Souris
Rôle des mégacaryocytes dans les syndromes myéloprolifératifs (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Irradiées pour détruire leur moelle osseuse puis greffées, 1 491 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent jusqu'à dix prélèvements de sang sur près de dix mois, des injections et des gavages, avant un prélèvement terminal sous anesthésie sans réveil. Le projet étudie le rôle des mégacaryocytes dans des cancers du sang, pour ouvrir des pistes de traitement. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la fibrose de la moelle, ce qui rendrait la souris "indispensable".
Objectifs
Introduction : Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des cancers du sang où la moelle osseuse fabrique trop de cellules, notamment trop de globules rouges et de plaquettes. Avec le temps, cette surproduction abîme la moelle et crée des cicatrices (myélofibrose), ce qui empêche de produire correctement le sang. Cela peut provoquer de la fatigue, un risque d’infections plus élevé, et parfois même une évolution d’autres types plus graves de cancers du sang. Les mégacaryocytes, les cellules qui fabriquent les plaquettes, jouent un rôle clé dans cette dégradation de la moelle. Pourtant, les traitements actuels n’agissent pas spécifiquement sur ces cellules, ce qui limite leur efficacité. Trouver des traitements capables de cibler directement les mégacaryocytes pourrait permettre d’améliorer la santé et la qualité de vie des patients atteints de NMP. Objectif général : Identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblant spécifiquement les mégacaryocytes, en étudiant leur fonctionnement dans les NMP. Le projet sera réalisé dans deux établissements.
Bénéfices attendus
En plus d’améliorer nos connaissances sur le rôle des mégacaryocytes dans les NMP, l’objectif final de cette étude est d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques capables de freiner la progression de la myélofibrose et, à terme, d’améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront réalisés chez des souris vigiles, à raison d’un maximum de dix prélèvements par animal sur une durée totale de 36 à 40 semaines (soit un prélèvement toutes les quatre semaines). Chaque prélèvement aura une durée inférieure à cinq minutes. Certaines souris recevront des traitements administrés par injection et/ou par gavage, à raison d’un maximum de deux injections et de deux gavages par jour, sur une durée maximale de huit semaines consécutives. Ces gestes seront réalisés chez des animaux vigiles et auront une durée inférieure à une minute chacun. Certaines souris vigiles seront préalablement irradiées et transplantées (moelle osseuse). Le geste, réalisé sur animal vigile, dure au maximum 10 minutes. Enfin, un prélèvement sanguin terminal sera effectué chez certains animaux, sous anesthésie profonde sans réveil, pour une durée totale estimée à environ dix minutes
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des souris, nécessaires pour la réalisation des gestes ci-après, entraînent un léger stress de courte durée : - Injections: la piqûre entraîne une douleur légère et passagère. - Prélèvement sanguin à la queue : l’entaille d’une veine va provoquer une douleur aigue et passagère. - Irradiation des souris : l’irradiation entraîne une destruction transitoire de la moelle osseuse, provoquant une fatigue passagère et une activité réduite pendant quelques jours. Les symptômes seront corrigés par une transplantation de moelle osseuse. Le transport vers l’irradiateur et l’espace restreint dans les boîtes d’irradiation peut induire un stress léger et temporaire. - Gavage oral : le passage de la sonde peut provoquer une irritation légère et transitoire de l’œsophage. - Modèles de souris NMP : Pas de nuisance lors du développement de la maladie, qui est indolore.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour pouvoir collecter les principaux échantillons nécessaires aux différentes analyses mises en œuvre dans ce projet (os, rate, poumons…).
Remplacement
Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des cancers du sang dans lesquelles certaines cellules deviennent anormales et perturbent le fonctionnement de la moelle osseuse, le lieu de production de toutes les cellules sanguines. Aujourd’hui, il n’existe pas de modèle in vitro en laboratoire capable de reproduire correctement ce qui se passe dans l’organisme, notamment l’apparition progressive de la fibrose (cicatrisation) dans la moelle. L’utilisation de modèles de souris est donc indispensable pour permettre de mieux comprendre l’évolution de ces maladies et, à terme, d’identifier de nouvelles pistes de traitement plus efficaces pour les patients.
Réduction
Les effectifs ont été définis en amont grâce à une approche statistique, afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux tout en garantissant des résultats fiables. Cette estimation tient compte de la variabilité attendue et des objectifs scientifiques du projet.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et leur utilisation sera respectée (valable uniquement pour les souris achetées). Une habituation à la manipulation et à la contention sera réalisée 5 jours avant le début des expérimentations. Le stress et la douleur des animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : - Par l’hébergement dans des cages en groupes sociaux. - Par un enrichissement dans la cage de nids, coton compressé et de frisure de papier kraft afin de permettre aux animaux de construire un nid et augmenter la diversité de leur comportement. - Par l’utilisation de boites de transport dédiées en conservant la composition des cages d’origine, et contenant une litière propre, du matériel d’enrichissement comme des nids ainsi que de la nourriture liquide et du gel d’hydratation, afin de limiter le stress et de garantir leur confort pendant le déplacement vers et au retour de l’irradiateur. - Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de gestes invasifs. - Par l’installation de l’animal dans une enceinte thermostatée après administration de l’anesthésie, puis sur une plaque chauffée, afin lutter contre l’hypothermie pendant les gestes invasifs. - Par l’injection d’analgésique avant les gestes invasifs.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus adaptée car la formation du sang et le fonctionnement de la moelle osseuse y sont bien connus et très proches de ceux de l’être humain. C’est également la seule espèce pour laquelle il existe des modèles génétiquement modifiés reproduisant les NMP. Ces modèles permettent d’observer l’ensemble des caractéristiques de la maladie telles qu’elles apparaissent chez les patients, y compris la fibrose de la moelle osseuse et les réponses aux traitements utilisés en clinique. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (entre 6 et 40 semaines), période durant laquelle il est possible d’étudier à la fois l’apparition de la maladie et son évolution vers des formes plus sévères.
Approches thérapeutiques des tumeurs osseuses primitives chez la souris immunodéprimée (ostéosarcome et sarcome d’Ewing) EU1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes classées en souffrance sévère, 2 880 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, après une greffe de cellules de tumeurs osseuses humaines. Choisies jeunes pour reproduire les ostéosarcomes et sarcomes d'Ewing de l'enfant, elles reçoivent jusqu'à 80 gavages et 80 injections sur seize semaines, plus une injection de cellules tumorales près de l'os. Le porteur signale une douleur modérée liée à cette injection et une perte de mobilité possible à mesure que la tumeur grossit. Le volume de la tumeur sert de seuil d'arrêt entraînant la mise à mort.
Objectifs
L’objectif scientifique est de vérifier que les résultats obtenus in vitro dans les cellules d’ostéosarcome et de sarcome d’Ewing sont applicables aux modèles de xénogreffe (greffe de cellules humaines chez des rongeurs) d’ostéosarcome ou de sarcome d’Ewing chez la souris immunodéficiente dans un contexte environnemental complexe (vascularisation, effets secondaires, microenvironnement osseux …) avant toute application clinique. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Le projet porte sur l’étude de molécules capables d’inhiber le développement et la progression des tumeurs osseuses primitives et/ou le développement des lésions osseuses associées. Des études préliminaires ont été réalisées in vitro sur différents types de cellules d’ostéosarcome (humaines et murines) et de sarcome d’Ewing. Suite aux résultats les plus significatifs, des modèles animaux seront utilisés pour tester l’efficacité de ces molécules thérapeutiques dans un environnement in vivo complexe (os, tumeur…) pour une application thérapeutique potentielle chez l’homme.
Procédures
EU 1/2 : 960 souris recevront maximum 5 gavages/semaine pendant 16 semaines maximum soirt 80 gavages, durée du geste : 1 minute. 960 souris recevront maximum 5 injections IP/semaine pendant 16 semaines maximum soirt 80 injections IP, durée du geste : 1 minute. 960 souris recevront maximum 5 injections IP et 5 gavages/semaine pendant 16 semaines maximum soit 80 injections IP et 80 gavages, durée du geste : 1 minute. L'ensemble des animaux recevra une injection intamusculaire de cellules tumorales (1 minute). EU 2/2 : la procédure d'imagerie IRM nécessitera une injection IV d'une minute et 20 minutes d'acquisition. 6 IRM maximum seront réalisées.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour ce projet sont un stress lié à la contention et à l'anesthésie des animaux. Une douleur modérée associée à l'injection en paratibiale (injection intramusculaire proche de l'os). Le développement tumoral chez la souris pourra à terme, être associé à des effets délétères (perte de poids). Le volume tumoral, bien que contrôlé 2 à 3 fois par semaine pourra entraîner une légère perte de mobilité. Une attention particulière sera portée à la mesure du volume tumorale qui constitue un critère d'arrêt décrit dans les points limites. L'imagerie, réalisée à l'aide d'un microscanner ou d’un IRM sous anesthésie isoflurane, peut également être source de stress pour les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront injectés avec des cellules tumorales et recevront des traitements de chimiothérapie qui ne sont pas compatibles avec une éventuelle réutilisation.
Remplacement
Dans le cadre du développement clinique de nouvelles molécules à activité anti-tumorale et impliquée dans la résorption, des études préliminaires in vitro ont déjà été réalisées avec succès. Une évaluation pré clinique est cependant indispensable pour étudier les effets de ces molécules in vivo. Le modèle murin reste le plus adapté à ce type d'étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d'effectuer des analyses statistiques. Compte-tenu d’études comparables déjà publiées, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique (n=8).
Raffinement
Afin de raffiner les procédures expérimentales, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter le plus précocement possible tout signe de douleur. La manipulation des animaux se fera sous anesthésie générale gazeuse, sur un tapis chauffant lors de la réalisation des gestes techniques. Une analgésie sera appliquée pour l'implantation des cellules tumorales et des points limites strictes et spécifiques du projet seront établis (détaillés dans le descriptif de la procédure). Les animaux seront hébergés en groupe, à raison de 4 par cage. Le transport à pieds sera effectué dans des cages adaptées (durée : 5 minutes, distance : 300 mètres). L'environnement sera adapté afin que les animaux puissent avoir un comportement aussi naturel que possible (litière adaptée à l'espèce, frisottis, maisonnette en carton...). L'alimentation et l'eau seront fournis à volonté.
Choix des espèces
L’utilisation de souris immunodéprimées est choisie afin d’étudier le développement de nouvelles thérapies sur des tumeurs humaines dans un environnement in vivo complexe (os et tumeur). Nous utilisons de jeunes souris afin de mimer au mieux les tumeurs osseuses qui se développent chez l’enfant, l’adolescent ou le jeune adulte chez les patients. Réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 5 semaines).
Thérapies dirigées contre l’adénocarcinome pancréatique ductal (PDA) en combinaison avec un inhibiteur du cycle cellulaire
- Recherche appliquée
- Cancers
Ouvertes par laparotomie sous anesthésie pour recevoir une injection de cellules cancéreuses dans le pancréas, 2 380 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent ensuite des prélèvements de sang, deux cycles de gavage et des injections répétées, sous une grille clinique qui déclenche la mise à mort au score de 4. Le projet teste un inhibiteur du cycle cellulaire, le palbociclib, seul ou en association, contre l'adénocarcinome du pancréas. Le porteur situe le bénéfice, pour les 40 à 50 % de patients porteurs de la délétion ciblée, au long terme.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier de nouvelles approches thérapeutiques ciblant la voie de signalisation du gène CDKN2A, impliqué dans le contrôle du cycle cellulaire ainsi que dans plusieurs aspects de la réponse immunitaire dans l’adénocarcinome pancréatique. Dans les tumeurs présentant une délétion de CDKN2A, les protéines CDK4/6 sont particulièrement activées. Le palbociclib, un inhibiteur de CDK4/6, a montré une activité antitumorale : il réduit la prolifération cellulaire et augmente l’infiltration tumorale par les cellules immunitaires, notamment les lymphocytes T. Depuis plusieurs années, nous avons développé et caractérisé des modèles murins de tumeur pancréatique orthotopique, et acquis une expertise dans l’analyse de la croissance tumorale et de l’immunité antitumorale via des techniques d’immunohistochimie, de biologie moléculaire et de cytométrie en flux. • La première procédure vise à évaluer l’effet du palbociclib en monothérapie dans des tumeurs pancréatiques. • La seconde procédure a pour objectif de déterminer si l’association du palbociclib à d’autres traitements immunomodulateurs permet d’améliorer la réponse thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont la mise en place des traitements antitumoraux spécifiques des tumeurs du pancréas qui portent la délétion du gène CDKN2A. Ces modèles tumoraux murins ont une relevance pré-clinique de l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC). Les bénéfices à long terme sont pour les patients avec délétion CDKN2A qui correspondent à 40-50% des patients PDAC.
Procédures
Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale, d’une durée d’environ 5 minutes, est réalisée. Elle consiste en une laparotomie suivie d’une injection intra pancréatique. Au cours de la cinétique expérimentale, les animaux seront soumis à : deux prélèvements sanguins, réalisés lors des séances d’échographie sous anesthésie générale ; deux cycles de gavage de 5 jours chacun ; trois injections intrapéritonéales (IP).
Impact sur les animaux
La durée expérimentale est d’environ 20 jours à partir de l’injection tumorale. Durant la première phase de croissance tumorale, les souris ne présentent généralement pas de signes cliniques de souffrance. À partir de 18 à 20 jours, certains animaux peuvent toutefois développer des signes liés au développement tumoral, tels qu’une altération progressive de l’état général, une diminution de la mobilité, une perte de poids pouvant évoluer vers un état de cachexie, ainsi qu’un aspect du pelage dégradé. Les manipulations nécessaires au suivi expérimental (capture, contention, pesées, injections répétées selon protocole) peuvent entraîner un stress ponctuel et une gêne transitoire. Les traitements administrés (palbociclib seul ou en association) sont susceptibles d’induire une baisse temporaire de l’activité ou de l’appétit, déjà décrite pour ces molécules. Afin d’assurer un suivi optimal et de prévenir l’installation d’une souffrance prolongée, une grille d’observation quotidienne (jointe en annexe) est utilisée pour évaluer l’ensemble des paramètres cliniques pertinents : état général, mobilité, prise alimentaire, hydratation, perte de poids, aspect du pelage et comportement. Toute dégradation des critères définis conduit à l’application stricte des points limites.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour le prelevement du pancreas et les analyses histologiques et par cytometrie en flux de la tumeur
Remplacement
Des approches alternatives ont été mises en œuvre afin de limiter au maximum le recours aux animaux dans ce projet. Analyses in silico pour l’identification des cibles immunothérapeutiques : Une étude in silico a été réalisée à partir des données de patients atteints de PDAC. Cette analyse a permis d’établir une liste de gènes dont l’expression est modulée par la délétion de CDKN2A. Cette stratégie permet de remplacer des expérimentations animales initiales, habituellement nécessaires pour la recherche et la sélection de nouvelles cibles immunitaires. Mise au point d’essais in vitro : Des tests d’activation des lymphocytes T par des cellules tumorales ont été développés en culture in vitro. Ces méthodes permettent d’évaluer la réponse immunitaire antitumorale sans recourir à des cohortes animales lors des phases exploratoires. Limites actuelles du remplacement : Malgré ces approches substitutives, l’utilisation d’animaux reste indispensable pour étudier : le comportement de la tumeur dans son microenvironnement pancréatique spécifique ; les interactions complexes avec le système immunitaire de l’hôte ; le recrutement intratumoral des cellules immunitaires pro et antitumorales. Aucune méthode alternative fiable ne permet actuellement de reproduire ces interactions in vivo de manière pertinente, ce qui rend l’emploi d’animaux nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Nous utilisons une méthode d’imagerie par l’échographie qui permet de détecter la prise de tumeur et de la mesurer au cours du temps pour un suivi longitudinal de la croissance tumorale, évitant l’utilisation de plusieurs cohortes d’animaux à différentes périodes. A partir des expériences passées nous utilisons un calcul du nombre d’animaux par groupe à l’aide d’une formule d’estimation détaillé dans les procédures expérimentales qui permet de réduire le nombre d’animaux sur des bases statistiques. Le calcul statistique utilisé est fondé sur une estimation classique recommandée par le Comité d’éthique, basée sur la différence attendue de volume tumoral entre groupe contrôle et groupe traité. Le calcul de la taille d’effet repose sur la formule d = (μ0 – μ1) / δ, où μ représente le volume tumoral moyen et δ sa variance. Le nombre d’animaux minimal est ensuite estimé selon la formule n = 16 / d², permettant d’assurer une puissance statistique suffisante pour détecter une différence significative.
Raffinement
Des mesures de raffinement rigoureuses sont mises en œuvre afin d’assurer le bien être des animaux tout au long des procédures expérimentales. L’environnement d’hébergement est enrichi par l’ajout systématique de nestlets dans chaque cage, permettant de réduire le stress, favoriser les comportements naturels de nidification et améliorer le confort thermique. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été optimisés afin de minimiser toute douleur ou détresse liée aux interventions. Toutes les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale, un agent permettant un ajustement précis de la profondeur anesthésique et un réveil rapide et contrôlé. Une analgésie préopératoire et postopératoire est administrée systématiquement. Afin de détecter précocement d’éventuels signes de souffrance, une grille d’évaluation clinique standardisée est utilisée quotidiennement. Elle regroupe un ensemble de critères physiologiques et comportementaux, chacun noté par un score numérique. La somme de ces scores permet une évaluation objective et reproductible de l’état de l’animal. Le point limite expérimental est fixé à un score total de 4. À la date prévue de fin d’expérimentation (J20), les scores cliniques n’atteignent généralement pas cette valeur, sauf cas exceptionnels. Dès qu’un animal atteint ce seuil, son suivi expérimental est immédiatement interrompu et une mise à mort est réalisée conformément aux procédures réglementaires. La grille clinique repose sur sept critères correspondant à des altérations significatives : distension abdominale liée à la présence d’une masse tumorale importante, amaigrissement marqué avec diminution de la masse au niveau du bassin, dépilation localisée ou généralisée, arrêt du toilettage, apathie et absence d’interaction, apparition d’un comportement agressif inhabituel, et signes de cachexie. Ce système de scoring assure un suivi précis, standardisé et non subjectif des animaux. Il n’a jamais été observé de situation nécessitant l’isolement d’un animal, les symptômes apparaissant selon une cinétique similaire entre individus d’un même groupe.
Choix des espèces
La souris est l’espèce majoritairement utilisée pour les modèles du cancer du pancréas décrit dans la littérature, et ces modèles se prêtent généralement aisément à un transfert de technologie chez l’homme. De plus les modèles murins ont cet avantage d’avoir un catalogue de modifications génétiques et de lignées cellulaires important qui permettent un meilleur décryptage des voies de signalisation impliquées. Les souris sont âgées de 8-10 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux
Modèle désensibilisation cornéenne chez le rongeur
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
Rats : 1305
Tuées pour l'essentiel à l'issue, environ 224 d'entre elles réutilisées dans d'autres protocoles, 2 610 souris et rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Leur cornée est désensibilisée par application de capsaïcine, parfois doublée d'un grattage de l'épithélium, pour reproduire une atteinte des nerfs de l'œil pouvant mener à la cécité chez l'humain. Le projet teste des composés censés préserver ou restaurer la sensibilité de la cornée. Le porteur décrit l'application de capsaïcine comme douloureuse sur animal vigile et prévoit une anesthésie pendant l'induction.
Objectifs
Notre objectif est de mettre en place un modèle de dénervation cornéenne chimique chez le rongeur. La cornée possède une innervation abondante provenant du ganglion trijumeau qui est impliquée dans la régulation de la sensibilité cornéenne, la sécrétion des larmes, le réflexe de clignement des paupières, et la cicatrisation. Des dysfonctionnements de ces nerfs afférents peuvent survenir à la suite de dommages du ganglion trijumeau, d’herpes oculaire, de diabète ou d’intervention chirurgicale et peuvent entrainer une dénervation cornéenne partielle ou complète. Chez l’homme la maladie est rare mais elle conduit à une altération sévère de la cornée si elle n’est pas diagnostiquée rapidement avec un risque de cécité. Les premiers signes sont une perte de la sensibilité cornéenne : hypoesthésie ou anesthésie, puis des altérations de l’épithélium de la cornée, couche de cellules la plus externe. Le processus naturel de cicatrisation n’étant plus assuré correctement, ces altérations évoluent en ulcères plus ou moins profond, qui peuvent s'accompagner d’un envahissement anormal de néovaisseaux alors que la cornée est un tissu complètement transparent. La diminution des clignements de paupières et de la sécrétion de larmes amplifie le processus. La désensibilisation chimique permettra d’étudier la contribution des fibres afférentes à la trophicité de la cornée, et les conséquences sur la cicatrisation, mais aussi de tester des composés agissant sur la préservation des fibres nerveuses et la restauration de la sensibilité cornéenne.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est la mise au point de modèles expérimentaux robustes permettant d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques visant à préserver ou restaurer la sensibilité et l’intégrité cornéenne après une dénervation.
Procédures
L'induction de la dénervation se fera par application d'un composé issu d'un piment la capsaïcine, connu pour insensibiliser les fibres nerveuses. Cette intervention a lieu une fois en début de l'étude, ou selon le protocole, deux fois à un jour d'intervalle, avec une concentration plus faible de produit. Dans le cas où le but sera d'étudier le retard de cicatrisation, un grattage de l'épithélium cornéen sera également pratiqué le jour de l'induction. Les examens ophtalmologiques ne sont pas invasifs et sont réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie ou sur l’animal en clinique vétérinaire. Pour notre projet, ces examens se feront pour une partie sur animaux vigiles (lampe à fente, mesure de la sensibilité cornéenne, ou mesure de production de larme) 4 fois par semaine sur une semaine. Certains examens nécessitant l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ils ne dureront que quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par injection au niveau de l'œil, soit par administration orale, par injection sous cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale ou intramusculaire (pour les anesthésies chez le rat). Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (en moyenne 4 fois 8 fois). Les injections de produit au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont limitées, une à deux fois par semaine. Elles sont un peu plus longues (environ 5min) et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Si le traitement est administré par voie orale ou intrapéritonéale, il peut être au maximum quotidien, par voie intraveineuse : au maximum 3 fois par semaine, par voie sous-cutanée : au maximum de 2 fois par jours. La durée d’une étude est 1 semaine. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
L’administration de capsaïcine est douloureuse sur un animal vigile, mais dans le projet l’animal sera anesthésié pendant la phase d’induction, pendant environ 30 min, une analgésie sera mise en place. Après cette phase de douleur, la capsaïcine induit une insensibilisation prolongée des fibres nerveuses pendant laquelle l’animal ne ressentira pas de douleur. Des traitements à base de capsaïcine existent chez l’homme pour traiter la douleur des névralgies. Si l’étude inclut l’étape d’étude la cicatrisation cornéenne le grattage de l’épithélium cornéen se fera sous anesthésie et analgésie. Les examens et administrations nécessitent une contention brève, pouvant induire un stress ponctuel de quelques minutes. Des mesures spécifiques (habituation, manipulation douce, environnement calme) seront mises en place pour limiter cet impact. Les procédures plus invasives, telles que les injections péri-oculaires ou les examens nécessitant une immobilisation prolongée, seront réalisées sous anesthésie légère afin de garantir le confort de l’animal. Ces anesthésies peuvent occasionner une gêne transitoire mais ne présentent pas de risque significatif à long terme.
Devenir
À l’issue de la procédure expérimentale, tous les animaux ayant suivi l’intégralité du protocole seront euthanasiés de manière éthique et réglementée, pour réaliser des analyses ex vivo nécessaires à la validation des résultats (analyses histologiques, dosages biochimiques, études moléculaires, etc.). Cependant, les animaux n’ayant pas été inclus dans la totalité de la procédure — estimés à environ 10 %, hors exclusions liées aux points limites — pourront être réutilisés dans d’autres protocoles expérimentaux compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Ces animaux sont généralement exclus en raison d’un défaut anatomique ou physiologique détecté lors des examens de baseline, notamment au niveau de l’œil, avant le début de l’induction de la pathologie. Ces individus n’auront reçu ni induction de la kératopathie, ni administration de traitement, mais auront uniquement été soumis à des examens non invalidants, parfois réalisés sous anesthésie légère. Leur réutilisation, lorsqu’elle est possible, s’inscrit dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R, tout en garantissant le respect du bien-être animal et des exigences scientifiques.
Remplacement
L’œil est un organe sensoriel d’une grande complexité, composé de structures anatomiques et physiologiques très diverses (cornée, cristallin, rétine, nerf optique...), interagissant de manière dynamique avec leur environnement local et systémique. Il est soumis à des variations mécaniques, physicochimiques et biologiques constantes, qui influencent directement sa fonction et sa réponse aux traitements. Bien que des méthodes alternatives aient été développées ces dernières années, telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modélisations in silico, ces approches, bien qu’utiles, ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions fonctionnelles et pharmacocinétiques observées dans un œil vivant. En particulier, elles ne permettent pas de simuler de manière fiable les effets de la dénervation sensitive, les altérations de la cicatrisation cornéenne. Dans ce contexte, le recours à un modèle animal reste actuellement indispensable pour reproduire les conditions pathologiques de dénervation cornéenne, et étudier l’efficacité et la tolérance de nouvelles approches thérapeutiques dans un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques liés à l’expérimentation animale, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour permettre une analyse fiable et reproductible des résultats. Une analyse réalisée en amont de chaque série expérimentale, afin de déterminer l’effectif optimal nécessaire à la détection d’un effet significatif. Ce calcul permettra, le cas échéant, d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs stratégies seront mises en œuvre. L’utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie, telles que l’imagerie cornéenne en temps réel (microscopie confocale), permettra de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, évitant ainsi la nécessité de sacrifices à chaque point d’analyse. Lorsque cela est scientifiquement pertinent, les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, l’optimisation des protocoles expérimentaux (standardisation des conditions d’induction de la dénervation, contrôle rigoureux des paramètres environnementaux et biologiques) contribuera à limiter la variabilité interindividuelle et à maximiser la robustesse des résultats.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec accès libre à la nourriture et à l’eau (ad libitum) dans des cages incluant des abris et des objets à ronger. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. L’application de capsaïcine se fera sous anesthésie, et un traitement analgésique est prévu en complément. De même si le retard de cicatrisation de l’épithélium cornéen est envisagé, les animaux seront anesthésiés et une analgésie est prévue. Si l’immobilité est requise pour un examen (confocal) une anesthésié une anesthésie légère et courte pourra être administrée pour assurer le confort et limiter le stress. Après chaque anesthésie, les animaux seront sous environnement chauffant pour prévenir l’hypothermie. Une hydratation locale sera réalisée sur les cornées jusqu’au réveil afin d’éviter les complications oculaires. Les animaux seront ensuite replacés dans leur environnement habituel pour réduire le stress post-manipulation.
Choix des espèces
Les espèces sélectionnées pour ce projet, le rat et la souris, présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques bien documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, notamment dans le contexte des pathologies cornéennes avec altération des fibres nerveuse. Ces deux espèces sont couramment utilisées dans les modèles expérimentaux validés de dénervation cornéenne et de régénération nerveuse, et leur emploi repose sur une expérience étendue au sein de la communauté scientifique. Leur utilisation permet une grande flexibilité expérimentale, notamment en termes de suivi longitudinal, d’imagerie cornéenne et de quantification des marqueurs moléculaires. Les animaux utilisés dans ce projet seront des jeunes adultes, âgés d’au minimum 6 semaines pour les rats et d’environ 5 à 6 semaines pour les souris, correspondant à une maturité fonctionnelle et physiologique des structures cornéennes et nerveuses Ce stade de développement garantit une réponse cohérente aux protocoles d’induction de la pathologie, ainsi qu’une meilleure reproductibilité des résultats. Le choix de cette tranche d’âge permet également d’éviter les biais liés à la croissance ou à la sénescence, tout en assurant une bonne tolérance aux procédures expérimentales.
Étude du rôle du récepteur plaquettaire GPIb dans les premières étapes de la dissémination métastatique MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour étudier comment un récepteur plaquettaire favorise la formation de métastases, 668 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des injections, un prélèvement de sang et, pour une partie, une chirurgie de trois heures trente avec pose d'un cathéter et injection de cellules tumorales. Le porteur signale des saignements possibles liés aux molécules antiplaquettaires testées et une perte de poids due aux métastases. Le bénéfice espéré, un traitement réduisant les métastases, reste formulé au conditionnel.
Objectifs
Les plaquettes sanguines ont un rôle primordial dans l’arrêt des saignements. Elles sont également impliquées dans diverses pathologies, notamment la thrombose artérielle, les processus inflammatoires et les cancers. Il est connu que les plaquettes favorisent le développement de métastases. Malgré l’implication des plaquettes, les traitements anti-plaquettaires actuels ne peuvent pas être utilisés en clinique chez des patients présentant un cancer en raison du risque de saignement qui y est associé. Le récepteur plaquettaire GPIb assure l’interaction entre les plaquettes et le facteur Willebrand conduisant à l’arrêt du saignement. Il est également une cible antithrombotique connue de par son rôle important dans la croissance du caillot. Nous avons généré 2 agents ciblant ce récepteur et bloquant son interaction avec le facteur Willebrand. Leur effet sur la thrombose a préalablement été validé, tout comme l’absence d’induction de saignement. Il a été montré dans la littérature que la GPIb plaquettaire serait impliquée dans la formation de métastases. Dans ce projet, nous souhaitons étudier le rôle de la GPIb dans la formation de métastases afin d’identifier une nouvelle cible pour réduire les interactions plaquettes – cellules tumorales et potentiellement réduire le développement de métastases dans le cadre de cancers du poumon, du sein et de la peau.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont l’éventuelle observation d’une réduction de l’interaction des cellules tumorales avec les plaquettes lorsque le récepteur GPIb est inactif. Un effet attendu serait également une réduction de la formation des métastases. L’identification d’un tel effet pourrait mener au développement d’un nouveau traitement permettant de réduire la formation de métastases et donc mener à une meilleure prise en charge des patients atteints de cancer.
Procédures
Pour la première procédure, les animaux sont soumis à une injection sur animal vigile et une injection sur animal anesthésié (moins d’une minute chacune). Un prélèvement de sang sur animal anesthésié est réalisé (maximum 20 min). Pour la seconde procédure, les animaux sont soumis à une injection sur animal vigile et 3 injections sur animal anesthésié (moins d’une minute chacune). Un cathéter intraveineux est mis en place et une procédure chirurgicale est réalisée (maximum 3h30, observation au microscope comprises). AJOUT Pour la troisième procédure les animaux sont soumis à une injection sur animal vigile et une injection sur animal anesthésié (moins d’une minute chacune). Un prélèvement de sang sur animal anesthésié est réalisé (maximum 20 min).
Impact sur les animaux
Une des nuisances attendue est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). On pourra également observer une douleur localisée de courte durée après les injections. On pourra observer d’éventuels saignements dus à la nature antiplaquettaire des molécules injectées. Un gonflement au site d’injection pourra être observé. Une perte de poids, due à la formation de métastases, pourra également être observée.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux sont mis à mort car la quantité de sang prélevée n’est pas compatible avec un maintien en vie des animaux. De même, l’injection de cellules tumorales ne permet pas un maintien en vie des animaux pour réutilisation dans une procédure ultérieure.
Remplacement
Le processus de formation de métastases étant particulièrement complexe et faisant intervenir plusieurs types de cellules (plaquettes, globules blancs, cellules endothéliales, cellules tumorales etc), l’environnement de la tumeur ainsi que les conditions de flux sanguin (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. Nous disposons néamoins de modèles in vitro qui permettront d’étudier au préalable ce processus avec des plaquettes et des cellules tumorales humaines.
Réduction
Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum. Ces effectifs permettent l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Une habituation est prévue 5 jours avant le début de l’expérimentation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: •Par l’hébergement en groupes sociaux. •Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures. •Par l’injection d’antalgique et d’analgésiant aux site d’incisions et application d’anesthésique local sur l’oeil •Contre la déshydratation, une injection de sérum physiologique est réalisée avant la procédure. •Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant la procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles de cancer. Les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant un récepteur humain permettant d’étudier l’effet de nouveaux traitements ciblant ce récepteur. De même, cela a permis la génération de souris déficientes pour ce récepteur. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois pour toutes les procédures. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Impact de l’obésité sur la réponse osseuse à la charge et à la décharge mécanique chez la souris femelle
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
160 souris femelles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. La moitié suivent un régime gras, puis toutes sont suspendues par la queue pour immobiliser leurs pattes arrière, ou centrifugées à deux fois la gravité, afin de mesurer la réaction de leurs os à l'inactivité ou à la surcharge. Le porteur situe l'intérêt de ces mesures pour la santé osseuse des personnes obèses au long terme. Il décrit la suspension et la centrifugation comme sources possibles de perte de poids, de vertiges et de baisse d'appétit.
Objectifs
Le projet vise à comprendre comment l’obésité modifie la façon dont nos os réagissent à l’activité physique ou à la sédentarité. L’obésité est un problème de santé majeur, associé à de nombreuses maladies, mais son impact sur la solidité et la régénération des os reste mal connu. Nous étudierons ce phénomène chez des souris nourries avec un régime standard ou un régime riche en graisses, soumises à deux conditions extrêmes : l’inactivité forcée (la suspension de la queue simulant la sédentarité ou la microgravité) et la surcharge mécanique (la centrifugation à 2G équivalent d’un effort intensif). Après ces expériences, nous analyserons la structure des os, ainsi que les changements cellulaires, moléculaires et génétiques. Ces travaux permettront de mieux comprendre comment l’obésité perturbe la réponse mécanique du squelette et d’identifier de possibles différences entre mâles et femelles. Les résultats constitueront une base de données pour la recherche sur la santé du squelette, avec des implications pour la prévention et les traitements adaptés à chaque profil métabolique.
Bénéfices attendus
Le projet cherche à comprendre en détail comment les cellules qui contrôlent la santé des os (les ostéocytes) réagissent aux mouvements ou au manque d’activité lorsque l’organisme est en situation d’obésité. Ces cellules jouent un rôle essentiel : elles resentent les pressions et les forces exercées sur les os et ajustent leur solidité en conséquence. En étudiant leur comportement dans un contexte d’obésité, nous espérons découvrir pourquoi les os des personnes obèses ne réagissent pas toujours de la même manière à l’exercice physique ou à l’inactivité. Les résultats de ce travail seront utiles à la communauté scientifique, en apportant de nouvelles données accessibles à tous dans les domaines de la physiologie osseuse et du métabolisme. À plus long terme, ces connaissances aideront les chercheurs et les médecins à mieux comprendre les effets de la sédentarité et de l’exercice sur le squelette des personnes obèses, et à adapter les traitements contre la perte osseuse selon le profil métabolique de chaque patient.
Procédures
Micro-tomographie aux rayons X : On réalise des images des os (tibia et fémur gauches) des souris pour observer leur structure. Les souris sont endormies, puis placées dans un appareil de scanner pendant environ 30 minutes. Ces acquisitions sont faits plusieurs fois (aux semaines 24 et 26, avant et après une contrainte mécanique). Après, les souris sont remises dans leur cage une fois réveillées. La dose de rayons X utilisée est faible et ne présente pas de danger pour leur santé ni pour leurs os. Injection de tétracycline : On injecte un produit (tétracycline) à deux moments précis (jours 7 et 12) pour marquer les zones où l’os est en train de se former. Cela permet ensuite de mieux étudier la croissance osseuse. Mesure de la glycémie : Le taux de sucre dans le sang est mesuré après 4 heures de jeûne. On prélève une petite goutte de sang au niveau de la mâchoire à l’aide d’une lancette, puis on nettoie et on comprime la zone. Ces mesures sont réalisées trois fois (semaines 18, 24 et 26).
Impact sur les animaux
Suspension : Les souris sont placées seules dans leur cage avec un aménagement simple. Cela permet de limiter l’utilisation de leurs pattes arrière pour les besoins de l’étude. On observe parfois une petite perte de poids au début, mais leur état se stabilise ensuite. Le dispositif est conçu pour éviter les blessures, notamment au niveau de la queue. Si une irritation apparaît, elle est soignée. Les souris en suspension peuvent se déplacer en utilisant leurs pattes avant et ont un accès facile à la nourriture et à l’eau. Centrifugation : La centrifugation en 2g (exposition à une force équivalente à 2 fois la gravité) ne provoque pas de stress important, mais peut entraîner des vertiges. Cela peut réduire temporairement leur appétit et leur consommation d’eau pendant 1 à 2 jours, et ralentir légèrement leur prise de poids. Les souris sont surveillées en continu (vidéo), et leur poids ainsi que leur alimentation sont régulièrement contrôlés avant, pendant et après l’expérience.
Devenir
Toutes les analyses complémentaires et les prélèvements d’échantillons sont réalisés à la fin de l’expérience. Les souris sont alors euthanasiées par du personnel qualifié, selon une procédure encadrée visant à éviter toute souffrance. Cette étape permet de prélever différents organes afin de réaliser des analyses approfondies (au niveau des cellules, des tissus et du fonctionnement de l’organisme).
Remplacement
Aujourd’hui, il n’existe pas de modèle en laboratoire (sur cellules) ni de simulation informatique capable de reproduire la complexité du fonctionnement de l’os dans un organisme vivant. L’os est influencé par de nombreuses cellules différentes et par plusieurs systèmes du corps (comme les hormones, le métabolisme ou le système immunitaire), qui interagissent en permanence. Les expériences réalisées sur des cellules permettent d’étudier certains facteurs séparément (comme l’obésité ou les contraintes mécaniques), mais elles ne reflètent pas l’ensemble des interactions qui se produisent dans un organisme entier. Dans notre étude, nous combinons ces facteurs pour observer leurs effets globaux sur l’os. Cela inclut des éléments importants comme les hormones, le métabolisme ou les molécules circulant dans le sang, qui ne peuvent pas être reproduits en laboratoire. La souris est donc utilisée comme modèle, car son fonctionnement osseux et son métabolisme sont proches de ceux de l’être humain et permet d’étudier de manière plus complète comment l’os réagit dans des conditions proches de la réalité. Enfin, les résultats obtenus chez la souris aideront à améliorer les futurs modèles en laboratoire, en apportant des données plus précises pour mieux reproduire le fonctionnement réel du corps.
Réduction
Il n’existe pas d’étude portant sur des souris femelles obèses soumises à des protocoles de suspension ou de centrifugation. Le nombre de souris utilisées a été calculé pour être le minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats fiables. Ce calcul s’appuie à la fois sur l’expérience du laboratoire et sur des données scientifiques déjà publiées. Des analyses statistiques ont permis d’estimer le nombre d’animaux requis, en tenant compte des variations entre individus et de la précision des mesures. Ainsi, 20 souris par groupe sont nécessaires pour réaliser l’ensemble des analyses. Enfin, l’étude est organisée de manière rigoureuse (plusieurs groupes, conditions identiques, répartition équilibrée selon le poids) afin de garantir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pendant toute l’expérience, les souris sont suivies de près par du personnel formé afin d’assurer leur bien-être. Elles reçoivent des soins attentifs tout au long du protocole. Elles sont hébergées dans des cages adaptées aux conditions de l’étude (suspension ou centrifugation). Pour la suspension, les souris sont placées seules dans des cages aménagées de façon à empêcher l’utilisation de leurs pattes arrière. Les souris sont surveillées tous les jours, et même deux fois par jour pendant les phases les plus contraignantes. Les chercheurs vérifient leur état général (poids, pelage, comportement, alimentation, digestion) ainsi que tout signe de stress ou de souffrance. Une légère perte de poids peut apparaître au début, mais elle est temporaire et le poids se stabilise ensuite. Si un animal présente des signes importants de souffrance (par exemple une perte de poids trop importante), il est immédiatement retiré de l’étude. Les manipulations sont réalisées de manière à limiter au maximum le stress : les souris sont endormies pour certaines procédures et se réveillent dans leur cage. Des dispositifs adaptés permettent d’éviter les irritations ou blessures, et tout problème éventuel est pris en charge rapidement. Enfin, leur poids et leur alimentation sont régulièrement contrôlés tout au long de l’étude pour s’assurer que leur état reste satisfaisant.
Choix des espèces
Les modèles invertébrés ne sont pas adaptés à l'étude de la physiologie osseuse car ils possèdent un exosquelette chitineux et non un endosquelette osseux. Pour les vertébrés, les rongeurs, et en particulier la souris, représentent modèles les plus pertinents et les moins exposés aux contraintes éthiques ou logistiques. La souris est un modèle robuste pour l'étude de l’os et des effets de la charge/décharge mécanique. Elle permet l’analyse fine des mécanismes moléculaires, cellulaires et tissulaires spécifiques impliqués dans l’homéostasie osseux. Le modèle murin utilisé ici pour simuler les contraintes mécaniques de décharge et charge mécanique, est particulièrement adapté, en raison de la petite taille et le poids de la souris qui limite l’impact des manipulations expérimentales. Ce modèle permet également le suivi in vivo de la cinétique de la perte osseuse par micro-tomographie aux rayons X ainsi que la récupération post-mortem des tissus et organes nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires. Nous utiliserons des souris femelles adultes, nous commenceront le régime riche en graisses à 8 semaine d’âge et les souris auront l’âge de 26 semaines quand protocole se termine (mise à mort et prélèvement de tissus par dissection). Le recours à des souris plus jeunes introduirait un biais de confusion important lié à la croissance active de la souris avec des retombées directes et indirectes sur le squelette. De plus, le choix est également dicté par le besoin d’utiliser des souris matures sur le plan squelettique au moment de la stimulation par charge et décharge mécanique. Concernant l’induction de l’obésité, les souris recevront un régime riche en graisses à partir de 8 semaines correspondant à 16 semaines avant la contrainte mécanique. Cette durée est nécessaire pour induire une obésité stable et reproductible. L’obésité étant un facteur clé de l’étude, ce délai est indispensable pour garantir la validité des comparaisons entre groupes et la robustesse des résultats obtenus.
Etude d’efficacité de nouveaux candidats médicaments dans deux modèles de souris de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), ou maladie de Charcot (MODIFICATIONS)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Génétiquement modifiées pour développer une forme de sclérose latérale amyotrophique, 3 030 souris perdent progressivement l'usage de leurs membres postérieurs, jusqu'à la paralysie pour l'une des lignées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des administrations répétées de candidats médicaments par voie orale, intraveineuse ou intrathécale sous anesthésie, des prélèvements de sang mensuels et une pose de pompe sous-cutanée. Toutes sont tuées, une partie dès l'atteinte d'un point limite avant la fin, pour prélever leurs organes. Le porteur revendique le recours à l'animal comme "incontournable", faute de méthode évaluant les symptômes moteurs de la maladie.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), appelée couramment maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative qui se caractérise par une dégénérescence progressive des neurones du cortex moteur, des motoneurones du tronc cérébral et de la moelle épinière. On distingue des formes sporadiques et des formes familiales. Quelle que soit la forme de la maladie, les signes cliniques sont identiques. Cependant, en fonction de la région initiale d’atteinte, on distingue deux variétés de SLA : (1) une forme spinale qui affecte tout d’abord les motoneurones de la moelle épinière et qui est caractérisée par une atteinte de la motricité des membres supérieurs et inférieurs; et (2) une forme bulbaire, affectant les motoneurones du tronc cérébral et provoquant des troubles de la parole et de la déglutition. Au cours des 25 dernières années, la recherche sur les patients SLA a révélé des mutations dans plus de 20 gènes, dont 2 d’entre eux sont les plus affectés et ont été associés à des cas familiaux de la SLA. Des mutations de ces 2 gènes ont été associées à la neurodégénérescence observée dans la SLA. Par conséquent, ces deux gènes font actuellement l’objet de nombreuses recherches, notamment pour le développement de stratégies thérapeutiques. Afin d’étudier la progression de la maladie et d’aider au développement de nouveaux candidats médicaments, des modèles de souris transgéniques ont été générés pour mettre en évidence les mécanismes physiopathologiques responsables de la dégénérescence moto-neuronale observée dans la SLA. Par conséquent et pour étudier deux voies fortement représentés chez les malades de la SLA, nous utiliserons dans ce projet deux modèles de souris transgéniques dont les deux gènes d'intérêt ont été modifiés et présentant des signes pathologiques qui reprennent la pathologie humaine sous sa forme spinale avec une dégénérescence progressive des motoneurones entraînant un déficit moteur progressif. Les souris présentent, à partir de 6 semaines, des tremblements des membres inférieurs, des signes de faiblesse musculaire ainsi que des déficits moteurs qui s’aggrave avec l’âge. Ces deux modèles fournissent des outils précieux pour identifier les mécanismes sous-jacents à la pathogenèse SLA et pour étudier les stratégies thérapeutiques à mettre en place pour arrêter la maladie, et dans notre cas, d’étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Bénéfices attendus
La sclérose latérale amyotrophique (SLA), ou maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte des motoneurones à la fois centraux et périphériques. Il s'agit de la plus fréquente des maladies du motoneurone de l'adulte (environ 2.5 malades pour 100000 habitants en France). Son diagnostic repose avant tout sur des éléments cliniques et l'exclusion d'autres pathologies. Ainsi, le délai entre l'apparition des symptômes et la pose du diagnostic est souvent long (9 à 13 mois), alors même que l'évolution de la maladie est rapide, avec un décès survenant généralement dans les 3 à 5 ans (le plus souvent par détresse respiratoire). Il s'agit d'une pathologie complexe et hétérogène dont les processus physiopathologiques sont encore mal compris. Les seuls traitements actuellement utilisés chez les patients atteints de SLA ne permettent, tout au plus, qu'une amélioration mineure de la survie, avec des résultats controversés. Ainsi, ce projet est utile pour avancer dans le traitement de cette maladie et donc le développement de nouveaux candidats médicaments.
Procédures
Dans ce projet, 2 lignées d’animaux génétiquement modifiés à phénotype dommageable sont étudiées. Les deux lignées sont des modèles de la sclérose latérale amyotrophique (ou maladie de charcot) mais ne développent pas la maladie de la même façon puisque les voies altérées dans les deux lignées sont différentes. Pour la lignée SOD1, les animaux développent des déficits moteurs qui évoluent tout au long de la vie de l’animal pour atteindre une paralysie des membres postérieurs et une diminution significative du poids (points limites définis dans le projet). Pour la lignée TDP-43, les animaux développent des déficits moteurs qui évoluent assez rapidement et se limite au bout de quelques semaines à une atteinte des membres postérieurs induisant une démarche laborieuse. Contrairement à la lignée SOD1, aucune paralysie des membres postérieurs n’est observée, les animaux ne montrent pas de perte de poids significative et il n’y a pas de mort prématurée observable sur la durée de notre projet. Des administrations seront réalisées sur animaux vigiles (1 à 2 minutes selon le type d’administration hormis pour les administrations intrathécales (MODIFICATION) ET SOUS-CUTANÉES CONTINUES PAR POMPE OSMOTIQUE. Les fréquences d'administration dépendront des caractéristiques pharmacologiques des candidats médicaments. La fréquence et la durée maximales d'administration sont définies selon le type d'administration utilisée de la façon suivante : -Administration orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée : 1 administration par jour pendant 3 mois -Administration intraveineuse : 2 administrations par semaine pendant 3 mois -Intranasale : 1 administration par jour pendant 6 mois -Intrathécales 3 administrations maximum réalisées sous anesthésie générale à une fréquence d’une par mois (temps minimal entre chaque administration). La durée de l’administration sera de 15-20 min environ. MODIFICATION : -SOUS CUTANÉE CONTINUE PAR IMPLANTATION DE POMPE OSMOTIQUE 15 MINUTES ENVIRON PAS PLUS DE 3 RENOUVELLEMENT AVEC 2 SEMAINES ENTRE CHAQUE RENOUVELLEMENT MINIMUM. Des prélèvements de sang à la veine mandibulaire seront réalisés tous les mois (durée environ 2 min). MODIFICATION : UN PRELEVEMENT DE LIQUIDE CEPHALO-RACHIDIEN POURRA ETRE REALISE SOUS ANESTHESIE GENERALE ET ANALGESIE JUSTE AVANT LA MORT DE L’ANIMAL (DUREE DU PRELEVEMENT 20 MIN MAXIMUM).
Impact sur les animaux
Ces modèles de souris transgéniques présentent des phénotypes dommageables avec une dégénérescence progressive des motoneurones entraînant un déficit moteur. Pour une des lignées, les animaux développent des difficultés progressives de mouvements des membres postérieurs, de perte de poids significative ou de mort prématurée avant la fin de l’étude. Les animaux issus de l'autre lignée utilisée dans ce projet développent également des difficultés progressives de mouvements des membres postérieurs allant jusqu’à la paralysie complète. Chez le fournisseur, les animaux à l'âge de 10 jours sont soumis au prélèvement d'un petit morceau de queue utilisé comme matériel biologique pour le génotypage. Lors du transport des animaux par avion d'une durée maximale de 5 jours (entre le moment où les animaux sortent de l’animalerie du fournisseur et celui où ils arrivent dans nos locaux), les animaux jeunes (3-4 semaines au minimum soit après sevrage) peuvent présenter un déficit moteur précoce léger dans le cas de la première lignée. Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. Dans notre projet, des études in vivo ont déjà été réalisées au préalable avec les candidats médicaments et ne montrent aucune toxicité particulière de ceux-ci. Les futurs candidats médicaments peuvent avoir différents mode d’administration. Une administration (intra-veineuse, per os, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intranasale) d’un candidat médicament entraîne une contention de l’animal qui peut induire un stress particulier. L’administration dans la colonne vertébrale sous l'arachnoïde au niveau lombaire (intrathécale) (MODIFICATION) ET L’IMPLANTATION D’UN DISPOSITIF DE DIFFUSION DE CANDIDAT MÉDICAMENT EN SOUS-CUTANÉ seront réalisées sous anesthésie générale précédée d’une analgésie. Ces actes peuvent entrainer une perte de poids des animaux ainsi qu'une légère déshydratation durant 24 à 48h. Un risque de lésion de la moelle épinière est possible dans moins de 5% des cas (MODIFICATION) POUR L’ADMINISTRATION INTRATHÉCALE. Un stress peut également être présent lors de la manipulation des animaux pour leur passage dans les différents tests moteurs. Des prélèvements de sang au niveau de la veine submandibulaire seront réalisés avec un intervalle minimal d’un mois sur animaux anesthésiés.
Devenir
En fin d’étude, pour des analyses sérologiques, histologiques, moléculaires et immunohistochimiques, les animaux seront soumis à différents types de prélèvements (organes) post mortem. L’ensemble des animaux arrivant au point limite avant la fin de l’étude comportementale sera mis à mort.
Remplacement
L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte d’un grand nombre de ces phénomènes, et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer les symptômes moteurs de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc incontournable pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.
Réduction
Les études internes précédemment réalisée dans notre EU sur les tests moteurs utilisés dans ce projet avec d’autres lignées ont montré qu’un nombre d’animaux égal à 15 par groupe est nécessaire pour observer des effets significatifs des candidats médicaments dans les tests comportementaux utilisés dans cette étude. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés. Les données seront présentées en moyenne et erreurs standard à la moyenne (SEM). Les différences entre les groupes seront évaluées à l’aide de tests paramétriques. Les tests paramétriques seront utilisés car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Des tests non paramétriques pourront être utilisés en deuxième intentions. Le choix des tests paramétriques ou non paramétriques sera fait en fonction des résultats obtenus dans le test de normalité. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, en plus des analyses comportementales, des prélèvements de sang et d’organes seront réalisés sur les animaux pour des études complémentaires.
Raffinement
(MODIFICATION) L’éleveur des animaux a obtenu la certification AAALAC et ISO9001. La certification AAALAC oblige à suivre une réglementation internationale très stricte en matière de bien-être animal et du principe des 3R. Une période d’habituation sans expérimentation est laissée aux animaux d’au minimum une semaine après leur arrivée. Durant cette période d'habituation, les animaux sont soumis à une évaluation journalière suivant la grille scoring mais aucune pesée de sera réalisée pour éviter un stress supplémentaire lié à la préhension de l'animal en surplus du stress récent induit par le transport et le changement d'environnement. Les souris seront ensuite pesées une fois par semaine. Lorsqu’une perte de poids sera observée, la fréquence des pesée pourra être augmentée en fonction de la perte de poids et de l‘apparition des déficits moteurs. Par ailleurs, leur état général sera évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un des points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Des procédures particulières seront mises en place suivant l’atteinte moteur des animaux (alimentation hydratée et hydrogel placé dans le fond de la cage). Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale afin de réduire le stress des animaux. Pour les procédures chirurgicales, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Après ces chirurgies et afin de faciliter leur convalescence, de l’hydrogel sera placé dans le fond de la cage pour les premières 24h et plus si besoin. Le poids des animaux sera suivi quotidiennement pendant une période minimale de (MODIFICATION) 48 OU 72h SELON LA CHIRURGIE et jusqu’à reprise du poids initial. Des procédures particulières pourront être mise en place en cas d’altération de l’état physique des animaux après la chirurgie (mise en place d’une analgésie, alimentation hydratée et hydrogel dans le fond de la cage en concertation avec le vétérinaire). Une période d’au moins (MODIFICATION) 7 À 10 jours de récupération sera respectée (MODIFICATION) SELON la chirurgie avant que les animaux ne soient soumis à un autre test de comportement.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments, et les données obtenues nous permettent maintenant de calculer les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette pathologie dans toute sa complexité. En effet, les animaux sont essentiels pour modéliser les mécanismes physiopathologiques de la SLA. Ils sont donc nécessaires pour évaluer l'efficacité des candidats médicaments. Au minimum 5 semaines pour la lignée TDP-43 et 12-13 semaines pour la lignée SOD1 au début de l’analyse comportementale. Dans ce projet, l’expérience et l’administration de traitements sont initiés à un moment où les animaux sont jeunes, avant le début des premiers symptômes pour pouvoir commencer à administrer le candidat médicament au moment où les premiers symptômes de la maladie apparaissent. Le génotypage est effectué chez le fournisseur à l'âge de 10 jours. Ils partiront de chez lui, après sevrage, à l'âge de 3-4 semaines pour la lignée TDP-43 (au minimum) et plus tardivement pour les souris SOD1 (au minimum 10 semaines).
Evaluation de l’efficacité d’un traitement innovant anti-tumoral chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
Jusqu'à vingt-et-une injections, huit séances d'imagerie sous anesthésie et une greffe de cellules cancéreuses par animal: 860 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet teste une thérapie fondée sur l'ARN messager, censée introduire des mutations toxiques dans les cellules tumorales. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids et un mal-être général. Les bénéfices annoncés, un traitement d'autres cancers à "mauvais pronostic", restent renvoyés au long terme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester des thérapies géniques innovantes (en utilisant la technologie de l’ARN messager, similaire à l’utilisée pour fabriquer les vaccins contre le covid) en introduisant des mutations toxiques spécifiquement dans des cellules tumorales injectées au préalable chez la souris. Ce projet nous apportera les preuves précliniques du potentiel de ce type de traitement comme thérapie innovante anti-cancéreuse.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider la capacité du nouveau traitement à induire la mort des cellules cancéreuses dans un modèle tumoral. Les résultats serviront également de base à l’exploration de l’efficacité de notre traitement innovant pour traiter d'autres cancers, en particulier des tumeurs solides à mauvais pronostic.
Procédures
- Souris injectées (21 fois au maximum / souris.) Durée de l’intervention : quelques secondes par souris. - Souris anesthésiées (10 fois maximum / souris). Durée de l’intervention : quelques minutes par souris. - Imagerie sur souris anesthésiées (8 fois maximum /souris). Durée de l’intervention : environ 10 minutes. - Souris qui subiront des prélèvements de sang (2 prélèvements au maximum). Durée de l’intervention : quelques secondes par souris.
Impact sur les animaux
Les tumeurs (issues des cellules cancéreuses injectées) peuvent induire une perte de poids et un mal être général. D’autres effets indésirables pourraient être attendus : - Les injections et prélèvement de sang causent un stress et douleur modéré de courte durée. - La contention nécessaire pour l’imagerie cause un stress et douleur légère de courte durée. Une anesthésie sous forme gazeuse sera réalisée avant la manipulation de la souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour les raisons suivantes : prélèvements des tissus d’intérêt à la fin de la procédure expérimentale ou point limite atteint avant.
Remplacement
L’efficacité des approches de thérapies innovantes antitumorales ne peut être évaluée que dans un modèle mimant la pathologie. Les expériences sur l’animal sont donc nécessaires et justifiées avant leur application chez l’homme.
Réduction
Le nombre de souris est le minimum nécessaire pour obtenir des données reproductibles tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. En plus, les mesures nécessaires sont effectuées sur les mêmes animaux tout au long de l’expérimentation.
Raffinement
L’imagerie sera faite en même temps que les observations nécessaires au suivi des animaux. Des points limites strictes et spécifiques au projet sont mis en place.
Choix des espèces
Les souris ont été décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour étudier le développement des leucémies humaines et servir de modèles pour l’évaluation de nouvelles thérapies. L'utilisation de la souris est parfaitement adaptée à la durée du projet, aux quantités de cellules leucémiques nécessaires pour la réalisation du projet, et pour modéliser l'administration de molécules thérapeutiques chez l'Homme. Nous allons utiliser des souris jeunes adultes au début des expérimentations (6-10 semaines de vie), choix le plus approprié par rapport au développement des leucémies aigues chez l’homme.
Rôle de la lipide kinase PIKfyve dans la cardiomyopathie diabétique EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumises pendant douze semaines à un régime enrichi en graisse, à des injections quotidiennes et à des échocardiographies hebdomadaires sous anesthésie, 800 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le projet vise à préciser le rôle d'une enzyme, PIKfyve, dans la cardiomyopathie du diabète et à tester des pistes thérapeutiques. Les retombées annoncées pour les patients restent renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que seul le recours à un "organisme entier" permet de prévoir la réponse au traitement et conclut que la souris est "indispensable".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque (IC) est l’une des premières causes de mortalité/morbidité dans le monde. Le diabète est une complication majeure de l’IC, et l’augmentation épidémique actuelle de l’obésité et du diabète font que la cardiomyopathie de type diabétique devient un problème majeur de santé publique, pour lequel les solutions thérapeutiques sont très limitées. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle d’une enzyme spécifique dans le développement de la cardiomyopathie de type diabétique et également de tester de nouvelles thérapeutiques pour lutter contre cette pathologie. Le projet se déroule dans deux Etablissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre le rôle d’une enzyme dans la progression de la cardiomyopathie diabétique, problématique majeure de santé publique, et permettra d'améliorer nos connaissances sur la progression de cette pathologie multifactorielle et complexe. A long terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer les traitements existants et offrir de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrant de cette pathologie, réduisant ainsi la morbi-mortalité associée.
Procédures
Les souris suivront plusieurs types d’interventions : alimentation modifiée enrichie en graisse pendant 12 semaines ; des examens hebdomadaires du cœur par échocardiographie (une fois par semaine, environ 10 min, sur animal anesthésié) ; des mesures de la composition corporelle (% masse grasse) réalisées en début et à la fin du protocole (sur animal vigile, 2 min par mesure) ; des injections journalières pendant 12 semaines (durée environ 10 secondes chacune, sur animal vigile) ; des exercices physiques adaptés, en début et en fin de protocole (quelques minutes par séance) ; un test de tolérance à l’insuline et au glucose en début, milieu et fin de protocole (intervention de 2h). L'ensemble des interventions auront lieu dans l'établissement utilisateur 1.
Impact sur les animaux
Certains régimes peuvent entraîner une prise de poids, une fatigue ou une réduction de mobilité. Des traitements peuvent provoquer une tension élevée ou une inflammation. Les signes de douleur ou d’inconfort seront surveillés, et des mesures seront prises pour soulager les animaux ou les retirer de l’étude si nécessaire. Les anesthésies nécessaires aux échocardiographies peuvent entraîner une récupération lente ou une hypothermie passagère.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de protocole afin de permettre les prélèvements d’organes et leurs analyses, qui ne peuvent pas être réalisés sans mise à mort.
Remplacement
L’utilisation du modèle murin est indispensable pour étudier l’interaction entre les différents types cellulaires cardiaques, les systèmes vasculaire et immunitaire. Seul le recours à un organisme entier permet de prévoir la réponse thérapeutique à la molécule testée.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en respectant la variabilité biologique et sans compromettre les résultats scientifiques attendus. Chaque animal sera utilisé pour mesurer un maximum de caractéristiques du développement de la pathologie (physiologiques, anatomiques, histologiques, biochimiques et moléculaires). Ceci permettra de limiter au maximum le nombre de souris utilisées au final.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, nous mettrons en place plusieurs mesures visant à assurer le bien-être des animaux et à réduire au maximum la douleur et la souffrance associées aux procédures expérimentales : - litière absorbante, renouvelée régulièrement, permettant les comportements naturels (fouille, creusage, nidification). De plus, les animaux obèses seront suivis plus régulièrement (remplissage des biberons, changement de litière plus fréquent si nécessaire). - interaction sociale préservée : les souris seront hébergées en groupes de 5 individus pour éviter l’isolement. - accès libre à l’eau et à la nourriture. Les échocardiographies seront réalisées sous anesthésie légère avec maintien thermique et du gel oculaire sera appliqué pour prévenir la déshydratation. - Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement tout signe de souffrance, de détresse ou d’inconfort : poil ébouriffé, posture anormale, signes de déshydratation, détection de signes de douleur (respiration anormale, mouvements réduits, vocalisations inhabituelles), analyse du comportement : isolement, diminution des interactions sociales, réduction de l’activité locomotrice, perte de poids. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé et qualifié, afin de réduire la durée et le stress des interventions. Ces mesures permettront de limiter au maximum la souffrance animale tout en assurant la qualité et la fiabilité des résultats obtenus dans cette étude. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied (moins de 10 minutes), à l’écart du public, dans les cages de transport sécurisées. Les cages seront placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.
Choix des espèces
L’espèce souris a été choisie car elle représente le modèle mammifère le plus couramment utilisé pour les études sur l’insuffisance cardiaque et le plus représentatif de la pathologie humaine. Ainsi, les résultats obtenus seront plus facilement transposables à l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge de 2 mois, correspondant à un stade jeune adulte, adapté aux objectifs de l’étude.
Evaluation d’une approche par thérapie génique dans un modèle murin de Charcot-Marie-Tooth 4C. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Soumises à des tests répétés sur rotarod, de force musculaire et à des mesures par électrodes implantées sous la peau, 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces souris reproduisent la maladie de Charcot-Marie-Tooth et reçoivent une injection unique d'un vecteur de thérapie génique sous anesthésie. Les tests, réalisés deux à trois fois selon les animaux, précèdent le prélèvement des organes après mise à mort. Le porteur espère un effet transposable à l'humain, un bénéfice qui reste conditionné aux résultats obtenus sur ce modèle.
Objectifs
La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une neuropathie d'origine génétique qui se manifeste dès l'enfance ou à l'âge adulte par une faiblesse musculaire et une diminution de la sensibilité des pieds et des mains. Ces manifestations sont la conséquence d'une atteinte des nerfs périphériques des jambes et des bras. Elle est accompagnée d'une atrophie musculaire progressive. La CMT touche environ 1 personne sur 2 500 dans la population générale à la naissance. Le modèle murin étudié développe les mêmes symptômes que ceux décrits chez l’Homme : faiblesse musculaire, diminution de la sensibilité au niveau des pattes. Contrairement à l’homme ces souris ne présentent pas de scoliose. Ces manifestations sont la conséquence d’une atteinte des nerfs périphériques. Ces souris ont un développement et une durée de vie comparable à celles de souris génétiquement non modifiées Ce modèle murin permettra d’étudier les effets du traitement par transfert de gène sain. Dans un premier temps, nous évaluerons les effets de cette thérapie avec des tests comportementaux : force musculaire, position des pattes, sensibilité à un stimulus électrique (électromyographie). Dans un second temps, une analyse biomoléculaire et histologique sera réalisée afin de regarder les effets de ce traitement par transfert de gène au niveau cellulaire et tissulaire.
Bénéfices attendus
La thérapie génique est en plein développement dans plusieurs maladies humaines, notamment dans certaines affections neurologiques. Elle s’appuie sur une dizaine d’années d’essais chez l’homme. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique dans notre modèle ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement applicable à l’homme.
Procédures
Injection du vecteur) : Cette injection (1 seule par animal) se fera sous anesthésie en moins de 15 secondes. Habituation à l’expérimentateur : 3 minutes par jour par souris, 5 jours consécutifs. Une à deux fois selon le protocole. Tests comportementaux : Deux types de tests comportementaux seront réalisés afin d’évaluer la coordination et la force musculaire de l’ensemble des animaux. Ces tests vont permettre d’étudier les effets du traitement par transfert de gène thérapeutique dans le système périphérique pour contrecarrer les mécanismes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Test 1 : test de coordination Durée : 20 minutes/jour c’est-à-dire 4 passages d’environ 5 minutes max sur le rotarod avec 1 heure de repos entre chaque passage. Répétition : 3 jours consécutifs Test 2 : test de force musculaire Durée : 15 minutes Répétition : 1 fois par jour, 3 jours consécutifs Test 3 : test pour évaluer l’asymétrie motrice Durée : 15 secondes Répétition : 1 fois Ces trois tests seront réalisés MODIFICATION : 2 À 3 fois selon les animaux. Mesures électrophysiologiques : Ces tests se feront sur des animaux anesthésiés. Ces tests seront réalisés après les tests comportementaux, les animaux seront donc habitués à l’expérimentateur. La mesure de la vitesse de conduction nerveuse consiste à stimuler un nerfet à mesurer la vitesse de transmisssion du signal. . Parallèlement, la réponse d'un muscle distal sous influence du nerf stimulé est recueillie par d’autres électrodes. Durée : 15 minutes maximum. MODIFICATION 2 À 3 répétitions selon les animaux. Répétition : les mesures seront réalisées au total 2 À 3 FOIS selon le groupe.
Impact sur les animaux
- Une possible complication liée à l’injection - est un gonflement autour du site d’injection. - Les tests comportementaux sont réalisés sur les animaux vigiles et sont conçus pour entrainer un minimum de nuisances. Cela peut cependant entrainer un stress chez les animaux que nous maintiendrons le plus bas possible. . Les mesures électrophysiologiques nécessitent l’implantation de fines électrodes sous la peau. L’implantation de ces électrodes est comparable à la pénétration d’une aiguille fine dans la peau. Cela peut entraîner un picotement ou une légère piqûre. Les souris CMT ont un développement, une durée de vie, et une fertilité comparable à celles des animaux non génétiquement modifiées. Cette pathologie se caractérise par une crispation des orteils et une diminution de la vitesse de conduction nerveuse. La diminution de la vitesse de conduction nerveuse peut se traduire chez l’animal par une faiblesse musculaire, pouvant entrainer une diminution du poids.
Devenir
A la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés. Le but est de prélever les organes post-mortem et de réaliser des analyses tissulaires.. Le but est de regarder l’effet du vecteur thérapeutique sur les marqueurs de la maladie de Charcot-Marie-Tooth.
Remplacement
Toutes les constructions génétiques utilisées seront caractérisées in vitro avant leur utilisation chez l’animal. Des études in vitro sur des cultures de cellules ont déjà été menées. Cependant, elles ne nous permettent pas d’évaluer l’efficacité du vecteur pour corriger les manifestations cliniques de la maladie à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
La constitution des groupes est basée sur notre expérience et le type d’analyses réalisées, afin d’obtenir des données statistiquement significatives permettant d’évaluer l’effet thérapeutique du traitement. Nous avons effectué une recherche bibliographique afin de nous assurer de ne pas dupliquer des protocoles expérimentaux déjà réalisés. Cette recherche nous a permis d’optimiser nos procédures et le nombre d’animaux afin d’obtenir des résultats statistiques exploitables, robustes et valables. La constitution des groupes est également basée sur notre expérience et le type d’analyses réalisées, et un test statistique. Les effectifs prévus ont été réduits au maximum.
Raffinement
L’injection du vecteur thérapeutique se fera sous anesthésie générale. Un analgesique sera appliqué au niveau de l’œil avant que l’animal ne soit placé dans la boîte à induction. Une fois l’animal endormi, l’injection est réalisée en moins de 15 secondes par un expérimentateur maitrisant cette technique. La souris injectée est ensuite placée dans une cage propre jusqu’à son réveil. Elle est ensuite immédiatement replacée dans sa cage d’origine. Une observation hebdomadaire des animaux, des pesées hebdomadaires seront réalisées. Un soutien nutritionnel sera apporté si besoin. Test comportementaux et tests d’électrophysiologie: Les tests seront précédés d’une phase d’habituation (handling) à l’expérimentateur afin de minimiser le stress et d’assurer une reproductibilité optimale de ces expériences. Puis auront les tests d’éléctrophysiologie. Cinq minutes avant l’anesthésie, la peau sera insensibilisée avec de la crème analgesique au niveau des sites de pose des électrodes afin d’éviter le picotement ou la légère piqûreCes tests seront réalisés après les tests comportementaux, les animaux seront donc habitués à l’expérimentateur. Pendant les mesures l’animal sera placé sur un tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle. La souris est ensuite placée dans une boite chauffante jusqu’à son réveil. Elle est ensuite remise dans sa cage d’origine. Des points limites seront mis en place afin de s’assurer de réduire au maximum la douleur éventuelle : suivi respiratoire, arrêt des tentatives de mesures électrophysiologiques en cas de 2 échecs consécutifs lors des mesures. Des points limites ont été établis afin de réduire au maximum les nuisances chez les animaux. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce d’étude préclinique a plusieurs justifications : - l’existence d’un modèle murin reprenant de nombreuses caractéristiques de la maladie humaine - la grande majorité des études de thérapie génique commence dans un modèle de souris pathologique, et selon les résultats peut se déployer chez un plus grand animal - la maitrise par notre équipe des tests comportementaux et électrophysiologiques chez la souris permettra une étude fine de ce modèle. L’injection du vecteur se fera à deux stades de vie différents : - à l’âge de 10 jours de vie dans le but de stopper ou ralentir l’apparition des signes cliniques - à l’âge de 3 mois , à un moment où les signes cliniques sont déjà présents. Le but est de ralentir l’évolution des signes cliniques ou les stopper.
Validation moléculaires de modèles génétiquement modifiés
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
1500 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux injections quotidiennes de tamoxifène pendant cinq jours pour déclencher une mutation, puis sont tuées pour vérifier au niveau des tissus que la modification a bien eu lieu. Le projet ne produit pas de résultat biologique en soi, il valide des lignées avant des études ultérieures. Le porteur justifie 30 animaux par lignée analysée, sans détailler le nombre de lignées qui aboutit au total de 1500 souris.
Objectifs
Dans le cadre de la recherche de nouvelles pistes thérapeutiques, l'analyse du rôle joué par chaque gène dans l'organisme est l'une des pistes souvent explorées. Parmi les différents moyens pour effectuer ce type d'analyse, l'utilisation de modèles animaux constitue souvent l'étape finale permettant d'étudier des mécanismes complexes (métabolisme, immunité, comportement) qui ne peuvent pour l'instant être modélisés in vitro ou in silico. Pour générer ces modèles animaux, de nombreuses technologies existent visant à modifier le gène dans une partie du génome et dans son ensemble. De plus, il est possible de n’exprime la modification génétique que lorsque certaines molécules sont injectées. Ainsi, le gène s’exprime normalement pendant le développement de l’animal, mais peut être muté sous contrôle d’un traitement à l’âge adulte. Ce type de mutation conditionnelle nécessite des étapes de validation moléculaire qui sont indispensables avant de réaliser des protocoles d’analyses plus complets. Le but de ce projet est justement de réaliser cette étape de validation sur l’ensemble des modèles animaux génétiquement modifiés que nous obtenons. Pour cela, nous injecterons une molécule, le tamoxifène, qui déclenche l’expression de la mutation génétique qui a été mise en place. Les animaux seront ensuite étudiés au niveau des tissus pour valider que les modifications génétiques ont lieu tel qu’attendu.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de progresser dans notre connaissance des gènes étudiés en recherche préclinique. À plus long terme, ces données pourront contribuer au développement de médicaments pour l’Homme.
Procédures
Durant ce projet, les animaux recevront deux injections intrapéritonéales par jour pendant 5 jours. Chaque injection dure moins de une minute.
Impact sur les animaux
Une injection peut induire une légère douleur et un stress lié à la contention. Chaque injection dure moins de une minute et les animaux seront surveillés pendant l'heure qui suit.
Devenir
À l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre l'examen détaillé de leurs organes, essentiel pour comprendre la fonction du gène supprimé.
Remplacement
Dans ce projet visant à valider des modèles génétiquement modifiés destinés à l’étude de mécanismes physiologiques complexes, le recours à un mammifère est indispensable, aucune approche in vitro ni aucune modélisation informatique ne pouvant, à l’heure actuelle, se substituer à l’analyse du gène cible dans son environnement naturel et dans l’ensemble de ses interactions au sein de l’organisme.
Réduction
Pour réaliser ce type d’analyse, un faible nombre d’animaux requis par groupe. Ainsi, nous utiliserons 5 animaux par condition. Afin de disposer des contrôles adéquats, nous pourrons utiliser jusqu’à 6 groupes expérimentaux selon la mutation utilisée. Ainsi pour une mutation étudiée, nous pourrions employer 30 animaux par lignée analysée. Cet effectif constitue un minimum pour obtenir des résultats qui soient analysables et pouvant permettre de conclure sur la bonne réalisation de l’étude.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Une surveillance quotidienne de leur état, une pesée hebdomadaire, ainsi qu'un suivi régulier de leur état général seront mis en place pour garantir leur bonne santé. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâton et balles à ronger). En cas de conflit entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et, si nécessaire, procéderons à des soins locaux. Tout au long des procédures, des seuils limites spécifiques seront établis pour assurer que les animaux demeurent dans des conditions éthiquement acceptables et pour réagir de manière appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être.
Choix des espèces
La souris est l’animal modèle de choix pour une première étude de la fonction d’un gène présent chez les mammifères. Elle permet notamment un accès facile à l’ingénierie génétique. Les animaux de la cohorte seront des animaux jeunes âgés de 6 semaines à réception et injectés au tamoxifène à partir de 8 semaines d'âge, hormis si le gène ciblé a un intérêt scientifique a être étudié durant la croissance, dans ce cas, nous injecterions des animaux agés de 4 semaines minimum.
Etude de la modulation des cellules de l’immunité dans le pancréas de souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
4102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir une biopsie de la queue, douze semaines de régime gras, jusqu'à dix injections, des jeûnes de six à seize heures, des gavages et cinq à dix prélèvements de sang à la queue. L'obésité provoquée entraîne prise de poids et baisse d'activité, et le pancréas ainsi que d'autres organes sont prélevés après mise à mort. Le projet cherche à comprendre le rôle des cellules immunitaires du pancréas dans le diabète de type 2, une piste thérapeutique annoncée comme lointaine.
Objectifs
Le pancréas régule la glycémie grâce à des cellules spécialisées qui produisent de l’insuline. Il contient aussi des cellules immunitaires qui participeraient à cet équilibre, mais dont le rôle reste encore mal connu. Ce projet cherche à comprendre comment ces cellules influencent le fonctionnement du pancréas, en particulier dans le cas de consommation excessives de graisses, pouvant conduire au développement d’une obésité et d’un diabète.
Bénéfices attendus
Étudier la fonction des cellules immunitaires du pancréas est essentiel pour mieux comprendre comment le pancréas régule le sucre dans le sang et réagit aux déséquilibres métaboliques, comme ceux causés par une alimentation riche en graisses. Ces cellules immunitaires, longtemps considérées comme de simples défenseurs contre les infections, jouent en réalité un rôle plus complexe dans le soutien des cellules productrices d’insuline et dans le maintien de la santé métabolique. En comprenant les mécanismes par lesquels ces cellules influencent le fonctionnement du pancréas, ce projet pourrait révéler de nouvelles pistes thérapeutiques pour prévenir ou traiter des maladies comme le diabète de type 2.
Procédures
1 biopsie de queue (10s), 1 régime riche en gras et en cholestérol (WD - 12 semaines), 1 régime riche en graisse (HFD - 12 semaines), 1 à maximum 10 injections (20s), 1 à 2 jeun (6h ou 16h), 1 à 2 gavages (1min), 5 à 10 prélèvements de sang à la queue (3s).
Impact sur les animaux
Injections : douleur légère due à la piqure. Obésité : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Coupure du bout de la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Biopsie de queue : douleur modérée. -Gavage : contention soutenue et introduction de la sonde.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de permettre le prélèvement du pancréas ainsi que d’autres organes d’intérêt. Ces prélèvements sont indispensables à la réalisation d’analyses visant à comprendre les mécanismes étudiés dans ce projet, notamment pour identifier les voies de régulation du métabolisme dans différentes conditions expérimentales et caractériser et localiser les différentes populations cellulaires.
Remplacement
Cette étude a pour but d'étudier le rôle des cellules immunitaires du pancréas en condition normale et de surcharge lipidique. Le pancréas répond à la prise et la perte de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux, réduit à son minimum, a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.
Raffinement
Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles pour les étudier. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours (souriceaux) et 22 semaines (adultes).