Souris

1 575 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe une tumeur mammaire, une partie subissant en plus une ablation des ovaires, puis elles reçoivent des injections d'hormonothérapie ou de cellules immunitaires avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever rate, tumeur, foie et poumons. L'objectif déclaré est de comprendre l'effet des œstrogènes sur les réponses immunitaires face au cancer du sein. Le porteur indique avoir envisagé des insectes ou des organismes non-vertébrés, écartés faute d'un système immunitaire comparable, et conclut que la souris est "indispensable".

Objectifs

Le système immunitaire est capable dans la plupart des cas de contrôler l’apparition et le développement des cancers. Dans certains cas les cancers peuvent échapper à ce contrôle immunitaire grâce à de nombreux mécanismes, incluant l'induction de cellules dites "immuno-suppressives". Ces cellules sont capables de bloquer la capacité du système immunitaire à éliminer les cellules tumorales. Plusieurs sous-types de cancers du sein ont été définis, basés sur la présence (l’expression) par les cellules tumorales des récepteurs hormonaux ER (récepteurs aux œstrogènes), ou PR (récepteurs à la progestérone). Les cancers hormono-dépendant dépendent ainsi de ces récepteurs. Cliniquement, il est possible de bloquer ces récepteurs en utilisant des molécules spécifiques. Cependant, outre les cellules cancéreuses, certaines cellules immunitaires pourraient également exprimer ces mêmes récepteurs hormonaux. L’effet des œstrogènes sur ces cellules immunitaires reste à ce jour peu connu. Ce projet a ainsi pour objectif de caractériser l’influence des hormones femelles sur les cellules immunitaires tueuses anti-tumorales et sur les cellules immunitaires pro-tumorales impliquées dans l’échappement des cancers au système immunitaire. Un modèle de cancer du sein de souris représentatif des cancers du sein humain et maîtrisé depuis 20 ans par le laboratoire sera utilisé.

Bénéfices attendus

Les données générées au cours du projet proposé devraient permettre : 1) de clairement déterminer l’effet des oestrogènes, le rôle des récepteurs hormonaux ER et des hormonothérapies sur différentes populations de cellules immunitaires pro- et anti-tumorales. 2) De déterminer si, en modifiant le contexte immunitaire chez des souris porteuses de tumeur, les hormonothérapies permettent d’améliorer l’efficacité des immunothérapies. Notre objectif à long terme est d'améliorer les réponses cliniques chez les patientes atteintes de cancer du sein.

Procédures

Modèle de cancer du sein de souris : injection dans la glande mammaire de cellules tumorales (~10 secondes). Ablation des ovaires, environ 15 min. Les procédures se feront sous anesthésie générale. Pour les thérapies: injections intraveineuses (dans la circulation sanguine), intrapéritonéales (dans la cavité péritonéale) ou intratumorales d'hormonothérapie (3 injections tous les 2-3 jours), ou de lymphocytes T (cellules immunitaires anti-tumorales) (1 injection) (temps de la procédure ~10 secondes). Les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale, y compris les animaux mis à mort aux points limites. Des prélèvements des différents organes seront effectués uniquement après la mort de l'animal : - Rates - Tumeurs - Foies - Poumons - Sang.

Impact sur les animaux

Les nuisances, stress et douleurs anticipés seront liés à la manipulation et contention des animaux, aux injections (cellules tumorales ou thérapies) ainsi qu’à la croissance tumorale. La croissance tumorale s'accompagne d'une fatigue générale. Un handicap physique lié à la tumeur primaire n'est pas anticipé puisque les souris seront euthanasiées avant qu'elles atteignent ce stade basé sur des points limites définis. Basé sur nos travaux précédents, les immunothérapies proposées sont bien tolérées et aboutissent dans certain cas à la régression des tumeurs et à la guérison des animaux. Les stratégies permettant une réduction de la souffrance et du stress sont détaillées dans les sections « remplacement, réduction, raffinement » et spécifiquement décrites pour chaque procédure.

Devenir

A l'issu de toutes les procédures, les animaux sont euthanasiés pour collecter les différents organes d'intérêt permettant une analyse du nombre, du phénotype et des fonctions de différentes populations de cellules immunitaires

Remplacement

L'utilisation de modèles de cancers de souris est indispensable à ces études et ne peut être remplacée par des approches alternatives : en effet, la simplicité des systèmes de culture in vitro n'est pas adaptée et ne permettrait pas de reconstituer toute la complexcité cellulaire d'une tumeur et de son environnement immunitaire. De plus, ces systèmes in vitro ne permettent pas l'évaluation de l'influence du microenvironnement propre à chaque organe sur les cellules pro-tumorales in vivo. Nous avons envisagé la possibilité d'utiliser des modèles d'insectes ou des systèmes non-vertébrés, mais ces organismes ne possèdent pas les cellules immunitaires retrouvées chez les mammifères, rendant impossible une extension des résultats à l'Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux sera restreint au minimum permettant de dresser des conclusions scientifiques basées sur une approche statistique. Par ailleurs les réponses immunitaires pouvant varier d'une expérience à l'autre, les expériences nécessitent d'être répétées au moins 3 fois.

Raffinement

La procédure majeure consiste à injecter des cellules cancéreuses dans la glande mamaire des souris. Cette procédure ne demande pas de chirurgie, et permet un suivi à long terme; la manipulation des animaux n'engendre pas de douleur et n'est associée qu'à un stress limité. L'évolution tumorale est très documentée, permettant un suivi reproductible et fiable des animaux, ainsi que d'anticiper les signes de détresse potentiels. Concernant l'objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l'angoisse infligées aux animaux, les souris sont hébergées dans des conditions très contrôlées, adaptées à leur fragilité (cages, nourriture et litière stériles). Elles sont observées chaque jour pour repérer tout signe de malaise. Si un animal montre trop de souffrance, il est euthanasié rapidement pour éviter toute douleur inutile. Des limites précises ont été fixées : Perte de poids de plus de 20% d’une semaine à l’autre; Changement de comportement (isolement, posture anormale, poils hérissés); Tumeur dépassant 2 cm. Les souris étant des animaux sociaux, 5 animaux seront placé par cage en présence d'un enrichissement de leur environnement (matériaux pour la fabrication de nids).

Choix des espèces

Il n´existe pas de méthode alternative pour ce projet. Le suivi de la réponse immunitaire chez les patients ne donne qu'une réponse partielle. Il est impossible, pour des raisons techniques et éthiques, d’observer directement chez l’être humain comment une tumeur agit sur le système immunitaire au fil du temps. C’est pourquoi la souris est utilisée, dont l’immunité ressemble beaucoup à celle des humains. L’étude sur la souris permet de suivre précisément comment les cellules du système immunitaire réagissent et évoluent face à une tumeur. Les expériences sur des cellules isolées ou sur des organismes plus simples (comme les insectes) ne permettent pas d’obtenir ces informations, car ils ne possèdent pas un système immunitaire comparable. La souris est donc le modèle le plus fiable et le plus couramment utilisé pour comprendre les mécanismes immunitaires liés au cancer.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant porter une tumeur mammaire pendant deux à six mois. On leur greffe des cellules tumorales dans la glande mammaire, puis elles reçoivent jusqu'à deux administrations par jour pendant 35 jours, avec chirurgie, radiothérapie et prélèvements sanguins répétés selon les protocoles. L'objectif déclaré est de tester des candidats médicaments contre le cancer du sein, aux retombées annoncées à long terme. Le porteur précise choisir des femelles jeunes de 6 à 10 semaines parce que la prise tumorale est moins bonne chez des individus plus âgés.

Objectifs

Les cancers du sein sont les cancers les plus fréquents chez la femme. Ils représentent une pathologie très hétérogène au regard de leurs profils moléculaires et de leurs issues cliniques. En effet, différents sous-types existent et deux patients ayant le même diagnostic initial pourront présenter des différences significatives en termes de localisation dans l’organe, d’agressivité, d’histologie, d’altérations génétiques et de réponse aux thérapies conventionnelles. Un seul type de modèle ne peut donc représenter l’ensemble de ces pathologies. Ce projet vise à évaluer les propriétés anti-tumorales de différentes approches thérapeutiques incluant notamment des candidats médicaments, l’utilisation de rayonnements ionisants (radiothérapie) (associées ou non à une ablation chirurgicale de la tumeur) ou encore l'utilisation de dispositifs médicaux dans des modèles de tumeurs mammaires obtenues par greffe de matériel biologique d’origine tumorale directement dans la glande mammaire de rongeurs (rat ou souris), la souris étant l’espèce animale la plus utilisée.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers du sein qui sont les plus fréquents chez la femme. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de tumeurs mammaires ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

Chaque animal pourra subir : - Des contentions vigiles pour induire une anesthésie et une analgésie, administrer le produit ou pour le suivi pondéral et la mesure de la tumeur avec un pied à coulisse : 1-2 min/ geste. - Une implantation, sous anesthésie, de cellules tumorales dans la glande mammaire, durée : environ 2 à 5 min. - Une administration du candidat-médicament, du véhicule ou d’un molécule référence. Durée : jusqu’à 2 min et au maximum 2/jour pendant 35 jours. - Les suivis du poids et de la croissance tumorale par mesure du volume de la tumeur avec un pied à coulisse sont réalisés au moins 1 fois par semaine et jusqu’à tous les jours en fonction de l’apparition des signes cliniques et de l’évolution de la croissance tumorale. La durée du suivi des animaux dépend du développement tumoral mais sera au maximum de 6 mois, avec une moyenne de 2-3 mois. - L’utilisation d’imagerie nécessitera le transport des animaux vers la plateforme d’imagerie. Durée : inférieure à 30 min. - La durée l’imagerie est comprise entre 1 et 5 minutes et entre 15 et 30 min pour une IRM. - Le suivi des tumeurs par imagerie/IRM se fait au maximum 2 fois par semaine sur 5 semaines mais généralement 1 fois par semaine sur 4 semaines. - Une contention dans le cas d’irradiation locorégionale. La durée d’une irradiation excède rarement 5 minutes, 1 fois/jour pendant 2 à 7 jours. - Potentiellement, l’exérèse de la tumeur, Durée : 5 à 15 min, - Des prélèvements sanguins. Durée : 1 à 5 min La fréquence de ces prélèvements est dépendante du volume prélevé et sera par exemple de 1 /semaine sur 6 mois maximum ou 5 /semaine sur 1 semaine.

Impact sur les animaux

Les contentions des animaux vigiles peuvent engendrer un stress mineur. Ils pourront également subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille ou une contrainte légère lors des administrations selon le type d’administration utilisée, ainsi qu’une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins. Le développement de la tumeur mammaire peut amener à un inconfort voire une réduction de la mobilité des animaux. Les tumeurs peuvent également développer une lésion qui sera évaluée par une échelle de cotation. L’ablation de la tumeur par chirurgie peut entrainer des douleurs post-opératoires limitées par l’administration d’un médicament anti-douleur. Le développement des métastases peut entrainer des inconforts voire des douleurs. La surveillance des animaux est d’autant plus nécessaire dans le cas d’atteinte des poumons, les métastases pulmonaires étant les plus fréquentes dans ce modèle de tumeur mammaire. Par ailleurs, les effets potentiellement indésirables du/des produits testés font l’objet d’échange avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques et d’ajuster les points limite.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expérimentations car ils auront reçu des cellules tumorales.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les tumeurs mammaires. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

De nombreuses études publiées dans ce domaine de recherche et utilisant des modèles animaux similaires, et plus particulièrement ces modèles rongeurs, décrivent l'utilisation de 6-10 animaux par groupe. Ce nombre est suffisant pour réaliser une analyse statistique et a également été confirmé et validé en interne. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état de santé des animaux utilisés sera assurée. Le poids des souris sera mesuré régulièrement (au moins une fois par semaine jusqu’à 5 fois par semaine). Lors de l’anesthésie pour les chirurgies, la température corporelles des animaux est maintenue constante grâce à une couverture chauffante ou un bloc chauffant. Les chirurgies se font sous anesthésie et analgésie. Lors du transport à l’extérieur, d'une durée inférieure à 30 min, les cages utilisées seront fermées avec un filtre permettant le maintien du statut sanitaire et éviter une contamination. Et la cage contiendra des éléments hydratants et nutritifs sous forme de gel, des croquettes ainsi que des éléments d’enrichissement. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Sur le site où sont réalisées les expérimentations tout est mis en oeuvre pour limiter les risques de contamination des animaux. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués avec notamment une attention particulière à la prise ou à la perte de poids de l’animal. Dans le cas de développement de signes cliniques, de la nourriture humidifiée ou en gel sera mise directement dans les cages pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Des biberons avec des tétines longues pour faciliter l’accès à l’eau pourront être utilisés. Dans le cas d’animaux avec phénotype dommageable, selon le phénotype, des enrichissements, de la nourriture humidifiée ou en gel seront mis directement dans les cages pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Des biberons avec des tétines longues pour faciliter l’accès à l’eau pourront être utilisés. La SBEA pourra être consultée pour valider les actions mises en place.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans les modèles animaux de tumeurs mammaires obtenues par greffe orthotopique de matériel biologique d’origine tumorale. Ces espèces permettent en effet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie du rongeur. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de candidats médicaments sur la prévention et/ou la thérapie de la pathologie. Généralement, des animaux femelles adultes âgés de 6 à 10 semaines seront utilisés au moment de l’implantation. La prise tumorale est connue pour être moins bonne chez des individus plus âgés.

Impossibles à garder en vie parce que l'irradiation du cerveau provoque des dommages irréversibles et une souffrance prolongée, 234 souris saines vont être utilisées puis tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur cerveau est irradié en une séance sous anesthésie, selon la méthode classique ou le mode FLASH, puis elles passent des batteries de tests comportementaux jusqu'à six mois après. L'étude déclare vouloir mesurer les effets de ces irradiations sur la mémoire, la mobilité et l'anxiété. Le porteur présente ce suivi comportemental comme un progrès pour le bien-être des animaux non-humains, alors qu'il consiste à irradier le cerveau d'individus sains.

Objectifs

La radiothérapie fait partie des traitements les plus utilisés contre le cancer, souvent associée à la chirurgie ou à la chimiothérapie. Elle consiste à utiliser des rayons pour détruire les cellules cancéreuses. Malgré son efficacité, ce traitement peut aussi endommager les tissus sains proches de la zone traitée, ce qui provoque des effets secondaires parfois importants. Une nouvelle approche, appelée « radiothérapie FLASH », cherche à réduire ces effets indésirables. Elle utilise des rayons délivrés à un débit extrêmement élevé, en une fraction de seconde, contrairement aux irradiations conventionnelles plus lentes. Elle pourrait permettre de mieux protéger les tissus sains tout en conservant la même efficacité de traitement contre le cancer. Le projet présenté a pour but d’étudier plus en détail cette technique innovante. Des souris saines seront irradiées au niveau du cerveau, soit selon la méthode classique, soit selon le mode FLASH. L’originalité de cette étude vient du fait qu’elle ne se limitera pas uniquement à l’observation du cerveau au microscope. Elle visera surtout à évaluer les effets de l’irradiation sur le comportement des animaux, à l’aide de plusieurs tests qui permettront d’étudier leur mémoire, leurs réflexes, leur mobilité, leur sensibilité et leurs émotions. Ces observations seront effectuées au fil du temps, afin d’identifier les éventuels changements de comportement à court et à long terme. Ces tests permettront de mieux comprendre comment le cerveau réagit à ce type d’exposition et de déterminer si la radiothérapie FLASH est réellement moins dommageable pour les fonctions cérébrales. À plus long terme, les résultats pourraient aider à améliorer les traitements pour qu’ils soient plus ciblés et mieux tolérés par les patients. Ainsi, cette recherche constitue une étape importante pour développer une une radiothérapie plus protectrice et pour améliorer la prise en charge du patient.

Bénéfices attendus

L’étude consiste à comparer deux types d’irradiation : une irradiation conventionnelle et une irradiation FLASH. Les souris recevront une exposition ciblée au niveau du cerveau, puis seront suivies pendant plusieurs semaines à l’aide d’une série de tests destinés à analyser leurs comportements : mémoire, locomotion, odorat, motricité, anxiété ou encore interactions sociales. Ces évaluations permettront de détecter, avec précision, d’éventuels changements du comportement à différents moments après l’exposition aux irradiations. Ce travail se distingue des recherches habituellement menées en radiothérapie FLASH, souvent centrées uniquement sur des analyses biologiques ou tissulaires. En s’intéressant aux fonctions cérébrales et au comportement, il apportera une vision plus globale des effets des irradiations et permettra de mieux relier les données observées au laboratoire à des effets concrets sur les fonctions du cerveau. Ce projet contribuera aussi à améliorer les pratiques de recherche animale, conformément aux principes des « 3R ». En observant finement le comportement des animaux, il pourrait permettre d’identifier des signes précoces de souffrance ou de dégradation avant qu’ils ne deviennent trop éprouvants et ainsi arrêter l’expérience. À court terme, ces informations aideront à adapter les protocoles pour améliorer le bien-être animal. À long terme, elles serviront à mieux définir les critères de suivi et de protection dans les futures études. En combinant innovation technologique et approche comportementale, cette recherche représente une étape importante pour comprendre comment la radiothérapie FLASH agit sur le cerveau et pour concevoir, à terme, des traitements anticancéreux plus sûrs, plus efficaces et mieux tolérés.

Procédures

Chaque souris recevra une seule séance d’irradiation sous anesthésie générale. Chaque animal sera ensuite soumis à des batteries de tests comportementaux non invasifs, réalisées à 72h, 2 mois et 6 mois post-irradiation. Chaque session de tests dure entre 3 à 30 minutes par animal. Les animaux ne seront soumis qu’à un seul test de comportement par jour sur une durée maximale de 5 jours consécutifs aux temps 72h et 2 mois post-irradiation, puis à nouveau 5 jours consécutifs sur une période de 14 jours, 6 mois après l’irradiation.

Impact sur les animaux

Les effets attendus dépendent du type d’irradiation utilisé. Chez les animaux exposés à une dose de radiothérapie, des effets indésirables peuvent apparaître, tels que : - des réactions locales sur la peau (rougeurs, inflammation, desquamation), - une fatigue générale, une perte de poids, une baisse d’activité, - des troubles neurologiques progressifs comme des difficultés de mémoire ou une augmentation de l’anxiété. Les tests comportementaux peuvent induire des stress légers à modérés et ou révéler de l’anxiété ou de la dépression sur des durées inférieures à 30 minutes.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort si les points limites sont atteints ou à la fin du projet. Les souris ne peuvent pas être gardées en vie après les tests car les irradiations cérébrales peuvent causer des dommages irréversibles et entraîner une souffrance prolongée.

Remplacement

Une formation sur vidéos pour les tests comportementaux remplace l’utilisation d’animaux lors de la phase d’apprentissage des protocoles. L’utilisation d’animaux pour la formation sera limitée, elle ne sera pas nécessaire pour tous les tests comportementaux. Seuls certains tests cognitifs ou moteurs nécessiteront une pratique sur animaux éveillés, car leur fiabilité dépend directement de la qualité de la manipulation, qui ne peut être acquise juste par la théorie. L’étude de l’effet FLASH ne peut actuellement être menée de façon fiable que sur des animaux vivants, car les réponses du cerveau et de l’organisme (inflammation, fonctionnement des neurones, mémoire, comportement) ne peuvent pas être reproduites sur des cellules en culture ou des tissus isolés. Aucune méthode alternative ne permet de simuler fidèlement une irradiation cérébrale totale et ses conséquences cognitives et émotionnelles.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au minimum nécessaire pour garantir la robustesse statistique des résultats. Une formation sur vidéos réduit le nombre d’animaux nécessaires à l’entraînement expérimental. Après avoir réalisé un calcul pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires, des groupes de souris seront constitués pour comparer de manière fiable les effets des deux types d’irradiation : conventionnelle et FLASH. Aucune répétition inutile ne sera effectuée, et chaque souris participera à plusieurs analyses complémentaires (cliniques, comportementales et histologiques), maximisant ainsi les données recueillies par individu.

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupe social dans des cages contenant de la litière, du coton pour la nidation, des bâtons de bois à ronger et un tunnel par cage. L'ensemble des procédures sera réalisé par du personnel qualifié. Avant le début de l’expérience, les souris seront acclimatées pendant deux semaines, puis habituées aux tests comportementaux. Les procédures ont été conçues pour minimiser la douleur, le stress et l'inconfort. Les irradiations auront lieu sous anesthésie générale. Des mesures préventives comme l’utilisation de chaufferettes pour éviter l’hypothermie et l’application d’un onguent ophtalmique pour protéger la cornée seront mises en place. Ensuite, leur état sera contrôlé régulièrement avec des points limites établis permettant de soustraire l’animal à la douleur.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce pour valider l’effet FLASH en irradiation cérébrale est justifié par son utilisation répandue et bien documentée en radiobiologie, avec des résultats transposables à l’humain. Sa taille permet une irradiation ciblée du cerveau avec le dispositif d’irradiation, et les mécanismes biologiques impliqués sont similaires à ceux observés chez l’homme. Les tests comportementaux sont validés pour évaluer de manière fiable les effets du FLASH sur les fonctions cognitives. En utilisant des souris de la même lignée génétique, on réduit la variabilité entre individus et ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Les souris seront âgées de 8 semaines, un stade de jeune adulte où le cerveau est complètement développé et où les animaux présentent un poids stable, garantissant une réponse physiologique homogène. Cela permet d’assurer la fiabilité des analyses comportementales et histologiques après irradiation.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour l'apprentissage de gestes techniques par des stagiaires d'un diplôme universitaire. Chaque animal subit une contention et au plus deux gestes, injection ou prélèvement sanguin, avant d'être tué pour la partie anatomie et autopsie de la formation. Les souris utilisées sont des animaux de réforme, d'anciens reproducteurs. Le porteur revendique une formation pratique "indispensable", après une phase sur mannequin en silicone jugée insuffisante pour manipuler un animal vivant.

Objectifs

Le Diplôme Inter-Universitaire (DIU) « Formation règlementaire destinée aux personnes concevant des procédures expérimentales, application aux modèles rongeurs et lagomorphes » est une formation, qualifiant des personnes amenées à concevoir des procédures expérimentales et les appliquer. Elle doit donc permettre l’acquisition de compétences théoriques et pratiques pour la manipulation d’animaux dans le respect de leur bien-être. Pour répondre à cet objectif, les travaux pratiques proposés permettent une familiarisation progressive des stagiaires avec l’animal de laboratoire par une partie théorique reprenant les 3R, le modèle souris et la présentation des différents gestes techniques, ainsi qu’une partie technique. La partie technique fait l'objet de cette demande d'autorisation de projet, au cours de laquelle les gestes techniques de base en expérimentation animale, sont enseignés aux étudiants du DIU (préhension, contention, injections et prélèvements de sang). Les travaux pratiques sont réalisés en effectif réduit, sous la supervision d’ingénieurs et de techniciens animaliers. Des enseignements plus théoriques d’éthique, de physiologie du stress et de douleur viennent compléter les connaissances afin que les stagiaires soient en mesure d’adapter leur pratique au comportement de l’animal qu’ils manipulent.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de pouvoir former les futurs concepteurs et réalisateurs de projets scientifiques, aux bonnes pratiques en expérimentation animale. À court terme, cette formation permet le respect des bonnes pratiques et la prise en compte du bien-être animal. À long terme, un geste réalisé de manière sûre sera reproductible et donc bénéfique pour les protocoles scientifiques menés.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une contention et deux gestes techniques maximum : une injection sous cutanée (40s) ou une prise alimentaire volontaire (1 min) associée à une injection dans l’abdomen (40s) ou un prélèvement de sang à la veine de la queue / mâchoire (1 minute)

Impact sur les animaux

Les injections peuvent provoquer une douleur transitoire de faible intensité au point d’injection. Les prélèvements sanguins peuvent également provoquer chez les animaux une douleur transitoire et un inconfort de faible intensité. La réalisation de ces gestes par des personnes peu expérimentées peut provoquer un stress passager pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour la dernière partie des travaux pratiques concernant l'enseignement de l'anatomie et l’autopsie du rongeur

Remplacement

Avant la mise en oeuvre de gestes effectués sur l’animal, les stagiaires seront formés via des vidéos et avec une souris de simulation Mimicky. La souris de simulation Mimicky est une souris en silicone permettant la préhension, la contention, l’administration orale ou l’injection dans la veine de la queue. Cependant, cette souris de simulation n’est pas suffisante pour l’apprentissage de la préhension d’un animal vivant et mobile. Les animaux vivants ne seront utilisés qu’en cas de besoin, pour les personnes souhaitant se former aux gestes techniques. Ce projet correspond à un enseignement pratique pour des personnels amenés à réaliser des protocoles d’expérimentation animale en autonomie. Les habilitations à l’expérimentation animale sont essentiellement théoriques. Cette formation pratique est donc indispendable pour améliorer les conditions de manipulation des animaux et la fiabilité des résultats obtenus dans les futurs projets de recherche.

Réduction

La stratégie de remplacement par l’utilisation d’animaux de simulation et de vidéos est choisie préférentiellement. Certains gestes pourront également être réalisés sur animaux morts. Les animaux utilisés ne seront pas produits pour cet enseignement, mais sont des animaux de réforme (anciens reproducteurs). Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisé est limité à 1 par stagiaire. Si le stagiaire est déjà à l’aise avec les gestes qu’il doit effectuer pour ses futurs projets ou s’il ne souhaite pas manipuler de souris car il travaille sur une autre espèce, les animaux ne seront pas utilisés. Pour la majorité des étudiants, la formation sera limitée à l’apprentissage de la préhension, de la contention et d’une injection.

Raffinement

Les gestes de base en expérimentation qui seront réalisés lors de cette formation ne seront réalisés qu’après une bonne maitrise de la contention des animaux, sans stress. Les animaux ne subiront jamais plus de deux gestes techniques, en plus de la contention. Des canules souples seront utilisées pour l'administration orale par gavage (uniquement réalisée par le formateur). Les gestes enseignés sont choisis afin d’éviter le plus possible la contention de l’animal : L’injection en sous cutanée, entre les homoplates, sera privilégiée car ne nécessite pas de contention stricte mais une immobilisation de l’animal sur la grille. Le prélèvement à la veine de la queue sera privilégié car il peut se faire sur animal vigile, sans contention. Les animaux recevront une anesthésie locale pour le prélèvement de sang à la mâchoire.

Choix des espèces

Le DIU est destiné aux personnes concevant des procédures expérimentales appliquées, en partie, aux modèles rongeurs. De plus, la majorité des animaux utilisés à des fins scientifiques étant des rongeurs, former les étudiants sur la souris est essentiel pour mener à bien leurs futurs projets selon les bonnes pratiques Le stade de développement sera dépendant des animaux de réforme fournis. Les animaux seront âgés de 14 semaines à 6 mois.

Trois jours avant l'accouplement puis à sept jours de gestation, 120 femelles reçoivent des pompes osmotiques implantées sous la peau pour diffuser un antiépileptique, et leurs 304 descendants sont ensuite soumis à des tests de motricité et de sociabilité entre 45 et 60 jours, 112 subissant en plus une injection dans le cerveau. 484 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de relier l'exposition prénatale à ces médicaments et l'autisme par des mécanismes épigénétiques. Toutes sont tuées à l'issue pour analyse des tissus, y compris les petits qui peuvent naître avec une malformation de la queue.

Objectifs

Les troubles du spectre autistique sont des troubles du développement qui touchent environ trois fois plus d'hommes que de femmes. Ces troubles se manifestent principalement par des difficultés dans les interactions sociales et des comportements répétitifs. Les facteurs environnementaux, comme l'exposition à certains médicaments pendant la grossesse, jouent un rôle important dans l'apparition de ces troubles. Par exemple, des médicaments utilisés pour traiter l’épilepsie, comme l'acide valproïque, ont été confirmés comme pouvant augmenter le risque d’autisme chez l’enfant à naître. D'autres médicaments, comme le topiramate ou la lamotrigine, sont également utilisés pour traiter l’épilepsie, mais leurs effets sur la descendance n'ont pas été clairement étudiés. Bien que ces médicaments n’affectent pas directement le code génétique, ils peuvent influencer l'expression des gènes à travers des mécanismes appelés épigénétiques. Cela signifie qu'une exposition à ces médicaments à des moments critiques du développement de l'embryon ou du fœtus pourrait changer la façon dont certains gènes fonctionnent, augmentant ainsi le risque d’autisme. Notre étude se concentre sur des modèles animaux pour comprendre le rôle de ces mécanismes épigénétiques et le lien entre la prise de ces médicaments par la mère pendant la grossesse et l'autisme chez l’enfant.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à mieux comprendre les risques liés à l'utilisation de certains médicaments antiépileptiques chez les femmes enceintes, et leur impact sur les descendants. À court terme, nous espérons que cette recherche nous aidera à identifier les régions du génome affectées par ces médicaments chez les animaux, ce qui permettra à moyen terme de les étudier chez des personnes atteintes d’autisme qui ont été exposées à ces médicaments avant leur naissance. Cela pourrait conduire à des tests diagnostiques et à la découverte de nouveaux traitements pour l'autisme.

Procédures

3 jours avant l'accouplement et à nouveau à 7 jours de gestation, des pompes osmotiques seront implantées sous anesthésie générale (10 min par implantation) en sous cutané chez les 120 femelles adultes. LES 304 DESCENDANTS seront soumis à des tests de motricité et d'évaluation de leur sociabilité, en condition vigile ; entre l'âge de 45 et de 60 jours, chaque souris subira 5 tests d'une durée maximale de 10 minutes pour les 4 premiers tests et de 35 minutes pour le cinquième test. Les tests seront réalisés sur 5 jours consécutifs avec 1 test par jour. 112 SOURIS AURONT UNE INJECTION CEREBRALE DE 1 HEURE.

Impact sur les animaux

Traitement prénatal : léger stress des mères lors de la manipulation - Chirurgie pour mise en place de la pompe et CHIRURGIE STEREOTAXIQUE : douleur post-opératoire minorée par des antalgiques traitement et inconfort transitoire au réveil - Pompe osmotique sous cutanée : gène légère pendant la durée de l’expérience -Avec le modèle d'injection unique d'acide valproïque, il a été constaté une taille des portées inférieure à ce qui était attendu. D’après notre expérience, pas de nuisances visibles sur la mère. -Pour les descendants exposés aux antiépileptiques : légère altération de la motricité et de la sociabilité. L’espérance de vie des petits n’est pas affectée après le sevrage. -Les tests comportementaux, Pour chaque souris du projet : L’ensemble des tests comportementaux évaluant le développement et la motricité générale pourront engendrer un stress léger et transitoire lié à la manipulation chez les souris et à la découverte d'un nouvel environnement. - Identification des petits : légère douleur transitoire due à la pose de bague dans le pavillon de l’oreille - Malformation de la queue (malformation congénitale) possible chez les petits issus de mères traitées avec les antiépileptiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses de tissus.

Remplacement

Ce projet inclut une étude du comportement, en particulier des aspects sociaux et moteurs, qui ne peut pas être reproduite en laboratoire sur des cellules ou via des modèles informatiques avec les connaissances actuelles. Il y a des éléments obtenus par des études cliniques, in silico et in vitro, sans animaux, qui indiquent une association entre anti-épileptiques et autisme. A ce stade de l'avancée des connaissances, seul une étude in vivo dans un organisme entier avec un réseau de neurones permet d'apporter la preuve du lien de cause à effet.

Réduction

Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques pour l’interprétation des résultats obtenus. Le nombre d'animaux à utiliser par expérience a été calculé de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs malgré la variabilité interindividuelle. De plus nous mettrons en place une stratégie d’accouplement restreinte au juste nécessaire en réalisant les accouplements par étapes successives jusqu’à obtention du nombre d’animaux nécessaires à nos études.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites stricts et précis et des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, une pesée est réalisée 1 fois par semaine. Après leur naissance, les animaux resteront avec leur mère jusqu’au sevrage (J21-J28), hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fournie par l’animalerie avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum.. La prise de sang terminale pour l’analyse épigénétique sera réalisée sous anesthésie avec une couverture antalgique. Les animaux seront placés en habituation dans la pièce de comportement minimum 30 minutes avant le début des tests. Les cages d’hébergement présentent des capteurs et sont suivis par logiciel permettant d’améliorer le bien-être animal et de surveiller et vérifier les cages 24heures sur 24. Enfin afin de respecter le bien-être animal, nous avons choisi à la place d'injections quotidiennes, l'implantation de pompes sous-cutanées délivrant le traitement en continu.

Choix des espèces

Les rongeurs sont à ce jour les espèces modèles ayant un système nerveux moteur proche de l’Homme. Les souris ont l’avantage d’être un modèle de choix pour les études comportementales. La souche de souris que nous utilisons est consanguine ainsi ces animaux présentent un fond génétique identique entre eux. De plus un environnement contrôlé au sein de notre animalerie nous permetta d’identifier des marques épigénétiques spécifiquement liées à l’exposition à l’agent étudié. Les mères et les pères effectueront les reproductions entre l’âge de 12 et 20 semaines (femelles) et 25 semaines (mâles), âge optimal pour la reproduction. Les souris de la descendance seront incluses dans le projet dès leur naissance et manipulées entre Jour 45 et Jour 60 pour les analyses comportementales, âge de référence pour la mise en évidence de troubles du spectre autistique sur le plan comportemental avec les outils utilisés.

Opérées pour une injection virale dans le cerveau puis soumises à trois sessions d'enregistrement électrophysiologique sous anesthésie, 20 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue par une chirurgie terminale de prélèvement. L'objectif déclaré est de cartographier un circuit reliant cortex préfrontal, thalamus et hippocampe pour comprendre les mécanismes de la dépression. Les retombées thérapeutiques annoncées restent au conditionnel et à long terme, l'étude visant d'abord à décrire l'activité de ce circuit. Le porteur affirme que la complexité du cerveau des mammifères rend le modèle animal irremplaçable, tout en concluant que ces travaux préparent un remplacement futur.

Objectifs

Des découvertes scientifiques récentes ont identifiées la dysrégulation des circuits neuronaux, en particulier ceux émergeant du cortex préfrontal, comme jouant un role central dans les mécanismes neuropathologiques des troubles psychiatriques tels que la dépression. Ce projet vise à caractériser les mécanismes électrophysiologiques du circuit neural reliant le cortex préfrontal, le noyau réuniens du thalamus et l'hippocampe. L'objectif est de comprendre comment l'activation du cortex préfrontal par des techniques pharmacogénétiques se propage à travers ce circuit pour influencer l'activité neuronale dans les structures cérébrales impliquées dans la régulation de l'humeur.

Bénéfices attendus

Cette recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques sous-tendant les troubles de l'humeur, en particulier la dépression. Les connaissances acquises sur le fonctionnement de ce circuit neural essentiel contribueront au développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant spécifiquement ces voies neuronales. Cette étude fournira également des bases scientifiques importantes pour la recherche translationnelle en psychiatrie.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie pour injection virale réalisée sur animal anesthésié et analgésié ( durée 60-90 minutes). Puis ils subiront 3 injections d’une molécule active réalisée sur animal vigile (durée moins de 1 minute) afin de faire trois sessions d'enregistrements de l’activité électrique des cellules nerveuses du circuit ciblé sur animal anesthésié et analgésié ( 3 sessions de 60 minutes chacune). Des injections intrapéritonéales d'activateur pharmacogénétique seront administrées (20 souris, 3 injections). Les animaux seront soumis in fine à une chirurgie terminale afin de prélever du tissu pour analyse.

Impact sur les animaux

La procédure de chirurgie pour injection virale pourrait induire une douleur modérée ainsi que des réactions inflammatoires locales. La gène occasionnée par le capot collé sur le crâne pour protéger la zone d'enregistrement est mineure, celui-ci pesant moins d’un gramme. L'injection de l'activateur chemogénétique peut induire une douleur aiguë de courte durée liée à l'injection. Ce composé n'a pas d'effets secondaires non spécifiques connus à la dose utilisée. Aucun effet secondaire comportemental n’est attendu suite à l’activation du cortex préfrontal, hormis un effet antidépresseur et un effet anxiolytique léger.

Devenir

Mise à mort pour prélèvement et analyse des tissus.

Remplacement

La complexité du cerveau des mammifères est unique. Bien qu'il soit maintenant possible d'étudier de nombreux problèmes neurobiologiques sur des cellules isolées ou des cultures de tissus, l'utilisation de modèles animaux ne peut être remplacée dans ce projet. Les connaissances sur les mécanismes électrophysiologiques du circuit préfrontal-réuniens-hippocampe sont bien trop limitées, et de fait aucun modèle in silico (tels que les cérébroïdes) in vitro n'existe pour modéliser l'activité de ce circuit complexe. Il s'agit d'un réseau neuronal faisant intervenir plusieurs types cellulaires spécifiques et régions du cerveau, avec de nombreuses protéines et neurotransmetteurs impliqués. En outre, l'étude de l'activité électrophysiologique in vivo est primordiale pour comprendre les patterns d'activation neuronale dans des conditions physiologiques. De plus, cette étude permettra d'en apprendre plus sur ce circuit et fera avancer les connaissances en vue d'un remplacement futur.

Réduction

La taille des échantillons a été déterminée sur la base d'une vaste expérience de laboratoire et a été vérifiée par une analyse de puissance mathématique. L'approche d'enregistrements séquentiels permet une réduction significative du nombre d'animaux nécessaires, chaque souris servant pour les trois sites d'enregistrement au lieu de nécessiter des groupes séparés pour chaque structure. Cette stratégie optimise l'utilisation des animaux selon les principes des 3R.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages enrichies leur permettant d'exprimer les comportements naturels de l'espèce : matériel de nidification (carrés coton, frisure), tunnel (également utilisé pour le change des animaux) et bâton à ronger. La chirurgie d’injection virale est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Durant toute la procédure l’animal est placé sur un tapis chauffant thermostaté à 37°C et relié à une sonde rectale afin de limiter l’hypothermie induite par l’anesthésie. Une pommade ophtalmique sera appliquée sur les yeux empêchant la déshydratation oculaire. Avant le début de la chirurgie, une couverture antalgique multi-modale sera faite. L’hydratation de l’animal sera assurée pendant et après la chirurgie par injection d’une solution saline stérile. Puis , l'animal sera replacé au sein de sa cage, maintenue sous lampe chauffante infrarouge afin de maintenir sa température corporelle jusqu'à son réveil complet. Puis l’état de santé des animaux sera suivi pendant 3 jours et évalué à l’aide d’une grille de score. Des points limites ont également été pré-définis afin de déterminer quand arrêter chaque procédure expérimentale afin de prévenir la souffrance animale et garantir la qualité des résultats. Les enregistrements électrophysiologiques sont également réalisés sous anesthésie, et avec analgésie post-opératoire En fin de procédure la chirurgie terminale sera réalisée sur l’animal après arrêt respiratoire. Le système de skull cap permet de réduire considérablement le stress lié aux interventions répétées en évitant de nouvelles incisions cutanées. Les animaux seront habitués à être manipulés pour minimiser le stress lors de la procédure.

Choix des espèces

Les cerveaux murins et humains possèdent de nombreuses similitudes, notamment des régions et circuits analogues (système limbique, cortex préfrontal) permettant de modéliser des réactions et phénotypes neurobiologiques comparables à ceux observés chez l'homme. Le circuit d'intérêt pour le projet est bien conservé entre la souris et l'homme, avec des projections anatomiques et des propriétés électrophysiologiques similaires. Les techniques d'enregistrements électrophysiologiques aigus sont largement établies et standardisées chez la souris, permettant une caractérisation précise de l'activité neuronale dans ces structures. L'utilisation de la souris s'inscrit dans la continuité de nos projets de recherche précédents, permettant une comparaison directe des résultats électrophysiologiques avec les données comportementales déjà obtenues dans notre laboratoire. Notre étude sera effectuée chez l'adulte jeune (8-14 semaines). L'étude repose sur l'exploration des enregistrements électrophysiologiques et nécessite que les systèmes neurobiologiques soient totalement matures (développement total des systèmes cognitifs et émotionnels, et des structures cérébrales cibles).

Lavages vaginaux d'abord quotidiens, puis chirurgie de retrait des ovaires et greffe de tissu ovarien de truie dans un muscle: 65 souris immunodéprimées vont être utilisées, classées en souffrance modérée. Le prélèvement de sang et de tissus en fin de protocole rend leur réveil impossible, elles seront donc toutes tuées. Le projet évalue si du tissu ovarien de jeune truie reprend sa croissance après congélation. La finalité tient à la filière porcine, avec la conservation de races d'élevage à forte valeur commerciale.

Objectifs

Notre équipe de recherche a été sollicitée dans le cadre de ce projet afin d’intervenir chez les races porcines à petit effectif pour lesquelles des chirurgies consistant à retirer les ovaires sont réalisées en pratique courante en élevage et permettent l’accès à du tissu ovarien au titre de déchets biologiques. Dans ce contexte, cette étude de transplantation de tissu ovariens de truie sur souris a pour objectif d’évaluer la reprise de croissance de la greffe de truie après cryoconservation (procédé de conservation à très basse température). En effet, un retour de la fonctionnalité permettrait d’étudier la croissance d’un tel tissu et de valider leur bonne qualité après cryoconservation.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, peu d’études ont été réalisées sur le tissu ovarien de truies prépubères. Par conséquent, à court terme, notre étude pourrait permettre d’acquérir davantage de données sur la croissance des cellules du tissu prépubère et surtout d’apporter des éléments de compréhension nouveaux sur l’effet de la cryoconservation sur la fonctionnalité de ce type de tissu. Par ailleurs, l’âge des donneuses (~2mois) utilisées dans notre étude permettra d’apprécier l’éventuelle mise en place de mécanismes de blocage/activation de la croissance de tissu ovarien certe prépubère mais très précoce. A plus long terme, des bénéfices pour la filière porcine pourraient découler de ce projet dans la mesure où la qualité de ce tissu cryoconservés serait validée par une reprise de croissance post greffe. En effet, la filière porcine pourrait de ce fait bénéficier d’un outil supplémentaire de conservation patrimoniale de races à fortes valeure ajoutée. En association avec d’autres biotechnologies de la reproduction comme la maturation in vitro et la fécondation in vitro cette méthode permettrait d’envisager l’obtention d’animaux vivants et serait utile à la filière aussi bien dans un objectif patrimonial que de sauvegarde dans un contexte sanitaire de plus en plus complexe (Peste porcine africaine PPA, Syndrome dysgénésique et respiratoire du porc SDRP…).

Procédures

L’ensemble des animaux sera soumis à des lavages vaginaux d’abord quotidiennement puis toutes les 2 semaines à partir de l’apparition des premieres cellules prouvant la bonne reprise de la greffe, la contention nécessaire à ce geste est estimé à quelques minutes par animal. Tous les animaux seront anesthésiés (gazeuse) pour la réalisation de la procédure chirurgicale. Ils resteront anesthésiés (gazeuse) le temps de la réalisation des différents actes, soit au maximum 1h environ. Toutes les souris recevront une injection de 500µL de sérum physiologique sous la peau durant la chirurgie et 12h post chirurgie. Enfin des administrations d’analgésiques seront également réalisées avant la chirurgie et durant les 3 jours suivants (animale vigile), ces dernières seront faîtes 2 fois par jour sous la peau. La durée de ces gestes est estimée à quelques secondes (moins d'une minute par animal).

Impact sur les animaux

Tout au long de l’étude, les animaux seront manipulés et subiront une contention ainsi qu’un lavage vaginal à l’aide d’une irrigation vaginale au sérum physiologique. Cet acte sans douleur générera du stress. Les animaux seront soumis à des actes chirurgicaux (retrait des ovaires et greffe dans le muscle) pouvant engendrer de l'inconfort, une douleur modérée et du stress, durant quelques jours après la chirurgie (estimé à 3 jours) qui sera réduite au maximum par le suivi post-opératoire et les traitements analgésiques. Des complications avant et après la chirurgie ainsi que des signes de rejet de greffe peuvent aussi être observés chez les animaux. Ces souris possédant pas d'immunité, une attention particulière sera portée sur l'apparition de signe d'infection chez les animaux. Les contentions et injections pour les traitement provoqueront un stress et une douleur transitoire chez les animaux.

Devenir

Le volume de sang prélevé pour analyses en fin de protocole ainsi que les prélèvements tissulaires réalisés rendent impossible le réveil de l’animal à la fin de l’anesthésie.

Remplacement

A l’heure actuelle, la greffe reste le meilleur moyen d’évaluer les capacités fonctionnelles de ce tissu ovarien dans la mesure où les méthodes alternatives in vitro (culture de cellules) ne sont pas complètement maitrisées chez la truie et tiennent peu compte de l'environnement tissulaire. Dans un objectif d’étude de la fonctionnalité du tissu, le recours à des cellules isolées ne rélète que partiellement la fonction ovarienne et l’absence de l’environnement cellulaire classique ne permet pas d'assurer le développement cellulaire normalement observable dans un organisme vivant.

Réduction

Les résultats obtenus lors des premiers essais de greffe nous ont permis d’obtenir des données préliminaire et d’effectuer des calculs statistiques du nombre minimal d’individus nécessaires pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d'enrichissement adaptés à l’espèce. Les portoirs et cages sont placés de façon à ce que les animaux ne soient pas trop exposés à la lumière avec la présence d’un environnement sonore (radio) afin de réduire le stress des animaux durant le déroulé du projet. Les animaux recevront une récompense alimentaire après les manipulations stressantes (notamment les rinçages vaginaux) de façon à induire un renforcement positif. Les animaux seront hébergés par cages de 5 souris, et opérés en respectant cette répartition afin de gérer les phases de réveils des animaux au mieux. Durant la période post-opératoire (3 jours) une surveillance accrue des animaux sera effectuée avec l’utilisation de grilles de quantification de la douleur. Les animaux seront suivis de façon biquotidienne pour l’observation de l’état général, de l’état des cicatrices et du comportement des animaux. Une injection d’analgésique avant l'opération ainsi que 2 fois/jour durant les 3 jours suivants sera effectuée. Après cette période les animaux seront observés quotidiennement dans leur cage et un examen clinique avec pesée sera réalisé 1 fois par semaine. Un vétérinaire pourra, le cas échant, réaliser un examen clinique approfondi sur les animaux. Des points limites suffisament prédictifs ont été définis.

Choix des espèces

Le recours au modèle rongeur (souris) comme receveur permet l’utilisation d’animaux naturellement immunodéprimés, ayant un cycle de vie ainsi qu’un cycle reproducteur courts et une taille réduite. De plus, ce modèle a déjà été validé comme supportant la greffe de tissu ovarien provenant de nombreuses espèces. Les souris adultes seront reçues à 8 semaines de façon à être matures sexuellement et d’un gabarit suffisant pour les étapes de chirurgie.

L'objet réel du projet est de mettre au point un modèle de cancer du côlon réutilisable dans d'autres études, présenté comme un "outil fiable" pour de nombreuses équipes. 180 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, classées en souffrance modérée et toutes tuées pour analyse. Un polype est induit dans le côlon par une sonde rectale ou par injection chirurgicale sous anesthésie, avec apparition de tumeurs sur 16 à 24 semaines. La finalité affichée est la production d'un modèle animal servant à d'autres travaux, en amont de toute avancée thérapeutique.

Objectifs

Dans le cancer du côlon chez l’homme, les tumeurs commencent souvent par de petits amas de cellules appelés polypes, qui se forment dans le côlon. Mais dans les souris utilisées habituellement pour la recherche, ces polypes se développent surtout dans l’intestin, et très peu dans le côlon. Cela rend l’étude du cancer du côlon plus difficile. Nous cherchons donc à mettre au point une méthode qui permettrait de créer un polype précisément dans le côlon de la souris, pour que ce modèle ressemble davantage à la maladie humaine. Grâce à ce modèle, les chercheurs pourront comprendre comment les cellules du côlon se transforment en cellules tumorales, étudier comment le polype interagit avec son environnement dans le côlon et observer les premières étapes de la formation d’une tumeur. Une fois mis au point, ce modèle pourra être réutilisé dans plusieurs projets de recherche sur le cancer colorectal, ce qui évitera de recommencer tout le travail de mise au point à chaque fois. Il deviendra un outil fiable, pratique et utile pour de nombreuses équipes de recherche.

Bénéfices attendus

Notre projet consiste à créer chez la souris un modèle de cancer du côlon qui ressemble vraiment à ce qui se passe chez l’être humain. Cela permettra aux chercheurs d’étudier comment un simple polype (une petite excroissance dans le côlon) peut évoluer et devenir un cancer. Nous voulons aussi comprendre le rôle de tout ce qui entoure la tumeur, appelé microenvironnement : ce sont les cellules, les tissus et les molécules autour du polype, qui peuvent aider ou freiner son développement. Grâce à ce modèle, nous espérons découvrir ce qui se passe au tout début de la maladie et peut-être trouver des marqueurs qui permettraient de mieux diagnostiquer ou suivre le cancer du côlon chez l’homme. Ce projet est très important, car les premières étapes du cancer colorectal sont encore mal connues et difficiles à étudier sans un bon modèle.

Procédures

Les animaux auront soit une administration unique par voie rectale à l’aide d’une sonde de cathéter (moins de 10 minutes) ou une injection unique directement dans le côlon nécessitant une intervention chirurgicale. Les actes s’effectueront sous anesthésie générale gazeuse (moins de 30 minutes). Ils recevront une dose d’analgésique 30 minutes avant l’anesthésie, 8h après l’intervention et deux dose le lendemain (moins d’une minute).

Impact sur les animaux

La drogue utilisée n’est pas dangereuse aux doses utilisées, mais elle peut parfois provoquer une petite irritation. L’introduction d’une sonde rectale peut entraîner un léger inconfort. Après une intervention chirurgicale, les animaux peuvent ressentir une sensibilité et une petite inflammation autour de la zone opérée. Des petits amas de cellules (polypes) apparaitrons dans le côlon après traitement. Nous avons estimé les effets indésirables attendus sur les animaux en fonction du temps : 16 à 20 semaines après traitement : inconfort léger, parfois un peu moins d’activité ou un pelage moins soigné. 20 à 24 semaines après traitement : inconfort modéré, avec possible sensibilité abdominale, baisse d’énergie ou petites perturbations du transit.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et les organes d’intérêts seront récupérés pour une analyse histologique post mortem.

Remplacement

Ce projet vise à développer un modèle murin du cancer colorectal., afin de mieux comprendre comment débute le cancer colorectal. Pour étudier ces mécanismes, il est nécessaire d’utiliser des organismes vivants complets, car ils possèdent l’ensemble des interactions naturelles présentes dans un corps (circulation sanguine, système immunitaire, environnement cellulaire complexe…). Les modèles murins utilisés dans ce projet reproduisent de manière fidèle les premières étapes de la formation des tumeurs intestinales. À ce jour, aucun modèle en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permet de reconstituer toutes les composantes d’un tissu vivant dans son intégralité. C’est pourquoi l’utilisation de ces modèles animaux reste indispensable pour répondre aux questions scientifiques posées dans ce projet.

Réduction

Nous avons choisi le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir des résultats fiables, en nous appuyant sur des données scientifiques et des méthodes statistiques. Nous utilisons des animaux des deux sexes afin de limiter le nombre total d’animaux élevés et utilisés. Nous commencerons par la méthode qui est moins invasive. Si elle fonctionne, la méthode plus lourde ne sera pas utilisée, ce qui réduira encore le nombre d’animaux nécessaires. Une fois la meilleure technique validée, elle pourra servir dans d’autres projets, évitant de répéter les mêmes étapes et contribuant à diminuer l’utilisation d’animaux à long terme.

Raffinement

Nous avons mis en place toutes les mesures nécessaires pour assurer le bien-être des animaux. Leur état sera vérifié chaque jour, et les procédures seront réalisées sous anesthésie pour éviter la douleur et réduire le stress. Les animaux seront maintenus au chaud jusqu’à leur réveil. Nous surveillerons attentivement tout signe de malaise (perte de poids, diarrhée, saignement, isolement…). En cas de problème, des actions rapides seront mises en place pour soulager l’animal, comme une alimentation plus facile à consommer, des améliorations de l’environnement ou l’administration d’antidouleurs en complément si besoin.

Choix des espèces

Ce projet nécessite un modèle animal proche de l’humain sur le plan physiologique. La souris utilisée ici reproduit très fidèlement les premières étapes du cancer colorectal, car elle développe les mêmes types de polypes que ceux observés chez l’homme. Aucune autre espèce ou modèle de laboratoire ne permet d’étudier aussi précisément le début de cette maladie. C’est pourquoi ce modèle de souris génétiquement modifié est indispensable pour mener à bien ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de 2-3 mois d'âge selon le protocole établi dans la littérature ou lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g.