Souris

852 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit des gavages, une autre deux chirurgies successives, une greffe de cellules tumorales dans le pancréas puis une injection dans la rate pour provoquer des métastases au foie. Le projet étudie le rôle de cellules immunitaires dans la progression d'un cancer du pancréas très agressif. Le porteur présente les organoïdes comme incapables de reproduire le processus métastatique et conclut à la nécessité du modèle vivant.

Objectifs

L’adénocarcinome canalaire pancréatique est un cancer très agressif, qui se propage fréquemment vers le foie. Chez de nombreux patients, des métastases hépatiques sont déjà présentes au moment du diagnostic. Il se développe à partir de lésions précancéreuses (appelées PanIN), mais les mécanismes qui conduisent à leur progression vers un cancer invasif et à la formation de métastases restent mal compris. Des études récentes montrent que le foie peut être modifié avant même l’arrivée des cellules tumorales, créant un environnement favorable aux métastases, appelé niche pré-métastatique. Les macrophages, cellules immunitaires importantes du microenvironnement tumoral, semblent jouer un rôle clé dans ces processus. Cependant, leur implication précise dans la progression de l'adénocarcinome canalaire pancréatique et dans l’apparition des métastases hépatiques n’est pas encore clairement établi. L’objectif principal de ce projet est d’étudier le rôle des macrophages dans la progression des lésions précancéreuses vers un cancer invasif et dans l’initiation des métastases hépatiques, en utilisant un modèle murin génétique. Plus spécifiquement, ce projet vise à : Étudier l’évolution des macrophages dans le pancréas au cours de la progression tumorale. Analyser le rôle des macrophages du foie dans la formation de la niche pré-métastatique. Évaluer l’impact de la modification des macrophages sur la croissance tumorale et la dissémination métastatique. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre le rôle des macrophages dans le développement du PDAC et des métastases hépatiques, et pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à la progression des lésions précancéreuses vers un cancer pancréatique invasif, en s’intéressant en particulier au rôle du microenvironnement tumoral. Il vise également à améliorer nos connaissances sur la formation des métastases de ce cancer, un problème majeur de santé publique. La présence de métastases empêche souvent les patients de bénéficier d’une chirurgie, qui reste actuellement le traitement curatif le plus efficace pour ce cancer. Mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la dissémination tumorale est donc essentiel. Ce projet analysera les changements qui affectent les macrophages au cours du développement tumoral et de la formation de la niche métastatique, ainsi que leur rôle dans ces processus. Les résultats pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Enfin, les données produites seront partagées en libre accès afin de soutenir d’autres travaux de recherche utilisant les mêmes modèles expérimentaux.

Procédures

Certains animaux auront 3 ou 4 gavages, durée 1 minute. D'autres animaux auront deux chirurgies successives : Injection de cellules tumorales dans le pancréas (greffe orthotopique, durée 10 minutes) puis injection dans la rate de cellules tumorales (10 jours plus tard) pour induire des métastases hépatiques (durée 10 minutes). Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée.

Impact sur les animaux

Les gavages induiront un stress transitoire léger. Les souris modèles présenteront par la suite une fragilité liée à l’activation de l’oncogène après l’administration de tamoxifène. Le développement progressif de lésions PanIN puis d’un cancer pancréatique invasif (PDAC) peut entraîner une contrainte chronique modérée, se traduisant notamment par une perte de poids, une diminution de l’activité et une altération de l’état général. Dans le modèle orthotopique, induit par chirurgie, les souris subiront deux interventions chirurgicales. Un stress léger et transitoire pourra être ressenti avant l'anesthésie. Ces procédures en elles-mêmes peuvent provoquer une douleur temporaire, et une légère perte de poids. Par la suite, la croissance des tumeurs, en particulier au niveau du foie, peut également entraîner des douleurs et un amaigrissement progressif. L’intensité globale des nuisances est estimée comme modérée selon le stade de la maladie, le modèle utilisé et les points d'arrêt prévus.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures. Dans le modèle génétique génétique, les souris seront mises à mort à différents stades de la progression tumorale afin de permettre l’analyse des tissus, notamment le pancréas, le foie, les poumons et la rate. Ces prélèvements sont nécessaires pour étudier le microenvironnement tumoral et pré-métastatique à l’aide de différentes techniques biologiques. La mise à mort de tous les animaux est indispensable pour permettre l’analyse des tissus.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro avancés, tels que les organoïdes et tumoroïdes, existent pour étudier le cancer, ils ne permettent pas de reproduire correctement le processus métastatique, qui implique des interactions complexes entre plusieurs organes. Ce projet s’intéresse en particulier au rôle du système immunitaire, notamment des macrophages et des monocytes circulants, dans la progression du cancer pancréatique depuis les lésions précancéreuses jusqu’au PDAC invasif. L’étude de ces interactions nécessite un environnement physiologique complet et un suivi à long terme, qui ne peuvent pas être obtenus avec des modèles in vitro seuls. Des approches in vitro seront néanmoins utilisées en complément pour confirmer certains résultats obtenus chez l’animal, contribuant ainsi à réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, elles ne peuvent pas remplacer entièrement l’expérimentation animale dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été limité au strict minimum, en s’appuyant sur les données de la littérature et sur des calculs statistiques d’effectif. Après la mise à mort, de nombreuses cellules, y compris des populations rares, seront collectées afin d’étudier leur rôle dans les tumeurs pancréatiques et les métastases hépatiques à différents niveaux d’analyse (cellulaire, moléculaire et transcriptomique). Chaque animal permettra ainsi de produire un grand nombre de données, optimisant l’utilisation de chaque individu et contribuant à la réduction globale du nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes, dans la limite de cinq animaux par cage, afin d’éviter l’isolement, sauf en cas de nécessité liée à des comportements agressifs. Leur environnement est enrichi avec du matériel adapté (papier, abris en carton) pour réduire le stress. Les animaux sont surveillés quotidiennement par l’équipe de recherche et le personnel de l’animalerie afin d’assurer un suivi rigoureux de leur état de santé. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués pour limiter toute souffrance. Les procédures ont été adaptées pour réduire au maximum les nuisances. Des anesthésies locales ou générales sont utilisées lorsque nécessaire lors des injections, avec des aiguilles fines. Pour les prélèvements sanguins, des dispositifs permettant de contrôler précisément les volumes prélevés sont employés.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour notre étude car il nous permet d'utiliser des modèles de tumeurs issus de lignées cellulaires murines ainsi qu'un modèle spontanné qui se rapprochent des pathologies humaines. Ses ressemblances en termes de physiologie nous permettent d'étudier le rôle du système immunitaire dans le processus tumoral dans sa globalité.

Immunodéficientes par construction, 2000 souris SCID vont être utilisées sur cinq ans pour mesurer le devenir de molécules anticancéreuses dans l'organisme. Toutes relèvent d'un niveau de souffrance modéré et seront tuées à la fin de chaque étude. Chaque animal reçoit le produit testé puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang en 24 heures, avant un prélèvement terminal sous anesthésie. Le RNT reconnaît qu'aucun calcul statistique n'a fixé l'effectif, l'estimation reposant sur le nombre utilisé les années précédentes.

Objectifs

Ce projet consiste à administrer aux animaux une molécule (classe thérapeutique: oncologie) et de déterminer certains paramètres pharmacocinétiques de la molécule administrée. Les souris sont régulièrement utilisées pour la recherche en oncologie dans les domaines de santé humaine. L’enjeu de ce projet est de réaliser des études chez les souris SCID (modèle de souris immunodéficients) et d'étudier la pharmacocinétique de molécules dans l’organisme notamment l'absorption, la distribution par la circulation sanguine, le métabolisme et l'élimination.

Bénéfices attendus

L'intéret de ce projet est de pouvoir mener différentes études en testants différents éléments d'essais sur des souris SCID. Cela permettra d'identifier les composés intéressants qui pourront peut être déboucher sur de nouveaux médicaments humains. Les différents protocoles entrant dans le scope de ce projet seront primordiaux pour avoir des données sur les paramètres phamacocinétiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types d'interventions : -Premier cas: administration de l'élément testé. Cela sera fait sur animal vigile par un personnel formé afin d'éviter tout stress à l'animal, - Puis des prélèvements de sang seront réalisés. 9 prélèvements maximum sur 24h. La durée d'un prélèvement est inférieure à la minute. Deuxième cas: les animaux placés sous anesthésie générale ( anesthésique gazeux) seront soumis à un prélèvement sanguin terminal. Durée du prélèvement de l'ordre de la minute.

Impact sur les animaux

Suite aux différentes administrations et durant les prélèvements sanguins, les animaux peuvent ressentir du stress, de la peur à la contention. Les prélèvements sanguins seront réalisés à différents sites de prélèvements, cependant il peut y avoir de la douleur, des lésions internes. Tous ces gestes seront réalisés par un personnel expérimenté et formé afin d'éviter au maximum toutes ces nuisances.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les prélèvements sanguins répétés et la perte des conditions de stérilité augmentent significativement le risque de souffrance et d’infections, rendant leur maintien incompatible avec un bon niveau de bien‑être. Cela sera pratiqué par un personnel expérimenté conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

Pour les études rentrant dans le scope de ce projet, le responsable de chaque étude s'assurera qu'il n'y a pas de methode de remplacement possible. Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. Ces techniques de remplacement ne peuvent pas être appliquées dans ce projet.

Réduction

Pour ce projet, il est envisagé d'utiliser environ 400 souris par an soit 2000 souris sur 5 ans. Ce nombre d'animaux est basé sur le nombre d'animaux réellement utilisé dans le projet des années précédentes. Le nombre d'animaux inclus dans chaque étude entrant dans le scope de ce projet sera réduit au minimum pour avoir des résultats interprétables. Par exemple, en utilisant la technique du micro sampling (prélèvement de 30 μL de sang par animal), cela permettra de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés car 9 points de prélèvements pourront être réalisés sur le même animal. Pas de test statistique réalisé en amont

Raffinement

Une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu ( enrichissement stérilisé). Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés par groupe de 3 ou 6 dans des cages comprenant de la litière et du matériel d'enrichissement (ex: nid, bois à ronger irradié). Les animaux seront observés au minimum une fois par jour pour une prise en charge rapide. Pour préserver les sites de prélèvements au maximum, un point de compression sera réalisé aprés chaque prélèvement avec la possibilité d'appliquer de la glace afin d'éviter la formation d'hématome. Les sites de prélèvements seront alternés autant que possible et le nombre de prélèvement de sang par site sera réduit au minimum.

Choix des espèces

La souris SCID est l'espèce utilisée dans ce type d'étude. Cette espèce est bien décrite et caractérisée dans la littérature et son utilisation est conseillée (OECD) pour les essais de produits pharmaceutiques dans le domaine de l'oncologie. Majoritairement adultes. Souris d'environ 20-30g

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras pendant douze semaines, elles reçoivent des injections quotidiennes sur la même durée, des échographies cardiaques hebdomadaires sous anesthésie et des tests de tolérance au glucose de deux heures. L'objectif est de préciser le rôle d'une enzyme dans la cardiomyopathie diabétique, les retombées pour les patients restant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que seul le recours à un "organisme entier" permet de prévoir la réponse à la molécule testée.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque (IC) est l’une des premières causes de mortalité/morbidité dans le monde. Le diabète est une complication majeure de l’IC, et l’augmentation épidémique actuelle de l’obésité et du diabète font que la cardiomyopathie de type diabétique devient un problème majeur de santé publique, pour lequel les solutions thérapeutiques sont très limitées. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle d’une enzyme spécifique dans le développement de la cardiomyopathie de type diabétique et également de tester de nouvelles thérapeutiques pour lutter contre cette pathologie. Le projet se déroule dans deux Etablissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre le rôle d’une enzyme dans la progression de la cardiomyopathie diabétique, problématique majeure de santé publique, et permettra d'améliorer nos connaissances sur la progression de cette pathologie multifactorielle et complexe. A long terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer les traitements existants et offrir de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrant de cette pathologie, réduisant ainsi la morbi-mortalité associée.

Procédures

Les souris suivront plusieurs types d’interventions : alimentation modifiée enrichie en graisse pendant 12 semaines ; des examens hebdomadaires du cœur par échocardiographie (une fois par semaine, environ 10 min, sur animal anesthésié) ; des mesures de la composition corporelle (% masse grasse) réalisées en début et à la fin du protocole (sur animal vigile, 2 min par mesure) ; des injections journalières pendant 12 semaines (durée environ 10 secondes chacune, sur animal vigile) ; des exercices physiques adaptés, en début et en fin de protocole (quelques minutes par séance) ; un test de tolérance à l’insuline et au glucose en début, milieu et fin de protocole (intervention de 2h). L'ensemble des interventions auront lieu dans l'établissement utilisateur 1.

Impact sur les animaux

Certains régimes peuvent entraîner une prise de poids, une fatigue ou une réduction de mobilité. Des traitements peuvent provoquer une tension élevée ou une inflammation. Les signes de douleur ou d’inconfort seront surveillés, et des mesures seront prises pour soulager les animaux ou les retirer de l’étude si nécessaire. Les anesthésies nécessaires aux échocardiographies peuvent entraîner une récupération lente ou une hypothermie passagère.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de protocole afin de permettre les prélèvements d’organes et leurs analyses, qui ne peuvent pas être réalisés sans mise à mort.

Remplacement

L’utilisation du modèle murin est indispensable pour étudier l’interaction entre les différents types cellulaires cardiaques, les systèmes vasculaire et immunitaire. Seul le recours à un organisme entier permet de prévoir la réponse thérapeutique à la molécule testée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en respectant la variabilité biologique et sans compromettre les résultats scientifiques attendus. Chaque animal sera utilisé pour mesurer un maximum de caractéristiques du développement de la pathologie (physiologiques, anatomiques, histologiques, biochimiques et moléculaires). Ceci permettra de limiter au maximum le nombre de souris utilisées au final.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, nous mettrons en place plusieurs mesures visant à assurer le bien-être des animaux et à réduire au maximum la douleur et la souffrance associées aux procédures expérimentales : - litière absorbante, renouvelée régulièrement, permettant les comportements naturels (fouille, creusage, nidification). De plus, les animaux obèses seront suivis plus régulièrement (remplissage des biberons, changement de litière plus fréquent si nécessaire). - interaction sociale préservée : les souris seront hébergées en groupes de 5 individus pour éviter l’isolement. - accès libre à l’eau et à la nourriture. Les échocardiographies seront réalisées sous anesthésie légère avec maintien thermique et du gel oculaire sera appliqué pour prévenir la déshydratation. - Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement tout signe de souffrance, de détresse ou d’inconfort : poil ébouriffé, posture anormale, signes de déshydratation, détection de signes de douleur (respiration anormale, mouvements réduits, vocalisations inhabituelles), analyse du comportement : isolement, diminution des interactions sociales, réduction de l’activité locomotrice, perte de poids. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé et qualifié, afin de réduire la durée et le stress des interventions. Ces mesures permettront de limiter au maximum la souffrance animale tout en assurant la qualité et la fiabilité des résultats obtenus dans cette étude. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied (moins de 10 minutes), à l’écart du public, dans les cages de transport sécurisées. Les cages seront placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.

Choix des espèces

L’espèce souris a été choisie car elle représente le modèle mammifère le plus couramment utilisé pour les études sur l’insuffisance cardiaque et le plus représentatif de la pathologie humaine. Ainsi, les résultats obtenus seront plus facilement transposables à l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge de 2 mois, correspondant à un stade jeune adulte, adapté aux objectifs de l’étude.

4443 souris vont être utilisées pour une zone de peau fibrosée de moins d'un centimètre carré dans le bas du dos, chacune recevant des injections répétées d'un agent inflammatoire cinq jours par semaine pendant deux semaines. Toutes relèvent d'un niveau de souffrance modéré et seront tuées pour analyses. Le projet observe comment la rigidité du tissu modifie la migration des cellules immunitaires dans la peau. L'effectif de plus de quatre mille animaux n'est rattaché qu'à un objectif de connaissance fondamentale, sans justification détaillée du nombre.

Objectifs

La peau est le plus grand organe du corps humain, indispensable à notre survie. Elle agit comme une barrière protectrice et joue un rôle crucial dans notre système immunitaire. La peau est composée de trois couches. 1)L’épiderme, la couche la plus superficielle 2)Le derme, la couche intermédiaire, contient des fibres de collagène et d’élastine qui lui donnent élasticité et fermeté. Il abrite également des vaisseaux sanguins, des nerfs, ainsi que des follicules pileux. 3) l’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau et est essentiellement composée de tissus adipeux et conjonctif. Elle fournit une isolation thermique. Dans le derme et l’épiderme, les cellules immunitaires patrouillent à la recherche de pathogènes ou de signaux de danger pour la mise en place d’une réponse immunitaire efficace, qu’elle soit spontanée suite à une infection ou à l’apparition d’une tumeur, ou induite par un vaccin par exemple. Ce processus est aussi essentiel pour le maintien de la tolérance immunitaire, et ainsi éviter les maladies auto-immunes. Certaines cellules immunitaires (les cellules dendritiques) se déplacent dans les tissus en prélevant des échantillons de leur environnement. Elles migrent ensuite vers les ganglions lymphatiques drainant leur tissu d’origine. Ces 2 étapes (échantillonnage en périphérie et migration vers les ganglions) sont clefs dans la mise en place de la réponse immunitaire et le maintien de la tolérance. Dans les tissus, la migration des cellules dendritiques est guidée par des signaux chimiques et physiques, qui sont profondément modifiés en cas d’inflammation. Notre projet vise à comprendre comment la modification des propriétés mécaniques de la peau modifie la migration et l’efficacité des cellules immunitaires dans la peau et dans les ganglions. La compréhension de ces mécanismes mis en jeu pourra s’appliquer à d’autres pathologies dans lesquelles la modification de la structure du tissu est majeure. La modification de la structure tissulaire et de ses propriétés physiques est maintenant connue dans de nombreuses pathologies notamment au sein de divers cancers, où le la modification du collagène semble favoriser la survenue de métastases en inhibant la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Comprendre comment l’installation d’une fibrose modifie les propriétés mécaniques des tissus et la migration des cellules immunitaires permettra d’obtenir des connaissances fondamentales sur la migration des cellules dans les tissus. Nous focalisons nos recherches sur les cellules dendritiques, cellules sentinelles du système immunitaire indispensable pour le déclenchement d’une réponse immunitaire spécifique. Nos premiers résultats mettent en évidence une accumulation de cellules dendritiques en cas de fibrose, qui sont incapables de migrer au ganglion lymphatique. Nous souhaitons adapter cette DAP afin de préciser les mécanismes moléculaires mis en cause dans ce défaut de migration. Ces mécanismes pourront être utilisés dans de nombreuses autres pathologies où la modification de la structure du collagène joue un rôle majeur dans la progression de la maladie et la réponse immunitaire, notamment en cas de cancer, où la migration des cellules dendritiques est également défectueuse. La modification proposée permettra d’identifier des mécanismes précis qui régulent la migration des cellules dendritiques, et pourra s’appliquer à d’autres pathologies (cancer).

Procédures

Dans un premier lot, les animaux anesthésiés recevront des traitements par injection à raison de maximum 1 injection par jour, 5 jours par semaine pendant 2 semaines (durée de chaque anesthésie de 5 minutes maximale). Certains de ces animaux recevront également un second traitement soit par injection à raison d’1 injection par jour pendant 5 jours consécutifs au maximum (durée du geste inf à 10sec) soit par application cutanée (application unique – durée du geste de 3 minutes). Dans un second lot, les animaux vigiles recevront une application cutanée unique de produit (durée du geste inférieure à 3 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors des injections de produits seront celles liées à la piqûre (douleur de courte durée). L’injection d’un agent inflammatoire induira une inflammation chez les animaux. L’inflammation se caractérise par la douleur, le gonflement, la rougeur et la chaleur qui peuvent entraîner une gêne chez l’animal. Néanmoins, il s’agit ici d’une inflammation locale et non générale, et modérée. La gêne est caractérisée par l’apparition d’une desquamation principalement entre les 12e et 16e jours après injection, et la présence d’un érythème dont l’intensité est maximale du 9e au 14e jour. Les animaux seront suivis pendant 6 semaines afin d’étudier la résolution de l’inflammation, mais nous ne nous attendons pas à des effets rémanents après la fin des injections. La surface attendue de la zone fibrotique de la peau du bas du dos de la souris est inférieure à 1cm. Nous porterons notre attention spécifique sur cette zone. Nous ne nous attendons pas à des conséquences sur la mobilité des souris, la zone fibrotique étant à distance des articulations des membres supérieurs et inférieurs. Un éventuel effet sur la mobilité n’a d’ailleurs pas été décrit dans la littérature.L’application cutanée d’un marqueur fluorescent sans addition de molécule pro-inflammatoire induira une réaction locale éventuelle (mais non décrite dans la littérature). L’application cutanée d’un marqueur fluorescent associé à une molécule proinflammatoire pourra induire un aspect inflammatoire local (rougeur, chaleur).

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

L’influence du microenvironnement tissulaire sur la migration des cellules immunitaires a été démontré par de nombreuses équipes au cours de la dernière décennie. Ces cellules répondent à des signaux de dangers, largement étudiés in vitro , comme par exemple la présence de composants bactériens. Néanmoins, il s’agit d’un effet direct d’un agent inflammatoire sur les cellules, qui ne prend pas en compte le contexte complexe et la réponse du tissu, qui répond également à la présence de signaux de dangers. Il n’est donc pas possible d’extrapoler ces données sans avoir une description précise et quantitative des propriétés du microenvironnement in vivo. L’utilisation de différents modèles in vitro (matrice en fibres 3D) ou ex vivo (explants de peau humaine) ne permettent pas de reconstituer la complexité du tissu cutané : - Sa structure en 3 couches (épiderme, derme, hypoderme) et la structure des fibres de collagène formant le tissu de soutien aux cellules. - Nombreux types cellulaires présents : kératinocytes dans l’épiderme, fibroblastes dans le derme, adipocytes (manquant dans les modèles in vitro), extrémités neuronales (non présents dans les modèles in vitro) et l’infiltrat immunitaire comportant de multiples types cellulaires différents. L’objectif de ce projet est de fournir cette description, afin ensuite de pouvoir établir des modèles in vitro conformes aux propriétés des tissus observées in vivo. Cela permettra alors d’isoler les propriétés du tissu une par une et de tester leur effet individuel sur les cellules immunitaires, afin d’identifier les paramètres les plus importants. Par ailleurs, Le modèle in vivo est indispensable pour déchiffrer le dialogue entre différentes cellules immunitaires et la migration d’un organe à l’autre, dans un organisme vivant intégré dont le système immunitaire est proche de celui de l’homme, comme la souris. L’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet, afin d’avoir un tissu et un système immunitaire complets et fonctionnels.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les expériences de mise au point seront réalisées sur des échantillons prélevés sur des animaux utilisés pour d’autres expériences (mise à mort pour prélèvement d’autres organes que la peau). Une première expérience sera réalisée afin de déterminer les meilleurs temps expérimentaux à utiliser. Les échantillons issus de cette expérience seront également utilisés pour les analyses des procédures suivantes. Le maximum d’échantillons d’intérêt a été et sera prélevé lors de la mise à mort des souris (peau, ganglions, sérum) et conservés pour des analyses ultérieures. Cela permettra de concentrer ensuite la caractérisation sur ces conditions expérimentales et donc de limiter le nombre total d’animaux utilisés. Grâce à nos résultats préliminaires, nous avons pu supprimer une procedure initialement prevue qui n’a plus de rationnel scientifique. A partir de données publiées et accessibles, nous avons ici déterminé le nombre d’animaux nécessaire comme étant le plus petit nombre d’animaux permettant de mettre en évidence une différence significative dans notre modèle expérimental (induction de fibrose cutanée).

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales, les animaux sont suivis attentivement afin d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Pour cela : -Les souris sont habituées à l’animalerie (accoutumance après transfert) et habituées à être manipulées par le même expérimentateur avant le début de la procédure, afin de limiter le stress après le début de la procédure. -Un suivi clinique renforcé sera réalisé pendant les 30 min suivant l’injection sous-cutanée, puis 6h après, puis une fois par jour pendant 10 jours, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. -Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point limite, les animaux seront sortis de la procédure (traitement antalgique, mise à mort). -Le suivi des animaux pour les procédures suivantes sera adapté en fonction de ce qui a été observé dans les procédures antérieures (au fur et à mesure de l’avancée du projet). Nous n’avons pas observé d’effet secondaire inattendu lors des premières expériences réalisées. Pour éviter l’inconfort et la douleur lors des procédures, des anesthésiques et analgésiques adaptés seront utilisés.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.

Génétiquement modifiées pour reproduire une épilepsie humaine, 600 souris développent des crises spontanées et imprévisibles pouvant provoquer leur mort subite. Le RNT les classe en souffrance modérée et prévoit de les répartir sur cinq ans. Elles ne reçoivent pas d'injection et sont surtout soumises au stress des manipulations, les prélèvements se faisant sur animaux morts. Le porteur affirme qu'aucun traitement n'existe et que le passage par un modèle vivant est une étape "indispensable" avant tout essai chez l'enfant.

Objectifs

Certaines mutations génétiques provoquent une épilepsie dans l'espèce humaine. Cette épilepsie peut se manifester par de fréquentes crises survenant durant les tous premiers mois de vie (avant l'âge de 3 mois). Cette activité épileptique est souvent accompagnée d'une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Il n'existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle qui reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Ce modèle va nous permettre de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de déveloper de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

L'utilisation de ce modèle animal permettra de tester de nouvelles approches thérapeutiques et à terme de proposer de nouvelles thérapies aux patients concernés.

Procédures

Les souris ne recevront aucune injection. Elle sont soumises uniquement au stress lié aux manipulations. Les prélèvements sont effectués sur animaux décédés. L’effectif concerné est de 600 souris sur une durée de 5 ans.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ce projet sont sujets à des crises d'épilepsie, spontannées et imprévisibles. Ces crises provoquent la mort subite des animaux dans le pire des cas, ou une perte de connaissance suivie d'une récupération spontannée en quelques minutes dans la majorité des cas. Il n'y a aucun autre effet indésirable connu chez ces animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative à l'utilisation d'animaux vivants n'est susceptible de répondre aux objectifs du projet. Le passage par un modèle vivant est une étape indispensable avant d'envisager un essai thérapeutique pédiatrique.

Réduction

La variabilité inter-individuelle est réduite par l'utilisation de souches de souris stables au niveau génétique. Une analyse de puissance statistique est réalisée en amont de chaque procédure afin de limiter l’étude au nombre d'animaux nécessaires pour répondre à la question posée grâce à un outil statistique dédié.

Raffinement

L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées au maximum par 5 dans des cages enrichies (litière, dôme et bandelettes en carton) avec nourriture et eau ad libitum, dans une pièce thermo-contrôlée en alternance jour/nuit (12/12). Ils sont vérifiés quotidiennement par un personnel formé. Des points limite clairs sont définis pour l'élevage de tous les animaux et les animaux seront euthanasiés lorsqu'ils atteindront les critères d'interruption.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s'agit de mammifères disposant d'un répertoire génétique très similaire à celui de l'espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Nous analyserons les animaux à différents âges entre la naissance et l’âge de 1 an. Tous seront utilisés pour la caractérisation histologique et moléculaire de la pathologie. Chez l'Homme, la maladie est détectée quelques jours à quelques semaines après la naissance. Notre projet a pour objectif d’observer et phénotyper les animaux dès la naissance jusqu’à l’âge adulte pour identifier les phases critiques de développement de la pathologie et mieux cibler la période à partir de laquelle un traitement devra être envisagé.