Souris
Développement d’un protocole d’immunothérapie de l’endométriose
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
7 254 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines pouvant recevoir jusqu'à sept administrations de traitement par semaine. Une partie subit une castration, puis une chirurgie d'implantation destinée à reproduire une endométriose, dont les lésions peuvent provoquer des douleurs abdominales pendant les 63 jours de la procédure. S'y ajoutent un prélèvement sanguin hebdomadaire et jusqu'à trois tests comportementaux par animal, dont un test d'hypersensibilité viscérale et une mesure de la capacité à faire son nid qui suppose quinze heures d'isolement. Le calcul d'effectif cité aboutit à dix souris par groupe pour des expériences reproduites deux fois, sans que le passage à 7 254 animaux soit expliqué.
Objectifs
Ce projet a un objectif principal : mettre au point un protocole d’immunothérapie de l’endométriose. Il permettra aussi de mieux comprendre l’importance de la composante immunitaire dans les mécanismes qui conduisent à l’endométriose.
Bénéfices attendus
L'endométriose est un trouble œstrogèno-dépendant fréquent chez les femmes en âge de procréer (10%). Cette pathologie se caractérise principalement par la présence de tissu endométrial à l'extérieur de l'utérus. Bien que les mécanismes qui conduisent à l’endométriose (pathogénèse) ne soit pas complètement décrits, on sait que le système immunitaire joue un rôle central dans son étiologie, sa pathophysiologie et les morbidités associées de douleur, d'infertilité. Il est maintenant admis que l'endométriose est une maladie inflammatoire chronique. Nous avons montré que cibler la réponse immunitaire peut diminuer l’installation et le développement des lésions. Nous avons identifié plusieurs médicaments en cours de développement dans des protocoles d’immunothérapie antitumorale qui pourraient permettre de moduler la réponse immunitaire et ainsi induire la disparition des lésions d’endométriose. L’objectif de ce projet est donc de developper un protocole de traitement et définir l’impact des traitements sur l’initiation et le développement des lésions d’endométriose, sur les cellules immunitaires et sur la douleur induite par l’implantation et le développement des lésions. Dans un deuxième temps et en fonction de toutes les premières observations, nous définirons les meilleurs protocoles d’administration de ces molécules dans le traitement de l’endométriose. Pour tout ce projet, nous utiliserons un modèle expérimental de référence déjà décrit dans la littérature et maîtrisé dans notre laboratoire. Globalement, ce projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’origine et le développement de l’endométriose. Ces mécanismes pourraient être exploités pour découvrir d’autres pistes thérapeutiques innovantes.
Procédures
Les animaux pourront subir : - Une castration, réalisée chez des animaux sous anesthésie générale (injection, 30 sec), opération qui dure moins de 10 min par souris -Chirurgie pour modélisation de l'endométriose sous anesthésie générale (injection 30 sec)- des administration de traitement (durée moins de 1 min) au maximum 7 fois par semaine - - des prélèvements veineux de sang - 1 min - au maximum 1 fois/semaine pendant la procédure -des tests comportementaux: test du niveau d'anxiété 10 minutes, une fois par semaine, test des comportements compulsifs: 30 minutes, une fois par semaine, test d'hypersensibilité, 5 minutes, une fois par semaine, test d'hypersensibilité viscerale, 5 minutes une fois par semaine, capacité à faire son nid (représentatif de la douleur) 15h d'isolement, une fois par semaine. Tous les animaux ne seront pas soumis à tous les tests comportementaux (pas plus de trois tests par animal).
Impact sur les animaux
Une partie des animaux subira une castration. Les animaux récupèrent parfaitement de cette opération. Cependant, la chirurgie peut induire des douleurs abdominales modérées post-opératoires (48 h maximum). Les injections réalisées aux animaux sont associées à des douleurs locales modérées et transitoires (moins de 5 minutes) au point d’injection. La croissance des lésions d’endométriose peut induire des douleurs abdominales pendant toute la durée de l'expérience (63 jours maximum). Ces douleurs potentielles seront évaluées quotidiennement par observation du comportement des souris dans les cages et avec des tests comportementaux. En cas de douleur, les souris recevront un analgésiant. De plus, un stress peut être généré chez l’animal par les manipulations répétées (contention lors des injections) (durée maximum 5 minutes). les injections hebdomadaires peuvent induire un stress transitoire lié à la contention, une douleur brève au point d’injection (5 minutes maximum) et, occasionnellement, une réaction inflammatoire locale modérée (24h maximum). Les effets systémiques attendus sont limités aux variations physiologiques liées à la stimulation hormonale, sans altération durable de l’état général lorsqu’elles sont administrées aux doses usuelles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure
Remplacement
Les réponses immunes dans l’endométriose sont complexes. Elles nécessitent l’implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée dans le temps (avec des cinétiques précises) et dans l’espace (l ésions, liquide péritonéal et ganglions lymphatiques drainant). Ces différentes étapes ne peuvent pas être mimées/reproduites in vitro.
Réduction
Une étude approfondie de la littérature a été réalisée. Elle nous a permis de choisir les modèles les mieux adaptés pour répondre à nos questions scientifiques mais aussi d’adapter le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous avons analysé les résultats déjà obtenus sur ce projet et nous avons réalisé un calcul d'effectif avecun logiciel qui aide à calculer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour une expérience en se basant sur des études statistiques afin d’obtenir des résultats fiables tout en évitant d’en utiliser plus que nécessaire. Ce calcul nous a donné une valeurs de 10 souris par groupe Les expériences seront reproduites 2 fois (5 souris par groupe et par expérience). Un maximum d’étude sera réalisé sur le même animal.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé à l'expérimentation animale et détenteur du diplôme de chirurgie expérimentale quand cela le nécessite (ovariectomie, castration). Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adaptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Afin de limiter les risques d'infection des animaux, les animaux seront placés dans des cages placées sur portoir ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environnement de toutes les cages sera enrichi (matériel permettant la nidification, rouleaux en carton) et de la nourriture/eau gélifiée rajoutée dans la cage si nous notons que les souris perdent du poids sans que les points limites ne soient atteints. Du sérum physiologique tiédi pourra être injecté en cas de déshydratation. Une molécule permettant l'anesthésie locale sera administrée en intradermique au point d'incision pour limiter la douleur. Durant l’opération du gel oculaire sera appliqué afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Durant et après la chirurgie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie et ce jusqu’à leur réveil. En péri-opératoire (avant et après la chirurgie), les animaux seront analgésiés pendant 24 heures (injection intraveineuse d'une molécule analgésique). Une surveillance accrue pendant les 3 jours post-chirurgie sera réalisée afin de détecter tout signe de douleur et de détresse. Des points limites spécifiques ont été établis et sont décrits pour chaque procédure. S’ils devaient être atteints, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les acteurs de la réponse immunitaire chez la souris sont très similaires à ceux de l'Homme. A ce jour, la souris représente le meilleur modèle animal pour étudier la réponse immunitaire qui est une réponse intégrée dans le temps (précoce avec la réponse immunitaire innée, plus tardive avec la réponse immunitaire adaptative) et dans l'espace (sur le site d’implantation des lésions ou dans les organes lymphoïdes). Les souris seront utilisées entre 6 et 12 semaines d’âge correspondant à un système immunitaire fonctionnel
Dynamique des changements biochimiques de la cellule lors d’un apprentissage
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une injection intracérébrale de 45 minutes, la pose d'un implant d'une heure et demie, puis une restriction alimentaire destinée à pousser l'animal à parcourir un dispositif de navigation spatiale : 150 souris subissent ce protocole. Toutes sont tuées à l'issue pour récupérer les tissus, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur reconnaît que la restriction alimentaire engendre une perte de masse qui peut être excessive ou s'accompagner de signes de souffrance, le tout pour mettre au point un fibroscope permettant d'observer l'activité de neurones pendant un apprentissage. Le nombre de 150 souris n'est adossé à aucun calcul, la seule précision chiffrée du dossier portant sur un maximum de 80 animaux pour la mise au point de la technique.
Objectifs
L’objectif principal est de comprendre comment les cellules du cerveau communiquent lorsqu’une mémoire se forme ou lorsqu’un comportement se produit, que ce soit dans des situations normales ou lors de maladies. Pour cela, le projet prévoit de créer un microscope couplé à une fibre optique (un fibroscope) permettant de suivre la souris pendant un comportement de façon peu invasive. Ce dispositif permettra d’observer directement, chez un animal vivant, l’activité de groupes de neurones pendant un apprentissage (mémorisation).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de comprendre, à moyen terme, le déroulé des évenements conduisant à l'adaptation de la communication entre deux neurones (la plasticité synaptique). Cette plasticité, impliquant des réseaux de neurones, est nécessaire à l'adaptation à l'environnement via des processus d'apprentissage et de mémorisation. Ainsi, une meilleure compréhension de ces phénomènes, répond parfaitement aux contraintes liées au fonctionnement cérébral. Les résultats de ce projet seront accessibles via des publications. Sur le long terme, ce projet permettra de mieux comprendre le phénomène d'apprentissage et de mieux connaitre les potentielles cibles thérapeutiques en cas de maladies.
Procédures
Les animaux seront soumis à des chirurgies comme des injections à l'intérieur du cerveau (environ 45 minutes) et la fixation d'un implant (environ 1h30) ainsi qu'une légère restriction alimentaire permettant de motiver la souris lors des tâches comportementales de navigation spatiale (environ 1-2h).
Impact sur les animaux
Les manipulations par les expérimentateurs et les expériences de navigation spatiale peuvent induire un stress chez la souris. La chirurgie peut également induire des douleurs secondaire. Enfin, la restriction alimentaire engendrera une perte de masse qui peut etre excessive ou associée à des signes de souffrance.
Devenir
Afin d’observer la signalisation dans chaque cellule, nous devons récupérer en fin d’expérience les tissus. Nous devons pour cela procéder a euthanasie de l'ensemble des animaux du projet afin d’obtenir un maximum d’information de l’animal.
Remplacement
Pour bien étudier la plasticité neuronale (c’est-à-dire la façon dont les connexions entre neurones changent), il faut absolument observer cela chez un animal vivant, car les résultats varient beaucoup selon les conditions de l’expérience. En particulier, une tâche de navigation dans l’espace (comme faire parcourir un labyrinthe à un animal) est nécessaire, et elle ne peut être réalisée que sur un animal vivant. Elle renforce les connexions dans l’hippocampe, une partie du cerveau impliquée dans la mémoire spatiale. Cela fournit des données précises et réalistes. Ces données sont ensuite utilisées pour nourrir un modèle mathématique prédictif. Ce modèle permet de prévoir ce qui pourrait se passer et ainsi guider les futures expériences pour les rendre plus efficaces.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, la mise au point des biosenseurs sera intégralement réalisée in vitro. De plus, l'étude histologique post-mortem, réalisée sur les animaux utilisés pour les tâches de comportement, permet d’acquérir le plus d’information possible en utilisant le moins d’animaux possible. Le modèle de prédiction théorique alimenté par les données vise également à réduire l’utilisation des animaux dans les futurs projets. Les souris utilisées pour la mise en place et l’optimisation de notre technique est associé à un maximum de 80 animaux. Ce nombre sera réduit autant que possible. Chaque fois que cela sera possible, cette mise au point sera effectuée chez des animaux déjà présents dans l'animalerie pour d'autres projets.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera quotidiennement suivi et l'administration d’analgésique sera systématique en cas de signe de douleur. Le stress des souris sera réduit par l’habituation de ces dernières à l’expérimentateur et à l’environnement ainsi que des enrichissements de cages, avec a minima du matériel de nidification (igloo et coton). Les manipulations de souris sont faites dans une pièce différente, hors de vision des souris en stabulation d’hébergement.
Choix des espèces
La souris est le modèle idéal pour ce type d’étude car il s’agit d’un mammifère, ayant donc des mécanismes cérébraux généralisables dans une grande mesure à l'homme, chez qui l’expression de biosenseurs est bien caractérisée. Nous utiliserons des animaux adultes, afin de découpler la plasticité induite par le comportement de celle inhérente au neurodéveloppement.
Effets de nanocorps-Fc ciblant un récepteur de l’immunité sur la réponse immunitaire anti-tuberculeuse dans le modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 290 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 176 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'un dispositif d'inhalation, séance qui peut durer 45 minutes, puis reçoivent six injections de nanocorps sur quatorze jours et quatre antibiotiques par voie orale chaque jour pendant la même période. L'infection peut provoquer perte de poids, perte de pelage, isolement social et difficultés respiratoires, effets que le porteur classe lui-même en intensité sévère. Il affirme utiliser une dose faible et une souche peu virulente afin de "minimiser l'intensité des symptômes", alors que 1 176 des 1 290 souris sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
Causant près de 2 millions de décès par an, la tuberculose représente la première cause de décès dans le monde par maladie infectieuse, et constitue ainsi un enjeu majeur de santé publique. Cette maladie infectieuse peut causer une importante inflammation des poumons pouvant les détruire. Les antibiotiques habituellement utilisés pour traiter la tuberculose ciblent la bactérie causant l’infection, mais n’agissent pas sur l’inflammation. Notre équipe a montré qu’un récepteur de notre système immunitaire régule l’inflammation dans les poumons de souris infectées par la tuberculose. Ainsi, cibler ce récepteur pourrait être utile pour favoriser la réponse immunitaire anti-tuberculeuse et limiter l’inflammation pulmonaire, en conjonction avec les traitements antibiotiques. A partir de libraries d’anticorps, nous avons sélectionné 4 anticorps de petite taille (appelés nanocorps) ciblant spécifiquement le récepteur immunitaire d’intêret, qui ont été modifiés afin d’augmenter leur effet biologique. Au total, nous disposons de 8 nanocorps ciblant notre récepteur d’intérêt. L’objectif de ce projet est d’évaluer si ces nanocorps sont capables de diminuer la charge bactérienne et l’inflammation pulmonaire chez des souris susceptibles à l’infection par la tuberculose, et ainsi être utilisés dans le futur comme des traitements contre cette maladie infectieuse dévastatrice.
Bénéfices attendus
Les bénéfices directs attendus du projet sont, à court terme, de mieux comprendre le rôle joué par notre récepteur immunitaire d’intérêt dans l’immunité anti-tuberculeuse, et à long terme, de générer de nouveaux traitements pour la tuberculose. Cette approche s’inscrit parmi les priorités de recherche 2025 de l’ANRS Maladies Infectieuses Emergentes (« nouvelles approches thérapeutiques pour la tuberculose »), et dans l’objectif de l’Organisation Mondiale de la Santé de mettre fin à la tuberculose d’ici 2030. Ce projet ouvre également des perspectives pour évaluer l’intérêt de nos nanocorps dans d’autres maladies impliquant notre récepteur immunitaire d’intérêt, notamment des maladies auto-immunes telles que la polyarthrite rhumatoïde ou les maladies inflammatoires chroniques intestinales. L’effet des nanocorps dans ces maladies inflammatoires sera étudié dans le cadre d’autres projets.
Procédures
- Infection par la tuberculose : La bactérie est administrée par voie inhalée à des animaux vigiles une fois en début d’expérience. Le procédé prend au maximum 45 minutes. - Injections de nanocorps : A partir du 7e jour d’infection, les souris recevront un nanocorps d’intérêt par injection, 3 fois par semaine pendant 14 jours (soit 6 injections au total). Le geste sera réalisé sur animal vigile, et l’injection dure environ 10 secondes par souris. - Administration d’antibiotiques anti-tuberculeux : A partir du 7e jour d’infection, les souris recevront 4 antibiotiques par voie orale, en 2 fois (un premier antibiotique d’abord, puis une heure après, les 3 autres antibiotiques ensemble), tous les jours pendant 14 jours. Les souris seront vigiles, et chaque administration dure environ 10 secondes par souris.
Impact sur les animaux
L’infection à la tuberculose peut causer un stress aux souris. Cette nuisance est jugée d’intensité légère. Lorsque l’infection se développe, elle peut causer des symptômes aux souris, tels que la perte de poids ou de pelage, l’isolement social ainsi que des difficultés respiratoires. Ces nuisances sont jugées d’intensité sévère, et seront surveillées de près. Un stress et une douleur liées aux injections de nanocorps sont attendus (nuisances d’intensité légère). De manière très rare, il pourrait aussi survenir une inflammation locale, voire une augmentation de volume de l’abdomen (nuisances d’intensité sévère). Enfin, en ce qui concerne le traitement antibiotique anti-tuberculeux, un stress lié à l’administration orale (nuisance d’intensité légère) est attendu. De manière très rare, il pourrait aussi survenir des effets indésirables médicamenteux (notamment des diarrhées pouvant entraîner une moins bonne hydratation et prise alimentaire ; nuisances d’intensité modérée).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure car le poumon doit être analysé comme point final.
Remplacement
Nous étudions l'impact de la modulation d’un récépteur immunitaire sur la réponse immunitaire anti-tuberculeuse. Pour étudier la réponse immunitaire, il existe des modèles cellulaires de laboratoire que nous utiliserons pour étudier l’effet de nos nanocorps avant de réaliser les expériences sur des souris infectées. Néanmoins, les réactions induites in vivo en réponse à un pathogène ou un traitement ne sont que partiellement, voire pas du tout, prévisibles par les modèles cellulaires in vitro. En particulier, le modèle souris permet d’accéder à la mise en place d'une réponse immunitaire dans un système intégré, et à des informations que ne peuvent pas nous délivrer des cellules isolées en culture, ou des structures multicellulaires artificielles de type « organoïde ».
Réduction
Afin de s’inscrire dans la logique de réduction, nous avons intégré 4 étapes dans notre raisonnement. Tout d’abord, les expériences réalisées font suite à des étapes préalables de validation dans des modèles cellulaires ayant montré un effet des nanocorps et une absence de toxicité in vitro. Ainsi les expériences proposées seront réalisées au stade où les méthodes alternatives à l’expérimentation animale auront été exploitées, et s’avèreront suffisamment prometteuses pour utiliser le modèle intégré murin. Ensuite, certaines étapes de nos projets pourront être suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt en fonction des promesses offertes par les résultats. Ces décisions sont ainsi susceptibles de réduire le nombre final d’animaux utilisés. Par exemple, si nous observons une toxicité avec un nanocorps particulier, celui-ci ne sera pas utilisé dans la suite du projet. De même, seuls les nanocorps montrant un effet biologique significatif continueront la suite des études. En outre, nous disposons d’une expertise dans les thérapies ciblant l’hôte et l’étude de leurs effets immunologiques en modèles murins. Ceci nous a permis de développer des approches expérimentales permettant d’analyser sur un même lot d’animaux, des paramètres qui étaient avant mesurés sur des lots d’animaux séparés. Ainsi, nous pourrons réaliser sur le même échantillon pulmonaire à la fois la mesure de charges bactériennes et de l’ensemble de l’immunité. Ceci permet également une réduction du nombre total d’animaux utilisés. Enfin, le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ce nombre minimal par groupe a été calculé en utilisant un logiciel spécifique dédié à l’expérimentation animale.
Raffinement
Afin de minimiser le risque d’infection cutanée, une désinfection du site d’injection sera réalisée préalablement à l’injection des nanocorps. Dans les jours post-injection, nous serons particulièrement attentifs à la survenue éventuelle de plaies, rougeur, chaleur, écoulement, et à l’état général de l’animal. En ce qui concerne l’infection de souris à la tuberculose, un soin particulier sera porté afin de réduire le stress de chaque animal préalablement à l’infection. Les animaux seront placés dans le dispositif d’inhalation par des opérateurs expérimentés, et attentivement surveillés pendant l’infection. Nous utiliserons une dose faible et une souche peu virulente de tuberculose afin de minimiser l’intensité des symptômes et la gravité de la maladie. Post-infection, nous surveillerons quotidiennement la survenue de signes respiratoires et l’état général de l’animal. Les antibiotiques anti-tuberculeux seront administrés aux souris aux doses pharmacologiquement validées, à un débit lent et régulier. Il est attendu que ces antibiotiques aient un effet bénéfique et réduisent l’intensité des symptômes de tuberculose chez les souris infectées. La survenue éventuelle d’effets indésirables sous antibiotiques sera attentivement surveillée, notamment le risque de diarrhée, de moins bonne prise hydrique et alimentaire, de déshydratation. En cas de diarrhées, la nourriture sera pré-hydratée pour favoriser la prise alimentaire, et l’eau de boisson pourra être supplémentée avec du sucre pour favoriser la prise hydrique. En cas de déshydratation, une réhydratation orale ou par injection pourra être pratiquée.
Choix des espèces
Il existe de nombreux modèles de tuberculose chez l'animal : du primate non-humain au poisson zèbre en passant par les rongeurs. Nous utilisons la souris car ce modèle est prédictif de ce qui se passe chez l'homme en termes d'immunité et de pathologie. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes âgées entre 6 et 12 semaines au début des procédures. En effet, à ce stade de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature.
Rôle du récepteur CB1, dans les neurones à pro-opiomélanocortine (POMC), dans la régulation de la réponse au conditionnement de la peur. MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Portant des modifications génétiques ciblant le récepteur CB1 ou les neurones à POMC, 1 984 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 696 d'entre elles reçoivent une injection de particules virales dans le cerveau, 232 se voient implanter une lentille intracérébrale au cours d'opérations de 45 à 75 minutes, et 192 sont gavées de tamoxifène cinq jours d'affilée. Le protocole repose sur un conditionnement à la peur, dont le porteur reconnaît qu'il augmente le niveau de stress, complété par des tests qualifiés d'anxiogènes sans qu'aucun ne soit nommé. Toutes sont tuées à la fin, par dislocation cervicale ou par perfusion intracardiaque après sédation, pour prélever le cerveau et d'autres tissus.
Objectifs
Notre corps réagit à la peur en utilisant ses réserves d’énergie et en modifiant certaines fonctions internes pour nous aider à faire face à la situation. La peur influence notre cerveau de différentes façons, ce qui peut changer nos émotions et notre comportement. Elle peut parfois provoquer des réactions peu adaptées, comme manger de façon compulsive. Dans le cerveau, une zone particulière joue un rôle important dans le contrôle de l’alimentation. Certaines neurones de cette zone (appeler les neurones à POMC) aident normalement à réduire la sensation de faim. Une molécule bien connue, appelée récepteur CB1, intervient à la fois dans la manière dont nous réagissons à la peur et dans la façon dont nous régulons notre alimentation. Le but de ce projet est de comprendre si ce récepteur CB1 peut influencer à la fois la réaction à la peur et le comportement alimentaire dans ces cellules qui participent à limiter la prise de nourriture. Pour cela, nous avons deux objectifs : Voir si le récepteur CB1 modifie l’activité de ces cellules lorsque les souris ont peur et déterminer si ce même récepteur influence la façon dont les souris mangent lorsqu’elles vivent une situation de peur
Bénéfices attendus
Nous souhaitons souligner la nouveauté de ce projet, puisque le rôle de la POMC dans la réponse à la peur n'a jamais encore été étudié auparavant. Les neurones à POMC ont été largement explorés dans le domaine du comportement alimentaire, mais leur rôle dans la régulation de l'anxiété et celui de la peur n'a pas encore été étudié. Il est admis que le stress ou l'anxiété altère le comportement alimentaire, ce qui peut entraîner des troubles du comportement alimentaire et l'obésité. Cependant, les mécanismes moléculaires reliant ces deux phénomènes ne sont toujours pas clairs. Dans ce contexte, les neurones à POMC et le récepteur CB1, par leur capacité à réguler à la fois l'alimentation et la réponse au stress, semblent être de bons candidats pour expliquer l’interaction entre alimentation et comportement de peur.
Procédures
Au cours de ce projet, nous réaliserons des opérations chirurgicales sur des souris POMC*CB1, POMC-Cre et CRH-Cre afin d'injecter des particules virales dans le cerveau. Les souris POMC*CB1 subiront une seule injection de vecteur viral dans le cerveau (696 souris). Les souris POMC-Cre seront également utilisées pour implanter une lentille qui nous permettra d'étudier l'activité neuronale en temps réel (232 souris). Ces procédures durent entre 45 et 75 minutes et sont réalisées sous anesthésie locale et générale (traitement à la lidocaïne au site d'incision et isoflurane pendant la chirurgie). De plus, les souris recevront un traitement analgésique pendant la chirurgie et un traitement antiflamatoire 48h après la chirurgie pour éviter la douleur et assurer une bonne récupération après la procédure. L'état général des souris, ainsi que le poids corporel, seront évalués les jours suivant la chirurgie selon les points limites de définies dans l'annexe 2. Les souris POMC-Cre+ et CRH-Cre+ (96 souris) avec une injection intracérébrale de virus AAV contenant le DREADDS, 4 semaines après la chirurgie, lorsque le virus sera exprimé, nous effectuerons une injection du CNO soit 30 minutes avant le test par voie intrapéritonéale, soit 1 heure avant le test par voie sous-cutanée. Ces procédures seront effectuée seulement une seule fois par animal. Les souris POMC-vglut2 at POMC-GAD (192 souris) recevront une administration orale de tamoxifène pendant 5 jours. Le tamoxifène induit une réduction temporaire du tissu adipeux, entraînant une perte de poids réversible. Pour réduire le stress de l’animal au moment de la procédure, une période d’habituation sera réalisée 3 jours avant le début des 5 jours de gavage.
Impact sur les animaux
Pour les procédures chirurgicales, afin d'éviter toute douleur, nous utilisons des analgésiques en pre-opératoires et réalisons une anesthésie locale de la peau avant l'incision. Après la chirurgie, un traitement analgésique est administré pendant 48h, nous suivons le poids corporel quotidiennement et nous évaluons les animaux selon les points limites. Pour les tests anxiogènes, nous laisserons un intervalle de 7 jours entre les tests effectués sur les mêmes animaux pour leur permettre de récupérer. Nous effectuerons toujours le test le moins anxiogène en premier et avec un maximum de 2 tests chez les mêmes souris. Le test de conditionnement à la peur augmente le niveau de stress chez les souris. Les animaux ayant subi une peur conditionnée ne seront pas réutilisés pour ce même test ou pour un test anxiogène.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans ce projet seront sacrifiées à la fin de l'expérience pour récupérer les tissus et réaliser des études moléculaires. Nous sacrifierons les souris de deux manières différentes : la dislocation cervicale pour le prélèvement de tissus frais et la perfusion intracardiaque sur cœur arrêté afin de fixer le cerveau pour les études histologiques. La persufion intracardiaque se fait après une injection intrapéritonéale de Xylazine à une dose de 20mg/kg pour la sédation. Une injection d’euthanasiant (pentobarbital à une dose de 400mg/kg) sera ensuite réalisée 10 à 20 minutes après. Nous attendrons que la souris ne présente plus de signe de coeur battant avant de procéder à l'ouverture de la cage thoracique pour la perfusion.
Remplacement
Pour évaluer l'implication des neurones à POMC et du système endocannabinoïde dans la régulation de la peur et du comportement alimentaire, il n'existe aucune alternative à l'heure actuelle que l'expérimentation animale. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement ne serait pas approprié. Le niveau de complexité de l'étude que nous proposons de réaliser est tel qu’aucun modèle informatique ne pourrait remplacer l’animal.
Réduction
Nous avons déterminé, en utilisant un calcul de puissance statistique, que nous avons besoin de 12 à 29 animaux par groupe pour obtenir des données exploitables.
Raffinement
De manière générale, les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 semaines, en cages collectives, et seront manipulés de façon bi-hebdomadaire pendant au minimum une semaine avant le début des expériences. Ces manipulations permettront d’habituer les animaux aux expérimentateurs et de réduire le stress. Les animaux auront une période de récupération d’au moins une semaine entre chaque expérience afin de limiter le stress et l’angoisse. Les animaux soumis à un test de peur conditionnée ne seront pas utilisés pour un autre test stressant ou anxiogène, ils seront sacrifiés après le test. L’enrichissement se compose de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnet en bois pour ronger et de tunnel en carton pour se cacher/manipuler les animaux. Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. Les souris seront hébergées en cages collectives, sauf lorsqu'elles auront à subir une chirurgie, et que la consommation de nourriture devra être consignée.
Choix des espèces
La peur et le comportement alimentaire sont depuis longtemps évalués chez la souris, qui représente une espèce pertinente pour ce type d’étude. La grande majorité des études portant sur les circuits cérébraux et les mécanismes de réponse à la peur, ainsi que l'étude du système endocannabinoïde sont réalisées chez la souris. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, ce qui implique que les résultats obtenus chez le rongeur seront transposable à l'humain, ce qui aura pour conséquence de faire avancer les connaissances dans ce domaine et à plus long terme de trouver de nouvelles voies thérapeutiques. Par ailleurs, les modèles génétiques dont nous avons besoin pour répondre à nos questions ne sont disponibles que chez la souris. Les expériences ne commenceront que lorsque les souris seront adultes (8 semaines). Mâles et femelles seront utilisés dans cette étude, car il a été montré que le système endocannabinoïde du cerveau de souris femelles est différent de celui des mâles, à la fois dans les conditions basales et lorsque les souris sont dans une situation de stress.
Étude de la combinaison des anti-PDL1 et anti-IL6 dans le traitement des métastases osseuses des cancers pulmonaires.
- Recherche appliquée
- Cancers
Une souris dont la tumeur atteint 10 % de son poids corporel est retirée de l'étude et mise à mort, comme celle qui perd du poids, respire difficilement ou refuse de se déplacer. 150 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous anesthésie, puis une radiographie hebdomadaire sous anesthésie pendant trois semaines et neuf injections de traitement, jusqu'à ce que les métastases fragilisent et détruisent leur tissu osseux. L'étude teste si l'association d'une immunothérapie et d'un anti-IL-6 freine les métastases osseuses des cancers du poumon, le porteur renvoyant tout bénéfice pour les patients à d'éventuels essais cliniques ultérieurs.
Objectifs
Avec 53 000 nouveaux cas et 22 000 décès par an en France, le cancer du poumon est l'un des plus fréquents et la cause principale de décès par cancer. Dans environ 40 % des cas, la maladie s'étend aux os : ce sont les métastases osseuses. Cette situation est très grave car les traitements actuels, appelés immunothérapies (qui aident le corps à se défendre seul contre la tumeur), fonctionnent mal une fois que le cancer a atteint l'os. Pourquoi ces traitements sont-ils moins efficaces ? Parce que l'os est un environnement particulier qui « paralyse » les cellules de défense du système immunitaire. De plus, les cellules cancéreuses dans l'os produisent en grande quantité une molécule appelée IL-6. Cette molécule aide la tumeur à progresser et l'aide à résister aux traitements. Un autre problème se pose : les immunothérapies provoquent parfois des toxicités articulaires chez les patients. Pour les soulager, les médecins utilisent des médicaments contre l'IL-6. Cependant, on ignore encore si cette combinaison de médicaments aide vraiment à combattre le cancer ou s'il risque de freiner l'action de l'immunothérapie. Ce projet fait suite à une première étude qui a analysé comment le cancer réagit à une immunothérapie classique seule. Aujourd'hui, nous voulons tester une nouvelle stratégie : attaquer sur deux fronts en même temps. Nous allons évaluer si le fait de bloquer simultanément la molécule IL-6 et de stimuler le système immunitaire permet de mieux détruire les tumeurs dans les os. Pour cela, nous utiliserons deux approches : -Étudier comment ce double traitement agit sur des tumeurs déjà installées dans l'os. -Étudier comment il peut empêcher les cellules cancéreuses de voyager dans le sang pour venir se fixer sur de nouveaux os. L'objectif final est de trouver une combinaison de traitements plus efficace pour améliorer la prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal de ce projet est d'ordre médical et scientifique. Il vise à lever un obstacle majeur dans le traitement des cancers pulmonaires ayant atteint les os, une situation qui concerne aujourd'hui près de 40 % des patients et pour laquelle les options thérapeutiques restent insuffisantes. 1. Une avancée vers des traitements plus efficaces Le premier bénéfice attendu est la démonstration qu'une thérapie combinée peut être plus puissante qu'un traitement seul. En testant l'association d'une immunothérapie (qui stimule les défenses naturelles) et d'un inhibiteur d'IL-6 (qui bloque une molécule favorisant la tumeur), nous espérons prouver qu'il est possible de "réveiller" le système immunitaire à l'intérieur de l'os. Si ce projet confirme nos hypothèses, cela ouvrirait la voie à de nouveaux essais cliniques pour proposer aux patients des traitements capables de réduire plus efficacement la progression des métastases osseuses. 2. Une meilleure compréhension de la résistance aux traitements Ce projet permettra de mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs sont dites "froides" (invisibles pour le système immunitaire). En étudiant précisément l'environnement de l'os, nous pourrons identifier les mécanismes qui permettent au cancer de s'y protéger. Ces connaissances sont fondamentales pour développer, à l'avenir, d'autres stratégies personnalisées en fonction des molécules produites par la tumeur du patient. 3. Une sécurisation des pratiques cliniques actuelles Actuellement, les médecins utilisent parfois des traitements anti-IL-6 pour soulager les effets secondaires inflammatoires des immunothérapies, sans connaître précisément l'impact de ce mélange sur la croissance de la tumeur. Ce projet apportera une réponse concrète sur la sécurité de cette stratégie : il permettra de savoir si ce traitement de confort aide aussi à combattre le cancer ou s'il risque de freiner l'immunothérapie, permettant ainsi de mieux guider les choix des oncologues. 4. L'amélioration de la qualité de vie Enfin, en cherchant à limiter la destruction osseuse (l'ostéolyse) provoquée par le cancer, ce projet vise indirectement à réduire les douleurs intenses et les risques de fractures chez les patients. À terme, une meilleure maîtrise de la progression tumorale dans l'os est synonyme d'une plus grande autonomie et d'une amélioration significative de la qualité de vie des malades.
Procédures
Le parcours expérimental de chaque animal se décompose en trois types d’interventions. Tout d’abord, les animaux reçoivent une injection unique de cellules sous anesthésie générale, une procédure qui dure environ 5 minutes. Par la suite, un suivi médical par radiographie est réalisé une fois par semaine pendant 3 semaines ; chaque séance de radiographie dure 10 minutes et se déroule également sous anesthésie pour garantir l'immobilité et le confort de l'animal. Enfin, le traitement est administré sous forme de trois injections par semaine réparties sur une période de 3 semaines, chaque injection durant moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Le développement des métastases dans l'os peut provoquer une fragilisation et une destruction du tissu osseux. Chez l'animal, cette pathologie est susceptible d'entraîner une gêne physique ou une douleur, qui se manifeste par une boiterie ou une baisse de son activité naturelle. En complément, les manipulations répétées nécessaires pour administrer les traitements représentent une source de stress pour les animaux. Ces interventions techniques peuvent également causer une irritation locale ou une inflammation au niveau des points d'injection. Enfin, la répétition des anesthésies générales, bien qu'indispensable au suivi médical, constitue une sollicitation physiologique supplémentaire pour l'organisme de l'animal.
Devenir
À la fin de l'étude, l'ensemble des animaux sera mis à mort de manière indolore sous anesthésie. Cette étape est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet : elle permet de réaliser des analyses profondes que l'imagerie (radiographie) ne peut pas fournir seule. L'importance des prélèvements : Une fois la procédure terminée, nous prélevons les tumeurs osseuses ainsi que les organes qui sont les sièges fréquents des métastases (comme les poumons, le foie et les autres os). Les organes et les tumeurs sont ensuite conservés et préparés pour être étudiés au microscope (analyse histologique). Cette étape est cruciale pour : -Observer l'architecture de l'os et l'étendue de sa destruction. -Analyser l'organisation des cellules cancéreuses. -Étudier la présence et l'activité des cellules de défense immunitaire au cœur même de la tumeur.
Remplacement
Bien que les études réalisées sur des cellules en culture (appelées études in vitro) permettent de comprendre de nombreux mécanismes isolés du cancer, elles ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier. Le cancer n'est pas seulement un amas de cellules malades ; c'est une maladie qui interagit en permanence avec tout ce qui l'entoure. Pour comprendre comment traiter les métastases osseuses, il est indispensable d'étudier la tumeur dans son environnement réel. Cela inclut : -Le système immunitaire : comment les cellules de défense circulent et tentent d'attaquer la tumeur. -Le tissu osseux : comment l'os réagit et se fragilise face à l'invasion cancéreuse. -Les vaisseaux sanguins : comment la tumeur est alimentée et comment les médicaments y sont transportés. -Les interactions cellulaires : les échanges constants entre les différentes cellules du corps et les cellules cancéreuses. À l'heure actuelle, il est impossible de recréer cette organisation complexe et ces interactions vivantes artificiellement en laboratoire. L'utilisation d'un modèle animal (souris) est donc la seule solution pour étudier l'efficacité réelle des nouveaux traitements avant de pouvoir les proposer aux patients. Tous les organes des animaux seront prélevés à la fin de la procédure.
Réduction
Nous avons utilisé des logiciels de statistiques et analysé les résultats d'études scientifiques déjà publiées. Cela nous permet de calculer précisément la taille de groupe minimale nécessaire pour obtenir des résultats fiables, tout en évitant d'utiliser plus d'animaux que nécessaire. Une utilisation optimisée de chaque animal : Pour chaque groupe de traitement, nous avons défini un effectif de 18 souris. Ce nombre est soigneusement calculé pour nous permettre de mener trois types d'analyses complémentaires et indispensables : -Analyse de l'os (10 animaux) : pour mesurer précisément l'étendue de la destruction osseuse et la taille de la tumeur. -Analyse génétique (4 animaux) : pour étudier comment les gènes de la tumeur et de l'os réagissent aux traitements. -Analyse des cellules (4 animaux) : pour identifier et compter les différentes cellules de défense (système immunitaire) présentes sur le site. En regroupant ces différentes analyses au sein d'une même expérience, nous évitons de multiplier les procédures. Chaque animal utilisé apporte une contribution maximale à la compréhension de la maladie, ce qui permet de limiter globalement le nombre total de souris nécessaires à l'aboutissement de ce projet de recherche. Chaque animal est prélevé de manière exhaustive afin de collecter le maximum de données. Cette approche permet de rentabiliser chaque procédure et de limiter, à l'avenir, le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement solides.
Raffinement
Pour favoriser leur bien-être, les souris vivent en petits groupes de trois dans des habitats spacieux et équipés de filtres à air. Leur environnement est stimulé par des aménagements spécifiques : de la litière épaisse et douce, des abris et des objets à partager. Une fois les groupes formés, nous n'introduisons aucun nouvel animal pour éviter tout stress lié à la hiérarchie sociale. De plus, lors du nettoyage hebdomadaire, nous ne changeons que la moitié de la litière afin de conserver leurs repères olfactifs familiers. A leur arrivée, les animaux bénéficient d'une période de deux semaines d'acclimatation. Pendant ce temps, ils sont manipulés régulièrement par les chercheurs de manière douce, uniquement pour les habituer au contact humain et réduire leur anxiété avant le début de l'étude. Chaque étape technique est réalisée avec le plus grand soin : Les cellules injectées sont rigoureusement contrôlées (absence de bactéries ou champignons). Toutes les injections se font sous anesthésie, et la température corporelle des souris est maintenue grâce à des coussins chauffants. Pour les traitements, nous privilégions les injections dans les vaisseaux sanguins (en variant les sites : queue, jambe ou cou) plutôt que dans l'abdomen, afin d'éviter toute inflammation locale douloureuse. Le bien-être des souris est évalué chaque jour par un personnel spécialisé et en lien avec un vétérinaire. Nous surveillons des signes précis : qualité du pelage, dynamisme ou comportement social. Nous avons défini des critères d'alerte très stricts. Si un animal présente une perte de poids, une respiration difficile, une réticence à se déplacer ou une tumeur atteignant 10 % de son poids, il est immédiatement retiré de l'étude et mis à mort sans douleur. Cela garantit qu'aucune souffrance inutile n'est tolérée.
Choix des espèces
Pour cette étude, nous utilisons un modèle de souris fréquemment utilisé dans la recherche contre le cancer à travers le monde. Cette large utilisation permet de comparer plus facilement nos résultats avec ceux d'autres recherches internationales. Nous avons choisi de réaliser notre étude sur des souris âgées de six semaines. À cet âge, les souris sont de jeunes adultes ayant atteint un stade de développement stable. Ce choix permet de s'assurer que les réactions observées face à la maladie ou aux traitements ne sont pas influencées par la phase de croissance de l'animal, ce qui rend les résultats scientifiques plus fiables.
Evaluation de l’hémostase et des fonctions plaquettaires dans des souris lupiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Injectées deux fois par semaine pendant huit semaines sur animal vigile, saignées quatre fois sur la même période, puis anesthésiées pour un temps de saignement mesuré jusqu'à trente minutes, 448 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles ont été génétiquement modifiées pour développer un lupus et présentent dès huit semaines perte de poids, défaut de toilettage, gonflements articulaires et inflammation des reins. Le traitement testé cible les plaquettes sanguines, dont le nombre chute chez les personnes atteintes de lupus, et l'étude mesure son effet sur l'arrêt du saignement. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur décrivant des procédures invasives et terminales incompatibles avec un réveil, les organes étant ensuite prélevés.
Objectifs
Le lupus est une maladie auto-immune (le système de défense de l’organisme s’attaque aux constituants normaux de l’organisme) responsable d’une altération de la qualité de vie des patients ainsi que des lésions d’organes avec présence d’une inflammation généralisée. L’objectif de notre étude est de mieux comprendre l’effet du lupus sur l’arrêt du saignement suite à une lésion et les fonctions des plaquettes sanguines. La thrombopénie (réduction du nombre de plaquettes) et l’activation plaquettaire sont fréquemment observées chez les patients présentant un lupus, contribuant à des complications de type formation d’un caillot sanguin et hémorragie, ainsi qu’à des atteintes de la peau et des reins. Les plaquettes activées favorisent leurs interactions avec les globules blancs ce qui amplifie la pathologie. Il est proposé aujourd’hui d’utiliser un traitement ciblant les plaquettes sanguines afin de diminuer leur capacité à former des agrégats et à interagir avec les globules blancs, prévenant ainsi l’inflammation et la réduction du nombre de plaquettes dans le cadre du lupus. Néanmoins, l’effet de ce traitement sur l’arrêt du saignement, les fonctions plaquettaires ainsi que sur la réduction du compte plaquettaire associés au lupus est à ce jour peu décrit. Comprendre l’impact du lupus sur l’arrêt du saignement et la fonction plaquettaire permettra d’identifier de nouvelles cibles potentielles pour des traitements dans le cadre du lupus.
Bénéfices attendus
Cette étude devrait nous permettre de mieux comprendre l’effet du lupus sur l’arrêt du saignement et les fonctions plaquettaires. Cela permettra d’identifier de nouveaux traitements qui pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de lupus et donc leur qualité de vie.
Procédures
Un lot d’animaux sera soumis à un temps de saignement sous anesthésie (30 minutes maximum). Un lot d’animaux sera soumis à 2 prélèvements sanguins sous anesthésie : l’un d’une durée de 5 minutes, l’autre de 20 minutes. Un lot d’animaux subira une injection d’un traitement 2 fois par semaine durant 8 semaines (animal vigile) et un temps de saignement sous anesthésie (30 minutes maximum). Un lot d’animaux subira une injection d’un traitement 2 fois par semaine durant 8 semaines (animal vigile), 4 prélèvements sanguins sur ces 8 semaines (durée de 5 minutes chacun, animal anesthésié) et 1 prélèvement sanguin d’une durée de 20 min sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les animaux atteints de lupus présentent, aux alentours des 8 semaines de vie, une perte de poids, un défaut de toilettage, des gonflements articulaires et ganglionnaire, ainsi qu’une inflammation des reins provoquant une présence de protéines dans les urines, ce qui est caractéristique des maladies auto-immunes. Le traitement testé pourrait réduire les signes de la maladie. Les procédures réalisées peuvent également induire des nuisances : >Anesthésie : impact sur le rythme respiratoire >Prélèvements sanguins : risque de douleur modérée et de saignement au site de prélèvement >Injection : durcissement de la peau et lésion au site d’injection
Devenir
Les procédures expérimentales réalisées sont invasives et terminales, ce qui ne permet pas le réveil des animaux sans induire une forme de souffrance incompatible avec leur bien-être. Par conséquence, à la fin de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés puis mis à mort selon les méthodes réglementaires. Après la mise à mort, leurs organes seront récupérés afin d’étudier les mécanismes de formations des plaquettes sanguines dans le cadre du lupus (étude complémentaire qui ne nécessitera donc pas d’animaux supplémentaires).
Remplacement
Les fonctions plaquettaires ainsi que l’arrêt du saignement sont des processus particulièrement complexes, faisant intervenir plusieurs types de cellules ainsi que des conditions physiques (pression artérielle, flux sanguin). Les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de modèles cellulaires humains permettant d’étudier le lupus et capable de générer assez de plaquettes pour les analyses prévues.
Réduction
Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum tout en permettant l’obtention de résultats statistiquement significatifs. De plus, du fait d’une différence de sévérité du lupus en fonction du sexe de l’animal, les données obtenues pour les femelles et les mâles seront analysés séparément. A la fin des procédures, les souris seront mises à mort, puis leurs organes seront récupérés afin d’étudier les mécanismes de formations des plaquettes sanguines dans le cadre du lupus (étude complémentaire qui ne nécessitera donc pas d’animaux supplémentaires).
Raffinement
Une acclimatation de 14 jours ara lieu entre l’arrivée des animaux à l’animalerie et leur utilisation. Une habituation à la manipulation et à la contention est prévue 5 jours avant le début de l’expérimentation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : >Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans un environnement enrichi (tissu, tunnel, …), >Par une anesthésie avant et pendant les procédures expérimentales, >Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures expérimentales > Les souris avec un phénotype impactant la qualité de vie auront accès à de la nourriture sous forme de pâté, ainsi qu’à de l’eau gélifiée. Elles seront suivies 3x par semaine pour détecter tout inconfort. Les souris atteignant un point limite seront soustraite à l’expérimentation. Durant toutes les procédures, les animaux seront suivis par un personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’un mammifère proche de l’Homme pour sa physiologie et ce modèle de souris génétiquement modifié se rapproche fortement de la pathologie humaine. Nous utiliserons dans ce projet des souris mâles et femelles de manière équilibrée, car une différence dans le développement de la pathologie est attendue entre mâle et femelles. A partir d’environ 8 semaines d’âge, les souris présenteront la maladie, associée à une thrombopénie. Le traitement testé dure 8 semaines. De plus, il est nécessaire que les individus aient un poids suffisant. Les animaux utilisés dans ce projet auront donc entre 7 et 16 semaines d’âge, ce qui correspond à un stade adulte, tout en évitant les effets liés au vieillissement.
Viellissement du globule rouge chez la souris thalassémique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une transfusion sanguine sur animal vigile, sept prélèvements de sang en vingt et un jours et des injections susceptibles d'entraîner des complications oculaires attendent 2 642 souris thalassémiques. 816 d'entre elles sont opérées sans réveil, 386 subissent des procédures légères et 1 440 des procédures modérées, toutes étant tuées à l'issue. Le porteur qualifie l'ensemble des nuisances de modérées, tout en décrivant une transfusion capable de provoquer une surcharge volémique avec insuffisance respiratoire, et des souris porteuses d'un phénotype dommageable stable de retard de croissance et d'anémie. La mise à mort intervient au bout de chaque procédure, pour récupérer le sang à analyser.
Objectifs
Les globules rouges sont responsables du transport d'oxygène dans le sang et ne sont pas touchés par les altérations courantes liées au vieillissement des autres cellules puisque constitués presque exclusivement de protéines. Chez les patients atteints par la bêta-thalassémie, le viellissement des globules rouges est accéléré causant l’anémie. Les deux objectifs de ce projet sont d’abord de caractériser, dans un modèle de souris thalassémique, différents marqueurs du viellissement du globule rouge en circulation et ensuite, d’étudier l'impact de drogues modulant la capacité de dégradation de protéines abîmées sur ces marqueurs de viellissement.
Bénéfices attendus
Les mécanismes moléculaires et cellulaires du vieillissement des globules rouges déterminent leur durée de vie en circulation et sont donc des objets d’études cruciaux dans plusieurs contextes physiopathologiques qui mènent à l'anémie. Une étude de preuve de concept déterminera l'impact d'une drogue activant la dégradation des protéines abîmées et ayant le potentiel de retarder le vieillissement des globules rouges, avec pour objectif de réduire l'anémie chez les patients bêta-thalassémiques.
Procédures
Injection pendant 5-10 secondes, suivie 20 minutes plus tard, d'une seconde injection pendant 5-10 secondes, puis quelques minutes plus tard par un prélèvement sanguin (sous analgésie et anesthésie générale) pendant 1 minute, effectués une seule fois. Injection pendant 5-10 secondes, effectuée quatre fois. Transfusion sanguine sur animal vigile pendant 5-10 secondes, effectuée une seule fois. Prélèvement de sang sur animal vigile pendant quelques secondes, effectué 7 fois sur 21 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont modérés. Un stress est induit par la contention, les injections d'analgésie et d'anesthésie (quelques secondes). Les prélèvements de petits volumes de sang sont de courte durée (
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever du sang qui sera analysé.
Remplacement
Veille bibliographique permanente pour éviter toute expérimentation inutile ou redondante. L’expérimentation animale est indispensable pour évaluer in vivo, dans un modèle préclinique pathologique, l’impact de drogues sur le vieillissement des globules rouges, puisqu’il est dépendant des contraintes réelles subies dans la circulation, qui ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro. De plus, la clairance du globule rouge sénéscent est réalisée par plusieurs tissus et types cellulaires dont l’activité dépend aussi du contexte physiologique global et complexe d’un individu.
Réduction
Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Les tests statistiques utilisés rigoureusement permettent l’analyse d’échantillons de petites tailles. Notre expertise des modèle de vieillissement et transfusion des globules rouges chez la souris ainsi qu’une analyse statistique utilisant un logiciel nous informent que des groupes de 12 souris sont nécessaires pour générer des résultats robustes. Certaines méthodes ont été optimisées afin d'être réalisées sur de très faibles volumes de sang prélevé, et sur plusieurs marqueurs en parallèle, permettant un suivi longitudinal sur le même animal.
Raffinement
Les injections, transfusions et prélèvements de petits volumes de sang (5uL) sur souris vigiles seront effectués par du personnel expérimenté qui maîtrisent les gestes techniques. Hébergement adapté des animaux, enrichissement de l’environnement. Lorsque l’approche expérimentale le permet, l'analgésie et l'anesthésie est utilisée pour réduire l'inconfort de l'animal. Un protocole de surveillance du bien-être est défini a priori et appliqué pour l’élevage des animaux à phénotype dommageable et pour chacune des procédures, avec définition de points-limites basés sur un score composite d’items d'observations cliniques.
Choix des espèces
Les lignées de souris consanguines présentent une faible variabilité biologique, rendant les tests plus puissants dans la détection de processus physiologiques et permettant de diminuer le risque d’incompatibilité transfusionnelle. De plus, la souris thalassémique étudiée est un modèle reconnu de vieillissement accéléré des GR en circulation, permettant une comparaison robuste des résultats obtenus avec ceux de la littérature scientifique. Pour l'élevage, des souris jeunes adultes seront mises en accouplement jusqu'à 30 semaines. Les souris jeunes adultes pour suivi des marqueurs de viellissement des GR ou "receveuses" utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines, permettant d’homogénéiser les groupes en terme de volume circulant et d’âge. Des souris adultes "donneuses" âgées de 10-14 semaines et qui ont une capcité circulatoire mature seront utilisées pour la réalisation des banques de sang.
Effets d’un morphinique sur la fonction rénale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Pour caractériser les effets rénaux d'un morphinique que les protocoles d'expérimentation recommandent comme antidouleur, 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des travaux antérieurs de la même équipe avaient relevé une baisse d'environ vingt pour cent de la filtration rénale et une hausse de la mortalité après opération. Toutes reçoivent deux injections sur animal vigile puis deux mesures de fonction rénale sous anesthésie générale, et une partie subit une chirurgie de 90 à 120 minutes pour la pose de deux cathéters, avec risque d'hémorragie et d'arrêt cardiorespiratoire. Douze souris sont tuées pour dosages, les 48 autres réutilisées ailleurs au motif qu'elles n'auront subi que des mesures qualifiées de non invasives.
Objectifs
Des travaux antérieurs ont mis en évidence que l’administration préopératoire d’un morphinique, à des doses usuellement considérées comme faibles et recommandées en expérimentation animale dans les protocoles douloureux, induisait une diminution de la fonction rénale (capacité du rein à filtrer le sang) en conditions physiologiques normales chez le rat et la souris. Plus spécifiquement, la capacité de filtration du rein ou débit de filtration glomérulaire mesurée de manière non invasive était diminué d’environ vingt pour cent par rapport aux valeurs normales habituellement constatées. Ces observations suggèrent que le morphinique pourrait exercer, en conditions physiologiques normales, des effets directs sur le rein, indépendamment de toute pathologie. D’autre part, dans des modèles de maladies rénales, nous avons observé une hausse de la mortalité post opératoire avec les mêmes doses administrées plusieurs fois au cours des premiers jours. Dans le but de mieux appréhender les implications de l’utilisation de morphinique dans nos protocoles expérimentaux futurs, il apparaît essentiel de caractériser plus finement ses effets sur la fonction rénale dans un contexte physiologique sain. Trois axes principaux seront explorés dans cette étude : 1. Effet dose-dépendant du morphinique sur la fonction du rein Évaluer l’impact de doses croissantes sur le débit de filtration glomérulaire, reflet de la capacité de filtration du rein, chez la souris. 2. Cinétique des effets du morphinique sur la fonction du rein Étudier la dynamique temporelle des effets du morphinique sur la fonction rénale, afin de déterminer la durée et l’intensité des effets. 3. Effets du morphinique sur la pression artérielle et le débit sanguin rénal
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces données permettra d’identifier les mécanismes par lesquels le morphinique influence la fonction rénale en l’absence de pathologie. Elles contribueront également à affiner les conditions expérimentales futures, afin de réduire les biais pharmacologiques des projets de recherche dans le domaine des maladies rénales.
Procédures
Tous les animaux recevront deux injections de morphinique, administrées à l’état vigile. Chaque injection dure environ 10 secondes. Une partie des animaux recevra deux injections supplémentaires destinées à induire une anesthésie locale. Tous les animaux seront soumis à deux mesures de la fonction rénale à une semaine d’intervalle, impliquant l’injection du traceur fluorescent sous anesthésie générale, suivie de la pose d’un capteur de fluorescence miniaturisé sur le dos de l’animal. Cette première étape dure environ 5 minutes. Deux heures plus tard, une seconde anesthésie générale sera pratiquée pour retirer le capteur, cette intervention ne durant que 2 minutes. Une partie des animaux sera soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et locale. Cette procédure consiste à poser deux cathéters afin de mesurer la pression artérielle et le débit sanguin rénal. La durée totale de cette intervention est estimée entre 90 et 120 minutes. Une partie des animaux sera euthanasiée à la fin de la procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée. L’autre partie sera réutilisée.
Impact sur les animaux
Les nuisances peuvent être générées par : 1.Les injections : Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et un stress lors de la contention pour la bonne administration. Les injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation. 2. La chirurgie pour les mesures de pression artérielle peut provoquer des douleurs et entraîner des saignements / hémorragies. 3. Les complications liées à l'anesthésie générale au moment de la chirurgie vasculaire et de la mesure de la fonction rénale : détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique.
Devenir
Afin d’effectuer des dosages et analyses spécifiques, douze animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée. Les 48 autres seront réutilisées car elles n’auront reçu que deux injections de morphinique et auront eu deux mesures de fonction rénale non invasive.
Remplacement
Le rein est un tissu complexe, qui comporte des dizaines de types cellulaires. Les organoïdes rénaux ne sont pas encore optimaux, notamment car il est encore impossible d'y réaliser une circulation sanguine. Ils ne permettent pas de mesurer la fonction rénale, c'est-à-dire la fonction de filtration du sang par le rein. Or, ce paramètre est le critère majeur de la caractérisation de l'effet du morphinique sur le rein. Les mesures de pression artérielle ne peuvent être envisagées que sur un modèle in vivo.
Réduction
Du fait de la simplicité du modèle et du caractère pilote de l’étude, des lots de 6 animaux sont suffisants pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences entre les groupes d’animaux. Les expériences seront renouvelées une fois de manière indépendante. Pour les mesures de pression artérielle, deux lots indépendants de 6 souris suffiront à mettre en évidence les effets potentiels du morphinique en aigu. Nous utiliserons des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre total d'animaux est de 60 souris dont 48 qui seront réutilisées.
Raffinement
1. Raffinement de l’hébergement et de la surveillance Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie une à deux semaines avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité. Le bien- être des animaux est également assuré par plusieurs types d’enrichissements. En dehors d'une courte période d'isolement limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. 2. Raffinement pour les injections Les injections sont réalisées à l’état vigile avec une aiguille très fine qui limite les risques hémorragiques et la douleur. Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté. 3. Raffinement pour la mesure de la fonction rénale : Après anesthésie générale, les souris sont placées sur un plateau chauffant. Après application d’une goutte d’anesthésique local, les injections du traceur sont réalisées avec une aiguille très fine qui va limiter les risques hémorragiques. Le site d’injection est alterné d’une mesure à l’autre. Un gel ophtalmique est appliqué ensuite pour atténuer la gêne après l’injection. Le produit utilisé comme traceur est parfaitement toléré, il appartient à la famille des sucres. Les souris sont placées dans une couveuse à 28 degrés Celsius , installée dans une pièce d'expérimentation de l'animalerie dans des cages individuelles pour ne pas risquer d'abimer le dispositif de mesure. Les souris ont accès à l'eau et à la nourriture. Les cages individuelles sont toutes placées dans la couveuse. A la fin de la mesure, les animaux sont remis dans leur cage initiale en respectant bien les groupes initiaux avec le même enrichissement. 4. Raffinement pour les mesures de pression artérielle et de débit sanguin rénal L’antalgie pré opératoire est assurée par des injections d’un anesthésique local aux sites d’incisions, dix minutes avant. La préparation chirurgicale pour la pose des cathéters et de la sonde rénale dure environ 30 minutes. Le morphinique injecté en bolus viendra prendre le relais de l’antalgie jusqu’à l’euthanasie finale après une heure d’enregistrement. Les animaux sont placés sur un plateau chauffant pour mieux tolérer l’anesthésie. Une perfusion continue de sérum physiologique permet d’assurer la stabilité pendant toute la durée de l’expérience.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce utilisée dans ce projet. Elle constitue le modèle animal de référence pour la majorité de nos projets. Bien que des résultats similaires aient été observés antérieurement chez le rat et la souris, l’utilisation exclusive de la souris est suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Le recours à une seconde espèce n’apporterait pas de bénéfice scientifique supplémentaire. Ce choix permet d’assurer la cohérence et la comparabilité des données avec les projets existants, tout en respectant le principe de Réduction en évitant l’utilisation d’une espèce animale supplémentaire. Pour toutes les procédures, les souris sont âgées entre 9 et 12 semaines car à cet âge, elles ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système glomérulaire mature et ne présentent pas encore de lésions de vieillissement.
Preuve de concept de faire une deuxième superovulation pour collecter une deuxieme fois des ovocytes des femelles donneuses souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
240 souris femelles vont être utilisées, chacune subissant deux fois la même chirurgie d'ouverture du dos pour aller prélever les ovocytes dans l'oviducte, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Deux injections hormonales de superovulation précèdent chaque collecte, et toutes sont tuées après la seconde, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent plus être réutilisées ailleurs. L'objectif déclaré est de diviser par deux le nombre de donneuses en les opérant deux fois plutôt qu'une, ce que le porteur présente comme une amélioration de leur bien-être. Le calcul d'effectif s'appuie sur des groupes de 6 femelles, sans que le passage à 240 animaux soit expliqué.
Objectifs
La fécondation in vitro (FIV) est une méthode couramment utilisée pour la création et reproduction assistée de souris génétiquement modifiés. Elle permet aussi de conserver certaines lignées précieuses dans le temps. Cette technique comprend plusieurs étapes : des femelles donneuses d’ovocytes sont traitées avec des hormones pour stimuler la production d’ovules, qui sont ensuite prélevés par une petite intervention chirurgicale. Les spermatozoïdes sont récupérés chez des mâles donneurs. Ovules et spermatozoïdes sont ensuite mis en contact dans un milieu adapté pour permettre la fécondation. En parallèle, des femelles dites « porteuses » sont préparées pour accueillir les embryons : elles sont accouplées avec des mâles stériles pour déclencher les signaux hormonaux nécessaires à la gestation. Les embryons obtenus par FIV sont ensuite transférés dans leur utérus. Contrairement à l’élevage naturel où les mâles et les femelles peuvent produire plusieurs portées au cours de leur vie reproductive, les souris utilisées pour la FIV subissent des interventions chirurgicales et ne sont donc utilisées qu’une seule fois et mises au mort dans le cadre du processus. Par conséquent, la FIV nécessite un nombre plus important de souris reproductrices que l’élevage naturel pour obtenir un nombre équivalent de petits. En plus des enjeux éthiques, cette consommation élevée d’animaux a aussi un impact écologique notable, lié au transport depuis le fournisseur, à l’hébergement et à l’élimination des carcasses. L’objectif de ce projet est de développer un protocole permettant de réutiliser les femelles donneuses une seconde fois, afin de diviser par deux le nombre de donneuses nécessaire, sans compromettre leur bien-être.
Bénéfices attendus
En cas de succès, cette preuve de concept pourrait permettre de réduire significativement le nombre de femelles nécessaires aux fécondations in vitro, tout en préservant leur bien-être. En parallèle, cette amélioration contribuerait également à diminuer l’empreinte carbone de l’activité, renforçant ainsi une démarche plus éthique et respectueuse de l’environnement.
Procédures
Injections hormonales pour stimuler la production des ovocytes : Deux injections sont administrées à un et trois jours avant la collecte des ovocytes. Il s’agit de procédures rapides et peu douloureuses. Chirurgie pour la collecte des ovocytes : Les ovocytes sont récupérés lors d’une intervention chirurgicale sous anesthésie. Une petite incision est faite sur le dos de l’animal pour accéder aux ovaires, puis une ouverture minime dans l’oviducte permet d'extraire les ovocytes. Cette intervention, similaire à celle réalisée pour l’implantation d’embryons, est une procédure bien maîtrisée qui dure entre 7 et 10 minutes. Chaque femelle donneuse subira cette intervention deux fois au total dans le cadre du projet. Injections d’antalgique : Chaque souris recevra une à deux doses d’antalgique au moment de la chirurgie, afin de prévenir et réduire toute douleur. Il s’agit d’une procédure courte et peu douloureuse.
Impact sur les animaux
L’injection d’hormones peut provoquer une légère douleur au point d’insertion de l’aiguille. Cependant, ces hormones sont largement utilisées pour ce type de procédure et sont bien tolérées, sans effets secondaires connus. Les interventions chirurgicales, bien que courtes et maîtrisées, peuvent entrainer un certain stress, des douleurs post-opératoires ou des complications liées à l’anesthésie.
Devenir
Les animaux sont mis à mort selon les méthodes réglementaires à la fin de la procédure, c’est-à-dire après la seconde collecte d’ovocytes. Cette étape est nécessaire car les animaux ne peuvent pas être réutilisés dans une autre procédure.
Remplacement
La FIV est une technique indispensable pour créer des souris génétiquement modifiées, conserver des lignées ou aider à la reproduction. Elle constitue un outil technique, et non une expérience scientifique, ce qui rend son remplacement par des méthodes sans animaux impossible à ce jour. Ce projet vise donc à en réduire autant que possible l’usage des animaux, en optimisant les procédures pour limiter leur nombre.
Réduction
Ce projet constitue une étude pilote visant à évaluer la faisabilité d’un protocole de collecte d’ovocytes. Le nombre d’animaux a été déterminé en tenant compte du taux d’échec attendu de la superovulation, qui varie selon l’âge des femelles : environ 30 % chez les jeunes et 20 % chez les plus âgées. De plus, le nombre d’ovocytes collectés diminue avec l’âge (en moyenne 60 chez les jeunes femelles contre 30 chez les plus âgées). Sur cette base, un groupe de 6 femelles a été sélectionné, ce qui permet d’obtenir un nombre d’embryons suffisant pour évaluer la faisabilité du protocole et comparer les résultats aux données de performance déjà disponibles. Ce nombre est jugé adéquat pour répondre aux objectifs scientifiques tout en limitant l’utilisation d’animaux. Les interventions seront réalisées par un premier chirurgien, chaque série pouvant être répétée une fois si les résultats initiaux ne sont pas suffisamment concluants. Pour garantir des données robustes et reproductibles, un second chirurgien effectuera les procédures indépendamment.
Raffinement
Toutes les chirurgies sont réalisées sous anesthésie et les animaux sont gardés sur un tapis chauffant pour éviter toute perte de chaleur. Un traitement antalgique est administré afin de réduire les douleurs après l’intervention. Les animaux font l’objet d’une surveillance renforcée pendant les 24h suivant la chirurgie. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place et seront respectés afin de permettre la prise en charge de tout cas clinique et d’éviter toute souffrance inutile. Pour faciliter leur récupération, une alimentation adaptée (sous forme de gel ou de croquettes déposées au fond de la cage pour un accès plus facile) pourra être mise à disposition. Les animaux bénéficient également d’un enrichissement de leur cage et sont hébergés en groupe, ce qui favorise leur bien-être.
Choix des espèces
Les souris sont l’espèce la plus couramment utilisée en expérimentation animale à des fins scientifiques, en raison de leur disponibilité, de leur biologie bien connue, et de leur pertinence pour de nombreux domaines de recherche. Ce projet a pour objectif d’améliorer un protocole de FIV actuellement utilisé dans plusieurs laboratoires, afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Le projet concerne des femelles donneuses d’ovocytes, utilisées principalement à deux stades de développement : entre 4 et 5 semaines, et entre 8 et 18 semaines. Ces périodes ont été sélectionnées car leurs caractéristiques reproductives sont bien documentées. Les femelles âgées de >5 à 8 semaines ne peuvent pas être utilisées, car elles montrent une résistance à la stimulation hormonale, rendant la superovulation inefficace à ce stade.
Etudes de toxicité sur le développement prénatal chez la souris, le rat et le lapin
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 2800
Lapins : 1960
Toutes les femelles sont tuées à la fin de l'étude pour permettre l'hystérectomie et l'examen des fœtus, squelette et cartilages compris. 5 138 animaux gestants vont être utilisés, 2 800 rates, 1 960 lapines et 378 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 270 d'entre elles et modéré pour 3 868. Pendant treize à vingt-trois jours selon l'espèce, chacune peut subir jusqu'à une vingtaine d'interventions par semaine, administrations répétées et prises de sang, avec un risque d'avortement que le porteur signale surtout chez la lapine. La finalité est réglementaire : établir une dose sans effet et une marge de sécurité pour l'exposition des femmes en âge de procréer, selon les lignes directrices du médicament ou de l'OCDE.
Objectifs
L’objectif de ce projet est l’évaluation des caractéristiques toxiques chez le rongeur d’un candidat médicament, d’un vaccin ou d’un produit chimique, conformément aux lignes directrices du médicament ou de l'OCDE. Ces études interviennent dans les phases cliniques du développement du médicament et permettent l‘évaluation du risque chez des femmes en âge de procréer, en fournissant des informations sur l’interaction entre le produit et le fœtus. Cela permet de déterminer une dose sans effet adverse et une marge de sécurité pour l’exposition humaine.
Bénéfices attendus
L'ensemble des études du projet vise à identifier une dose sans effet permettant le calcul des marges de sécurité chez les femmes en gardant en permanence le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine (industrie pharmaceutique) ou la sécurité (industrie chimique).
Procédures
Les animaux sont traités par différentes voies (de façon journalière, voire plusieurs fois/j) hebdomadaire, ou de manière plus espacée (ex: toutes les semaines, ou une seule fois durant la gestation) avec le produit d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure dans le cas de perfusion intraveineuse. La durée des études est standardisée (13j chez la souris, 16j chez le rat, 23j chez le lapin). Des prélèvements sanguins, seront réalisés afin de déterminer les niveaux du ou des composés administrés, de leurs métabolites ou d’autres marqueurs pharmacologiques pour permettre l’analyse pharmacocinétique, et/ou. pour des analyses hémato-biochimiques ou hormonales par exemple. L’ensemble de ces prélèvements sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de déceler tout signe clinique. Le poids corporel sera mesuré à différents temps au cours du projet et Lles consommations alimentaires pourront être suivies. Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et un examen complet de la mère (ex : cavité utérine et des organes reproducteurs associés) et des fœtus (ex : squelette et cartilages, pour l’évaluation de la croissance embryo-fœtale) est effectué. La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1h/animal/jour (en considérant par ex. 1 journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant par exemple 1 administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Dans certaines situations rares, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (en cas d’agressivité ou de soins individuels par exemple).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent aux effets pharmacologiques et/ou toxicologiques du produit administré, à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoire liés aux procédures [prélèvements, administrations répétées, contention et/ou des effets systémiques (exemples : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire, et des avortements (spontanés ou liés au produit) en particulier chez la lapine)] qui peuvent être observés. Un hébergement en individuel, avec contacts olfactifs, visuels et sonores préservés et enrichissements additionnels, peut être requis (ex. pour suivre la consommation alimentaire individuelle ou pour des études par voie dermale ; rare chez les rats/souris, plus fréquent chez le lapin).
Devenir
A l’issu de la procédure les animaux seront systématiquement euthanasiés pour permettre la faisabilité de l’hystérectomie.
Remplacement
L’évaluation de la toxicité prénatale d’un composé ou de plusieurs composés administrés dans un organisme complet gestant ne peut pas être réalisée qu'avec des études in vitro, car il n'existe pas d'alternative complète in vitro pour ce type d'évaluation en raison de la complexité de l’interaction entre la mère et le fœtus par l’intermédiaire du placenta. Seule l’observation sur un organisme vivant dans son ensemble permet d’évaluer les différentes phases de l’implantation au jour de la parturition et de définir les potentielles interactions entre le composé et le fœtus lorsqu’il est administré chez la mère.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe dépend du design de l’étude. En effet les études dites préliminaires utiliseront un nombre d’animaux plus faibles que les études réglementaires. Mais le nombre d’animaux par groupe correspondra au minimum permettant une analyse statistique fiable, conformément aux recommandations des lignes directrices. En se basant sur des tests statistiques, comprenant à minima des tests de normalité, d’analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés est le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.
Raffinement
Les doses utilisées sont des doses permettant de définir une toxicité maternelle dans les études de chimie ou d’établir a minima une marge de sécurité suffisante dans les études pharmaceutiques. L’état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Si un ou plusieurs points limites sont atteints, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin seront utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie locale ou générale pour éviter le stress, la douleur ou l’inconfort. Les rongeurs et les lapins sont hébergés en groupe (afin d’éviter le stress lié à l’hébergement individuel). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel. Le cas échéant, des enrichissements supplémentaires avec maintien du contact visuel et olfactif sont proposés aux animaux hébergés individuellement.
Choix des espèces
Les espèces rat, souris, et lapin sont des espèces de laboratoire largement utilisés en recherche biomédicale (littératures et connaissances très larges) et sont des espèces recommandées par les lignes directrices. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants (essais préliminaires in vitro et in vivo), voie d'administration choisie, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique. De façon standard, les rats, souris et lapins seront âgés de 6 à 10 semaines, 6 à 8 semaines et 4 à 6 mois, respectivement, correspondant à un niveau « jeune adulte » de croissance et de développement nécessaire et suffisant pour conduire les expérimentations. Les animaux ne doivent pas avoir été gravides au paravent.
Rôle du récepteur au neuropeptide Calcitonin Gene Related Protein dans un noyau spécifique de l’hypothalamus dans les effets bénéfiques de la production intestinale de glucose.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Quarante-cinq minutes de chirurgie pour injecter un virus dans une zone précise du cerveau, puis, deux semaines plus tard, une heure de plus pour implanter un cathéter dans la veine porte : 312 souris vont subir les deux opérations, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes seront tuées pour le prélèvement d'organes. Le porteur signale que l'intervention cérébrale peut entraîner des troubles neuro-musculaires et que les sutures abdominales sont douloureuses. L'objectif est de savoir si le glucose fabriqué par l'intestin entre les repas coupe la faim en passant par un récepteur précis de l'hypothalamus, piste avancée contre l'obésité et le diabète. Le choix de la souris tient, selon le porteur, à ce que les poissons régulent la faim autrement que les mammifères.
Objectifs
Avec l’augmentation mondiale de l’obésité, du diabète et des maladies du foie qui y sont liées, il devient essentiel de trouver de nouvelles façons de prévenir ou limiter ces problèmes de santé. Des travaux récents montrent que lorsque l’intestin produit du glucose entre les repas, cela envoie un signal au cerveau qui aide le corps à brûler plus d’énergie, à manger moins et à mieux réagir à l’insuline. Ce mécanisme naturel aide donc à lutter contre l’obésité et le diabète. Ce signal passe par différentes zones du cerveau, dont une région située à l’arrière du cerveau qui influence ensuite une région plus centrale connue pour être responsable de la sensation de satiété. Les communications entre ces deux régions sont réalisées par des connexions nerveuses plus ou moins directes et la libération de molécules chimiques. Ce projet cherche à comprendre si la production de glucose par l’intestin agit sur la satiété via des connections directes entre la partie arrière du cerveau et la partie centrale et si ces connexions contrôlent la faim via la libération d’une molécule chimique particulière. Pour tester cela, nous utiliserons différentes techniques chez la souris adulte pour modifier l’expression du récepteur de cette molécule chimique dans la partie centrale du cerveau qui contrôle la faim. Grâce à des souris génétiquement modifiées et à des injections ciblées de virus dans différentes zones du cerveau, nous pourrons déterminer si l’absence de ce récepteur empêche la production de glucose par l’intestin d’exercer son effet coupe-faim. Notre hypothèse est simple : si ce récepteur manque dans les parties qui réalisent la connexion entre la zone arrière et la zone centrale du cerveau, alors la production de glucose par l’intestin ne pourra plus réduire la prise alimentaire.
Bénéfices attendus
La régulation de la faim est réalisée principalement par deux régions du cerveau : une située à l’arrière et une centrale. Définir comment ces deux régions communiquent et quels sont les éléments nécessaires à la régulation de la faim est essentiel pour comprendre comment est contrôlée la prise alimentaire, pour étudier si ces connexions sont altérées dans différentes pathologies (obésité, diabète) et pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet s’intéresse à un message particulier produit par l’intestin en dehors des repas qui exerce des effets anti-diabète et anti-obésité, par l’intermédiaire de l’activation de ces deux régions du cerveau. Les résultats de ce projet permettront de caractériser comment ces régions communiquent, dans le cadre spécifique de ce signal intestinal. Cette caractérisation permettra ensuite de proposer différentes stratégies pour activer ce signal et produire ses effets bénéfiques sur l’organisme.
Procédures
Les souris de cette étude seront soumises à une procédure chirurgicale sous anesthésie gazeuse pour injecter des virus dans une zone précise du cerveau (durée 45 min). En pré-médication, 1 injection d’analgésiques sous la peau sera effectuée (15 secondes) et au moment de l’intervention chirurgicale, une injection locale d’analgésiques sera rajoutée (30 secondes). Pour gérer la douleur post-opératoire une injection sous la peau d’un analgésique 1H après la pré-médication puis sera effectuée 1 fois/jour pendant 2 jours (3x 15secondes). Deux semaines après, la glycémie des souris sera mesurée. Pour cela, une goutte de sang sera prélevée (2 fois à 1 semaine d’intervalle) à l’extrémité de la queue après application d’une crème anesthésiante. Puis les souris de cette étude seront soumises à une deuxième procédure chirurgicale sous anesthésie gazeuse pour implanter un cathéter dans leur veine porte (située entre l’intestin et le foie) (durée 1H). En pré-médication, 2 injections d’analgésiques sous la peau seront effectuées (2x 15 secondes) et au moment de l’intervention chirurgicale, une injection d’analgésique locale sera rajoutée (30 secondes). Pour gérer la douleur post-opératoire une injection sous la peau d’un analgésique sera effectuée 1 fois/jour pendant 3 jours (3x 15secondes). Enfin, une injection d’analgésiques (10 secondes) sera réalisée avant la mise à mort des souris. La mise à mort sera réalisée par l’injection d’un médicament à visée euthanasique.
Impact sur les animaux
L’injection du virus peut entrainer une faible réponse immunitaire localisée. L’intervention chirurgicale réalisée dans le cerveau peut entrainer des problèmes neuro-musculaires. Les interventions chirurgicales sont susceptibles de provoquer de la douleur post-opératoire, notamment au niveau des sutures de l’abdomen. Le prélèvement d’une goutte de sang à la queue, peut provoquer du stress et une douleur transitoire
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyses.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être réalisée sur des modèles in-vitro car la détection du glucose dans la veine porte a des impacts sur l’ensemble du corps et implique des dialogues entre les organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté dans les vaisseaux et active un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie qui ont des effets bénéfiques anti-obésité et anti-diabète. Pour comprendre comment la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques, il est donc nécessaire de l’étudier dans l’organisme entier.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans la procédure d’étude a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et des connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 13 souris maximum par condition et par sexe seront utilisés pour répondre aux questions posées dans le projet. Au total, ce projet réalisé sur 4 ans nécessitera 208 souris transgéniques et 104 souris de type naturel.
Raffinement
Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Les chirurgies seront réalisées par des personnes expérimentées avec du matériel biocompatible et adapté à la souris. Pendant la chirurgie, les souris seront placées sur un tapis chauffant afin de maintenir leur température corporelle entre 36 et 38°C et un gel lubrifiant sera déposé sur les yeux. En fin de chirurgie les animaux seront réhydratés par une injection sous-cutanée de solution physiologique et surveillés dans une pièce chauffée à 24°C pour faciliter leur récupération . Le suivi post-opératoire se fera dans une pièce dont la température sera réglée à 24°C pendant une semaine pour favoriser la reprise de poids des souris. De l’aliment hydraté sera également mis à disposition dans la cage les jours suivants la chirurgie. La mise en place d’une grille de score pendant toute la durée du projet permet d’adapter la surveillance et l’utilisation d’antalgiques selon l’état de l’animal. Cette grille de score et l’utilisation de points limites adaptés ont permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet.
Choix des espèces
En ce qui concerne la régulation de la faim, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux, comme la souris, dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le protocole sera réalisé chez des souris adultes âgées de 12 semaines.
Techniques d’évaluation de la fonction musculaire chez les murins
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Rats : 600
4 800 rongeurs, 4 200 souris et 600 rats, vont être utilisés sur cinq ans, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut enchaîner jusqu'à cinq tests sur animal vigile, tapis de course, roue, équilibre, agrippement, analyse de la marche et de la respiration, puis jusqu'à deux séries d'électrophysiologie et d'échographie musculaire sous anesthésie. La mesure finale de force musculaire est pratiquée sur la totalité des animaux sous anesthésie sans réveil, avant le prélèvement des muscles pour l'histologie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité physiologique de l'animal vivant, et présente sa combinaison de techniques comme une contribution aux 3R.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est d’améliorer la compréhension fonctionnelle et mécanistique des maladies neuromusculaires en analysant différents paramètres du système neuromusculaire, notamment la coordination motrice, la fonction respiratoire et la fatigue musculaire. Plus spécifiquement, ce projet vise à : – caractériser les altérations neuromusculaires associées à différentes pathologies à l’aide d’approches expérimentales complémentaires ; – explorer le rôle de gènes et de protéines d’intérêt impliqués dans le fonctionnement et la maintenance du muscle et des motoneurones ; – développer et caractériser de nouveaux modèles murins pertinents de maladies neuromusculaires ; – évaluer l’efficacité et les mécanismes d’action de stratégies thérapeutiques expérimentales. Les études s’appuieront sur des approches in vivo et in vitro chez la souris et le rat, permettant une analyse intégrée des propriétés des fibres musculaires, des motoneurones et de leurs interactions avec les autres types cellulaires contribuant à l’homéostasie du système neuromusculaire. À terme, ces travaux ont pour objectif d’identifier des cibles thérapeutiques transposables à l’humain et de contribuer à l’amélioration des stratégies de diagnostic et de prise en charge précoce des maladies neuromusculaires.
Bénéfices attendus
Les maladies neuromusculaires constituent un ensemble d’environ 200 pathologies d’origine génétique ou acquise, touchant les muscles et/ou le système nerveux. En France, elles concernent près de 30 000 à 50 000 personnes, avec une prévalence estimée entre 4 et 7 pour 10 000 habitants. Si certaines peuvent être stabilisées lorsqu’elles sont diagnostiquées précocement, d’autres évoluent vers des formes sévères, neurodégénératives et parfois fatales. Ces affections entraînent fréquemment une perte progressive de l’autonomie (altérations de la marche, de la respiration, de la déglutition, etc.) et nécessitent une prise en charge médicale et médico-sociale lourde et multidisciplinaire. Ce projet vise à générer de nouvelles connaissances sur la fonction neuromusculaire en étudiant de manière approfondie des paramètres tels que la coordination motrice, la fonction respiratoire et la fatigue musculaire. Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des mécanismes biologiques, physiopathologiques et médicaux impliqués dans ces maladies, l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques transposables à l’humain et l’amélioration du diagnostic précoce, condition essentielle pour une prise en charge efficace. Les approches expérimentales combinées (in toto, ex vivo et in situ) permettront une évaluation intégrée et fonctionnelle des atteintes neuromusculaires, maximisant la valeur scientifique des données obtenues. Cette stratégie méthodologique contribue également à limiter le nombre d’animaux utilisés et à réduire leur impact, conformément aux principes des 3R (remplacement, réduction, raffinement), tout en garantissant des résultats robustes, fiables et reproductibles, au bénéfice de la recherche biomédicale et, à terme, des patients atteints de maladies neuromusculaires.
Procédures
Dans un premier temps, les animaux pourront pratiquer un ou plusieurs exercices fonctionnels sans anesthésie permettant d'évaluer différents paramètres comme la respiration, la coordination, la marche etc... Ces tests seront faits une fois ou plus (maximum 5) avec un temps de repos imposé entre les tests de 2 jours et peuvent durer de 5 à 25 minutes. Dans un second temps les animaux effectueront des tests sous anesthésie générale et analgésie adéquate permettant l'évaluation de la fonction musculaire des muscles fléchisseurs, l'enregistrement de l'activité électrique vers le muscle en passant par le système nerveux et une échographie du muscle squelettique. Les animaux subiront ces tests une fois ou deux maximums avec un temps de récupération d'un mois imposé. La durée de ces tests est comprise entre 10 et 20 minutes. Enfin, l'évaluation de la mesure de force musculaire (sans réveil) s'effectuera sur la totalité des animaux une seule fois et se fera sous anesthésie générale et analgésie adéquate. Sa durée est comprise entre 20 à 30 minutes. Ce test pourrait être associé à un prélèvement sanguin (toujours sous anesthésie générale et analgésie) qui est une procédure de courte durée (entre 1 à 2 minutes), réalisée par du personnel formé, permettant l’obtention d’un volume de sang suffisant en une seule manipulation.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues pour les tests fonctionnels sur animaux vigiles sont le stress lié à la manipulation momentanée de l’animal par l’expérimentateur, au changement d’environnement et à la mise en place des rongeurs dans les appareillages de mesure. Une fatigue musculaire peut survenir pour le tapis de course. Concernant l’évaluation des paramètres d’évaluation de la marche et de la respiration, seul un léger stress dû aux changements d’environnement est à prévoir. Pour les tests nécessitant une anesthésie, les effets indésirables pouvant survenir sont l’hypothermie, la détresse respiratoire, des douleurs au réveil au site de placement d’aiguilles, et du stress au réveil de l’anesthésie le cas échéant. Les animaux présentant un phénotype dommageable pourraient être atteint musculairement (faiblesse musculaire, dégénérescence neuromusculaire, altérations motrices ou respiratoires selon la lignée).
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés en suivant la réglementation en vigueur. Tous les tissus et échantillons musculaires seront prélevés pour des analyses histologiques et moléculaires réalisées ultérieurement en laboratoire de recherche.
Remplacement
Les techniques utilisées dans le cadre de ce projet visent à évaluer la physiologie fonctionnelle de l’animal. À ce jour, aucune méthode alternative ou approche in vitro ne permet de reproduire avec une précision suffisante la complexité physiologique et les interactions systémiques observées chez l’animal vivant. Ainsi, l’utilisation de modèles murins demeure indispensable et scientifiquement justifiée pour l’évaluation de l’efficacité et des effets fonctionnels ou histologiques induits par les traitements en cours de développement. Les modèles de culture cellulaire ou tissulaire existants, bien qu’utiles pour des approches mécanistiques, ne permettent pas de récapituler l’ensemble des réponses intégrées au niveau musculaire, nerveux et systémique. Ce projet vise donc à combiner, au sein d’un protocole cohérent, un ensemble de techniques complémentaires permettant une évaluation complète, rigoureuse et transposable des effets thérapeutiques, tout en respectant les principes de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).
Réduction
4800 animaux seront utilisés (4200 souris et 600 rats sur 5 ans). Pour limiter le nombre, les animaux seront analysés avec un maximum 5 tests. Au total 12 actes seront testés dont 7 sont des tests fonctionnels sur animaux vigiles (roue volontaire, tapis de course, test d’équilibre, test d’agrippement, évaluation de la marche et de la coordination, évaluation des paramètres respiratoires), 3 sont des tests sous anesthésie générale pour les analyses électrophysiologiques et l’échographie des muscles squelettiques puis réemployés pour l’étude in situ ou in vitro des muscles après une anesthésie sans réveil. Ce nombre d’animaux a été déterminé grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques permettant la comparaison des groupes expérimentaux deux à deux. Des prélèvements tissulaires seront réalisés pour des analyses biochimiques et moléculaires ultérieures
Raffinement
Si les animaux ne proviennent pas de l’établissement utilisateurs, ils pourront subir du stress dû aux mouvements des cages, ou lors du transport entre les deux animaleries, mais aussi lors du transfert dans les nouvelles cages ou encore lors d’un changement d’environnement et d’alimentation. Une période d’acclimatation d’une semaine minimum sera alors effectuée dans ces cas-là. Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maisonnettes plastiques/cartons ou batônnets à ronger) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés. Un suivi quotidien sera réalisé pour détecter tout signe d'inconfort. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le nombre d’animaux par cage est réduit à 2 minimum et à 5 maximum pour la souris, les rats seront répartis 2 par cage. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis. Plusieurs indicateurs physiologiques et comportementaux permettent de suivre le bien-être de l’animal : observation d'apparition de comportement anormal (hypertoilettage, prostration), posture en cas de douleurs, absence d’interactions avec les congénères, consommation d’aliments et d’eau, sommeil. Pour limiter l'expression des phénotypes dommageables, le matériel des cages est irradié, des croquettes sont mis au sol et si nécessaire de la bouillie ou de l'hydrogel seront apportés dans les cages pour faciliter la prise alimentaire et hydrique. La douleur et le stress sont limités en apportant une anesthésie gazeuse et une analgésie adaptée pour les actes techniques le nécessitant. En vue de réduire au maximum le stress des animaux, un exercice d’habituation sera réalisé pour les actes ne nécessitant pas d’anesthésie.
Choix des espèces
Les espèces souris Mus musculus et le rat Ratus norvegicus ont été choisies car elles représentent deux excellents modèles pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus le rat et la souris sont des modèles de choix pour l'étude des dysfonctionnements musculaires car de nombreuses voies de régulation dans le système neuro-musculaire sont conservées entre souris, rat et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiologie et la physiopathologie de ces deux rongeurs sont un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ces modèles animaux. Les expériences seront réalisées sur des rongeurs (souris et rats) adultes âgés de 2 à 24 mois environ chez lesquels le système neuromusculaire est complètement développé. En fonction des phases de l’étude, de la réalisation des actes, les animaux pourraient être âgés de 3 à 24 mois lorsqu’ils seront euthanasiés pour les prélèvements.