Souris

4608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des régimes gras et sucrés pendant six à douze mois pour reproduire une stéatose évoluant vers un cancer du foie, avec échographies sous anesthésie tous les quinze jours et, pour certaines, une chirurgie terminale. Une prise de poids importante, l'anesthésie répétée et le développement tumoral peuvent altérer leur état général. Le porteur justifie ce total de 4608 animaux par un calcul de puissance sans en détailler le résultat, sur un projet qui reste une caractérisation de mécanismes.

Objectifs

Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire. (MODIFICATION) L'ajout des prélèvements sanguins nécessite une modification du projet sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnosticet pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris) (MODIFICATION: et trois prélèvements sanguins seront réalisés sur ces animaux au cours du projet (3 fois, 1 minutes, animal vigile)]. Une autre partie des animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). (MODIFICATION :Un prélèvement sanguin de plus grand volume sera réalisé sur animal anesthésié et analgésié en fin de projet (1 fois, 2 minutes)). Une partie des animaux sera sujette à un transport entre centres de recherche. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection sous-cutané et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général. (MODIFICATION : De la douleur légère de courte durée peut être ressentie au point de prélèvement pour les prélèvements sanguins. Dans de très rares cas une perte de sang hémorragique peut être observée).Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs impliqués peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (4608).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.

Réduction

4608 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.

Des souris donneuses sont tuées pour prélever leur moelle osseuse, aussitôt injectée en rétro-orbitaire à des souris receveuses sous anesthésie, 288 souris au total étant utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les receveuses subissent ensuite des prélèvements sanguins rétro-orbitaires répétés et des échographies cardiaques pour suivre l'atteinte du cœur. Le projet étudie une enzyme impliquée dans la dysfonction cardiaque après greffe de moelle. Toutes les souris sont tuées pour le prélèvement du cœur, des poumons, du foie et des reins.

Objectifs

Les infections sévères, notamment sepsis, sont un problème majeur de santé publique qui touche près de 50 millions de personnes chaque année dans le monde. Le sepsis entraîne une dysfonction cardio-circulatoire qui se définit par : un dérèglement de l’endothélium, une vasodilation excessive et une chute de la pression artérielle. De plus, le sepsis est associé à un dérèglement de tous les composants de l’immunité conduisant à une immunodépression (diminution des défenses immunitaires). Cela conduit à long terme à de graves défaillances d’organes. Les enképhalinases sont des enzymes dégradant les peptides opioïdes, qui interviennent dans la régulation de la pression artérielle. Notre laboratoire s’intéresse principalement à une enzyme impliquée dans les dysfonctions cardio-circulatoires avec un effet inotrope négatif (diminution de la force du battement du cœur) et vasodilatateur. Des études ont montré que l’enzyme, fortement exprimée par toutes les cellules tumorales, pouvait promouvoir la prolifération et l’invasion tumorale. Ainsi il a été démontré qu’une expression élevée de cette enzyme dans la tumeur est associée à un taux de mortalité plus important des patients avec tumeurs malignes. Dans des modèles expérimentaux de cardiotoxicité induite par les anthracyclines, une surexpression de l’enzyme a été observée dans la moelle osseuse et le cœur, précédant la dysfonction cardiaque. Une augmentation des niveaux de l’enzyme a été relevée chez les patients allogreffés, suggérant un lien entre l’enzyme et la cardiotoxicité post-allogreffe ; Par ailleurs, bien que le sexe masculin soit un facteur de risque de maladies cardiovasculaires communément décrit en population générale, certaines études suggèrent que les femmes auraient un risque plus important d’hospitalisation pour insuffisance cardiaque chez les patients allogreffés. Le dimorphisme sexuel pourrait influencer l’impact de l’enzyme, notamment en raison du rôle des œstrogènes augmentant l’expression de l’enzyme ou encore des différences pharmacocinétiques des chimiothérapies variable selon le sexe. Notre projet a donc pour but de comprendre s’il existe un lien entre enképhalinase et système immunitaire dans un contexte de dysfonction cardio-circulatoire. Pour cela, nous allons étudier le rôle de l’enzyme dans la physiopathologie de la dysfonction cardiaque survenant dans l'allogreffe de cellules souches hématopoïétiques à l'aide d'un modèle murin pré-clinique d'allogreffe.

Bénéfices attendus

La physiopathologie de la dysfonction cardiaque survenant après une allogreffe reste encore peu explorée, bien qu’elle soit fréquente et puisse aggraver le pronostic des patients. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait rapidement permettre, à court et moyen terme, d’identifier des facteurs de risque précoces et d’adapter la surveillance et la prise en charge clinique des patients. À plus long terme, ces recherches contribueraient également à améliorer la pratique médicale et à développer des stratégies préventives en cardio-oncologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions : les souris "receveuses" recevront en intra péritonéal un traitement. La durée de l’injection sera d’environ 10 secondes par souris. Les souris « donneuses » seront prélevées au niveau des tibias et fémurs après leur mise à mort (5min x1). L’injection de la moelle osseuse aux souris « receveuses » se fera sous anesthésie générale en rétro-orbitaire (5min x1). Post-greffe, un prélèvement sanguin sous anesthésie générale supplémenté par un collyre analgésiant et des échocardiographies seront réalisés (5min x 5) pour suivre leur fonction cardiaque.

Impact sur les animaux

Les animaux seront sujets à différentes injections : intra-péritonéales pour les anesthésies et les médicaments et rétro-orbitaire pour la greffe de cellules de moelle osseuse. Ces injections pourront induire un stress et une gêne chez l’animal. Des prélèvements sanguins en rétro-orbitaire seront réalisés sous anesthésie générale et en appliquant préalablement un collyre analgésiant. Les prélèvements en rétro-orbitaire pourrait générer un stress et une douleur chez l’animal. Les prélèvements seront effectués en alternant l’œil à chaque fois afin de minimiser les risques de traumatisme oculaire chez la souris.

Devenir

Mise à mort des animaux suite au prélèvement rétro-orbitaire pour permettre la récupération des organes (cœur, poumon, foie, rate, rein gauche et rein droit) ainsi que de la moelle osseuse pour des futurs analyses.

Remplacement

L'objectif principal est d'étudier le rôle de l’enzyme dans la physiopathologie de la dysfonction cardiaque survenant dans l'allogreffe de CSH (cellules souche hématopoïétique) à l'aide d'un modèle murin pré-clinique d'allogreffe, en tenant compte du dimorphisme sexuel de l’enzyme. Les modèles in vitro et organoïdes ne peuvent mimer les phénomènes pathophysiologiques systémiques mis en jeu dans la maladie, d'où la nécessité d'utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par calcul statistique pour mettre en évidence une différence significatif entre les groupes. Notre critère de jugement principal sera la diminution de la fraction de raccourcissement du ventricule gauche (paramètre indiquant une dysfonction de la contraction cardiaque). La taille de l’échantillon (sample size) a été calculée en utilisant “The Cohen’s d calculation”. Prenant en considération un seuil de signification de p

Raffinement

Des points limites adaptés et une surveillance quotidienne des animaux permettent de prévenir toute forme de souffrance des animaux. Les protocoles expérimentaux se feront sous anesthésie générale (kétamine 80-100 mg/kg) afin d’éviter le plus possible une quelconque douleur chez l’animal. Lorsque l’animal sera totalement endormi (test du reflexe à la patte), l’animal sera placé sur une plaque chauffante à 37°C. Un collyre analgésique (tétracaïne 1%) sera utilisé avant chaque injection et prélèvement rétro-orbitaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel de l’animalerie. L’optimisation du protocole inclura une seule anesthésie (kétamine 100 mg/kg) permettant l’évaluation de la fonction cardiaque par échocardiographie et le prélèvement sanguin.

Choix des espèces

Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherche. Elles partagent une grande homologie génétique et physiologique avec les humains, ce qui permet de mieux comprendre les processus biologiques et les maladies chez l’humain. Ensuite, les souris se reproduisent rapidement et sont relativement peu coûteuses à élever, ce qui permet d'obtenir rapidement des cohortes expérimentales. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle de dysfonction cardiaque aigue comporte de nombreuses similitudes avec la dysfonction cardiaque chez l’Homme. Les souris transgéniques enképhalinases sont viables et asymptomatiques, elles se reproduisent normalement. Leur phénotype n’est pas dommageable

Jusqu'à vingt anesthésies et vingt injections intrapéritonéales par animal, 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit par chirurgie une greffe de cellules de neuroblastome humain dans la glande surrénale, avec incision, sutures et palpations répétées de la tumeur. Le neuroblastome étant un cancer de l'enfant, les greffes sont réalisées sur des souris âgées de cinq à six semaines. Le porteur retient la souris pour la proximité de son génome avec celui de l'humain et la disponibilité de nombreux modèles.

Objectifs

Le neuroblastome est le cancer pédiatrique le plus fréquent chez le jeune enfant. Parmi les mutations génétiques impliquées dans ce cancer certaines sont de très mauvais pronostic. Actuelllement aucun modèle murin de neuroblastome permettant un suivi dans la durée de la croissance tumorale n'est mis au point afin de valider les gènes mis en évidence dans le développement des neuroblastomes. C'est pourquoi ce projet vise à mettre au point ce type de modèle en utilisant des lignées de neuroblastome humain mimant les conditions de plus mauvais pronostic.

Bénéfices attendus

L’un des axes de lutte contre le Cancer est d’empêcher l’initiation tumorale et de lutter contre la progression tumorale et la récidive. Ce projet permettra d’avoir un modèle afin de mettre en évidence l’implication des gènes d’intérêt dans le développement des différents types de tumeur et de proposer de nouveaux protocoles thérapeutiques à moyen terme. De plus ce modèle permettant un suivi longitudinal cela permettra de réduire le nombre d'animaux et de visualiser le potentiel métastatique de ces modifications.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie, afin de réaliser la greffe des cellules tumorales. Cela durera environ 15 minutes, de l'endormissement jusqu'au réveil des animaux, et ne sera pas répété. Le suivi de la croissance tumorale nécessitera également une anesthésie volatile d'environ 15 minutes. Cela pourra être répété jusqu'à 20 fois sur la durée du protocole. De plus il y aura une injection en intrapéritonéale précédent chaque suivi de la croissance tumorale, jusqu'à 20 fois lors de ce protocole. La durée de la contention liée à la piqure est inférieure à 30 secondes. Enfin la greffe se fera dans la glande surrénale qui est le site préférentiel de développement des neuroblastomes chez l'Homme.

Impact sur les animaux

Lors de ce protocole les animaux vont subir dans un premier temps une greffe de cellules nécessitant une anesthésie générale volatile qui pourra générer du stress. De plus l’incision de la peau et du péritoine, ainsi que les sutures pourront générer de la douleur. Les injections d’antalgiques en sous-cutané, pré et post-opératoire, pourront engendrer une légère douleur. L’imagerie des animaux afin de suivre l’évolution de la luminescence pourra générer du stress (lié à l’anesthésie volatile) et une légère douleur liée à l’injection de la solution de substrat luminescent en intra-péritonéal. Une palpation au niveau du rein injecté pour pouvoir évaluer le volume de la tumeur sera réalisée, ce qui pourra générer un stress lié à la contention de l’animal. De plus les animaux pourront ressentir un stress léger lors des pesées.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort car les prélèvements à réaliser ne permettent pas le maintien en vie de l'animal (tumeur, organes principaux comme le foie, les poumons, les reins, le cerveau notamment.

Remplacement

Les travaux sur des modèles cellulaires ont permis de mettre en évidence des gènes pouvant représenter des cibles thérapeutiques dans le cas des neuroblastomes. Des études sur des modèles cellulaires ont été réalisées au préalable. Pour démontrer définitivement l'implication de ces gènes dans la maladie et leur potentiel thérapeutiques l'utilisation d'un modèle complexe chez l'animal est nécessaire. C'est pour cela que le but de ce projet est de développer un modèle de neuroblastome, avec suivi longitudinal, en réalisant des greffes de cellules humaiones de neuroblastome chez la souris.

Réduction

Le but de ce protocole est de mettre au point un modèle murin de neuroblastome, permettant un suivi longitudinal. Pour cela 3 lignées représentant trois stades différents de neuroblastome ont été sélectionnées. Un suivi longitudinal sera réalisé, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les greffes de cellules humaines de neuroblastome dans la glande surrénale seront réalisées en séquentiel. Ce modèle permettra ensuite de valider le rôle de gènes d’intérêt dans la croissance tumorale des neuroblastomes et de visualiser le potentiel métastatique afin de proposer de nouveaux choix thérapeutiques. Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été calculé pour que les données générées soient suffisamment robustes pour ne pas nécessité de répéter ce projet ultérieurement

Raffinement

Dès leur arrivée dans l’animalerie les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) expérimentateur(s) de 7 jours. Les animaux seront pesés une fois par semaine en début de protocole puis deux fois par semaine ensuite. Cette pesée entre dans le cadre du suivi de l’état général des souris. Les animaux seront observés lors du change par le personnel animalier et deux à trois fois par semaine par les expérimentateurs. Une liste précise permettant de quantifier les signes éventuels de souffrance sera alors utilisée afin d’évaluer si les animaux présentent des signes de souffrance ou d’atteinte d’un point limite. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements comme du coton de nidation, des batônnets de bois et éventuellement des tunnels. De la litière en cellulose sera utilisée pour les animaux dépourvus de fourrure.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour les études sur l'animal car le génôme de la souris est très proche de celui de l'Homme. De plus de nombreux modèles ont été développés chez la souris. Pour ce projet un modèle innovant de neuroblastome sera réalisé, avec des greffes de cellules humaines de neuroblastome représentant différents types de tumeurs, de mauvais pronostic. Le neuroblastome étant un cancer pédiatrique les greffes seront réalisées chez des animaux jeunes (âgés entre 5 et 6 semaines), à la fois chez des mâles et des femelles, en fonction du sexe des cellules utilisées.

Pour constituer une biobanque et fournir des tissus à la recherche, 910 animaux, souris, rats, lapins, chiens, ouistitis et macaques, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les prélèvements vont de prises de sang sur animal vigile à des ponctions de liquide céphalorachidien ou synovial sous anesthésie, ces dernières pouvant provoquer douleur, gonflement ou infection articulaire. Le recours au primate non humain est présenté comme obligatoire pour les études précliniques de sécurité. Une partie des animaux est réutilisée dans d'autres projets ou adoptée, le reste étant tué pour alimenter la biobanque en organes.

Objectifs

Afin de garantir la qualité des résultats et la validité des études, un objectif synergique des exigences 3Rs, le développement et la validation de méthodes d’analyses des échantillons biologiques sont nécessaires pour la bonne réalisation des études de sécurité et d’efficacité pré-clinique de médicaments régies par les BPL (Bonnes Pratiques de Laboratoires). A terme, dans le cadre de ces exigences 3Rs, des appareils et des méthodes d’analyses plus performantes permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour un objectif scientifique donné et de raffiner les procédures expérimentales (par exemple, en réduisant les volumes sanguins prélevés, ou en déterminant des points limites plus précoces). De plus, en recherche fondamentale ou avancée, les produits biologiques (organes, tissus ou fluides) issus d’animaux sont essentielles pour des études in vitro, la recherche translationnelle et in fine le développement de méthodes alternatives à l’expérimentation animale. Ces études permettent de limiter l’utilisation directe d’animaux en expérimentation à des procédures peu invasives ou de réduire le nombre d’animaux utilisés pour obtenir la même quantité de données scientifiques. Ce projet a donc pour objectif le prélèvement de fluides (sang, liquide céphalorachidien, liquide synoviale, sperme) et d’organes afin de constituer une biobanque, de développer ou optimiser les méthodes d’analyses des biomarqueurs d’intérêt et fournir à la communauté scientifique des produits biologiques

Bénéfices attendus

Ce projet assure le développement et la validation de méthodes d’analyses ou d’identifications de marqueurs physiologiques dans les études pré-cliniques et indispensables à l’élaboration de tout nouveau médicaments, ainsi que la constitution d’une biobanque et l’approvisionnement en tissus biologiques des laboratoires de recherche. Il permet la mise en application dans le cadre d’études réglementaires régies par les BPL (Bonnes Pratiques de Laboratoires) d’appareils ou de méthodes d’analyses biochimiques, hématologiques, histologiques ou encore immunologiques plus fiables et plus précises. Il permet d’assurer un suivi plus spécifique des effets d’un produits en cours d’essai chez l’animal, ce qui apporte au moins deux bénéfices majeurs : 1) détecter plus rapidement les effets délétères pour la santé des animaux modèles (et donc anticiper des lésions sévères avant que l’impact sur le bien être devienne significatif) et 2) augmenter notre capacité à détecter de potentiels effets toxiques en amont des phases de test cliniques chez l’humain. De plus, il permet de développer des méthodes réduisant les volumes prélevés nécessaires lors des analyses de biomarqueurs, ainsi que les fréquences de prélèvement chez l’animal. Enfin, en particulier dans le cadre des prélèvements d’organes, en plus de constituer une biobanque indispensable à la recherche fondamentale, appliquée ou translationnelle, il permet d’assurer une formation sous tutorat de collaborateurs ayant acquis les bases théoriques des gestes techniques mais nécessitant de pratiquer ces gestes et ce sans utiliser d’animaux à dans ce seul but. Ainsi, ce projet permet l’optimisation continue de la qualité des données expérimentales des études précliniques et les respects des exigences 3Rs de réduction (liées à la qualité des études) et de réduction et de raffinement (réduction de la fréquences et des volumes d’échantillons biologiques nécessaires).

Procédures

Les prélèvements sanguins seront la plupart du type effectués vigiles, dans un système de contention appropriés, en quelques minutes. Le prélèvement de liquide céphalorachidien ou de liquide synoviale est effectué sous anesthésie, de 10 à 20 minutes environ. Le prélèvement d'organes est effectués post mortem.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins (majoritaires au cours de ce projet) ne constituent pas de risque significatif pour la santé des animaux, d’autant plus car ils sont effectués dans le cadre des lignes directrices internationalement reconnues. Le prélèvement de liquide céphalo rachidien, lorsqu’il est effectué par un personnel qualifié sur un animal en bonne santé ne présente que peu de risques de complications sévères. Les complications les plus susceptibles d’avoir lieu sont celles lié à l’anesthésie (prévenu en utilisant un protocole d’anesthésie mis en place par un vétérinaire), et le risque d’une hernie en cas d’hypertension intracrânienne (risque négligeable lorsque le geste est pratiqué sur des animaux en bonne santé).. Le prélèvement de liquide synoviale peut entrainer un gonflement, une douleur au niveau de l’articulation, ou encore une infection (arthrite). Tous les effets secondaires seront pris en charge par un vétérinaire, disponible 24h/24

Devenir

Les animaux seront soit utilisés dans d'autres projets autorisés par le MERS, soit adoptés lorsque cela est possible (sur avis vétérinaire), soit euthanasiés pour fournir la recherche biomédicales en échantillons biologiques et entretenir une biobanque pour chaque espèce ou lorsque les 2 premières solutions ne peuvent être effectés après avis vétérinaire.

Remplacement

Lorsque cela est possible, le développement et la validation d’appareils ou de méthodes analytiques sont faits en utilisant des substitues au sang. Ces substitues peuvent être des solutions de contrôles chimiques reconstitués (surtout dans le cadre de dosages biochimiques), ou encore des contrôles humains délivrés par le fournisseurs des appareils. Ces échantillons reconstitués permettent de remplacement les échantillons de sang frais prélevés chez l’animal.

Réduction

Dans le cadre des études pré-cliniques, des prélèvements sanguins sont nécessaires avant que ne commencent l’étude, c’est-à-dire avant l’administration du produit testé. Lorsque les volumes de sang prélevés le permettent, le sang (et ses dérivés : plasma, sérum) non utilisé dans le cadre de l’étude est récupéré pour ce projet, réduisant ainsi le nombre d’animaux naïfs nécessaire. De plus, l’utilisation d’échantillons chimiques reconstitués lieu et place de sang frais permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Lors de la procédure terminale pour prélever les organes, les animaux utilisés seront le plus souvent des animaux ré-utiliser d’autres procédures (après validation par un vétérinaire), afin de ne pas sacrifier un animal uniquement pour récupérer ces organes. La procédure peut permettre de former les personnels à des actes techniques simples (ex : prise de sang) lorsque l’animal est anesthésie.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux bénéficient d’une période d’adaptation afin de s’habituer à leur nouvel environnement et de limiter le stress. Ils sont ensuite entraînés de manière progressive, à l’aide de méthodes positives, pour faciliter les soins et réduire les contraintes lors des manipulations nécessaires. Les animaux vivent en groupe dans des conditions adaptées à leurs besoins, avec des activités et des aménagements quotidiens destinés à favoriser leur bien‑être. L’isolement n’est utilisé qu’en cas de nécessité (par exemple pour des soins), sous contrôle vétérinaire. Les changements de groupes sont réalisés progressivement afin de réduire le stress et le risque de blessures. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement, avec un suivi vétérinaire régulier et un accès à une assistance vétérinaire 24h/24. Chaque animal fait l’objet d’un examen vétérinaire avant d’être inclus dans le projet. Toutes les interventions sont tracées afin d’assurer un suivi rigoureux. Des équipements adaptés sont utilisés pour limiter les manipulations directes et le stress, notamment chez les primates. Les quantités de substances administrées ou prélevées respectent strictement les recommandations internationales en vigueur, dans le but de garantir la sécurité et le bien‑être des animaux.

Choix des espèces

Les études précliniques de sécurité et d’efficacité sont obligatoires avant tout essai chez l’être humain et répondent à des règles réglementaires strictes. Elles nécessitent l’utilisation d’au moins deux espèces animales différentes afin d’assurer la fiabilité des résultats. Pour certaines études portant sur le système immunitaire, le recours au primate non humain est nécessaire en raison de sa proximité biologique avec l’homme. Ce projet a pour objectif de développer et d’améliorer les outils et méthodes d’analyse utilisés dans ces études précliniques. Les espèces animales choisies correspondent à celles reconnues comme les plus pertinentes pour évaluer la sécurité des candidats médicaments. Les animaux inclus dans ce projet sont les mêmes que ceux utilisés ensuite dans les études, et sont sélectionnés à partir d’un âge garantissant leur maturité et leur bon état de santé.

Irradiées à dose sublétale, injectées de cellules leucémiques, puis traitées par injections quotidiennes ou par un implant sous-cutané, 1072 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent des prélèvements de moelle osseuse dans le fémur, source d'inconfort et de stress, et une perte de poids est observée sous traitement prolongé. L'objectif est de caractériser une leucémie surexprimant un récepteur, pour orienter de futurs traitements plus ciblés. Toutes sont tuées en fin de procédure pour le prélèvement de leurs organes.

Objectifs

La leucémie aiguë promyélocytaire est un cancer des cellules de la moelle osseuse et du sang, déclenché par une anomalie génétique qui conduit à la production d'une protéine anormale hybride entre deux gènes dont celui du récepteur de l’acide rétinoïque. La combinaison de deux agents thérapeutiques, dégrade cette protéine et permet l’éradication définitive de la maladie. De façon notable, la surexpression du gène du récepteur à l’acide rétinoïque est capable d'induire une prolifération des cellules sanguines de souris ex vivo et de leur conférer une plus grande sensibilité à l’un des agents thérapeutiques efficace. Cette surexpression est retrouvée dans 30% des Leucémies Aiguës myéloïdes chez l’Homme. Dans ce projet nous souhaitons caractériser les gènes cibles responsables de l'auto-renouvellement de ces cellules leucémiques afin d’identifier des biomarqueurs cliniquement appropriés et l'élaboration de traitements plus efficaces et plus ciblés. Nous comparerons également l'efficacité d’un agent thérapeutique potentiel à celle d’un traitement de chimiothérapie à large spectre dans nos modèles expérimentaux de leucémies. A terme nous espérons développer de nouvelles thérapies basées sur ces mécanismes.

Bénéfices attendus

Nous espérons pouvoir identifier les mécanismes par lesquels les cellules leucémiques prolifèrent dans ces leucémies. Ainsi, nous pourrons mieux choisir le traitement de façon à ce qu’il soit plus efficace et plus spécifique que la chimiothérapie large spectre, avec moins d’effets secondaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection intraveineuse et éventuellement à un ou plusieurs prélèvement(s) de moelle osseuse effectué(s) dans le fémur. Les animaux traités pourront recevoir les différents traitements soit par injections quotidiennes intra-péritonéales (5 maximum), intra-veineuses (3 maximum), ou encore par un implant sous-cutané nécessitant une seule courte chirurgie.

Impact sur les animaux

Lors de la première phase, correspondant à l’établissement du modèle de leucémies chez la souris, celles-ci seront exposées à une irradiation à dose sublétale par rayons X causant une inflammation transitoire dans la moelle osseuse et à une injection intra-veineuse pour l’inoculation des cellules leucémiques. Pour les traitements de courte durée (1 à 3 jours) les effets indésirables attendus sont le stress et l’inconfort liés à une injection intra-péritonéale ou intra-veineuse unique ou répétée quotidiennement pendant cette durée. Pour les traitements plus longs (7 à 21 jours), des effets indésirables liés à l’anesthésie, à une courte chirurgie et à la cicatrisation seront à prévoir suite à l’implantation des capsules du traitement en sous-cutané. Nous avons pu constater dans certains cas une perte de poids chez des souris en cours de traitement prolongé. Un inconfort et stress liés au prélèvement intrafémoral sont à prévoir chez les animaux concernés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, et les organes nécessaires aux analyses ultérieures seront prélevés.

Remplacement

L’objectif du projet est de déterminer le mécanisme de transformation leucémique par une protéine surexprimée et les effets de la réponse à un traitement ciblé et à la chimiothérapie chez un individu leucémique. Nous avons au préalable testé ces molécules ex vivo sur des modèles cellulaires proches tels que des lignées de cellules leucémiques immortalisées. Il est donc maintenant nécessaire d’être dans des conditions qui reproduisent au maximum celles retrouvées chez les patients comme le micro-environnement des cellules, les interactions avec les autres types cellulaires, ou encore la métabolisation des médicaments par un organisme entier.

Réduction

Une estimation des effectifs nécessaires pour la constitution des groupes pour mener l’étude a été faite en tenant compte de données antérieures sur une autre leucémie, ainsi que d’un calcul de puissance satistique pour comparer les résultats sur nos animaux traités et non-traités. Chaque groupe sera donc constitué de 12 souris. Nous utiliserons au maximum 1072 souris sur les 5 ans que durera le projet, réparties en un groupe contrôle et 2 groupes tests. Cinq temps d’analyse (entre 24h et 21 jours puis survie post-traitement) seront réalisés pour chacun des 2 modèles de souris développant des leucémies chez chacune des deux souches génétiques utilsées si nous parvenons à obtenir un modèle dans chaque souche et pour chacune des deux formes existantes de la protéine. Un même groupe pourra servir de contrôle à plusieurs temps et types de traitement pour minimiser le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les animaux seront surveillés à l'aide d'une grille d’évaluation, tenant compte notamment de leur apparence et de leur comportement. Elle sera tenue chaque semaine de façon à définir des points limites de douleur/souffrance suffisamment précoces pour déclencher une mesure corrective (séparation en cas d'agressivité inter-individus, accès facilité à la nourriture, désinfection d'une plaie, etc.). Ce suivi clinique sera quotidien lors de la phase de traitement. L'utilisation d'antalgique ou d'analgésique sera envisagée si besoin. Après les prélèvements intra-fémoraux, des croquettes humidifiées facilement accessibles seront mises à disposition des animaux après leur réveil. Si nos résultats de comparaison des deux méthodes d’inoculation du traitement montrent un effet équivalent, nous pourrons opter pour l’injection IP lors de temps courts de traitement pour nos études futures afin d’améliorer le bien-être des animaux. En revanche, l’utilisation des capsules implantées en sous-cutané permet d’éviter des injections IP quotidiennes sources d’inflammation et de stress répété pour les temps longs de traitement.

Choix des espèces

La souris est un petit mammifère suffisamment proche de l’Homme pour les expériences menées dans ce projet. La grande expérience de notre laboratoire sur la protéine Le gène responsable de la leucémie est proche en séquence et en fonction chez l’homme et chez la souris. Les molécules testées sont à administrer par différentes voies, toutes disponibles sur l’espèce animale choisie. De plus, le contrôle de leur bien-être au quotidien est facilité car les signes de souffrance/douleur ont été bien caractérisés chez cette espèce. Les études passées et présentes menées dans ce domaine par la communauté scientifique sont réalisées essentiellement sur ce modèle. La composition de la moelle osseuse change avec l’âge des individus, notamment la quantité de progéniteurs. Ainsi nous utilisons des souris jeunes adultes de 6 à 8 semaines pour nos expérimentations. Nos études précédentes et celles faites dans les autres laboratoires travaillant dans ce domaine sont couramment réalisées à ce stade de développement.

Soumises à une injection veineuse ou à une chirurgie du cerveau, 1134 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cerveau. Le modèle induit la dégénérescence d'environ la moitié de certaines populations de neurones et l'apparition de troubles moteurs, pour reproduire une maladie neurodégénérative rare. Le porteur ajoute qu'un intérêt du projet est de fournir ce modèle à d'autres chercheurs qui n'y ont pas accès. Il annonce des tests de comportement répétés jusqu'à six mois après la chirurgie sans préciser lesquels.

Objectifs

L’atrophie multisystématisée est une maladie neurodégénérative rare et mortelle touchant environ 5000 personnes en France. Cette pathologie se caractérise par une perte progressive de neurones dans plusieurs régions du cerveau. Cette perte neuronale s’accompagne de l’accumulation toxique d’une protéine spécifiquement dans certaines cellules. Cependant les mécanismes liant ces deux évènements restent peu connus. Comme pour de nombreuses autres maladies, les modèles animaux représentent un outil essentiel pour répondre aux limites des modèles informatiques et cellulaires. Ils apportent beaucoup de connaissances sur cette pathologie. Ainsi, il est essentiel de poursuivre leur optimisation. Dans le contexte de l’atrophie multisystématisée, les modèles transgéniques présentent une pathologie tissulaire large mais peu de troubles comportementaux. Il faut donc poursuivre le développement de nouveaux modèles mimant le plus possible la pathologie humaine. L’objectif de cette étude est de tirer avantage de nouveaux outils moléculaires (vecteurs viraux) pour développer un nouveau modèle de souris d’atrophie multisystématisée qui rassemble de nombreux avantages des modèles précédents. En particulier, nous souhaitons générer un modèle plus pertinent et plus accessible à la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Comme pour les autres maladies, les modèles animaux d’atrophie multisystématisée sont des outils essentiels pour mieux comprendre les mécanismes pathologiques et développer des thérapies. Par le développement de ce nouveau modèle, nous espérons apporter de nouvelles connaissances concernant les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la pathologie. En effet, notre approche permettra l’apparition de signes pathologiques dans l’ensemble du système nerveux central adulte qui est plus vulnérable à ces processus toxiques. Tous ces signes permettront une modélisation plus fidèle de cette maladie chez l’animal. Enfin, de nombreux chercheurs n’ont actuellement pas accès à des modèles animaux d’atrophie multisystématisée, souvent par défaut d’expertise ou du matériel nécessaire à la chirurgie du cerveau. Notre nouvelle méthode de modélisation, obtenue par une simple injection intra-veineuse, permettra de fournir un modèle accessible à une grande communauté de chercheurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection dans la veine (5 minutes) ou une chirurgie du cerveau (20 minutes). Dans la semaine avant ces interventions ainsi qu’un, trois et 6 mois plus tard, les animaux réaliseront des tests de comportements répartis sur 2 jours. Chacun de ces tests peut durer entre 3 minutes et environ 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont : 1-L’injection dans la veine ou dans le cerveau qui peut induire un stress attendu. 2-L’induction du modèle qui peut induire une dégénérescence d’environ 50% de certaines populations neuronales et gliales et l’apparition de légers troubles moteurs et non-moteurs. 3-Les tests comportementaux qui peuvent induire des stresses attendus, y compris lors du déplacement des animaux vers les salles expérimentales.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour l’analyse du cerveau.

Remplacement

Ce projet a pour but de mesurer des marqueurs de la maladie, notamment comportementaux, au cours du développement de l’atrophie multisystématisée. De ce fait, il est impossible de reproduire la complexité d’un organisme vivant et de remplacer notre approche chez l’animal par un modèle cellulaire ou une simulation informatique.

Réduction

La détermination du nombre d’animaux est basée a priori sur nos études antérieures et celles d’autres équipes démontrant des résultats statistiquement significatifs avec une taille d’échantillons de 15 animaux par condition. Ce nombre pourra être corrigé après l’obtention des résultats des expériences pilotes qui nous fourniront une estimation de la taille de l’effet de l’induction du modèle. Celle-ci nous permettra de calculer le nombre minimal théorique d’animaux nécessaires pour détecter une différence statistiquement significative après un test de mesures répétées ou une comparaison directe de 2 groupes expérimentaux. Le nombre d’animaux nécessaire sera calculé à l’aide d'un logiciel danalyse statisitique. Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Avant leur utilisation en expérimentation, un contrôle qualité des vecteurs viraux sera réalisé.

Raffinement

Suite à leur arrivée dans l’animalerie, les animaux auront une semaine d’acclimatation. L’injection du vecteur viral sera réalisée sous anesthésie et traitement anti-douleur. Les tests comportementaux ont été répartis sur plusieurs jours et les animaux seront acclimatés à la salle avant de réaliser les tests. La mise à mort des animaux sera réalisée selon un protocole d’anesthésie et de double analgésie adaptées. Des points limites basés sur des signes indicatifs seront utilisés afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des régions affectées dans l’atrophie multisystématisée. Le modèle sera induit chez des animaux jeunes adultes (10 semaines). À ce stade, les systèmes cérébraux sont matures et stables et le resteront tout au long des procédures expérimentales proposées.

Cinquante souris femelles subissent un transfert d'embryons par chirurgie sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste une méthode combinant hormones et stimulation mécanique pour éviter le recours à des mâles stérilisés lors de la préparation à la gestation. Présenté comme une amélioration du bien-être des animaux non-humains et une réduction de leur nombre, il prévoit la mise à mort des femelles ayant reçu un transfert ou devenues gestantes, quelques-unes seulement pouvant être réutilisées après une période de repos. La démarche revendique de limiter la souffrance tout en soumettant ces femelles à une chirurgie utérine puis à la mort.

Objectifs

Notre service conserve et restaure des lignées de souris utilisées dans la recherche. Pour certaines techniques, il est nécessaire de préparer des femelles capables de recevoir des embryons, ce qui implique de les mettre dans un état physiologique similaire à une grossesse, appelé pseudo-gestation. Ce projet teste une méthode alternative qui combine hormones et stimulation mécanique douce, afin d’éviter l’utilisation de mâles stérilisés pour déclencher cet état. Les embryons sont ensuite transférés par chirurgie dans ces femelles préparées. Un maximum de 50 femelles sera utilisé. Le bien-être des animaux sera assuré tout au long du projet, et toutes les procédures potentiellement douloureuses seront réalisées sous anesthésie générale.

Bénéfices attendus

Ce projet teste une méthode alternative pour préparer les femelles souris à recevoir des embryons, sans avoir recours à des mâles stérilisés. À court terme (1–2 ans) : valider la méthode et mesurer son efficacité, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et limiter leur stress et inconfort. À moyen terme (3–5 ans) : rendre les transferts d’embryons plus fiables et plus faciles à réaliser, tout en améliorant le bien-être des animaux.

Procédures

Les interventions prévues peuvent provoquer des effets transitoires sur les animaux : • Préparation hormonale : léger inconfort et stress pendant la manipulation, de courte durée (30 secondes), disparaissant immédiatement après. • Stimulation mécanique : trois séquences de 30 secondes, inconfort temporaire et stress modéré dus à la contention et à la vibration, avec retour rapide à un comportement normal après chaque séquence. • Transfert embryonnaire (10 minutes) : douleur et inconfort modérés liés à l’intervention et à l’anesthésie, récupération complète attendue après 1 à 2 jours grâce à une surveillance attentive et à une analgésie adaptée.

Impact sur les animaux

Les effets transitoires attendus : somnolence, légère baisse de température, diminution temporaire de l’appétit, sensibilité ou inflammation à l’endroit de l’opération, mobilité réduite. Les effets indésirables possibles : douleur après l’intervention, hématome, infection de la plaie, complications locales dans les trompes utérines pouvant entraîner la perte d’embryons. Ces effets sont liés aux manipulations, à l’administration de traitements hormonaux et au transfert d’embryons, et sont généralement temporaires et réversibles. Aucun effet génétique permanent n’est attendu chez les animaux utilisés.

Devenir

À la fin du projet, seules les femelles non utilisées pour le transfert embryonnaire et non gestantes pourront être réutilisées après une période de repos adaptée. Les femelles ayant subi un transfert embryonnaire, ainsi que les femelles gestantes ou ayant mis bas, seront euthanasiées de manière réglementaire à l’issue du suivi. Afin de valider la technique, les animaux produits ne seront pas conservés à des fins expérimentales ou reproductives, et seront euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur après l’intervention.

Remplacement

La revitalisation d’une lignée de souris consiste à redonner vie à une lignée conservée sous forme congelée afin qu’elle puisse à nouveau être utilisée en recherche. Cette étape est nécessaire pour préserver des lignées importantes et éviter de les recréer à partir de zéro. La redérivation permet également d’éliminer d’éventuels agents infectieux transmis par les animaux adultes. Ces embryons sont ensuite implantés chez une femelle porteuse saine, ce qui permet d’obtenir des animaux exempts de contamination. Cette méthode nécessite l’utilisation d’animaux vivants, mais elle constitue une approche plus respectueuse du bien-être animal que le maintien prolongé de colonies entières. Le projet vise à améliorer cette technique en réduisant le nombre d’animaux impliqués et en limitant les procédures contraignantes, notamment en évitant l’utilisation de mâles stérilisés.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été estimé pour être le minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats fiables. Les femelles receveuses sont optimisées par synchronisation hormonale et stimulation mécanique, ce qui réduit le nombre d’animaux par expérience. Chaque intervention est planifiée pour éviter les répétitions inutiles.

Raffinement

Toutes les procédures impliquant les animaux sont conçues pour limiter le stress et la douleur. Les animaux sont entraînés à la manipulation afin de réduire l’anxiété et le stress liés aux interventions. Les interventions chirurgicales, notamment le transfert embryonnaire, sont réalisées sous anesthésie générale. Une réadministration d’antalgique est prévue si nécessaire. L’environnement des animaux est optimisé par l’enrichissement et le maintien de conditions de logement favorisant le bien-être, avec un maximum de deux femelles par cage pour limiter les interactions agressives et le stress. Le personnel intervenant est formé pour effectuer toutes les manipulations rapidement et avec précaution, afin de minimiser l’inconfort et assurer un suivi constant du bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris a été choisie car il s’agit d’un modèle couramment utilisé, bien connu pour sa capacité à porter une gestation et à élever les petits dans de bonnes conditions. Son cycle reproducteur court et bien caractérisé permet d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. Les animaux utilisés dans ce projet sont des femelles adultes, âgées d’au moins 8 semaines, car elles sont sexuellement matures et capables de mener une gestation normale après le transfert d’embryons. Le recours à des femelles à ce stade de développement est indispensable pour assurer l’implantation des embryons, le bon déroulement de la gestation et la survie des petits, tout en limitant les risques pour la santé et le bien-être des animaux.