Souris

Deux heures par jour, cinq jours sur sept, pendant un à trois mois d'exposition à la fumée de cigarette: 1 100 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent en plus une instillation d'élastase dans la trachée, l'implantation d'une pompe sous la peau et un cathétérisme cardiaque. Le projet vise à comprendre la perte musculaire associée à la bronchopneumopathie chronique obstructive et à explorer des pistes thérapeutiques. Le porteur retire les éléments de nidification des cages pendant les deux heures d'exposition quotidienne et met à mort tout animal atteignant un score de dégradation trop élevé, les organes étant ensuite prélevés.

Objectifs

La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est l’une des maladies respiratoires les plus fréquentes dans le monde et constitue une cause majeure de décès. Elle provoque une dégradation progressive des poumons, rendant la respiration de plus en plus difficile. Le tabagisme en est la principale cause, mais d’autres facteurs, comme la pollution de l’air, des infections respiratoires répétées durant l’enfance ou certaines prédispositions héréditaires, peuvent également favoriser son développement. Cette maladie s’accompagne souvent d’une diminution de la masse et de la force musculaires, appelée sarcopénie, ce qui altère la qualité de vie des personnes atteintes. Chez l’adulte, les muscles possèdent normalement une grande capacité d’adaptation et de réparation, leur permettant de se renouveler efficacement. Cette capacité repose sur des cellules souches présentes dans les muscles, généralement au repos, mais capables de s’activer en cas de besoin pour assurer leur entretien et leur régénération. Avec l’âge, ces mécanismes deviennent toutefois moins performants : les muscles se réparent moins bien, ce qui entraîne une diminution progressive de leur masse et de leur force, comme observé dans certaines situations de fragilité musculaire. Par ailleurs, certaines protéines présentes dans l’organisme jouent un rôle clé dans ces processus et pourraient constituer des pistes prometteuses pour de futurs traitements, afin de limiter les atteintes pulmonaires et de préserver la fonction musculaire. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de la perte musculaire associée à cette maladie et d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la santé et la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la sarcopénie associée à la BPCO et fournir un cadre de traitement potentiel.

Procédures

Exposition à la fumée de cigarette : 2h/ jour, 5 jours/7 pendant 1, 2 ou 3 mois. Administration intratrachéale d'élastase sous anesthésie : 15min, 1 fois. Implantation sous-cutanée de pompe osmotique : 10-15min. Test d'agrippement : 5 min, entre 2 et 4 fois par procédures. Test de course : 16 min, entre 2 et 4 fois par procédures. Évaluation de la fonction cardiaque et de la pression artérielle par cathétérisme : 25-30min, 1 fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont principalement dues au stress lié : - à la contention et aux manipulations sur animal vigile (test d’agrippement, test de course). - à l’exposition à la cigarette incluant l’odeur et le bruit généré par la machine. Remarque : en cas d’agressivité ou de mortalité, les animaux pourraient être isolés (seul dans une cage) afin de les garder dans l’étude.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.

Remplacement

Afin de tester l’impact direct de l’hypoxie intermittente sur la biologie des cellules satellites, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment. Pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n'est pas envisageable. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un organisme ou d’un tissu entier. L'utilisation de modèles animaux, dont les systèmes musculosquelettique et pulmonaire sont similaires à l’Homme, reste essentielle afin d’étudier les effets délétères de la BPCO sur le muscle squelettique et la biologie des cellules satellites. Par ailleurs, la variabilité des caractéristiques des patients comme leur âge, leur consommation de tabac, ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles.

Réduction

Nous allons réduire le nombre d'animaux en utilisant des méthodes non invasives (test d’agrippement, test de course sur tapis roulant) qui permettent de répéter les analyses sur le même animal mais aussi en utilisant des tests statistiques appropriés. Des expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=11 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle dans nos modèles de BPCO.

Raffinement

Les animaux importés de fournisseurs agréés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des anesthésiques et analgésiques. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, des perturbations de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. Une surveillance accrue sera mise en place pendant les 24h suivant l’instillation d’élastase. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson. Remarque : Afin de facilité l'exposition à la fumée de cigarettes, les éléments de nidification seront retirés des cages pendant les 2h d'exposition.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car les systèmes physiologiques pulmonaire et musculosquelettique sont proches de ceux de l’Homme. Par ailleurs, la souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées afin de faciliter les analyses nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude. Enfin, nous utilisons des outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles du muscle squelettique et des cellules satellites in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes de 8 semaines. A ce stade, l’appareil respiratoire est totalement développé et les muscles squelettiques sont parfaitement formés avec les cellules souches musculaires résidant en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos.

Pour cartographier les circuits nerveux de la sensibilité de la langue, 220 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit des injections dans la langue, l'application de molécules et jusqu'à deux chirurgies d'une heure sous anesthésie. Le porteur rattache ce travail au syndrome de la bouche qui brûle, une douleur orale touchant surtout les femmes ménopausées, et évoque un rôle des hormones. Les perspectives thérapeutiques annoncées restent renvoyées au long terme, les souris étant tuées pour le prélèvement de tissus.

Objectifs

La langue est un organe essentiel au bon déroulement de nombreuses fonctions orales (mastication, gustation, phonation etc.). Sa sensibilité conditionne le bon déroulement de ses fonctions. Certaines conditions médicales ou environnementales altèrent la bonne exécution de ces fonctions, dégradent la santé et altèrent la qualité de vie. Par exemple, le syndrome de la langue qui brûle correspond à une pathologie douloureuse encore mal comprise. Cliniquement, ce syndrome se manifeste par une sensation persistante de brûlure au niveau de la pointe de la langue, caractérisée par une douleur modérée à sévère sans lésion apparente. Avec son impact significatif sur la qualité de vie, elle représente un véritable enjeu de santé publique ainsi qu’un enjeu socio-économique majeur. Les traitements actuellement disponibles ne traitent pas les causes de la pathologie et ne soulagent que trop peu la douleur. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués pour permettre une meilleure prise en charge de la pathologie. Il faut noter que le syndrôme de la bouche qui brûle affecte 7 femmes pour 1 homme, et atteint principalement les femmes au moment de la ménopause. Ceci suggère un rôle des hormones dans cette pathologie. Ici, l’objectif du projet est de caractériser les circuits nerveux impliqués dans la sensibilité de la langue et d’évaluer l’effet des changements hormonaux sur cette sensibilité dans des modèles murins reproduisant la carence hormonale associée à la ménopause, et leur contrôle.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra une meilleure caractérisation des circuits nerveux du syndrôme de la bouche qui brûle, inconnus à ce jour. Plus largement, il permettra également d’évaluer les effets des modifications hormonales survenant à la ménopause, qui restent très peu étudiées du point de vue de la sensibilité (douleur, tact, goût, sensation de bouche sèche etc.). A plus long terme, l’identification des mécanismes sous-tendant ce syndrome et les circuits nerveux de modulation de la sensibilité ouvrira des perspectives thérapeutiques ciblées pour les patients.

Procédures

Injection (2x, 20 secondes, sous anesthésie), application de molécule (1x, 10 minutes, sous anesthésie), injection (jusqu’à 3x, 20 secondes, animal vigile), chirurgie (jusqu’à 2x, 1 heure, sous anesthésie).

Impact sur les animaux

La chirurgie peut engender une douleur post-opératoire transitoire et légère de quelques heures à quelques jours. Les procédures d’injection de molécules peuvent également induire une douleur transitoire de quelques heures à quelques jours, notamment localement au niveau des sites d’injection.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de procéder à des prélèvements de tissus pour des études immunohistochimiques.

Remplacement

L’innervation précise des neurones sensitifs innervant la langue, et les projections descendantes pouvant médier l’apparition des douleurs spécifiques à la langue n’est pas connue à ce jour. Cela nécessite donc une caractérisation chez l’animal vivant par traçage neuronal. En effet, il n’existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico permettant de modéliser des voies nerveuses qui n’auraient été caractérisées sur modèle vivant au préalable.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Le bien-être des animaux sera garanti grâce à l’utilisation d’anesthésie générale et grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout au long des procédures, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des points limites pour lesquels les animaux seront mis à mort ont été définis.

Choix des espèces

Le travail sera effectué sur la souris car il s’agit d’un excellent modèle pour étudier le système nerveux et les pathologies pouvant affecter la sensibilité. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et humain, permettant l’extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout majeur dans l’analyse et l’interprétation des résultats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car les circuits neuronaux sont développés et matures.

Pour étudier le dialogue entre cellules leucémiques et moelle osseuse humanisée, 688 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules humaines après irradiation, elles reçoivent des injections répétées de chimiothérapie et, pour une partie, une ponction de moelle osseuse au fémur décrite comme le geste le plus douloureux et invasif. L'expansion leucémique provoque à terme une perte de poids et une grosse rate, avant la mise à mort pour prélever les organes hématopoïétiques. Le porteur reconnaît qu'un modèle d'organoïde de moelle osseuse existe déjà mais le juge non stabilisé, donc encore insuffisant pour remplacer la souris.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) sont des cancers du sang dont le pronostic diffère fortement entre les patients jeunes et âgés. L’intensification de la chimiothérapie a amélioré la survie des patients (supérieure à 85% pour les enfants ; seulement 50% chez les adultes). L’une des explications possibles résiderait dans l’influence des facteurs physiologiques sur la résistance des cellules leucémiques aux traitements. Bien que ces cellules se propagent dans de nombreux organes du patient, le tissu d’expansion privilégié reste la moelle osseuse (MO), située dans les cavités osseuses. Or, la MO évolue avec l’âge : pauvre en adipocytes (cellules graisseuses) à la naissance, elle s’enrichit avec le vieillissement, la chimiothérapie et/ou l’obésité. Chez la souris, on retrouve une MO riche en adipocytes dès la naissance au sein des vertèbres de la queue. L’injection de cellules de patients LAL à des souris immunodéficientes (ID), qui ne rejettent pas la greffe de cellules humaines, a montré que les cellules leucémiques deviennent « dormantes » et résistantes à la chimiothérapie dans les os riches en adipocytes. Ce modèle a permis d’identifier de nombreux mécanismes de développement et de chimiorésistance des LAL, mais il souffre d’une limite majeure : les molécules produites dans la MO de la souris ne sont pas parfaitement identiques à celles produites chez l’homme. Pour dépasser cette limite, des chercheurs ont créé un modèle d’os humanisés qui permet de recréer une MO majoritairement composée de cellules humaines. Notre projet vise plusieurs objectifs : 1) Mettre en place une MO « humanisée » chez la souris ID avec une composition cellulaire la plus proche possible de celle retrouvée chez les individus humains sains. 2) Explorer les signaux du microenvironnement médullaire qui influence la croissance ou la résistance aux traitements des cellules leucémiques humaines. 3) Reproduire le vieillissement de la MO afin de comprendre les mécanismes à l’origine des rechutes plus fréquentes chez les individus âgés en comparaison aux enfants. 4) Développer, un modèle pré-clinique pertinent pour l’étude des échantillons de patients qui ne greffent pas en souris ID dépourvues de cet environnement osseux humanisé. Ce modèle d’os « humanisée » constituera un atout majeur pour identifier de nouvelles pistes thérapeutiques et améliorer les chances de guérison des patients atteints de LAL.

Bénéfices attendus

La rechute des leucémies aiguës lymphoblastiques est souvent fatale. Comprendre les mécanismes impliqués dans les mécanismes de résistance menant à la rechute est un enjeu majeur en vue d’améliorer la prise en charge de ces patients. Cette meilleure compréhension passe immanquablement par l’utilisation de modèle d’étude de plus en plus pertinents. On compte parmi ces modèles, les cultures in vitro de cellules leucémiques et les modèles animaux (principalement des souris). Les modèles in vitro permettent de répondre à des questions simples, souvent pour confirmer des résultats observés dans des modèles plus complexes (modèles animaux). Seuls les modèles animaux permettent d’étudier l’interaction des cellules leucémiques avec les composants cellulaires et moléculaires retrouvés dans l’os autrement appelé moelle osseuse (MO). L’utilisation de ce modèle humanisé permet d’avoir un environnement humanisé dans lequel se développe les cellules leucémiques du patient. Il s’agit d’une avancée majeure permettant de mieux comprendre le dialogue qui existe entre les cellules leucémiques et celles de leur environnement de la MO. Notre projet s’inscrit dans cet objectif et a pour but d’identifier des nouvelles pistes thérapeutiques basées sur l’addiction des cellules leucémiques pour des facteurs produits par les cellules de la MO. Il est important de proposer des thérapies innovantes. Actuellement, les traitements proposés sont majoritairement développés pour cibler les cellules cancéreuses. Mais l’ensemble des connaissances démontre que les cellules cancéreuses communiquent avec leur environnement cellulaire et qu’aujourd’hui, une thérapie innovante doit intégrer cette vision d’ensemble. C’est exactement l’objectif de notre étude.

Procédures

En fonction des questions posées, les animaux seront soumis au maximum à : 1- Une injection de cellules stromales/souches mésenchymateuses humaines sous la peau de la souris. Cet acte est rapide (quelques secondes) et est réalisé sous sédation (532 animaux). Cette injection est un acte unique dans toutes les procédures. 2- Injection d’une hormone en sous-cutanée en vigile (5 secondes), pour 532 animaux, à raison de 5 jours/semaine, pendant un mois. Cette hormone permet de faire maturer les os « humanisés ». 3- Une injection de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques humaines (hCSPH) pour 520 animaux. Cet acte, qui ne dure que quelques secondes, est effectué sous sédation. Toutefois, ce geste nécessite que les souris soient irradiées au préalable pour permettre la reconstitution des cellules sanguines humaines. Acte qui dure 1 à 2 minutes. 4- Une injection de cellules leucémiques de patients pour 365 animaux. Cet acte, qui ne dure que quelques secondes, est effectué sous sédation. 5- Afin de mimer une MO d’un patient âgé ou obèse, les croquettes classiquement utilisées seront remplacées par des croquettes complémentées d’une molécule connue pour induire la différenciation adipocytaire pendant 13 semaines pour 98 animaux.6- Selon la question posée, certaines souris subiront une injection de molécules utilisées en chimiothérapie conventionnelle selon le même protocole que pour l’injection de cellules hématopoïétiques et leucémiques. Cet acte, de quelques secondes, est effectué sous sédation 48 animaux. 7- Ces mêmes souris recevront d’autres molécules utilisées en chimiothérapie conventionnelle. Les injections seront réalisées sur des souris non-anesthésiées après avoir appliqué un analgésique local. 1 injection tous les jours pendant 5 jours. Le geste d’injection dure quelque secondes (48 animaux). 8- Selon la question posée, un seul prélèvement de moelle osseuse sera effectué dans le fémur des souris sous anesthésie générale et analgésie. Ce geste dure moins de 5 minutes. Avant le réveil un prélèvement sanguin sera également effectué au niveau du site sous-mandibulaire (durée du geste : 2 secondes). Ce double prélèvement sera effectué sur 364 animaux. Le prélèvement sanguin pourra être renouvelé 4 fois à raison d’un prélèvement toutes les 3 semaines pour 48 animaux. Ce prélèvement sanguin s’effectue avec des souris non-endormies.

Impact sur les animaux

Notre expérience dans la réalisation de ces protocoles dans le modèle murin, nous permet d’anticiper des nuisances modérées sur les animaux utilisés dans ce projet. Plusieurs points sont à retenir : - L’Implantation de ce modèle humanisés sous la peau des souris peut engendrer une gêne dans leur déplacement. - La mise en place d’une hématopoïèse humaine chez la souris peut engendrer à long terme une anémie de l’animal liée à une chasse de l’hématopoïèse murine. - L’expansion leucémique des cellules de patients dans le modèle murin provoque à long terme une perte de poids de l’animal ainsi qu’une augmentation de la taille de la rate. En point ultime d’expérience, nous notons parfois une prostration/manque de mobilité de l’animal. - La chimiothérapie utilisée provoque également une perte de poids liée à l’ensemble des effets adverses des agents utilisés. - L’induction d’une MO âgée ou d’un patient obèse peut entrainer des effets liés à la prise de poids rapide des souris. Le prélèvement de moelle osseuse, effectué au niveau des fémurs, est le geste le plus invasif effectué dans nos procédures. au niveau des fémursCe geste est douloureux. - La manipulation des souris peut aussi causer stress et angoisse entrainant un affaiblissement.

Devenir

Dans l’ensemble des procédures, l’euthanasie des animaux aura lieu soit à l’issue de 12 semaines de mise en place de l’hématopoïèse humaine, soit au cours de l’expansion leucémique, soit 1 semaine après la chimiothérapie. Nous euthanasierons les souris afin de suivre et mesurer le développement de la leucémie. Les tissus/organes hématopoïétiques (moelle osseuse, rate, colonne vertébrale, mini-os) seront prélevés et les cellules qui y sont contenues seront caractérisées. Cela permettra de comparer les différents groupes de souris afin de pouvoir tirer les conclusions suite à nos observations.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude des leucémies, l’expérimentation sur des modèles animaux, comme les souris, est essentielle pour comprendre comment la maladie se développe chez un patient. Les méthodes de cultures in vitro ne permettent pas de mimer un environnement osseux. Le système de culture in vitro le plus complexe que nous pouvons mettre en place consiste à cultiver ensemble des cellules leucémiques avec des cellules hématopoïétiques saines sur des cellules stromales (cellules adhérentes extraites des MO humaines, cf paragraphe 5.5.2). Malgré la complexité de ce système, il reste encore très éloigné des modèles animaux. En effet, de nombreuses autres cellules seront encore absentes. Très récemment, des systèmes d’organoïdes de moelle osseuse en bioréacteur ont été développés. Ce modèle, bien que pertinent, n’est pas stabilisé à long terme. Il ne permet pas d’établir une hématopoïèse humaine stable. Il est donc impossible d’utiliser ce système d’un point de vue exploratoire comme nous souhaitons le faire avec le modèle de mini-os in vivo. En revanche, ce modèle d’organoïde pourra être mis au point au laboratoire pour valider des hypothèses révélées par le projet ici présenté. Une fois mis en place, il pourra remplacer/compléter le modèle murin pour répondre à des questions simples.

Réduction

Afin de développer le modèle préclinique le plus pertinent possible, nous tiendrons compte de la diversité de la maladie retrouvée chez les patients et nous utiliserons plusieurs patients représentatifs, sélectionnés parmi les centaines d’échantillons disponibles au laboratoire. Les résultats obtenus à partir de notre étude devraient ainsi être transposables à un nombre important de patients. Ce choix méticuleux réduira par conséquent l’utilisation des souris. Par ailleurs, chaque expérience sera répétée afin de garantir la fiabilité et la robustesse scientifique des résultats. Enfin, la comparaison de plusieurs conditions biologiques et groupes expérimentaux nécessite l’utilisation de plusieurs animaux. L’ensemble de ces faits expliquent le nombre important de souris nécessaires au projet de recherche que nous développons. De plus, lorsque nous devons tester plusieurs conditions en suivant la même procédure, nous réaliserons les expériences en même temps pour comparer tous les groupes avec un seul groupe témoin. Enfin l’analyse séparée des 2 mini-os par souris (un sur chaque flanc) permettra de réduire considérablement le nombre de souris utilisées pour atteindre la puissance statistique.

Raffinement

Dans l’ensemble des procédures associées à cette demande, les animaux sont hébergés en groupe. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront régulièrement surveillées par l’équipe, le personnel animalier et un vétérinaire afin de repérer tout changement de comportement et éviter toute douleur, souffrance ou stress inutile. L’apparition de ces critères, notés selon une grille remplie par les animaliers ainsi que les expérimentateurs, permettra une prise de décision rapide quant à la mise en place de la stratégie à adopter pour arrêter la souffrance. Afin d’améliorer le bien-être des souris vis-à-vis des potentielles souffrances et angoisses liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies recevront un complément hydrique et alimentaire sous forme d’hydrogel et de nourriture humidifiée déposée directement dans la cage en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons pour plus de confort. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale. Enfin, pour diminuer le stress de la contention, nous transférons les animaux de leur cage vers la cage de sédation, par l’intermédiaire d’un tube de transfert dans lequel viennent se loger les animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris immunodéficientes pour leur incapacité à rejeter la greffe de cellules d’une espèce étrangère, ici de cellules humaines. Outre l’absence de rejet, ce modèle est pertinent pour l’étude des cancers du sang puisqu’il est capable de récapituler l’expansion leucémique de patients dans un modèle vivant. Les cellules de patients interagissent alors avec l’ensemble des constituants cellulaires et moléculaires de l’animal au même titre qu’une cellule leucémique interagit avec son environnement chez le patient. La mise en place d’un modèle humanisé permettra d’obtenir un environnement le plus fidèle possible de celui rencontré par les cellules leucémiques chez les patients. Il outrepassera les limites liées aux barrières d’espèces. Cette amélioration significative du modèle permettra d’aborder plus spécifiquement les dialogues inter-cellulaires. Cela conduira vers de nouvelles pistes thérapeutiques pertinentes pour les patients. En outre, il représente une avancée majeure pour les cellules de patients difficiles à amplifier en souris immunodéficientes qui nécessitent probablement un environnement humain. Le modèle de mini-os deviendra, à minima pour ces patients, le modèle préclinique de référence permettant de tester des cibles thérapeutiques impossible à tester in vivo jusqu’à lors. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, qui, selon les recherches de notre laboratoire, montrent une excellente capacité à accepter des greffes après injection, que ce soit pour des cellules normales ou malades.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour comparer un candidat médicament au sémaglutide dans un modèle d'obésité. Rendues obèses par un régime gras et maintenues à 30 °C, elles reçoivent jusqu'à 49 injections quotidiennes, subissent des jeûnes de quatre à six heures et jusqu'à neuf prélèvements de sang. Toutes sont mises à mort pour le prélèvement d'organes et de sang. Le projet sert le développement précoce du composé d'un client, l'étape in vivo étant présentée comme 'incontournable' avant tout essai chez l'humain.

Objectifs

L’obésité constitue un problème majeur de santé publique, avec une augmentation importante de sa prévalence au niveau mondial depuis plusieurs décennies. Selon l’Organisation mondiale de la santé, plus d’un milliard de personnes étaient concernées en 2022. Malgré l’existence de traitements récemment autorisés, tels que le sémaglutide, certaines limitations ont été rapportées, notamment une perte concomitante de masse musculaire, susceptible d’aggraver la faiblesse musculaire chez les sujets obèses. Le présent projet s’inscrit dans une étude menée à un stade précoce du développement d’un candidat médicament de notre client. Ce projet a pour objectif d’évaluer les effets d’un traitement sur le métabolisme et l’équilibre énergétique dans un modèle murin d’obésité induite par l’alimentation, maintenu dans des conditions de température proches de celles de l’être humain (thermoneutralité), en analysant la prise alimentaire, le poids corporel, la composition corporelle, la dépense énergétique et la régulation du taux de sucre dans le sang.

Bénéfices attendus

L’obésité constitue un problème majeur de santé publique, avec une augmentation importante de sa prévalence au niveau mondial depuis plusieurs décennies. Selon l’Organisation mondiale de la santé, plus d’un milliard de personnes étaient concernées en 2022. Malgré l’existence de traitements récemment autorisés, tels que la sémaglutide, certaines limitations ont été rapportées, notamment une perte concomitante de masse musculaire, susceptible d’aggraver la faiblesse musculaire chez les sujets obèses. Dans le cadre du présent projet, le sémaglutide sera considéré comme composé de référence, afin de situer les effets du candidat médicament évalué par rapport à un traitement actuellement utilisé en pratique clinique. Ce projet s’inscrit dans une étude menée à un stade précoce du développement d’un candidat médicament de notre client. Ce projet a pour objectif d’évaluer les effets d’un traitement pharmacologique (composé A) sur le métabolisme et la régulation de l’équilibre énergétique dans un modèle murin d’obésité induite par un régime riche en graisses, maintenu à thermoneutralité (environ 30 °C). Les paramètres étudiés incluront la prise alimentaire, le poids corporel, la composition corporelle, le métabolisme énergétique (par calorimétrie indirecte), ainsi que la tolérance au glucose et la sensibilité à l’insuline. Cette approche permettra de différencier les effets directs du traitement sur le métabolisme de ceux liés à une modification de l’appétit, dans des conditions proches de la physiologie humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Hébergement individuel (max. 63 jours) ; 2) Injection quotidienne de traitements ou véhicule (max. 49; durée : env. 1 minute) ; 3) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (max. 18 mesures; durée : env. 1 minute) ; 4) Analyse non invasive de composition corporelle (3 mesures, durée de la mesure : 2 minutes) ; 5) Mise à jeun en présence d'eau (4 fois, durée: 4h à 6h) ; 6) Injection de glucose (1 fois, durée : env. 1minute); 7) Prélèvements sanguin à la queue (max. 9 prélèvements, durée du prélèvement : 2 minutes); 8) Mesure de dépenses énergétiques (2 session de mesures de 72h).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel, de composition corporelle ainsi que le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations des traitementset les prélèvements sanguins occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. La mise à jeun de 4h ou 6h pourra induire une sensation de faim. De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour des prélèvements d’organes et de sang.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 12 animaux par groupe pour les souris obèses a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 10 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. L'administration des traitements par voie sous-cutanée et par voie orale sera réalisée par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique à l'aide d'une canule avec embout souple pour l'administration orale. Avant la mesure de la composition corporelle, les animaux seront habitués à être installés dans le tube de couleur rouge permettant de réduire le stress des animaux au cours de la mesure. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins via la veine de la queue avant de pratiquer ces procédures et seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs. De plus une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Avant la mesure des dépenses énergétiques en cages métaboliques , les animaux seront également habitués à leur nouvel environnement durant 20h. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 18 semaines. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour évaluer un candidat médicament sur le métabolisme des graisses. Certaines rendues obèses par un régime gras, elles subissent un hébergement individuel jusqu'à huit semaines, des cages à métabolisme quasi isolées, une chirurgie d'administration, des jeûnes et jusqu'à huit prélèvements de sang. Elles sont mises à mort pour prélever organes et sang, à un volume incompatible avec la survie. Le projet est une étape du développement d'un client, l'apport pour les animaux non-humains eux-mêmes se réduisant, selon le porteur, à de 'meilleures' méthodes de raffinement.

Objectifs

Le métabolisme des lipides est un processus essentiel dans le corps humain qui implique la synthèse et la dégradation des lipides. Ce processus est essentiel à la production d'énergie, à la formation de la membrane cellulaire et à la production d'hormones, entre bien d'autres fonctions. Le surpoids et l’obésité correspondent à un excédent de graisse dans le corps. Ils sont principalement dus à une alimentation trop riche et une activité physique faible. Cependant, des facteurs psychologiques ou génétiques, des maladies chroniques peuvent intervenir dans leur survenue. Des médicaments peuvent également entrainer une prise ou perte de poids. Un adulte sur deux est concerné. Chaque étude de ce projet a pour objectif d’étudier l’effet de candidats-médicaments sur le métabolisme lipidique chez le rongeur (animaux normaux ou obèses) grâce à l’analyse de différents paramètres comme la composition de la masse corporelle, la dépense énergétique, la consommation alimentaire, d'eau et de l'activité physique etc… dans un environnement stable et contrôlé (température, humidité et lumière). Les candidats-médicaments peuvent donc être testés pour : - Leur efficacité pour un médicament ayant une indication contre l’obésité, - Leur effet sur la prise ou la perte de poids pour un médicament ayant une indication sans lien avec l’obésité.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine (Obésité) qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Chaque souris pourra subir : - Des contentions vigiles pour induire une anesthésie et une analgésie, administrer le produit : 1-2 min/ geste. - Une contention pour le passage dans l'appareil de RMN : 2 min, 1 à 3 fois / étude. - Un hébergement individuel dans la salle d’hébergement sur au maximum 8 semaines et/ou un hébergement quasi isolé (accès visuel limité des congénères, pas d’accès aux odeurs) dans des cages à métabolisme pendant au maximum 2 semaines ou 3 fois 4 jours au cours des 8 semaines de l’étude. - Des administrations en aigu ou en chronique avec au maximum 1/jour sur 8 semaines. - Une chirurgie pour l’administration du candidat médicament (15-30 min, 1/étude). - Des prélèvements de sang : 1-2 min/prélèvement, maximum 5/24h et 8/étude.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l'initiation du projet. Ils font donc l'objet d'échange avec les responsables Bien-Être Animal pour adapter les outils d'observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et l’analgésie, administrer le produit et faire des prélèvements de sang ou pour le passage dans l'appareil de RMN peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Un stress peut être engendré du fait de l’hébergement individuel des animaux sur plusieurs semaines et/ou du fait de l'isolement sur maximum 2 semaines. Les chirurgies peuvent induire des douleurs qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Les souris de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture. Elles pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille ou une contrainte légère lors des administrations suivant le type d’administration utilisé ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, un premier tri des candidats-médicaments est réalisé in vitro sur des cellules en culture pour tester leur efficacité. Puis des tests in vivo, chez la souris, sont réalisés avec les candidats-médicaments sélectionnés car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets pharmacologiques d’une nouvelle molécule sur l’obésité, le diabète… sur un organisme complet. De plus, avant l’administration à l’homme, l’administration chez l’animal permet d’évaluer l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat-médicament. A ce jour, la souris est une des espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

De nombreuses études publiées dans ce domaine de recherche et utilisant des modèles animaux similaires, et plus particulièrement ces modèles rongeurs, décrivent l'utilisation de 8-12 animaux par groupe. Ce nombre est suffisant pour réaliser une analyse statistique et a également été confirmé et validé en interne. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état de santé des animaux utilisés sera assurée. Le poids des souris sera mesuré régulièrement (au moins une fois par semaine jusqu’à 5 fois par semaine). Lors de l’anesthésie pour les chirurgies, la température corporelles des animaux est maintenue constante grâce à une couverture chauffante ou un bloc chauffant. Lors du transport à l’extérieur, d'une durée inférieure à 30 min, les cages utilisées seront fermées avec un filtre permettant le maintien du statut sanitaire et éviter une contamination. Et la cage contiendra des éléments hydratants et nutritifs sous forme de gel, des croquettes ainsi que des éléments d’enrichissement. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Sur le site où sont réalisées les expérimentations tout est mis en œuvre pour limiter les risques de contamination des animaux. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués avec notamment une attention particulière à la prise ou à la perte de poids de l’animal. Dans le cas de développement de signes cliniques, de la nourriture humidifiée ou en gel sera mise directement dans les cages pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Des biberons avec des tétines longues pour faciliter l’accès à l’eau pourront être utilisés. Dans le cas d’animaux avec phénotype dommageable, selon le phénotype, des enrichissements, de la nourriture humidifiée ou en gel seront mis directement dans les cages pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Des biberons avec des tétines longues pour faciliter l’accès à l’eau pourront être utilisés. La SBEA pourra être consultée pour valider les actions mises en place.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur le métabolisme lipidique. Généralement, les animaux âgés de 16 à 20 semaines seront utilisés au moment du début de l’étude, sachant qu’il faut un nourrissage hyper lipidique pendant 12 semaines pour obtenir des souris obèses. Les souris congéniques mutantes sont obèses dès leur naissance. Elles peuvent donc être utilisées dès 5-6 semaines. Les souris "normales" peuvent être utilisées dès 5-6 semaines.