole pour le prélèvement de leurs organes.

Objectifs

L'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée est une forme d'insuffisance cardiaque qui se définit par des symptômes cliniques d’insuffisance cardiaque, associés, entre autres, à une fraction d’éjection du ventricule gauche supérieure ou égale à 50 %. Il a été estimé que la proportion de patients souffrant d’insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée augmente de 1% par an et est en passe de devenir la forme d’insuffisance cardiaque majoritaire. Les études récentes indiquent une claire implication du système inflammatoire menant à une fibrose du coeur (rigidification du muscle du coeur) excessive dans cette pathologie, en revanche, les mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent l’implication du système inflammatoire dans le développement de l'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée restent mal compris. Également, des études ont mis en évidence un lien causal entre une pathologie des cellules de la moelle osseuse, qui affecte préférentiellement les individus âgés, et le développement d’une inflammation excessive et d’une insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée. Cette pathologie est caractérisée par l'acquisition, par des cellules de la moelle osseuse, de mutations touchant des gènes impliqués dans les cancers du sang. Au stade de cette pathologie auquel nous nous interessons, une ou des mutation(s) sont observées dans au moins 2% des cellules sanguines circulantes en absence de cancer du sang. Notre projet vise à explorer précisément les liens mécanistiques entre cette pathologie de la moelle osseuse et notamment sa principale mutation décrite sur le développement de l’insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires inflammatoires mis en jeu lors de l'hématopoïèse clonale à potentiel indeterminé et impliqués dans l’insuffisance cardiaque. Ce projet permettra également de mettre en évidence de nouvelles options thérapeutiques prometteuses qui cibleront la réponse inflammatoire.

Procédures

- Irradiation en corps entier. Durée : 30min. - Transplantation de moelle osseuse dans des souris irradiées anesthésiées par injection. Durée: 5 secondes. - Echocardiographie sur souris anesthésiées (une à quatres fois). Durée : 10min. - Implantation de mini-pompes sur souris anesthésiées. Durée : 5min - L'administration de traitements. Durée: 5 secondes. - Mise à mort par exsanguination pour récupération des organes et prélèvement de sang sous anesthésie. Durée : 5min.

Impact sur les animaux

- Transplantation de moelle osseuse dans des souris irradiées anesthésiées par injection. Durée 5: secondes. Nuisance : légère douleur transitoire au point d'injection. - Implantation de mini-pompes osmotiques sur souris anesthésiées. Douleur péri-opératoire modérée. - L'administration d'inhibiteurs peut induire du stress et une légère douleur transitoire au moment de l'administration au traitement. Durée: 5 secondes.

Devenir

Les organes de tous les animaux seront prélevés à la fin des différentes procédures, nécéssitant la mise à mort des animaux.

Remplacement

Pour respecter le principe des 3R, nous avons évalué nos hypothèses avec des cultures de macrophages avant de l’étudier dans un modèle pré-clinique chez la souris. Ces expériences nous ont notamment permis de déterminer les concentrations optimales et d’évaluer la puissance des inhibiteurs dans des tests d’activation cellulaire. Cependant, la réponse inflammatoire et le remodelage cardiaque résultent d’interactions complexes entre plusieurs organes (moelle osseuse, sang, rate) et diverses populations cellulaires. Cette dynamique ne peut être appréhendée de manière intégrée qu’au sein d’un organisme entier, dans lequel la physiologie systémique et les communications intercellulaires et inter-organes sont préservées. C’est pourquoi notre projet nécessite l’utilisation d’un modèle chez la souris préservant la complexité physiopathologique globale des systèmes cardiovasculaire et inflammatoire.

Réduction

Les effectifs sont déterminées et les résultats sont analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales, notamment l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés pour les procédures et l’établissement de points limites adéquats. - Transplantation de moelle osseuse : injection de cellules de moelle par voie intraveineuse, anesthésie gazeuse. - Implantation de mini-pompes osmotiques en sous-cutané (chirurgie) : injection sous-cutanée d’analgésique. L’intervention se fait sous anesthésie gazeuse. La stratégie d’antalgie préventive au site d’incision par injection sous-cutanée d’analgésique, qui sera répétée dans les jours suivants la chirurgie selon les besoins des animaux. - Mise à mort des animaux par exsanguination (veine cave inférieure) : injection sous-cutanée d’analgésique. Les animaux seront sous anesthésie gazeuse profonde durant toute l’intervention. Les souris seront élevées en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris : - température contrôlée à 22°C - cycle de jour/nuit de 12 heures - nourriture et eau ad-libitum - hébergement dans des cages de 2 à 5 souris maximum - enrichissement des cages avec maisonnettes, batônnets en bois et coton. Après la procédure chirurgicale, les animaux sont placés dans une cage de réveil chauffée et enrichie, sous surveillance jusqu’au réveil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs congénères, dans une cage d’hébergement enrichie. La stratégie antalgique sera systématiquement poursuivie en post-opératoire, avec administration sous-cutanée d’antalgique le lendemain de la chirurgie et les jours suivants si nécéssaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les responsables du projet pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être jusqu’à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

La souris constitue le modèle expérimental de référence pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’inflammation et le remodelage cardiaque. Ces phénomènes mettent en jeu différents systèmes biologiques extrêmement dynamiques (inflammation, fonction et remodelage cardiaques), ce qui nous oblige d’avoir recours au modèle d’insuffisance cardiaque par surcharge de pression. Ce modèle est largement validé dans la littérature, ce qui permet une comparaison directe et une intégration cohérente des résultats avec les données existantes dans la littérature. Les procédures seront initiées sur des souris jeunes adultes (souris de 6 semaines). Le protocol expérimental s'étend sur 7 semaines, cela nous permet d'obtenir des prélèvements de souris adultes âgées de 13 semaines.

4 000 rongeurs, 3 600 souris et 400 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des tumeurs sous la peau, puis ils reçoivent jusqu'à deux administrations par jour pendant 35 jours, avec imagerie, radiothérapie et prélèvements sanguins. L'objectif déclaré est de tester des candidats médicaments anticancéreux avant un éventuel passage chez l'humain, à raison de neuf études de souris et une de rats par an sur cinq ans. Le porteur fixe les groupes à six à dix animaux, un effectif qu'il dit valider en interne d'après la littérature.

Objectifs

Le cancer n’est pas une maladie unique mais un groupe d’affections où des altérations génétiques ont conduit des cellules initialement normales à une croissance anormale et incontrôlée. De plus, au sein d’un même type de cancer, différents sous-types existent et deux patients ayant le même diagnostic initial pourront présenter des différences significatives en termes de localisation dans l’organe, d’agressivité, d’histologie, d’altérations génétiques et de réponse aux thérapies conventionnelles. Un seul type de modèle ne peut donc représenter l’ensemble de ces pathologies. Ce projet consiste à évaluer l’activité antitumorale de différentes approches thérapeutiques dans des modèles de tumeurs obtenues par greffe de matériel biologique d’origine tumorale dans les tissus superficiels (en général souscutanés) de rongeurs (rat ou souris), la souris étant l’espèce animale la plus utilisée. Une masse tumorale se forme alors progressivement au site d’implantation. L’efficacité antitumorale d’une approche thérapeutique est déterminée par l’évolution de la croissance tumorale chez des animaux traités par rapport à des animaux non traités (ou recevant le placebo ayant servi à formulation des produits testés) ou recevant un traitement de référence. Pour ce projet d’une durée de 5 ans, il est prévu de réaliser 9 études par an pour les souris et 1 étude par an pour les rats.

Bénéfices attendus

A long termes, les bénéfices attendus du projet sont le développement et la mise sur le marché de nouvelles approches thérapeutiques telles que des candidtas médicaments et/ou des rayonnements ionisants (radiothérapie) efficaces et présentant un minimum d'effets secondaires dans le traitement des cancers. A court termes, ce projet permettra de démontrer que la candidat médicament est actif dans un modèle expérimental de tumeur et d'évaluer d'eventuels effets secondaires. Il permettra également de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux peuvent être soumis à des interventions telles que l'implantation du matériel biologique d'origine tumorale (1 fois, 10-15 min) sur l'animal vigile ou anesthésié, des contentions vigiles lors des administrations (2 min, Maximum 2 administrations/jour pendant 35 jours), des prélèvements sanguins (Maximum 5, 2 min) et des suivis réguliers des animaux et des tumeurs (5-10 min, minimum 1 fois /semaine jusqu’à 7 fois/semaine). Ils peuvent subir également des contentions lors des sessions d’imagerie vigiles ou sous anesthésie (5 à 30 min, Maximum 2 fois/semaines pendant 5 semaines), lors des sessions de radiothérapie (5 min, maximum 5 fois/semaine pendant 3 semaines).

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l'initiation du projet. Ils font donc l'objet d'échange avec les responsables Bien-Être Animal pour adapter les outils d'observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie (pour l’implantation des cellules tumorales ou les suivis par imageries) et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille ou une contrainte légère lors des administrations suivant le type d’administration utilisé ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation ou si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets indésirables provoqués par les produits testés et/ou le modèle.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, un premier tri des candidats-médicaments est réalisé in vitro sur des cellules tumorales en culture pour tester leur efficacité. Puis des tests in vivo sont réalisés avec les candidats-médicaments sélectionnés chez la souris et le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets pharmacologiques d’une nouvelle molécule sur le développement tumoral sur un organisme complet. De plus avant l’administration à l’homme, l’administration chez l’animal permet d’évaluer l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

De nombreuses études publiées dans ce domaine de recherche et utilisant des modèles animaux similaires, et plus particulièrement ces modèles rongeurs, décrivent l'utilisation de 6-10 animaux par groupe. Ce nombre est suffisant pour réaliser une analyse statistique. et nous l'avons également confirmé et validé. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état de santé des animaux utilisés sera assurée. Les tumeurs seront mesurées régulièrement (au moins une fois par semaine jusqu’à 5 fois par semaine) afin de suivre leur progression et/ou l'apparition de zones de nécrose. Afin de minimiser les effets digestifs des irradiations, une supplémentation nutritive peut être réalisée pendant les jours qui suivent les irradiations. Pour les animaux immunodéficients, ils seront hébergés dans des cages spécifiques fermées avec un filtre qui permettent de protéger les animaux de l’extérieur et éviter ainsi toute infection. Pour les mêmes raisons, la manipulation de ces animaux est faite sous un poste de sécurité microbiologique (PSM). Les souris immunodéficientes sont hébergées en portoirs ventilés. Lors de l’anesthésie pour l’acquisition des données d’imagerie, la température corporelles des animaux est maintenue constante grâce à une couverture chauffante ou un bloc chauffant. Lors du transport à l’extérieur, les cages utilisées seront fermées avec un filtre permettant le maintien du statut sanitaire et éviter une contamination. Et la cage contiendra des éléments hydratants et nutritifs sous forme de gel, des croquettes ainsi que des éléments d’enrichissement. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués avec notamment une échelle de cotation pour la nécrose tumorale. Dans le cas de développement de signes cliniques, de la nourriture humidifiée ou en gel sera mise directement dans les cages pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Des biberons avec des tétines longues pour faciliter l’accès à l’eau pourront être utilisés. Des animaux transgéniques avec ou sans phénotype dommageable peuvent être utilisés. Dans le cas d’animaux avec phénotype dommageable, selon le phénotype, des enrichissements, de la nourriture humidifiée ou en gel sera mise directement dans les cages pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Des biberons avec des tétines longues pour faciliter l’accès à l’eau pourront être utilisés. La SBEA pourra être consulté pour valider les actions mises en place.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans les modèles animaux de tumeurs obtenues par greffe de matériel biologiques d'origine tumorale dans les tissus superficiels. Généralement, les animaux âgés de 6 à 10 semaines seront utilisés au moment de l’implantation. La prise tumorale est connue pour être moins bonne chez des individus plus âgés.

Jusqu'à quinze injections par animal, dont certaines directement dans les ventricules du cerveau sous cadre stéréotaxique : 550 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une neuro-inflammation leur est déclenchée par injection de lipopolysaccharide, avec perte de poids, léthargie, tremblements ou convulsions possibles. L'objectif déclaré est de tester des candidats médicaments contre les maladies neurodégénératives. Leur cerveau est prélevé après la mise à mort pour mesurer l'effet des traitements.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson, ainsi que certaines atteintes aiguës du cerveau liées à l’inflammation, représentent aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique. Leur fréquence augmente avec le vieillissement de la population et, à ce jour, il n’existe pas de traitement capable de stopper ou de guérir ces maladies. De nombreuses études montrent que l’inflammation du cerveau, appelée neuroinflammation, joue un rôle clé dans l’apparition et l’aggravation de ces pathologies. Cette réaction excessive du système immunitaire cérébral contribue à perturber le fonctionnement normal des neurones et à accélérer leur dégénérescence. Malgré les progrès de la recherche, les solutions thérapeutiques permettant de contrôler efficacement cette inflammation restent encore limitées. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif de développer et d’étudier un modèle expérimental de neuroinflammation chez la souris, déclenchée de manière contrôlée par l’administration de lipopolysaccharide (LPS). Ce modèle permettra de mieux comprendre les mécanismes de l’inflammation cérébrale et de tester de nouveaux candidats médicaments capables de réduire l’inflammation et de protéger les neurones. À terme, l’ambition est d’identifier des molécules prometteuses ouvrant la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de plusieurs candidats thérapeutiques dans un contexte de maladies neurologiques associées à une neuro inflammation induite par injection d’un composé. Ces études d’efficacité constituent une étape clé du développement préclinique, car elles permettent d’identifier les molécules les plus prometteuses, de définir des stratégies thérapeutiques pertinentes et de soutenir la justification scientifique et pharmacologique d’un futur développement clinique. Le bénéfice final attendu est la progression vers de nouvelles options thérapeutiques.

Procédures

Les animaux recevront le produit testé en dose unique ou répétée en respectant les volumes d’injections recommandés selon la voie d’administration. Lors d’injections répétées, 15 injections maximum par animal pourront être réalisées et étalées quotidiennement sur 15 jours ou 14 étalées bi-quotidiennement sur 7 jours. Sur animaux vigiles, les injections seront réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute) et la durée sera d’environ 5 minutes sur des animaux anesthésiés, anesthésie comprise. Pour les injections réalisées en intra-cérébéllo-ventriculaire nécessitant un cadre de stéréotaxie, la durée totale de la procédure pourra aller jusqu’à 45 minutes (incluant anesthésie, positionnement et fermeture). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit au maximum 4 prélèvements de sang). Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront manipulés régulièrement pour différentes procédures (pesées, examens cliniques, administration de traitements, prélèvements sanguins), ce qui pourra entraîner un certain niveau de stress. Comme le projet consiste à induire une neuro inflammation et à tester l’efficacité de traitements préventifs ou curatifs, les animaux pourront également présenter certains effets indésirables liés à l’inflammation ou aux traitements, tels qu’une inflammation locale ou générale, un œdème, une perte de poids, une léthargie ou au contraire une agitation inhabituelle, une déshydratation, des difficultés respiratoires, des tremblements, des convulsions ou encore des troubles digestifs. Pour garantir leur bien être, des points limites clairement définis seront appliqués afin de détecter rapidement tout signe de souffrance et d’assurer une prise en charge immédiate. L’intensité et la durée des signes cliniques pourront varier selon les groupes, en fonction du niveau de neuro inflammation induit et de l’efficacité des traitements évalués.

Devenir

Le projet visant à évaluer l’efficacité de traitements curatifs ou prophylactiques contre les maladies neuro-dégénératives, l’euthanasie des animaux est indispensable afin de permettre la collecte d’organes, notamment des cerveaux, nécessaires à la réalisation des différentes analyses prévues qui permettront d’évaluer l’effet des traitements.

Remplacement

À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de reproduire la complexité du système nerveux central, notamment les interactions entre les neurones, la microglie et les mécanismes inflammatoires impliqués dans les maladies neurodégénératives et les troubles cognitifs. Pour évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est indispensable d’étudier de manière intégrée l’inflammation cérébrale, la survie des cellules nerveuses et les effets sur le comportement. Seul un modèle animal permet actuellement de reproduire ces processus de façon cohérente et pertinente, rendant l’expérimentation animale essentielle pour évaluer de manière fiable l’efficacité de futurs traitements.

Réduction

Pour pouvoir déterminer de manière fiable si le traitement testé est réellement efficace, plusieurs groupes de souris seront constitués, comprenant chacun au minimum six animaux. Un groupe non traité et non soumis à la neuro inflammation sera toujours inclus pour servir de référence. Les résultats obtenus dans les différents groupes seront ensuite comparés à l’aide de méthodes statistiques appropriées, permettant d’évaluer de façon objective et scientifiquement valide les effets du traitement.

Raffinement

Dans ce projet, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au moins cinq jours (portée à sept jours après un transport aérien) afin de s’habituer à leur environnement. Ils seront hébergés en groupe dans des conditions enrichies adaptées à leurs besoins à l’exception des animaux opérés, qui pourront être hébergés individuellement pendant 24 à 48 h afin de permettre la cicatrisation de leurs points de sutures. Leur état de santé sera observé quotidiennement pour détecter rapidement tout signe anormal. En cas de besoin, des mesures de soutien (soins locaux, réchauffement, isolement si nécessaire) seront mises en place, ou une mise à mort humanitaire sera réalisée si l’état de l’animal se dégrade de manière irréversible. Après l’induction de la neuro inflammation, les animaux seront pesés régulièrement et feront l’objet d’un suivi clinique à l’aide d’une grille d’évaluation permettant de repérer tout changement, entre autres, dans leur comportement ou leur apparence. Ce suivi permettra d’identifier rapidement les signes de souffrance et de prendre les décisions appropriées pour garantir leur bien être. Si nécessaire, des examens plus approfondis seront réalisés et toute anomalie sera signalée au vétérinaire responsable. Lors des anesthésies, des précautions seront prises pour éviter l’hypothermie et protéger les yeux des animaux, notamment en utilisant un tapis chauffant et un gel oculaire.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle préclinique de référence pour l’étude des mécanismes de neuro inflammations impliqués dans le développement de pathologies neurodégénératives, car elles permettent d’observer ces processus dans un organisme vivant et d’évaluer de nouveaux traitements de manière intégrée. Ce modèle est bien établi, largement utilisé et reconnu par la communauté scientifique. Les souris développent, après induction contrôlée d’une neuro inflammation, des altérations immunitaires, comportementales et neuronales similaires à celles observées dans plusieurs maladies humaines. Cela permet d’étudier plus précisément l’évolution des processus inflammatoires cérébraux, leurs conséquences sur la survie neuronale, ainsi que l’effet de traitements curatifs ou prophylactiques. Grâce à ces modèles robustes et reproductibles, il est possible d’évaluer efficacement les mécanismes impliqués et le potentiel thérapeutique des produits testés. L’utilisation de souris présentant un âge, un sexe et un statut sanitaire standardisés garantit des conditions expérimentales homogènes. Cela permet d’obtenir des résultats fiables et comparables entre les groupes, notamment pour analyser l’inflammation du tissu cérébral, les marqueurs biologiques, les comportements associés aux déficits cognitifs et l’impact du traitement sur la progression des atteintes neurodégénératives tout en assurant un bon équilibre entre exigences scientifiques, considérations éthiques et faisabilité pratique. Par leur taille et leurs caractéristiques biologiques, les souris sont adaptées aux volumes de traitement, aux prélèvements et aux analyses nécessaires à ce type d’étude. Dans ce projet, des souris âgées d’au moins 6 semaines, correspondant au stade jeune adulte/adulte, seront utilisées afin de limiter les variations physiologiques liées à la croissance. Ce choix permet également d’obtenir des animaux d’environ 20 g, garantissant une meilleure stabilité des mesures expérimentales. Les deux sexes seront inclus afin de prendre en compte la variabilité potentiellement induite par les hormones sexuelles et d’assurer une représentativité optimale des résultats.

Anesthésiées puis injectées dans la trachée avec des bactéries, des cellules immunitaires ou une chimiothérapie, 356 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Un sepsis pulmonaire leur est provoqué, avec hypothermie, gêne respiratoire et perte de poids attendues. L'objectif déclaré est de comparer les sous-types de sepsis humains à ce modèle murin. Le porteur reconnaît lui-même que la souris pourrait ne représenter qu'une partie des malades, ce que le projet vise justement à vérifier.

Objectifs

Le sepsis est une infection grave qui touche 50 millions de personnes par an dans le monde. Il est responsable de >10 millions de décès par an. Les infections respiratoires sont la première cause de sepsis.Malgré sa gravité, les traitements n’ont guère évolué depuis 30 ans, en partie parce que les patients atteints de sepsis sont très différents les uns des autres. Des chercheurs ont identifié chez certains patients des « sous-types » de sepsis basés sur le niveau de certains marqueurs de l’inflammation dans le sang. Ces sous-types permettent de regrouper les patients plus uniformément et pourraient aider à mieux cibler les traitements. Comprendre comment ces sous-types fonctionnent est donc essentiel pour développer de nouvelles thérapies. Chez la souris, ces sous-types n’ont pas encore été étudiés, il est possible que la souris ne représente qu'une seule partie des malades. D'autre part , Le sepsis modifie profondément le système immunitaire, créant ce qu’on appelle une « mémoire immunitaire », qui peut être bénéfique ou au contraire délétère. Le projet vise à reproduire un modèle de sepsis pulmonaire chez la souris. L’objectif est de décrire l’évolution spatiale et temporelle des principales cellules immunitaires pulmonaires chez l’animal afin de le comparer aux sous types de sepsis observés chez l'homme.Dans un second temps, nous cherchons à connaître le rôle des sous-types cellulaires dans la cicatrice immunitaire laissée par le sepsis en injectant à des souris des macrophages porteurs de cette mémoire immunitaire.

Bénéfices attendus

Jusqu’à présent, les traitements visant à réguler le système immunitaire chez les patients atteints de sepsis ou de syndrome de détresse respiratoire n’ont pas donné de résultats efficaces, et seuls les corticoïdes sont parfois utilisés en pratique. Ce projet vise à mieux comprendre comment le système immunitaire réagit dans ces maladies. À terme, il pourrait permettre de repérer quels patients sont les plus susceptibles de bénéficier des traitements existants et d’aider à développer de nouvelles thérapies.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de bactéries, de cellules immuniatires ou de chimiothérapie dans la trachée sous anesthésie générale. L'administration de la bactérie dure 30 secondes sous anesthésie générale. L'administration des cellules immunitaire dure 30 secondes sous anesthésie générale. L'administration de la chimiothérpaie dure 30 secondes sous anesthésie générale. Cette administration est répétée une fois 5 jours après.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une injection intratrachéale de bactéries, de cellules immunes ou de chimiothérpie sous anesthésie générale. Ce geste n’est pas douloureux. Il en découlera une hypothermie, une gène respiratoire et une perte de poids transitoire qui est récupérée très rapidement

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de prelever les différents organes à analyser

Remplacement

Le sepsis est une réaction inappropriée d’un hôte à un pathogène qui se traduit par une défaillance d’organe. Il met en jeu une physiopathologie complexe à un niveau moléculaire, cellulaire, d’organe mais aussi de l’organisme entier. L’infection respiratoire nécessite le recrutement de cellules inflammatoires produites par la moelle osseuse, qui sont transportées par le sang jusqu’aux organes et pénètrent les organes via des signaux moléculaires. Il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro (culture cellulaire ou organoïde) qui reproduise la complexité de l’immunité innée humorale, de l’immunité adaptative (qui met plusieurs jours à se mettre en place) ou de la communication entre les organes. L’obtention de données de transcriptomique sur les cellules immunitaires pulmonaires permettra de remplacer un certain nombre d’observations chez l’animal, car ces données permettent d’étudier « in silico » les mécanismes immunitaires à l’œuvre. Ces données pourront être réutilisées pour de futurs projets.

Réduction

La première partie de l’étude consiste à observer et décrire ce qui se passe chez les animaux, sans chercher à tester un traitement particulier. Il n’est donc pas possible de prévoir exactement combien d’animaux seront nécessaires. Pour limiter leur nombre, l’équipe s’est appuyée sur des expériences similaires publiées et sur son expérience passée. Pour la deuxième partie de l’étude, le nombre d’animaux et de groupes a été calculé de manière statistique afin d’être sûr de détecter les différences importantes tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les injections intratrachéales se font sous anesthésie générale, qui apporte du confort pour l’animal et réduit son stress pendant l’intervention. Une dose d'antidouleur sera administrée en cas d’observation de souffrance de l’animal. Des points limites bien établis et suffisamment précoces permettront de minimiser la douleur de l’animal en appliquant les décisions définies.

Choix des espèces

Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle murin de pneumonie est relativement similaire à la pathologie humaine. De plus, le modèle murin pour l’étude de la réponse immunologique au sepsis pulmonaire est le plus couramment utilisé dans la littérature. Souris de 4 à 8 semaines correspondant à de jeunes adultes permettant de mimer les conditions pathologiques humaines. C’est également le stade le plus utilisé dans la littérature permettant une extrapolation et une comparaison de nos résultats avec d’autres travaux.

Pour étudier comment le cortex visuel se réorganise après une lésion de la rétine, 845 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie subit une chirurgie d'une à deux heures pour poser une fenêtre crânienne et une barre de tête, une autre une lésion de la rétine, puis des observations au microscope sur animal éveillé, répétées jusqu'à vingt fois. L'étude déclare vouloir éclairer des maladies comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge et développer des outils de restauration visuelle. Le cerveau est prélevé en fin de projet pour compléter les données anatomiques.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre les dynamiques de la réorganisation des neurones du cortex visuel après une lésion partielle de la rétine. Après une lésion, une partie du secteur du cortex visuel ne reçoit plus d’informations visuelle. Les neurones de ces secteurs finissent par retrouver une activité visuelle, en étant recruté par des neurones avoisinants dont le champ récepteur spatial est proche. La dynamique exacte de cette réorganisation est inconnue. En particulier, nous cherchons à comprendre si la sélectivité pour certains aspects des stimuli visuels de ces neurones avant et après lésion influe sur leur réorganisation. La réponse des neurones du cortex visuel avant et après lésion sera quantifiée par des techniques d’imageries. Dans un second temps, nous chercherons à mesurer in vivo la force des connexions entre les neurones avant et après lésion. Ces mesures seront faites par des techniques d’imageries spécialisés. Ce projet permettra de mieux comprendre les réorganisations des neurones qui suivent une perte fonctionnelle localisée de la fonction rétinienne, qui se produit dans certaines pathologies comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge.

Bénéfices attendus

Ce projet constitue un axe de recherche essentiel, dont les bénéfices attendus sont technologiques et biologiques. Au niveau technologique, le développement de mesure de la connectivité in vivo via des méthodes tout-optiques, encore jamais été réalisé, constitue une avancée méthodologique importante. Au niveau biologique, les lésions rétiniennes sont un modèle classique de dégénérescence maculaire liée à l’âge. Ce projet permettra de mieux comprendre les conséquences de cette maladie au niveau du système nerveux central. A un niveau plus fondamental, ce projet permettra de mieux comprendre comment les réseaux corticaux adaptent leurs représentations des stimuli visuels lors de perte sensorielles. Enfin, une perspective de ce projet consiste à développer les outils qui pourront être utilisés dans différentes stratégies de restauration visuelle.

Procédures

Une partie des animaux auront une chirurgie sous anesthésie et sous analgésie consistant à injecter des molécules d'intérêt et à poser une fenêtre et une barre de tête pour étudier l'activité neuronale. Durée de la chirurgie : 1h-2h, une fois par animal. Une partie des animaux observés en microscopie sera éveillée, les animaux seront observés sous un microscope et sur un tapis roulant. Durée : 1-3h, répétée au maximum 20 fois. Une partie des animaux subira une lésion focale de la rétine sous anesthésie et analgésie. Durée de la procédure : 5 minutes, une fois par animal.

Impact sur les animaux

La contention de l'animal pour les injections et pour les expériences sur animaux vigiles peut entrainer un léger stress des animaux. Les injections peuvent induire légère douleur de courte durée au moment de l'introduction de l'aiguille. L’immobilisation des animaux sous le microscope peut occasionner un léger stress. De rares effets pourront se produire pendant les chirurgies : mauvaise réaction à l’anesthésie, saignements pendant la chirurgie. Nous nous attendons à ce que les chirurgies de pose d’implants chroniques puissent causer des douleurs post-opératoires, du stress ou une perte de poids temporaire. Après lésion de la rétine, dans de rares cas des atteintes oculaires inflammatoires peuvent être observées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire à la fin du projet. Les cerveaux seront prélevés afin d'obtenir des données anatomiques supplémentaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Les nouvelles molécules de ce projet seront d’abord testées sur des échantillons in vitro (cultures cellulaires, organotypiques). Nous sélectionnerons les plus prometteurs pour nos expérimentations in vivo). Des simulations par ordinateur, préliminaires aux expériences, sont utilisés pour obtenir les paramètres optimaux d’illumination des tissus (température, modèles pour l’activation des opsines). Les animaux seront utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. À l’heure actuelle, ce modèle ne peut pas être entièrement remplacé par une approche alternative in vitro car les circuits neuronaux impliqués dans la réponse à une stimulation visuelle ne sont pas observables in vitro.

Réduction

L’utilisation d’animaux avec implants chroniques nous permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à chaque expérience et répéter les stimulations et les acquisitions tout en respectant le bien-être des animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (845) est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Le nombre d'animaux nécessaires a été estimé à l'aide d'un test statistique de puissance. L’utilisation de méthodes de protéomique moderne permet de quantifier l’expression de nombreuses protéines (jusqu’à 200) sur les mêmes échantillons, réduisant considérablement le nombre d’animaux nécessaires. Nous utiliserons ensuite des tests statistiques adaptés pour l’analyse de nos résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation. La température des cages, l’hygrométrie et le cycle jour nuit sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Selon les procédures, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale et d’une analgésie. L’efficacité de l’anesthésie sera régulièrement contrôlée tout au long de la procédure par test des réflexes. En cas de signes de réveil, une adaptation du niveau d’anesthésie sera réalisée. Des traitements analgésies/anesthésies locaux seront également mis en place. Les souris seront constamment surveillées et réchauffées pendant la phase d’anesthésie et de réveil à 37 degrés Celsius (dans une boîte ou sur un tapis chauffant). Pendant les procédures d’anesthésie générale les yeux seront protégés contre le dessèchement avec gel oculaire. A la fin de la chirurgie l’animal reçoit une dose de solution saline de réhydratation pour l’aider à récupérer rapidement ses capacités. Les procédures sont affinées au cours du temps pour garantir le bien-être des animaux (par exemple la mise à disposition dans la cage de gel pour l’alimentation en cas de perte de poids en post-opératoire). Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée pour assurer une surveillance adaptée des animaux. L’utilisation d’une grille d’évaluation et scoring permettra de définir les points limites précoces et prédictifs à chaque acte expérimental pour s'assurer de réduire la souffrance et la détresse des animaux au maximum. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure chargée du bien-être de l'animal. Les animaux étant observés éveillés, ils seront soumis à un entrainement avant les observations au microscope, pour les habituer à leur environnement et réduire le stress.

Choix des espèces

La souris adulte est un modèle très utilisé par les laboratoires de recherche pour étudier le fonctionnement de circuits neuronaux complexes dans des conditions physiologiques. La souris est un modèle établi et très utilisé du système visuel. La taille du cerveau de souris est aussi idéale pour les études en microscopie multi-photonique en profondeur avec une résolution cellulaire. Au début des procédures, les souris seront âgées entre 7 et 24 semaines (système visuel mature), puis nous effectuerons des expériences sur les réorganisations post lésions des circuits neuronaux corticaux jusqu’à 6 mois post-lésion. La souris permet également d'obtenir des modèles transgéniques présentant un phénotype non dommageable et ne pas nécessitant l’injection de vecteurs viraux.

Huit injections rétro-orbitales, une irradiation du cerveau, un prélèvement de liquide céphalorachidien et une perfusion intracardiaque terminale : 7 137 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines lignées reproduisent la maladie d'Alzheimer et développent, vers neuf mois, troubles de mémoire, déclin cognitif et convulsions. L'objectif déclaré est de comprendre le rôle de cellules immunitaires inflammatoires dans le vieillissement, les maladies neurodégénératives et les tumeurs du cerveau. Les cibles thérapeutiques évoquées pour les patients restent une perspective lointaine, quand les atteintes infligées aux souris sont immédiates.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de certaines cellules immunitaires inflammatoires dans le cerveau. Ces cellules peuvent apparaître lors du vieillissement, dans certaines maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer, ou dans les tumeurs cérébrales. Nous voulons comprendre comment ces cellules arrivent dans le cerveau, comment elles interagissent avec les cellules cérébrales et comment elles contribuent à l’inflammation. L’objectif est également d’identifier si certaines stratégies thérapeutiques pourraient limiter cette inflammation et améliorer l’évolution de ces maladies.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait améliorer notre compréhension du rôle du système immunitaire dans plusieurs maladies du cerveau, notamment la maladie d’Alzheimer et le glioblastome. Les résultats pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques visant à réduire l’inflammation cérébrale et à ralentir la progression de ces maladies. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de maladies neurodégénératives ou de tumeurs cérébrales.

Procédures

Irradiation cérébrale unique sous anesthésie générale (durée 4 minutes), suivie d’injections rétro-orbitales répétées (8, durée 1 minute, vigile), de prélèvements sanguins (jusqu’à 3, durée 1 minute, anesthésie locale), d’un prélèvement terminal de liquide céphalorachidien et d’une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde et analgésie adaptée, durée 5 minutes, n=1.Des biopsies auriculaires seront réalisées à J10 à l’aide d’un emporte-pièce stérile (2–3 mm) pour le génotypage sous anesthésie locale, n=1, durée moins d'une minute anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les biopsies auriculaires unduiront un stress léger et transitoire. Les irradations localisées du cerveau et les phénotypes des modèles Alzheimer induiront une inflammation cérébrale et donc possiblement une fatigue générale liée à la réponse inflammatoire systémique et des modifications comportementales légères (réduction de l’interaction sociale, augmentation des périodes de repos). Les modèles Alzheimer peuvent aussi développer des troubles de la mémoire, apathie et anomalies sociales à partir de ~9 mois, associés à une perte neuronale, un déclin cognitif, troubles moteurs (dont ataxie), altération de l’apprentissage et du comportement social ou un déclin cognitif progressif, avec ataxie légère et risque accru d’épisodes convulsifs. Les prises de sang pourront induire une douleur légère et transitoire au point de ponction, un stress bref lié à la contention et rarement des hématomes localisés ou saignements mineurs, rapidement résolutifs. Le prélèvement de liquide céphalorachidien n'induira aucune nuisance étant fait sous anesthésie générale profonde sans réveil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Des approches alternatives ont été envisagées, comme l’utilisation de cultures cellulaires ou de modèles informatiques. Ces méthodes permettent d’étudier certains mécanismes biologiques mais ne reproduisent pas la complexité d’un organisme entier. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment des cellules immunitaires circulant dans le sang peuvent entrer dans le cerveau et interagir avec les cellules cérébrales. Ces phénomènes impliquent de nombreux organes et systèmes biologiques, notamment la circulation sanguine et la barrière hémato-encéphalique. Ces interactions complexes ne peuvent actuellement être étudiées que dans un organisme vivant, ce qui rend nécessaire l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique afin de garantir une robustesse des résultats tout en limitant l’utilisation d’animaux. Pour une analyse comparative multi-groupes (effet du modèle Alzheimer, sexe, temps d'intérêt), nous avons calculé et optimisé le nombre d'animaux nécessaires avec un calcul de puissance. Ce design expérimental permet d’atteindre une puissance statistique suffisante tout en respectant les principes éthiques de la réduction animale. Le caractère terminal des expérimentations (prélèvement du cerveau) ne permet malheureusement pas de suivre un animal.

Raffinement

Plusieurs mesures de raffinement seront mises en œuvre afin de limiter la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies avec matériaux de nidification et objets d’exploration afin de favoriser l’expression de comportements naturels. Un suivi clinique quotidien sera réalisé afin de détecter précocement tout signe de détresse ou d’altération de l’état général. Toutes les procédures potentiellement douloureuses ou stressantes seront réalisées sous anesthésie et/ou analgésie adaptées, conformément aux recommandations en vigueur. Des points limites précoces permettront d’interrompre les procédures si nécessaire. Dans les modèles impliquant des animaux âgés ou présentant des signes neurologiques, l’accès à la nourriture et à l’eau sera facilité, et une alimentation ramollie ou un gel nutritif pourra être fourni. Dans les modèles tumoraux, une surveillance renforcée sera mise en place afin de détecter rapidement les signes neurologiques et de mettre en place des mesures palliatives (nourriture adaptée, soins) ou d'arrêter la procédure si nécessaire.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris dans ce projet est pertinente en raison de sa forte similitude biologique avec l’humain, tant sur le plan génétique, anatomique que physiologique. Les modèles transgéniques reproduisent des caractéristiques clés de la maladie d’Alzheimer, telles que la formation de plaques amyloïdes, la dégénérescence neuronale ou les troubles cognitifs, permettant d’étudier leurs mécanismes et d’évaluer l’efficacité de traitements dans un contexte biologiquement pertinent. La souris est également privilégiée pour sa facilité de manipulation génétique : il est possible de créer des lignées ciblant spécifiquement les gènes impliqués dans la maladie. Certains outils indispensables à notre étude, comme le suivi in vivo des monocytes, n’existent actuellement que chez ce modèle. Enfin, la physiologie générale du cerveau murin, et en particulier celle de la barrière hémato-encéphalique, reproduit fidèlement celle de l’humain, renforçant la pertinence de ce modèle. L’utilisation de ces souris s’inscrit également dans la continuité de nos travaux antérieurs, permettant de tirer pleinement parti des outils et lignées disponibles dans notre laboraotire. En fonction des études et suivant l'évolution de la maladie dans les modèles considérés, les animaux adultes seront âgés entre 3 et 12 mois. .