Souris
MODIFICATION Codage synaptique de l’entrée sensorielle dans le cortex insulaire postérieur (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses d'électrophysiologie ou d'anatomie, 1 942 souris vont être utilisées dans des travaux d'un niveau de souffrance modéré sur le cortex insulaire. Elles subissent une ou deux chirurgies crâniennes, l'implantation d'une fenêtre crânienne, une fixation de la tête répétée et un hébergement individuel de 21 jours, avec une injection de chlorure de lithium provoquant une nausée. Le projet vise à décrire comment ce territoire du cerveau traite le goût, le toucher, le son et la température, des connaissances que le porteur qualifie de 'très limitées'. Les bénéfices restent formulés comme l'espoir d'ouvrir 'la voie' à une meilleure compréhension, sans application annoncée à court terme.
Objectifs
L'objectif principal du projet est de déterminer les propriétés des circuits neuronaux du cortex insulaire postérieur (CIP) et les mécanismes par lesquels ces circuits traitent les informations sensorielles. En effet le cortex insulaire est impliqué dans une grande variété de fonctions, notamment l'interoception, les états émotionnels et, dans sa partie postérieure, le traitement sensoriel du goût, du toucher, du son et de la température. Nos connaissances sur les propriétés des circuits neuronaux du CIP et sur sa connectivité fonctionnelle dans des conditions physiologiques et pathologiques sont très limitées. Il a été postulé que la plasticité à court terme est un facteur clé dans le façonnement du traitement sensoriel, permettant par exemple de distinguer des stimuli de nature similaire. Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été testée directement. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire allant du traçage anatomique et fonctionnel in vitro à l'imagerie fonctionnelle in vivo et enfin nous évaluerons la pertinence de nos résultats avec des tests comportementaux spécifiques. Nous activerons ou inactiverons des voies spécifiques et testerons les conséquences sur la fonction des circuits et le traitement sensoriel. Nous modifierons, au niveau d'une synapse spécifique, la plasticité à court terme en éliminant ou en surexprimant des protéines clés impliquées dans la transmission synaptique et nous testerons les conséquences sur la fonction du circuit, le traitement sensoriel et le comportement.
Bénéfices attendus
Nous espérons identifier les principales projections sous-corticales vers le CIP et comprendre le circuit synaptique par lequel les informations sensorielles sont intégrées dans le CIP. Grâce à l'approche expérimentale impartiale conçue ici, nous espérons acquérir des notions fondamentales sur l'anatomie et la fonction du circuit sous-cortical-cortical impliqué dans le traitement sensoriel gustatif. Dans une perspective plus large, cela ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la physiologie du CI, une région proposée pour orchestrer les entrées sensorielles, cognitives et émotionnelles.
Procédures
- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30 et 60 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H. L'habituation à la fixation de la tête devrait durer entre 5 et 60 minutes par jour sur 2 à 5 jours. L'habituation à la stimulation sensorielle devrait durer de 2 à 5 jours. Les manipulations opto- ou chimiogénétiques des assemblages neuronaux sont réalisées sur un animal éveillé. L'ensemble de la procédure dure environ 1 à 2 heures. Du chlorure de lithium sera injecté une fois aux souris lors d'une procédure de test d'aversion gustative conditionnée, lequel durera au total 11 jours. MODIFICATION LES ANIMAUX SERONT MAINTENUS EN HEBERGEMENT INDIVIDUEL PENDANT 21 JOURS
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie stéréotaxique bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...). La fixation des souris par la tête peut générer une gêne qui sera minimisée par une habituation lente à l’aide de plusieurs sessions. En ce qui concerne la restriction hydrique, nous nous attendons à une perte de poids qui sera surveillé quotidiennement. L'injection de chlorure de lithium induit une nausée transitoire.
Devenir
Tous lea animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie.
Remplacement
La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le rôle des propriétés et des plasticités synaptiques dans le traitement sensoriel dans le CIP chez des animaux au comportement éveillé. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici.
Réduction
La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex de la souris présentent de nombreuses similitudes avec le néocortex d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. Comme la taille du cerveau varie entre 3 semaines et 6 mois, les coordonnées stéréotaxiques seront ajustées en conséquence. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.
Évaluation de l’effet in vivo de combinaisons de traitements agissant sur la multiplication des cellules du cancer du sang. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour tester des combinaisons de médicaments contre une leucémie aiguë myéloïde, 798 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 160 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont irradiées puis greffées avec des cellules cancéreuses de souris ou humaines, avec des prélèvements de sang hebdomadaires et des ponctions de moelle osseuse au fémur répétées jusqu'à trois fois. La maladie peut provoquer une forte perte de poids, une déshydratation et une hypothermie, les animaux étant mis à mort au cumul de plusieurs points limites ou au plus tard trois mois après le traitement. Le porteur situe deux étapes in vitro en amont mais affirme qu'une preuve d'efficacité chez la souris reste 'indispensable' avant l'essai clinique.
Objectifs
Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des cancers du sang de mauvais pronostic. De nouvelles options thérapeutiques sont donc nécessaires. Afin d’identifier de nouvelles combinaisons de médicaments limitant la multiplication de cellules leucémiques, nous avons procédé à une première étape in vitro (sans utilisation d’animaux) sur 3 types de cellules leucémiques différentes, ce qui nous a permis d’identifier plusieurs combinaisons de traitements intéressantes. La deuxième étape in vitro à partir d’échantillons de patients, nous a permis de confirmer l’effet combiné pour deux combinaisons innovantes. Parallèlement, le projet intègre une étude sur une nouvelle formulation d’un médicament qui est capable de détruire les cellules cancéreuses en utilisant le fer présent dans l’organisme. Notre projet a pour but de tester ces combinaisons et cette nouvelle formulation de médicament sur des modèles de souris afin de les valider et de pouvoir envisager leur utilisation dans des essais cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
Nos travaux pré-cliniques, qui évaluent la pertinence d’un traitement sur les cellules et dans des modèles de souris avant de le donner à l’homme, devraient permettre de mettre en évidence une nouvelle stratégie thérapeutique dans les LAM, grâce au développement d'une thérapie basée sur l’administration de deux médicaments en simultané et d’une nouvelle formulation d’un autre médicament . Ces nouveaux traitements ont pour ambition d'être à la fois efficaces et bien tolérés pour améliorer le pronostic des patients atteints de LAM.
Procédures
Dans un premier temps, pour déterminer la toxicité des traitements, il sera administré sur un premier lot d’animaux une molécule thérapeutique par injection au niveau de l’abdomen 1 fois tous les 2 jours pendant 14 jours. Un deuxième lot recevra une deuxième molécule par voie orale 2 fois par jour pendant cinq jours avec une pause de 3 jours, un troisième lot une troisième molécule au niveau de l’abdomen 1 fois par jour pendant 14 jours, un quatrième lot une combinaison de la première molécule combinée avec la deuxième et un cinquième lot une combinaison de la première molécule combinée avec la troisième molécule. En parallèle, pour l’étude de formulation d’un nouveau médicament, un groupe d’animaux (souris vigiles) recevront ce traitement par injection au niveau de l’abdomen et une autre groupe par voie orale 1 fois par jour à des temps déterminés ou 2 fois par jour pendant 4 jours à 8h d’intervalle. Pour suivre l’efficacité du médicament nous effectuerons un prélèvement de sang juste avant l'euthanasie sous anesthésie générale (durée: 2 min). Chaque injection dans l'abdomen dure 30s, l'administration par voie orale dure 1 min. Dans cette même étude, pour suivre la maladie, les souris malades bénéficieront d’un suivi par imagerie (caméra spéciale) sous anesthésie générale pour visualiser l’évolution de la maladie de manière non invasive (durée: 20 min). Dans un second temps, un groupe d’animaux vigiles sera irradié (2 min) au préalable pour favoriser une prise de greffe. 3 à 6h après, il sera injecté (souris vigile), au niveau de la veine de la queue, des cellules cancéreuses de souris (30s). Des prélèvements de sang d’une durée de quelques secondes seront réalisés une fois par semaine au niveau de la joue pour établir le développement de la maladie et à deux semaines un prélèvement de moelle osseuse au niveau du femur sur animal anesthésié (5min) renouvelé 2 semaines plus tard (3 fois maximum). Une fois la maladie établie, les traitements vus précédemment seront administrés. Et enfin, un autre groupe de souris sera soumis aux mêmes interventions que le groupe précédent en remplaçant les cellules cancéreuses de souris par des cellules cancéreuses humaines.
Impact sur les animaux
Le développement de la maladie peut entrainer une importante perte de poids, un changement de comportement, de mobilité, une déshydratation et/ou une hypothermie. L’administration orale d’un traitement peut entrainer une possible irritation du tube digestif. Les différents prélèvements et injections peuvent générer un stress et une éventuelle gêne temporaire surtout après le prélèvement de moëlle osseuse.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse et la rate afin de caractériser l’effet du traitement sur l’expansion des cellules cancéreuses. Dans le cas où le traitement testé améliore la survie des animaux, alors ceux-ci seront gardés en vie post-traitements et ils ne seront euthanasiés que lorsqu’ils présenteront plusieurs points limites cumulés ou au plus tard 3 mois après la fin du traitement.
Remplacement
Bien que certains modèles cellulaires manipulés in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de caractérisation de réponse aux traitements, ils ne sont pas suffisants car ils ne permettent pas de récapituler toutes les conditions pathologiques de croissance de la leucémie observée chez l’homme. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles pré-cliniques murins.
Réduction
Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établi grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subis par l'animal. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Une surveillance, une pesée et un suivi clinique quotidien des animaux à l’aide d’une grille d’observation permettront de déterminer des points limites précoces qui conduiront à un renforcement du suivi et/ou à l’euthanasie de l’animal
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à identifier le traitement qui sera le plus efficace et le plus adapté pour être transféré et testé en clinique chez l’homme. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’au moins 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.
Manipulations et utilisations d’animaux vertébrés à des fins d’enseignement
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 1280
Pour entraîner des étudiants et des professionnels aux gestes de l'expérimentation, 375 souris et 1 280 rats vont être utilisés dans des travaux pratiques d'un niveau de souffrance allant de léger à modéré. Une partie subit une chirurgie de plus d'une heure, des gavages et jusqu'à six injections, d'autres deux tests comportementaux sous l'effet d'un médicament psychoactif. Les animaux opérés ne sont pas réveillés quand des organes ont été prélevés ou l'intervention jugée trop délabrante, ceux soumis aux contraintes légères étant réutilisés ou adoptés. Le porteur présente le recours aux animaux non-humains comme 'une réalité de la recherche' à laquelle les futurs professionnels doivent être formés.
Objectifs
Le recours à l’animal est une réalité de la recherche : les personnes qui doivent expérimenter avec des animaux doivent être formées : licences professionnelles, master, formation continue… Dans le cadre de cette formation professionnelle, nous voulons qu’une part de cette formation soit faite de façon centralisée avec des bonnes pratiques, en complément du compagnonnage qui, utilisé exclusivement, cloisonne le savoir et fait perdurer localement les habitudes – bonnes ou mauvaises. En licence et master non professionnels, le confinement dû à la COVID19 a mis en évidence l’intérêt fondamental de l’enseignement présentiel en effectifs réduit. Dans les TD, « celui qui sait » formalise le concept à transmettre à l’apprenant qui reste passif. Les TP apportent une démarche active, la confrontation à la réalité et un aspect méthodologique ; ils sollicitent chez l’apprenant d’autres vecteurs que le son ou l’image. Nos TP comportent également, selon leur niveau, la sensibilisation aux règles d’éthique en expérimentation animale, au bien-être animal, aux conditions d’hébergement et de manipulation des animaux, aux choix des modèles, aux méthodes alternatives et à la rationalisation des groupes expérimentaux.
Bénéfices attendus
1) Pour les formations réglementaires initiales en expérimentation animales : les étudiants vont apprendre comment avoir confiance dans les animaux, à les observer dans leur comportement, les méthodes de contention les plus confortables pour les rongeurs, les techniques pour les injections, et les prises de sang de petits volumes. 2) Pour les formations à la chirurgie expérimentale, les étudiants vont apprendre les bases de la chirurgie, dont les sutures, l'aseptie en condition réelle, le suivi d'une opération et deux voies d'abord classiques. 3) Pour les licences professionelles, il s’agit de futurs techniciens en déjà titulaires d’un niveau applicateur d’expérimentation animale et d’un certificat de chirurgie expérimentale qui suivent une formation spécifique pour acquérir les compétences techniques de leur métier. 4) Les étudiants de master 2 sont un public international en 5e année de formation à la recherche dans les domaines de la biologie et de la santé et qui seront amenés, dans leur futur milieu professionnel, à concevoir, réaliser et superviser des recherches mettant en jeu des aspects liés à l’expérimentation animale. 5) Les étudiants de licence 3° années de biologie, durant les TP de Physiologie, appréhendent de façon concète la complexité du vivant et de son étude.
Procédures
TP Chirurgie : les rat ou souris auront une injection d'un antalgique puis une administration d'un anesthésique et une chirurgie qui peut durer plus d'une heure. TP" LPro télémétrie" : les rats subissent une contention inhabituelle de quelques minutes pour leur faire enfiler un gilet qui est non contraignant ensuite. TP "FC Contention et glycémie" : les rats subissent des contentions douces non contraignantes pendant 4 fois une heure, et un autre jour quatre gavages et 4 prises de sang de faible volume. TP "Manipulation et comportement de souris" : les souris subissent des contentions répétées de moins de 3 minutes minutes et au maximum 6 injections et 4 gavages, le tout réparti sur plusieurs jours. Ils participent aussi, un autre jour, à deux tests de comportement légers de quelques minutes sous l'effet d'un médicament psychoactif. Autres TP : les animaux auront une contention de moins d'une minute et une injection d'un antalgique puis une deuxième contention de moins d'une minute et une administration d'un anesthésique et ne seront pas réveillés.
Impact sur les animaux
TP Chir : les animaux ne seront réveillés que si l'opération s'est bien passée et ils seront désorientés pendant la période réveil, il peut rester une légère douleur malgré une double antalgie. TP" LPro télémétrie" : le gilet est peu contraignant. TP "FC Contention et glycémie" : les animaux peuvent être stressés par des contentions maladroites, ils peuvent souffrir pendant quelques minutes d'une injection mal faite après quoi les points limites seront appliqués (évènement possible mais rare). TP "FC Manipulation et comportement de souris" : les animaux subissent des contentions répétées de moins de 3 minutes et peuvent ressentir une légère douleur suite aux 6 injections et 4 gavages répartie sur plusieurs jours. Ils participent aussi, un autre jour, à deux tests de comportement légers de quelques minutes sous l'effet d'un médicament psychoactif. Les animaux peuvent être stressés par des contentions maladroites, ils peuvent souffrir pendant quelques minutes d'une injection mal faite (évènement possible mais rare). Tous les TP : les animaux pourraient commencer à se réveiller pendant une anesthésie (évènement théorique encore jamais observé, en raison d'observations intermédiaires de points limites et des mesures prévues).
Devenir
Tous les animaux impliqués dans des anesthésies sans réveil ne sont pas réveillés : soit des organes vitaux ont été prélevés pour des expériences ex vivo, soit l'intervention est délabrante et non compatible avec la survie. Pour les apprentissages de chirurgie les animaux ne sont réveillés que si l'opération s'est bien passée et pour 16h maximum car le risque d'une dégradation de leur état ensuite n'est pas nul. Les animaux qui subissent des contraintes légères de contention et d'injections sont gardés en vie et peuvent être réutilisés, ou adoptés.
Remplacement
Le recours à l’animal est une réalité de la recherche : les personnes qui doivent, dans leur démarche scientifique ou professionnelle, expérimenter avec des animaux doivent être formées : licences professionnelles, master, formations réglementaires. Dans le cadre de ces formations professionnelles, nous voulons qu’une part de cette formation soit faite de façon centralisée avec des bonnes pratiques, en complément du compagnonnage qui, utilisé exclusivement, cloisonnerait le savoir et ferait perdurer localement les habitudes – bonnes ou mauvaises. Les TP de chirurgie sont précédés de 4h de TP sur matériaux non vivants et sur des cadavres. L’usage de maquette ne nous permet pas d’amener les étudiants en filières professionnelles à un niveau de compétence suffisant en chirurgie. En licence et master non professionnels, le confinement dû à la COVID19 a mis en évidence l’intérêt fondamental de l’enseignement présentiel en effectifs réduits. Dans les cours et les TD, « celui qui sait » formalise le concept à transmettre à l’apprenant qui reste passif. Les TP apportent une démarche active, la confrontation à la réalité, un aspect méthodologique et sollicitent chez l’apprenant d’autres vecteurs que le son ou l’image. C’est pourquoi nous avons quelques TP en plus des habituels TD et cours.
Réduction
Les travaux pratiques sont très réduits en nombre durant les années de licence. 2 TP de physiologie en L3 pour des étudiants qui ont choisi la biologie comme horizon professionnel. Les TP ne sont plus nombreux que pour ceux qui se sont engagés dans un parcours professionnel impliquant l’usage des animaux : licence professionnelle ou formations réglementaires à l’expérimentation animale. Pour tous les TP sauf en filière professionnelle, n=1 et la répétabilité est abordée en comparant les résultats des différents apprenants. Nous favorisons au maximum l'utilisation d'animaux de réforme. La gestion de l'emploi du temps permet en plus de réutiliser la plupart des animaux qui ont eu des contraintes légères. S'il ne s'agit pas d’animaux de réformes dans les TP avec des contraintes légères, le nombre sera réduit de moitié, à 1 pour deux étudiants et non un pour un : moins d'animaux, manipulés par les deux groupes. Si ce sont des animaux de réformes, c’est le principe du raffiner qui sera appliqué.
Raffinement
Nous avons des points limites adaptés à chaque intervention ou manipulation. Au cours des TP, nous veillons à sensibiliser les étudiants et stagiaires aux effets du stress chez les animaux et à imposer l’ambiance de travail la plus calme possible. Plusieurs salles de travaux pratiques sont réquisitionnées lors des TP sur rongeurs vigiles afin de répartir animaux et stagiaires : cela évite que le stress d’un animal soit communiqué à l’ensemble de ses congénères. Les doses à injecter sont affinées en amont par une étude bibliographique, une seule dose est utilisée ce qui réduit le nombre d’animaux tout en permettant l’observation. Enfin, les drogues, les autres substances injectées et les tests comportementaux, ont été choisis pour être les plus bénins possibles tout en permettant d’observer le phénomène recherché. Les interventions se font sous anesthésie générale avec antalgie, maitrise de la température par tapis chauffant, réhydratation, et protection des yeux contre le dessèchement. Le réveil et le suivi post opératoire (de 16h maximum, soit jusqu'au lendemain matin) se font en cage individuelle, avec un élément de la cage d'origine comme enrichissement. La surveillance de signes cliniques, le taux d’encadrement, et l’application des points limites font qu’aucun animal ne peut se réveiller durant une anesthésie. Les effectifs d’animaux pour les TP avec des contraintes légères, permettent, lorsque nous avons des animaux de réformes, de diminuer par deux les contraintes subies par les animaux. Si ce ne sont pas des animaux de réforme, c’est le principe du réduire qui est appliqué. Certains de ces TP sont spécifiquement dédiés à l'enseignement des méthodes non invasives de mesures et des contentions les moins stressantes.
Choix des espèces
Des modèles mammifères sont nécessaires afin de pouvoir extrapoler à l’homme. Le rat et la souris sont les espèces de mammifères les plus fréquemment rencontrées dans la recherche fondamentale ou en R&D en industrie pharmaceutique, domaines futurs d’activité de nos étudiants en formation professionnelle. Nos autres TP de physiologie font appel au rat en raison de l’abondance littérature scientifique consacré à cette espèce. Les animaux achetés pour ces TP sont des jeunes adultes, pour des raisons de taille. Pour les animaux de réforme, sauf exceptions mentionnées dans le document complet, l’âge importe peu.
Modèle murin de consommation chronique d’alcool : Mise en place et étude d’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune hébergée seule jusqu'à dix-sept semaines pour mesurer sa consommation d'alcool. Rendues dépendantes, elles reçoivent des candidats médicaments par voie orale, intraveineuse ou intrapéritonéale, avec des prélèvements sanguins répétés puis, à la demande du client, une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le projet est présenté comme une prestation proposée à des laboratoires privés ou académiques, la finalité commerciale précédant l'apport scientifique. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun test ne rend compte du comportement sur un 'organisme vivant entier' et conclut au recours 'nécessaire' à la souris.
Objectifs
Selon l’OMS, le trouble lié à la consommation d'alcool touche environ 283 millions de personnes, à l’échelle mondiale. En France, il est estimé à 1.5 millions de personnes et environ 70 000 personnes meurent des conséquences directes ou indirectes de l’alcool. L’alcoolisme est donc un problème de santé majeur pour lequel aucun traitement satisfaisant n’existe actuellement. Le projet présenté ici a pour objectif de mettre en place un modèle murin de consommation d’alcool et d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments dans le cadre d’une prestation proposée à des laboratoires privés ou académiques. L’alcoolisme chronique, appelée alcoolodépendance, est le fait de présenter une addiction à l’alcool sous la forme d’une alcoolisation quotidienne et régulière tout au long de la journée pour maintenir un taux constant d’alcool dans le sang. Tout comme la drogue, la dépendance à l’alcool est définie comme le besoin d’en consommer pour maintenir un état auquel l’organisme s’est habitué. Cette dépendance s’installe souvent sur le long terme et de manière insidieuse. L’objectif de ce projet sera : 1) de mettre en place un test murin de consommation chronique d’alcool. 2) d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments, ayant déjà démontré leur pertinence sur la dépendance liée à la consommation d’alcool grâce à d’autres tests réalisés en amont de ce projet (in vitro, organoïdes ou autres). Actuellement, il existe plusieurs traitements de première intention, utilisables dès que possible après l'arrêt de la consommation d'alcool dans l'objectif de réduire l'appétence pour l'alcool et ainsi les risques de rechute. S’ils ont une efficacité démontrée, ils ont un effet d’une amplitude modérée et présentent de nombreux effets indésirables (nausées et/ou vomissements, céphalées, sédation ou insomnie, anxiété, nervosité...). Ce projet est donc pertinent pour le développement de nouveaux candidats médicaments pouvant améliorer la qualité de vie des personnes dépendantes de l’alcool.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mettre en évidence l’efficacité de potentiels nouveaux candidats médicaments dans un modèle murin d’alcoolisme. Les résultats obtenus, s’ils sont positifs, permettront la poursuite du développement de ces candidats médicaments dans la lutte contre l’alcoolisme.
Procédures
Chaque étude aura pour durée maximale 17 semaines. Des administrations seront réalisées sur animaux vigiles (1 à 2 minutes selon le type d’administration). La fréquence d'administration dépendra des caractéristiques pharmacologiques des candidats médicaments, au maximum 2 administrations par semaine pour la voie intraveineuse sur 9 semaines, 2 administrations par jours pour la voie orale sur 4 semaines ou 1 administration par jour pour les voies orales, intrapéritonéales, ou sous cutanées sur 9 semaines. Dans le cas d’une demande précise du donneur d’ordre, les animaux (à la fin de l’étude) peuvent être soumis à une perfusion intracardiaque (entre 5 et 20 min selon le débit de perfusion) sous anesthésie générale précédée d’une analgésie. Des prélèvements sanguins submandibulaires sur animaux vigiles (1 fois toutes les deux semaines maximum) ou intracardiaque sur animaux anesthésié (1 seule fois en fin d’étude) pourront être réalisés.
Impact sur les animaux
Les animaux sont stabulés individuellement dès leur arrivée dans nos locaux et jusqu’à la fin de l’étude soit au maximum 17 semaines. Ce mode d’hébergement est nécessaire à la mesure précise de la consommation individuelle d’alcool. La consommation d’alcool peut engendrer des signes comportementaux d'intoxication (non attendu dans le projet, les animaux ayant en permanence de l’eau à disposition). Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. Avant de réaliser des études dans le cadre de ce projet, nous nous assurerons auprès du demandeur que des études in vitro et/ou vivo auront été préalablement réalisées afin que les candidats médicaments soient administrés à des doses ne présentant pas de toxicité. Les futurs candidats médicaments peuvent avoir différents modes d’administration. Une administration (per os, sous-cutanée, intrapéritonéale) d’un candidat médicament entraîne une contention de l’animal qui peut induire un stress. Pour une administration Intraveineuse effectuée dans la veine caudale, les souris seront placées dans un tube de contention induisant un stress pour l'animal. Les animaux pourront être soumis à un prélèvement de sang submandibulaire réalisé sous anesthésie générale. Si le donneur d'ordre souhaite réaliser des études complémentaires sur les organes des animaux (ex : histologique), une perfusion intracardiaque sera réalisée sur des animaux anesthésiés et ayant reçu au préalable un analgésique.
Devenir
Afin d’effectuer des analyses complémentaires, l'ensemble des animaux sont soumis à la fin de l’expérience à des prélèvements sanguins ou d’organes.
Remplacement
L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier la consommation d’alcool. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, permettant de conclure de manière fiable. Etant donné la variabilité de la consommation d’alcool chez la souris, 12 animaux par groupe sont prévus afin d'assurer une analyse statistique pertinente. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.
Raffinement
Une attention particulière sera portée aux enrichissements du milieu pour réduire au maximum les effets de l’isolement. De plus, les animaux sont stabulés sur des portoirs conventionnels en cages transparentes, de cette façon les animaux peuvent voir les congénères des cages adjacentes et ne sont pas isolé olfactivement. Toutes les expériences seront réalisées après une période d’acclimatation de 14 jours. Une observation quotidienne sur des caractéristiques spécifiques (physiologie clinique, aspect général, comportement...) sera effectuée durant la période d’expérimentation par du personnel formé au soin. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs critères prédéterminés (repérés le plus précocement possible grâce à l'observation et à l'appui d'une grille du bien-être animal) sera mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est largement utilisée pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer de façon fiable les doses administrables à l'homme dans le cadre d’essais cliniques ultérieurs. Le choix de la souris C57bl/6 a été fait suite à une étude bibliographique approfondie qui démontre que cette lignée de souris à une appétence naturelle pour l’alcool. Elles consomment spontanément l’alcool qui leur est proposé contrairement à d’autres lignées (comme DBA/2 ou BALB/C) qui le rejettent. Cette préférence stable permet de modéliser la consommation volontaire, un aspect essentiel pour reproduire le comportement humain vis-à-vis de l’alcool. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux âgés de plus de 3 semaines et de 24 mois maximum. Les modèles sont susceptibles d’être utilisés pour l’étude de produits potentiellement actifs chez le jeune, l’adulte ou la personne âgée.
Impacts d’une exposition chronique périnatale à deux additifs alimentaires inorganiques riches en aluminium sur les fonctions intestinales, immunitaires, métabolique chez la souris de la vie in utéro à l’âge adulte.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
3 504 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées à l'aluminium dès la gestation à travers leur mère, elles subissent des gavages, des prises de sang et, pour une partie, une colite provoquée par un produit chimique entraînant diarrhées sanglantes et perte de poids. Le projet évalue l'effet d'additifs alimentaires sur l'intestin et le risque de maladies chroniques. Le porteur annonce une fourchette large, de 1 200 à 3 504 animaux, sans préciser ce qui fixe le nombre réellement utilisé.
Objectifs
Les études montrent que l’aluminium (Al) peut être neurotoxique et immunotoxique. L’alimentation constitue la principale source d’exposition : si les denrées brutes contiennent de l’Al d’origine naturelle, les aliments ultra‑transformés en apportent les plus fortes quantités via des additifs renfermant de l’Al comme composé principal ou impureté. L’autorité européenne de sécurité des aliments estime que les consommateurs les plus exposés à ces additifs dépassent la dose hebdomadaire tolérable de 1 mg d’Al/kg pc/semaine, tout en soulignant le manque de données toxicologiques spécifiques pour l’Al qu’ils contiennent, notamment en cas d’expositions précoces susceptibles d’engendrer des effets à long terme. Des particules d’Al ont été observées dans le placenta humain et le méconium, démontrant une exposition dès la vie fœtale. Après ingestion, l’Al s’accumule dans divers organes, dont le foie, acteur clé du métabolisme. Au niveau intestinal, des particules d’Al ont été détecté dans la barrière intestinale. Celle‑ci, constituée de l’épithélium, du microbiote et du système immunitaire intestinal, dépend de l’équilibre entre ces trois composantes pour maintenir l’homéostasie. Toute altération d’un de ces acteurs est associée au développement de maladies chroniques, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin et le diabète de type 2. Compte tenu de l’immunotoxicité de l’Al, nous posons l’hypothèse qu’une exposition dès la gestation à des additifs riches en Al pourrait perturber la barrière intestinale et favoriser l’émergence de ces pathologies. Ce projet vise à explorer chez la souris exposée dès la gestation à deux additifs riches en Al, i) la biodistribution de l’Al et ii) les impacts sur les fonctions métaboliques et intestinales des descendants. Des femelles seront exposées à ces additifs via l’alimentation pendant la gestation et la lactation. Après le sevrage, une partie des descendants poursuivra le même régime jusqu’à l’âge adulte afin d’analyser l’impact sur le métabolisme, la barrière intestinale et la susceptibilité à la colite.
Bénéfices attendus
Ce projet chez la souris nous permettra d’approfondir nos connaissances sur l’impact d’une exposition orale chronique à deux additifs contenant de l’Al sur la barrière intestinale et ses conséquences sur le développement de maladies chroniques comme les maladies inflammatoires chronique de l’intestin et le diabète de type 2. Les données obtenues dans ce projet réalisé à des doses d’exposition humaine permettront également d’aider les agences de sécurité alimentaire et les responsables des politiques publiques à formuler des recommandations sur les limites de teneur en Al des additifs alimentaires pour une utilisation sans danger pour la femme enceinte, le nouveau-né, l’enfant et l’adulte.
Procédures
Dans le cadre des mesures d'intolérance au glucose et de la perméabilité intestinale, les animaux recevront une administration orale de glucose ou d'un marqueur de perméabilité intestinale (geste rapide d'environ 15 secondes) et des prélèvements sanguins seront également réalisés au niveau de la queue, après application d'une crème anesthésiante locale (10 secondes/prélèvement). Des prélèvements de fèces seront aussi effectués deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans sciure pour permettre de récolter les fèces. Dans le modèle de colite, la dilution à 2% d'un composé chimique pendant 7 jours permettra d'induire progressivement une inflammation intestinale.
Impact sur les animaux
La réalisation des mesures d'intolérance au glucose ou de mesure de perméabilité seront génératrices d'inconfort notamment lié à la mise à jeun des animaux ainsi qu’à l'administration orale par gavage avec un risque possible de fausse route. L’administration de glucose entrainera une hyperglycémie transitoire nécessaire pour évaluer la tolérance au glucose des animaux. Les prélèvements de sang engendreront un stress lié à la contention et la piqure. Une fois les mesures terminées, une légère inflammation des tissus de la zone prélevée pourra se mettre en place. Enfin la procédure visant à provoquer une inflammation intestinale, entrainera une perte de poids plus importante que dans les autres procédures ainsi que des troubles intestinaux, avec apparition de selles molles ou de diarrhée, avec ou non présence de sang. Dans l’ensemble des procédures, les animaux seront exposés à des doses d’additifs correspondant aux niveaux d’exposition humaine pour lesquels aucun effet clinique n’a été rapporté à ce jour. Dans un contexte d’inflammation intestinale, les propriétés immunotoxiques et adjuvantes de l’aluminium laissent supposer que l’exposition aux additifs riches en Al pourrait aggraver la colite avec une perte de poids et une diarrhée plus importante. Enfin le prélèvement de fèces pourra générer un stress lié à l’isolement.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort et des prélèvements seront effectués post mortem pour des analyses biochimiques, histologiques et de biologie moléculaire pour évaluer l’impact d’une exposition orale chronique à deux additifs contenant de l’Al sur la barrière intestinale et ses conséquences sur le développement de maladies chroniques comme les maladies inflammatoires chronique de l’intestin, le diabète.
Remplacement
Les impacts directs des additifs alimentaires riches en aluminium sur l’épithélium intestinal, le microbiote et les cellules immunitaire peuvent être évalués par des approches in vitro ou ex-vivo à l’aide respectivement d’organoïdes intestinaux, de lignées cellulaires immunitaires ou de digesteurs artificiels. Ces approches sont actuellement mises en place pour ce projet et nous permettra d’obtenir des informations sur l’expression des gènes impliqués dans les fonctions de la barrières intestinales ou encore sur la composition et l’activité du microbiote. Toutefois elles ne permettent pas aujourd'hui de reproduire les échanges entre la mère et le fœtus ou la complexité des dialogues microbiote-intestin-foie-système immunitaire, ni même d’évaluer la distribution des particules d’Aluminium dans l’organisme.
Réduction
Nous avons conçu nos expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé à l’aide de test statistiques adapté. Sur l’ensemble du projet, au minimum 1200 animaux et au maximum 3504 animaux seront nécessaires.
Raffinement
Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue une heure avant les prélèvements sanguin comme préconisé par le fabricant. Lors du modèle d’inflammation intestinale une grille d'évaluation sera utilisée pour évaluer le degré de l’inflammation avec des points limites spécifiques appliqués. L’accès à l’alimentation et l’eau sera facilité en disposant un aliment hydraté dans une boite de petri directement sur la sciure de la cage. Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance, il sera retiré de l'étude et des soins adaptés pratiqués. Le cas échéant une euthanasie sera pratiquée par le responsable du projet sur les conseils du vétérinaire référent.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote, l’intestin, le foie. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte afin qu'elles soient capables de procréer et les descendants seront utilisés avant la mise bas (fœtus), au sevrage ou à l’âge de 5 mois selon les procédures. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition périnatale ou à long terme sur les fonctions intestinales et métaboliques en prenant en compte un potentiel effet sexe.
Mistime :conséquences métaboliques et cognitives d’une désynchronisation des rythmes métaboliques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Nourries huit semaines d'un régime gras et sucré à des horaires décalés, elles passent des tests métaboliques et cognitifs, avec un prélèvement de sang derrière l'œil sous anesthésie locale. Le projet veut montrer qu'un désalignement des rythmes jour-nuit dérègle le métabolisme et la mémoire. Cette "preuve de concept" reste annoncée au conditionnel, quand les prélèvements et le régime imposé sont, eux, bien réels.
Objectifs
Les mammifères présentent un rythme circadien de 24 heures, permettant de synchroniser les fonctions biologiques aux variations environnementales, notamment l’alternance jour/nuit. Cette synchronisation repose sur l’interaction entre l’horloge centrale et les horloges périphériques, et est principalement régulée par la lumière. La régulation du métabolisme est fortement dépendante de cette coordination pour maintenir l’homéostasie énergétique. Cependant, la pollution lumineuse et/ou des rythmes alimentaires irréguliers peuvent perturber cette synchronisation, induisant un désalignement entre horloges centrale et périphériques. La lumière artificielle nocturne inhibe la sécrétion de mélatonine, perturbant le rythme veille/sommeil et les horloges métaboliques (foie, muscles). Ces désynchronisations augmentent le risque de troubles métaboliques, surtout lorsqu’elles sont combinées à une prise alimentaire durant la phase de repos. L’axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien (HHT), régulateur des hormones thyroïdiennes (HT), joue un rôle central dans le fonctionnement du cerveau, le métabolisme et les rythmes circadiens. Les HT influencent la neurogenèse, le métabolisme énergétique et interagissent avec les horloges biologiques. Leur production est essentielle pour maintenir la rythmicité des horloges métaboliques. Des dérèglements métaboliques peuvent entraîner une inflammation chronique favorisant la neuroinflammation. Celle-ci altère la plasticité neuronale, affecte les fonctions cognitives et augmente le risque de neurodégénérescence. La flexibilité métabolique apparaît comme un facteur clé de prévention des déséquilibres métaboliques. Elle dépend des horloges circadiennes, qui optimisent les processus métaboliques selon le cycle jour/nuit. La flexibilité métabolique pourrait être améliorée en synchronisant la prise alimentaire avec le rythme circadien naturel d’utilisation des nutriments. Ainsi, des approches comme le Time-Restricted Feeding (TRF), ou alimentation à horaires restreints, limitant la prise alimentaire à certaines plages horaires, ont montré des effets bénéfiques sur la régulation métabolique, bien que les mécanismes impliqués restent à élucider. Grâce au TRF, nous étudierons à l’aide d’une souche de souris sensible à l’obésité induite, les effets métaboliques, neuroinflammatoires et cognitifs d’une désynchronisation, ainsi que le potentiel de la resynchronisation alimentaire avec le cycle jour/nuit à restaurer l’équilibre métabolique et cognitif.
Bénéfices attendus
Notre projet pourrait apporter la preuve de concept des effets néfastes des perturbations circadiennes sur la régulation du métabolisme et de leurs conséquences sur la cognition. La désynchronisation devrait exacerber les perturbations métaboliques et promouvoir la prise de poids et une augmentation de la neuroinflammation, associée à une diminution de la neurogenèse, pouvant conduire à des altérations cognitives. Toutefois, ces effets devraient être réversibles grâce à la resynchronisation. Ces résultats devraient appuyer l’hypothèse selon laquelle les désalignements circadiens affectent à la fois le métabolisme et la santé cérébrale, augmentant les risques de vieillissement précoce et de neurodégénérescence.
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu’à une seule procédure, qui sera constituée de 4 actes : - alimentation riche en gras et en sucre (45 % des calories apportées par la graisse et 17% des calories apportées par du sucrose) restreinte dans le temps (soit à volonté, soit durant le jour, soit durant la nuit) pendant 8 semaines - caractérisation métabolique : prise de poids hebdomadaire, test de tolérance au glucose avec mesure de la glycémie après gavage à partir d'une goutte de sang prise à la queue+prise de sang pour dosages hormonaux, mesure de composition corporelle par bioimpédance, mesure de la production de chaleur par caméra thermique - évaluation de capacités cognitives avec différents tests de comportements - prélèvement sanguin avant euthanasie
Impact sur les animaux
Les animaux ne devraient pas subir d’effets indésirables majeurs, le régime HFHS étant équivalent à une nourriture occidentale. On attend une prise de poids variable entre les individus, mais qui selon notre expérience ne devrait pas dépasser un gain de poids supérieur à 7% par rapport au poids initial.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de procéder aux prélèvements des différents tissus nécessaires à nos analyses.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer le recours aux animaux car les études physiologiques portant sur des influences métaboliques ne peuvent être réalisées que chez des animaux vivants, dans un système intégré. Par conséquent, l’impact du régime HFHS et de la synchronisation/désynchronisation de la prise alimentaire avec le cycle circadien de l’animal sur ses capacités cognitives ne sera observable qu’en réalisant des tests de mémoire sur animaux vivants. De même, nous ne pouvons pas mimer la flexibilité métabolique in vitro ou ex vivo, il est donc nécessaire d’utiliser l’animal entier.
Réduction
Dix animaux par groupe seront utilisés (6 pour les prélèvements de tissus et 4 pour les analyses immunohistochimiques), un nombre estimé à partir de nos expériences passées avec ce type d’analyses et qui est le minimum pour garantir une exploitation et une puissance statistique des résultats obtenus. Un nombre d'animaux plus faible serait dommageable dans l'exploitation de nos données et contribuerait à utiliser des animaux inutilement. Ainsi, nous évaluons le nombre d’animaux à 30 souris pour ce projet. Pour ne pas perdre en puissance statistique, l’analyse des résultats obtenus sera effectuée à l’aide d’un test non paramétrique avec permutation qui utilise une méthode de calcul exact avec une estimation par Monte Carlo
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (gel lidocaïne (gel ophtalmique à 2 %) pour anesthésie locale pendant la prise de sang en rétro-orbital). Les animaux disposent de nourriture selon le rythme décrit (mais leur permettant d’avoir l’apport calorique nécessaire sur 24h) et de l’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de nid en plastique. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de celles-ci grâce à une surveillance attentive (points limites, énoncés ci-après) et des soins adaptés. Même si nous n’attendons pas d’effets délétères marqués suite à notre procédure qui est légère, les indicateurs habituels comme la prostration, détectée par les animaliers ou par l’expérimentateur, l’absence d’alimentation (la diminution des quantités de nourriture disponible entre deux nourrissages est vérifiée par pesée), des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, grattement, léchage) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, agitation anormale ou hyperréactivité) seront particulièrement suivis. Dans le cas où un ou plusieurs des symptômes cités varient de manière significative, l’animal sera dans un premier temps sorti de la procédure, et/ou euthanasié dans les cas les plus extrêmes. Une bonne maîtrise de la procédure et un suivi assidu des groupes expérimentaux doit prémunir de la survenue d’incidents de ce type. Tout signe d'atteinte du système nerveux central (inclinaison de la tête, spasmes, convulsions, troubles de l'équilibre) entraînera systématiquement le retrait de l'animal de la procédure et son euthanasie.
Choix des espèces
Le modèle biologique choisi est la souris. Les connaissances accumulées par la communauté scientifique sur les souris, et particulièrement sur les C57Bl6/J dans les modèles d’obésité, ont permis d’identifier de nombreux mécanismes physiologiques impliqués dans le maintien de la balance énergétique et de valider des tests comportementaux permettant de mesurer les capacités mnésiques des souris. Tous les protocoles utilisés dans ce projet de recherche ont été optimisés et validés pour la souris, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. Nous utiliserons des animaux adultes (âgés de plus de 8 semaines au début de l’expérience), afin que les résultats ne soient pas faussés par la prise de poids induite par la croissance des animaux s’ils sont trop jeunes.
Évaluation de l’efficacité thérapeutique de différentes stratégies de thérapie génique dans le modèle murin de la maladie de Pelizaeus Merzbacher.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Génétiquement modifiées pour reproduire une maladie de la myéline, une partie des 376 souris développe tremblements, troubles moteurs puis convulsions et meurt vers l'âge de trois mois. Elles vont être utilisées dans des procédures allant jusqu'à un niveau de souffrance sévère pour 96 d'entre elles, toutes tuées à l'issue. Après une injection de thérapie génique sous anesthésie, elles passent des tests moteurs et une IRM de deux heures. Le porteur définit des points limites, mais garde une partie des animaux au-delà de deux mois pour suivre la survie, jusqu'à l'aggravation de la maladie.
Objectifs
La maladie de Pelizaeus Merzbacher est un défaut héréditaire de formation de la myéline (membrane isolante permettant le transport du message nerveux dans les neurones) du système nerveux central. Cette maladie se caractérise chez les patients de sexe masculin par une altération précoce du développement psychomoteur (inférieur à 6 mois de vie). Au cours des premières années de myélinisation active, le manque de force musculaire est associé à des signes neurologiques progressivement modifiés par la maturation du système nerveux. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement pour cette pathologie. L’objectif de ce projet sera de tester sur un modèle animal de la pathologie (souris génétiquement modifiées) différentes stratégies thérapeutiques basées sur une approche de thérapie génique.
Bénéfices attendus
La maladie de Pelizaeus-Merzbacher est une maladie génétique rare de la famille des leucodystrophies. Sa fréquence est de 1 pour 100 000 naissances. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour cette pathologie. Ce projet pourrait permettre d’établir la preuve de concept de l’efficacité d’une des approches de thérapie génique proposées, de valider la dose optimale pour un traitement afin de mener un projet de plus grande envergure à plus long terme. Ainsi ce projet pourrait contribuer à proposer un essai thérapeutique chez les enfants souffrant de la maladie de Pelizaeus Merzbacher et pouvoir ainsi proposer un traitement chez l’Homme.
Procédures
Sur un total de 376 animaux, 312 animaux recevront une injection sous anesthésie générale (durée 5 min au total, une fois) et 64 serviront de contrôles non injectés Une partie d’entre eux (280) participera ensuite à 3 tests comportementaux afin d’évaluer les déficits locomoteurs. 2 sessions de tests seront réalisées (à 1 mois puis 2 mois) et pour chaque session les tests seront répartis sur 3 jours. Nous aurons un jour avec un test évaluant la motricité (3 essais, 4 minutes maximum par essai), puis un jour avec un test évaluant la mobilité générale (2 minutes par test, 1 essai) et enfin un jour avec un test d’évaluation de la force musculaire (2 minutes par test environ, 1 essai). Une partie de ces animaux aura ensuite un examen d’imagerie par résonance magnétique sous anesthésie générale (une fois, 2h maximum). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les prélèvements d’intérêt.
Impact sur les animaux
La lignée de souris génétiquement modifiée utilisée dans le projet présentera un phénotype dommageable chez certains animaux se traduisant par l’apparition de tremblements dès 12 jours, de troubles moteurs dès 4-5 semaines et des crises de convulsion à partir de 2 mois entrainant leur décès vers l’âge de 3 mois. Les troubles moteurs pourront engendrer un stress et de potentielles pertes de poids pour l’animal. Les anesthésies générales réalisées pour administrer la thérapie génique et pour l’imagerie par résonance magnétique pourront engendrer des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de difficultés cardiaque et respiratoire. L’injection de la thérapie génique sera associée à des risques d’inconfort au niveau de la zone d’injection, de saignement après injection et un risque rare de lésion oculaire. Les tests comportementaux pourront générer un stress en lien avec le changement d’environnement et le test en lui-même.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont réalisés post-mortem pour pouvoir répondre à notre objectif scientifique
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes et marqueurs moléculaires associés à la maladie de Pelizaeus Merzbacher. Nous avons donc besoin de modèles animaux vivants permettant de reproduire la maladie pour l’étudier et surtout pour évaluer l’effet bénéfique d’approches thérapeutiques telles que la thérapie génique. Un modèle animal de choix existe déjà pour étudier cette maladie, il s’agit d’une lignée de souris génétiquement modifiée qui reproduit avec une bonne fiabilité la majorité des symptômes décrits chez les patients.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire. De ce fait un nombre de 20 à 24 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de prendre en compte la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 376 souris sera nécessaire pour ce projet. De plus nous réaliserons ce projet par étape nous permettant de n’utiliser que le nombre strictement nécessaire d’animaux, notamment si la première étape ne permet pas d’obtenir des résultats concluants les étapes suivantes en seront pas initiées. L’ensemble des résultats sera analysé à l’aide des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’eau et de croquettes à volonté, ainsi que d’un enrichissement de leur environnement composé à minima d’un carré de coton pour nidifier et d’un bâtonnet de bois à ronger. Ils seront observés quotidiennement. En cas d’anomalie celle-ci sera transmise à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à notre équipe afin de mettre en place une prise en charge rapide et adaptée pour l‘animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. Une partie des animaux utilisés dans le projet présentera un phénotype dommageable, pour sa prise en charge nous faciliterons leur accès à la nourriture dès le sevrage en leur mettant à disposition des croquettes directement en fond de cage voir de l’eau gélifiée en supplément si nécessaire. Tous les animaux seront pesés à minima une fois par semaine, puis 2 fois par semaine pour ceux conservés au-delà de 2 mois. A partir de cet âge de 2 mois un suivi quotidien pour chaque animal avec un test de retournement permettra de valider son autonomie à pouvoir se déplacer et s’alimenter. L’administration de la thérapie génique et l’imagerie par résonance magnétique seront réalisées sous anesthésie générale afin de réduire le stress et bénéficier d’une bonne immobilité de l’animal. Nous prendrons en charge les risques associés à ces anesthésies en maintenant la température des animaux tout au long de leur anesthésie (chambres d’induction et de réveil chauffées, tapis chauffant), en appliquant un gel oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire ou inconfort post-injection de la thérapie (appliqué après l’administration de la thérapie), et en surveillant visuellement la profondeur de l’anesthésie pour adapter si nécessaire le pourcentage d’anesthésique à chaque animal. Pour les tests comportementaux les animaux bénéficieront d’une période d’habituation de 30 minutes à la pièce d’expérimentation avant chaque test. Les tests seront répartis sur 3 jours afin de laisser un temps de repos aux animaux entre chaque test. Pour le tests nécessitant 3 essais les animaux bénéficieront d’une période de repos de 30 minutes entre chaque essai.
Choix des espèces
La souris est une espèce largement utilisée pour modéliser les pathologies humaines. Son génome est bien connu et des outils sont disponibles pour le modifier. Ainsi, une lignée de souris génétiquement modifiées existe déjà pour modéliser la maladie de Pelizaeus Merzbacher. Celle-ci permet de reproduire la majorité des symptômes rencontrés chez les patients et nous permettra donc d’évaluer l’efficacité thérapeutique de notre stratégie de thérapie génique. Les souris seront utilisées juste après leur sevrage et analysées jusqu’à l’âge de 2 mois pour la majorité avant l’apparition des symptômes invalidants. Seul un groupe de souris permettant d’apprécier la survie sur le meilleur de nos traitements sera gardé au-delà de l’âge des 2 mois avec suivi attentif. Le choix de l’âge d’injection est justifié du fait de la présence des premiers signes de la maladie sans pour autant que celle-ci soit trop avancée. Le choix de l’âge de l’euthanasie à deux mois permet d’une part de pouvoir voire un effet moléculaire optimal de la thérapie génique administrée mais également de constater ces effets avant la progression de la maladie. En effet prélever les animaux en fin de vie, quel que soit leur âge ne nous montrerait que l’état final de l’animal avant la mort lié à la progression de la maladie, c’est-à-dire que tous les animaux en fin de vie devraient avoir les mêmes caractéristiques finales.
MOFDIFICATION Codage synaptique de l’entrée sensorielle dans le cortex insulaire postérieur (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une injection de chlorure de lithium qui provoque une nausée, une fenêtre ouverte dans le crâne et jusqu'à vingt et un jours en cage individuelle : 1 942 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent aussi une injection de virus dans le cerveau, une fixation de la tête et une restriction d'eau pour les motiver à une tâche gustative. Le projet étudie comment une région du cortex traite les informations sensorielles du goût. Toutes sont tuées pour des analyses d'électrophysiologie ou d'anatomie.
Objectifs
L'objectif principal du projet est de déterminer les propriétés des circuits neuronaux du cortex insulaire postérieur (CIP) et les mécanismes par lesquels ces circuits traitent les informations sensorielles. En effet le cortex insulaire est impliqué dans une grande variété de fonctions, notamment l'interoception, les états émotionnels et, dans sa partie postérieure, le traitement sensoriel du goût, du toucher, du son et de la température. Nos connaissances sur les propriétés des circuits neuronaux du CIP et sur sa connectivité fonctionnelle dans des conditions physiologiques et pathologiques sont très limitées. Il a été postulé que la plasticité à court terme est un facteur clé dans le façonnement du traitement sensoriel, permettant par exemple de distinguer des stimuli de nature similaire. Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été testée directement. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire allant du traçage anatomique et fonctionnel in vitro à l'imagerie fonctionnelle in vivo et enfin nous évaluerons la pertinence de nos résultats avec des tests comportementaux spécifiques. Nous activerons ou inactiverons des voies spécifiques et testerons les conséquences sur la fonction des circuits et le traitement sensoriel. Nous modifierons, au niveau d'une synapse spécifique, la plasticité à court terme en éliminant ou en surexprimant des protéines clés impliquées dans la transmission synaptique et nous testerons les conséquences sur la fonction du circuit, le traitement sensoriel et le comportement.
Bénéfices attendus
Nous espérons identifier les principales projections sous-corticales vers le CIP et comprendre le circuit synaptique par lequel les informations sensorielles sont intégrées dans le CIP. Grâce à l'approche expérimentale impartiale conçue ici, nous espérons acquérir des notions fondamentales sur l'anatomie et la fonction du circuit sous-cortical-cortical impliqué dans le traitement sensoriel gustatif. Dans une perspective plus large, cela ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la physiologie du CI, une région proposée pour orchestrer les entrées sensorielles, cognitives et émotionnelles.
Procédures
- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30 et 60 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H - L'habituation à la fixation de la tête devrait durer entre 5 et 60 minutes par jour sur 2 à 5 jours. L'habituation à la stimulation sensorielle devrait durer de 2 à 5 jours. Les manipulations opto- ou chimiogénétiques des assemblages neuronaux sont réalisées sur un animal éveillé. L'ensemble de la procédure dure environ 1 à 2 heures. Du chlorure de lithium sera injecté une fois aux souris lors d'une procédure de test d'aversion gustative conditionnée, lequel durera au total 11 jours. MODIFICATION LES ANIMAUX SERONT MAINTENUS EN HEBERGEMENT INDIVIDUEL PENDANT 21 JOURS MAXIMUM
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...). La fixation des souris par la tête peut générer une gêne qui sera minimisée par une habituation lente à l’aide de plusieurs sessions. En ce qui concerne la restriction hydrique, nous nous attendons à une perte de poids qui sera surveillé quotidiennement L'injection de chlorure de lithium induit une nausée transitoire.
Devenir
Tous lea animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie.
Remplacement
La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le rôle des propriétés et des plasticités synaptiques dans le traitement sensoriel dans le CIP chez des animaux au comportement éveillé. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici.
Réduction
La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex de la souris présentent de nombreuses similitudes avec le néocortex d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. Comme la taille du cerveau varie entre 3 semaines et 6 mois, les coordonnées stéréotaxiques seront ajustées en conséquence.Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.
Etude de l’efficacité de 5 formulations administrées par voie sous-cutanée chez la souris obèse et diabétique
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rendues obèses et diabétiques, 63 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit onze à treize injections sous-cutanées et une dizaine de prélèvements de sang à la queue, l'étude étant limitée aux mâles pour ne pas doubler les effectifs. Elle est menée en prestation contractuelle pour un industriel qui teste cinq formulations à libération prolongée d'un médicament. Le bénéfice avancé, une injection mensuelle plus confortable pour de futurs patients, reste conditionné à un passage en clinique encore lointain.
Objectifs
En 2021, 537 millions de personnes dans le monde étaient touchées par le diabète de type 2 tandis que 800 millions d’adultes souffraient d’obésité. Ces chiffres alarmants concernent deux “maladies du siècle” qui dépendent de plusieurs facteurs génétiques, environnementaux ou alimentaires. Cette prévalence inquiétante s'accompagne en outre d'une mortalité importante: on attribut directement à l'obésité et au diabète de type 2 associé environ 3,5 millions de décès par an au niveau mondial. Face ce contexte, l'armada thérapeutique s'avère particulièrement pauvre, et s'accompagne de posologies contraignantes et d'effets secondaires non négligeables. Récemment, des médicaments ciblant les récepteurs du GLP-1 ont été autorisés sur le marché afin de traiter à la fois l'obésité et le diabète de type 2. Néanmoins, bien que très efficaces, ces traitements s'administrent par voie sous-cutanée et des recherches actives sont en cours afin d'améliorer la posologie et de réduire la fréquence d'administration de ces traitements. L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre d’une prestation contractuelle pour le compte d’un industriel pharmaceutique qui développe des composés thérapeutiques dans le domaine des troubles métaboliques. Cet industriel a notamment développé une nouvelle forme de galénique (matrice sous-cutanée) permettant une libération lente et prolongée du médicament X. Des études précédentes ont montré que cette galénique améliore largement la biodisponibilité du médicament X sur le long terme et diminue largement les effets de pics plasmatiques. Elle aurait ainsi l'avantage de permettre une réduction drastique des prises pour le patient (une administration par mois) améliorant ainsi largement son confort de vie. La matrice à libération prolongée de notre client a été testée in sillico et in vitro et sa bonne tolérance locale au niveau sous-cutané a également été démontrée. Au total, 5 formulations différentes à libération prolongée du médicament X ont été développées et l'objectif du présent projet vise ainsi à démontrer que, sous ces nouvelles formes galéniques, le médicament X conserve son efficacité. La procédure du présent projet se limitera ainsi à une administration des formulations à libération prolongée du médicament X et du médicament X sous sa galénique initiale suivies de pesées de poids corporel et de dosage glycémique.
Bénéfices attendus
Si les résultats obtenus sont positifs, les formulations du médicament X pourront entrer en phase d'étude clinique et être ensuite autorisé à être mis sur le marché en tant que traitements anti-obésité et antidiabétiques, et dont la posologie serait bien moins contraignante pour les patients traités que le médicament actuel. Par ailleurs, un meilleur contrôle de la biodistribution du médicament X du fait de sa libération prolongée pourrait également améliorer l'efficacité des traitements actuels.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (19 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Injection des traitements (11 ou 13 administrations selon le groupe d'animaux; durée : 1 minute); 3) Prélèvements d'une goutte de sang pour mesure de la glycémie (10 prélèvements; durée du prélèvement : 1 minute).
Impact sur les animaux
L'hébergement en cage individuelle sera source de stress du fait d'un isolement partiel des animaux qui garderont néanmoins des contacts visuels et olfactifs. Les mesures de poids corporel, les administrations des traitements et les prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les prélèvements de sang en bout de queue occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
Un prélèvement sanguin sera prévu pour des analyses ultérieures après mis à mort de l'ensemble des animaux .
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la glycémie dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques)
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 9 animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au sexe mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les mesures glycémiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux sexes. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux sexes.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages de glycémie (un seule goutte de sang prélèvée en bout de queue). Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
Le modèle de souris obèses nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques.
Formation aux injections ciblées dans le cerveau chez le rat et la souris
- Formation professionnelle
Rats : 320
Non pour produire des connaissances mais pour former des expérimentateurs à la chirurgie du cerveau, 320 souris et 320 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une opération stéréotaxique d'environ 45 minutes puis des injections, réalisées par les stagiaires sous supervision. Le porteur affirme que vidéos et animaux artificiels ne remplacent pas l'entraînement sur un animal vivant anesthésié. Les animaux formés sont tués pour vérifier la qualité du geste sur leur cerveau, les surnuméraires étant réutilisés pour d'autres enseignements ou projets.
Objectifs
La technique d’injection dans le cerveau (ou chirurgie stéréotaxique) faisant l’objet de ce projet de formation est une technique utilisée en médecine humaine. Elle est employée dans un cadre thérapeutique pour soigner des zones du cerveau en les stimulant ou en injectant des molécules thérapeutiques. Dans les laboratoires de recherche en neurobiologie, cette technique est également utilisée pour comprendre comment fonctionnent les cellules du cerveau et comprendre avec quelles autres cellules elles communiquent. Des cartographies du cerveau qu’on appelle atlas ont été établies pour permettre aux expérimentateurs de cibler très précisément les différentes zones du cerveau. Mais l’utilisation de ces atlas et la réalisation de la technique demande une formation spécifique . Cette formation donnée par des expérimentateurs chevronnés permettra au stagiaire de mener à bien une chirurgie stéréotaxique sur la souris ou le rat. Cette formation s’adresse aux techniciens, ingénieurs, doctorants et chercheurs ayant déjà validé deux formations réglementaires et qui souhaitent apprendre ou se perfectionner dans cette technique de pointe de la neurochirurgie. Le stage allie cours magistraux d’une part, démonstrations et travaux pratiques d’autre part. Les cours magistraux (qui n’impliquent pas d’animaux) apportent les connaissances nécessaires à la mise en œuvre de la technique, des soins donnés aux animaux avant pendant et après la réalisation de cette technique. Ils abordent aussi les bases de l’anatomie du cerveau et les principes de la stéréotaxie. La partie consacrée à la pratique permet au stagiaire de mettre en œuvre cette technique avec succès. Pour atteindre cet objectif, le stage se dote d’un fort taux d’encadrement de ces travaux pratiques (maximum de 2 stagiaires par formateur) qui permet un guidage personnalisé pour chacune des étapes de l’opération et pour surmonter efficacement toute difficulté éventuelle et assurer une prise en compte constante du bien-être animal.
Bénéfices attendus
A l’issue de la formation, les stagiaires auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir une qualité d’exécution de la chirurgie stéréotaxique et le maintien du bien-être animal dans le cadre de leur expérimentation. L’anticipation et la prise en charge de la douleur, la mise en place de la chirurgie et de ses appareillages, l’utilisation fine d’un matériel hautement fragile, la réalisation d’un geste technique précis, l’identification des signes cliniques des animaux et le bon suivi post-opératoire sont autant d’éléments permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés pour l’investigation.
Procédures
Chaque animal subira au cours des procédures 2 injections d’anesthésiant local et général (1 minute) + 1 intervention chirurgicale (45 minutes) + 2 injections terminales (2 minutes). Les injections seront réalisées dans la cavité abdominale. Chaque chirurgie réalisée par le stagiaire sera contrôlée par le formateur qui veillera au respect du bien-être animal.
Impact sur les animaux
L’anesthésie par injection peut induire un stress léger ainsi qu’une légère douleur de courte durée. Une douleur peut apparaitre en post opératoire au niveau de la suture. Une légère perte de poids, réversible, peut être observée le lendemain de la procédure.
Devenir
Après le suivi post-opératoire les animaux qui auront été utilisés pendant la formation seront euthanasiés pour permettre le prélèvement du cerveau. Celui-ci sera étudié pour vérifier la qualité de la réalisation technique du stagiaire. Les animaux surnuméraires seront pris en charge par la plateforme de zootechnie pour une réutilisation (enseignement ou projet de recherche).
Remplacement
L’utilisation de vidéos d’enseignement ou d’animaux artificiels ne peuvent pas remplacer la démonstration et l’entrainement sur un animal vivant et anesthésié. La réalisation d’une telle technique nécessite dans le même temps l’apprentissage des bonnes pratiques pour garantir le maintien de la bonne santé de l’animal tout au long de la procédure et après.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été optimisé pour permettre les démonstrations des formateurs et l’entrainement complet de chaque stagiaire.
Raffinement
Les souris et rats destinés au stage sont maintenus en groupe sociaux avec des éléments d’enrichissement dans leur cage et ils bénéficient d’un suivi de leur état comportemental et physiologique au quotidien. Seuls les formateurs procèdent à la manipulation des animaux éveillés et à leur anesthésie dans un environnement calme. Au cours des opérations, si malgré la couverture antalgique et le monitoring de l’état d’anesthésie, un animal donne le moindre signe de mal être (insensibilité à la médication), il sera mis à mort avec une surdose d’anesthésique. Les animaux feront l’objet d’un suivi post-opératoire. En cas d’atteinte de points limites strictes, l’animal sera immédiatement euthanasié. Ces points sont : l’ouverture de la plaie, l’infection du site opératoire, les signes neurologiques aigus (convulsions, paralysie, léthargie extrême), l’incapacité à s’alimenter.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles de choix en neurobiologie expérimentale. De nombreuses lignées génétiquement modifiées ont été générées pour étudier la biologie de ces mammifères et par extension celle de notre espèce. Il est donc important pour une formation pertinente d’utiliser le modèle sur lequel le stagiaire sera amené à travailler. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car c’est à cet âge que les atlas qui permettent une bonne localisation de la zone à injecter peuvent être utilisés.
Radiofréquences 5G sur le récepteur au froid : induction thermogénique et adaptation métabolique MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Une partie des 144 souris utilisées est génétiquement modifiée pour supprimer un récepteur au froid, afin d'en tester le rôle. Toutes vont être exposées deux heures par jour à un champ électromagnétique de type 5G pendant six jours ou un mois, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le porteur cherche à savoir si ces ondes déclenchent des changements métaboliques proches d'un syndrome métabolique. Toutes sont tuées par prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie, puis leurs organes sont prélevés.
Objectifs
Depuis novembre 2020, des champs électromagnétiques (CEM) de type 5G sont émis. En France, 3 bandes sont utilisées, dont deux le sont déjà pour la 4G. En 2020, 54 000 sites d’émission étaient installés en France, soit 30 000 de plus qu’il y a 5 ans. L’extension de l’exposition à ces rayonnements pose la question des effets sanitaires, notamment chez les personnes qui se disent atteintes d’hypersensibilité électromagnétiques caractérisée par divers symptômes. Nous avons montré que des rongeurs exposés aux CEM développaient progressivement des épisodes d’augmentation de température corporelle similaires à ceux observés lors d’une activation de la thermogenèse via l’activation de récepteurs au froid. La détection du froid par les voies afférentes permet l’activation des récepteurs adrénergiques du tissu adipeux brun par la noradrénaline. De plus, la thermogenèse induit une lipolyse et est accompagné par une libération d’acides gras libres dans la circulation sanguine. Nous avons montré que l’augmentation de température corporelle de souris exposés aux CEM était accompagnée d’une augmentation des niveaux de noradrénaline et d’acides gras libres dans le sang. Au-delà d'une exposition de 6 jours aux CEM, l'activité de thermogenèse semble rester stable à un niveau élevé ce qui devrait déclencher des adaptations métaboliques. Pour preuve, nous avons reporté l'induction d'une protéine dans les adipocytes blancs qui activerait le phénomène de brunissement des adipocytes blancs. Dans l'ensemble, nos résultats soutiennent l'hypothèse selon laquelle les CEM déclenchent des changements métaboliques favorisant l'augmentation de l'activité thermogénique basale. Ce projet évaluera les effets des CEM de type 5G et 4G en s’appuyant sur les résultats observés précédemment après 6 jours d’exposition chez des souris mâles et femelles. Puis, nous évaluerons si une exposition de 6 jours ou d’un mois aux CEM peut induire des changements métaboliques dans le modèle murin. L’utilisation de souris KO pour un récepteur au froid permettra d’évaluer l’implication de ce récepteur dans ces changements. Les effets seront évalués chez des animaux mâles et femelles en utilisant la fréquence pour laquelle nous observerons le plus d’effet dans la précédente procédure. Au maximum, 144 souris seront étudiées réparties dans 24 groupes d’animaux.
Bénéfices attendus
Si nous trouvons que l'exposition aux CEM 5G induit effectivement des changements métaboliques similaires à ceux observés dans des pathologies comme le syndrome métabolique, un deuxième projet pourrait être mis en place afin de mesurer la synergie entre un régime hypercalorique associé ou non à une exposition aux CEM. Ce projet pourrait aider à estimer le rôle cofondateur de l'exposition aux CEM dans le développement d'un syndrome métabolique et de ses maladies cardiovasculaires associées comme l'hypertension et l'insuffisance cardiovasculaire. Le syndrome métabolique est une maladie courante, débilitante et en pleine expansion et devient un fardeau pour la santé publique dans les sociétés occidentales. A court terme, les résultats de ce projet, en collaboration avec des cliniciens, pourraient permettre de réaliser un essai clinique exploratoire dans le but de vérifier la signature moléculaire des CEM chez des patients atteints de syndromes métaboliques ou de diabète. Alternativement, un essai clinique pourrait être conçu afin de suivre l'activité métabolique des patients soumis à l'exposition quotidienne normale aux CEM par rapport à un groupe protégé de toute exposition. La signature moléculaire de l'exposition aux CEM pourrait être testée dans des échantillons de sang.
Procédures
Les animaux seront exposés à un champ électromagnétique 2h par jour (2 sessions d'une heure) pendant 6 jours ou 1 mois selon les groupes d'animaux. Les différentes mesures effectuées seront réalisées en utilisant des techniques non invasives (comportement alimentaire en pesant l'alimentation et température cutanée en utilisant une caméra infrarouge). Un seul prélèvement sanguin sera réalisé à la fin de la procédure sous anesthésie générale et après application d'un anesthésique local avant la mise à mort. Il faut moins d'une minute pour prélever le sang nécessaire avant l'arrêt cardiaque. Une fois l'animal déclaré mort, différents organes d'intérêt seront prélevés.
Impact sur les animaux
Dans le passé, nous avons exposé des rats et des souris à 900 MHz entre 1 et 5 semaines à la même intensité que ce projet afin d’étudier les effets sur différentes fonctions physiologiques. Durant l’exposition, aucun effet indésirable notable n’avait été observé (comportement, poids corporel, prise alimentaire). Toutefois, les animaux peuvent avoir du stress liés à l'exposition elle-même, aux manipulations par l'expérimentateur et à l'isolement pour mesurer individuellement la prise alimentaire.
Devenir
A l'issue des procédures 1 et 2, les animaux seront anesthésiés afin de réaliser un prélèvement sanguin intracardiaque qui induira la mort.
Remplacement
Les fonctions étudiées dans ce projet sont la thermorégulation et l'activation métabolique. Il existe des mannequins qui permettent d’étudier les échanges thermiques entre le corps et l’environnement mais il n’existe pas de modèle permettant d’étudier les modifications de la régulation thermique ainsi que l'adaptation métabolique en lien avec ces modifications. Les modèles in vitro ou in silico permettant de modéliser les modifications métaboliques mais ils ne peuvent reproduirent les adaptations métaboliques suite à une possible activation de la thermogenèse. De plus, pour étudier l'implication du récepteur au froid dans ces modifications, le modèle murin KO est le plus adapté pour comprendre les mécanismes impliqués et il permettra d'observer les adaptations sur l'organisme en entier. Actuellement, les modèles in vivo et in silico ne permettent pas d'intégrer toutes ces adaptations.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe par expérimentation a été déterminé pour obtenir d’éventuels effets avec des différences statistiques suffisamment robustes. Ainsi, nous utiliserons 6 animaux par groupe car lors d’une précédente étude, 4 animaux par groupe permettaient d’observer seulement une tendance à une diminution de la température de la queue sans atteindre le seuil de significativité alors qu’avec 6 animaux nous nous assurerons d’observer une éventuelle diminution significative de la température de la queue. Pour les analyses lipidomiques et transcriptomiques, 6 animaux par groupe sont suffisants pour obtenir des effets robustes statistiquement. Les données seront analysés statistiquement avec des logiciels adaptés.
Raffinement
Pour assurer le raffinement des animaux dans ce projet, ils seront quotidiennement observés selon des critères bien précis qui permettront de déterminer un score. Selon la valeur du score, une action sera réalisée pour soulager au maximum l’animal dans le cas où ce score est supérieur à 3. Si le score est inférieur à 3, cela signifiera que l'animal ne présente pas de souffrance et/ou douleur. Pour diminuer le stress lié à l’hébergement individuel, différents enrichissements (cylindres en carton et lanières de papier kraft) seront présents dans chaque cage. Un fond sonore sera également présent afin de couvrir d’éventuels bruits extérieurs, brefs et bruyants, sources de stress pour les animaux. Les paramètres physiologiques étudiés in vivo seront mesurés sans contrainte pour l’animal : la température cutanée de la queue sera mesurée avec une caméra infrarouge et la prise alimentaire par une balance reliée à la mangeoire.
Choix des espèces
Le modèle d’étude sera la souris pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à une contrainte. - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude des modifications transcriptomiques. - la souris est le modèle de prédilection pour obtenir des individus KO, ici pour le récepteur au froid TRPM8. Les animaux seront étudiés à l’âge adulte car la taille de la queue des jeunes ne permettra pas de mesurer la température cutanée avec la caméra thermique.
Evaluer l’impact d’une modulation alimentaire en vitamine D sur le microbiote intestinal et la santé métabolique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des points limites gradés déclenchent l'arrêt de la procédure, mais 72 souris vont d'abord être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Pendant douze semaines de régime, elles subissent des gavages, deux prises de sang à la queue, une injection intrapéritonéale, des jeûnes et des isolements répétés. Les tissus sont prélevés après la mise à mort pour étudier l'effet de la vitamine D sur le microbiote. Le porteur précise qu'aucune analgésie n'est prévue pour ce protocole.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’apporter des données permettant de mieux comprendre l’impact de la vitamine D sur la santé, et les conséquences d’une carence en vitamine D sur la santé métabolique et le microbiote. Afin de prendre en compte de possibles effets liés au sexe, des souris mâles et femelles seront nourris pendant 12 semaines avec un régime contrôle, déficient ou non en vitamine D, ou un régime riche en lipides et en sucres, déficient ou non en vitamine D. Les souris carencées seront étudiées et comparées aux souris non carencées pour le suivi de l'evolution pondérale, la prise alimentaire, et l’impact sur le microbiote. Au total, l'etude portera donc sur 8 groupes d'animaux. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9ème semaine et un test de tolérance au glucose à la 10ème semaine. Les fèces seront également récoltées et le microbiote des animaux sera analysé. Les animaux seront mis à mort après les 12 semaines de régime afin d'étudier l’inflammation, l’expression et l’activation de la voie de signalisation de l’insuline dans des organes à forte activité métabolique (foie, muscles, tissus adipeux), l’adiposité, l’expression génique du tissu adipeux, et l’empreinte épigénétique du tissu adipeux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’impact de l’interaction entre la vitamine D et le microbiote intestinal sur la santé métabolique ainsi que sur la composition du microbiote. Ce travail est essentiel pour mieux comprendre le rôle du statut en vitamine D dans la réponse à l’alimentation, notamment dans le contexte d’un régime riche en lipides. Il permettra d’ouvrir de nouvelles perspectives, en particulier en ce qui concerne les recommandations relatives à la supplémentation en vitamine D chez l’Homme.
Procédures
Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé la 6ème semaine. Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test oral de tolérance au glucose et un test de tolérance à l'insuline seront pratiqués respectivement en 9ème et 10ème semaine. Ces tests nécessitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage dans le cas du test de tolérance au glucose, et une injection lors du test de tolérance à l'insuline. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en hébergement individuel des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur valeur de glucose dans le sang. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. Ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution permettant d'évaluer la perméabilité intestinale. Durant le protocole, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.
Impact sur les animaux
Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors de tolérance au glucose et à l'insuline et du recueil de fèces. Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors du gavage avec une dose de glucose, ou une dose de colorant visant à etudier la perméabilité intestinale, et lors des injections d'insuline. Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles. Lors des tests, les animaux seront soumis à des restrictions alimentaires afin de réaliser les tests sur animaux à jeun (4h ou 6h). De même, la vielle au soir de l'euthanasie, les animaux seront mis à jeun. Les souris subiront deux gavages durant le protocole, deux prises de sang à la veine caudale et une injection intrapéritonéale, qui pourraient engendrer des douleurs temporaires et reversibles. Contention des animaux à plusieurs reprises lors des tests.
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques, séquencage) et de démontrer les effets métaboliques de la modulation en vitamine D dans l’alimentation, à la fois sur le microbiote et sur la santé métabolique.
Remplacement
L’impact d’une modulation en vitamine D sur la santé métabolique et le microbiote ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Il n'existe pas de modèle alternatif à l'heure actuelle permettant d'étudier ces paramètres in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux (9 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test de Student, notamment en ce qui concerne la prise de poids.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton ainsi que du coton de nidification. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.
Choix des espèces
Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 9 semaines à l’achat et d’environ 10 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à des animaux adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.