Souris

Une ligature est posée chaque semaine autour des molaires supérieures de 90 souris, avec deux injections dans la gencive par semaine pendant quatre semaines, pour leur provoquer une parodontite. Elles reçoivent en parallèle, cinq jours par semaine, une injection d'un agent qui épaissit leur peau et peut fibroser leurs poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes, l'objet étant de vérifier si une maladie des gencives favorise la sclérodermie systémique, une maladie auto-immune rare dont la cause reste inconnue. Le porteur affirme que ces gestes ne sont pas douloureux et ne justifient donc aucun antalgique, et retient la souris parce que les outils d'analyse immunitaire et parodontale y sont, écrit-il, très développés.

Objectifs

La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune rare qui touche près de 10 000 personnes en France, principalement les femmes. La cause n’est pour le moment pas connue. Les patients atteints de sclérodermie systémique présentent fréquemment une parodontite, qui est une pathologie inflammatoire très répandue dans la population mondiale, puisqu’elle touche plus de 50% de la population âgée de plus de 50 ans. Elle est due à une dysbiose du microbiote parodontal et se caractérise par une inflammation des tissus de soutien des dents appelé parodonte, qui comprend la gencive, l’os alvéolaire et le ligament alvéolodentaire. La parodontite aboutit au déchaussement, voire à la perte des dents. Notre hypothèse est que la parodontite pourrait constituer un facteur de risque et avoir un impact sur le développement de la sclérodermie systémique. L’objectif de ce projet est de développer un modèle de souris permettant d'étudier l'impact de la parodontite dans le développement de la sclérodermie systémique.

Bénéfices attendus

La cause de la sclérodermie systémique n’est pour le moment pas connue, mais les facteurs environnementaux, et notamment la dysbiose du microbiote, jouent un rôle dans le déclenchement de la maladie. La mise en évidence de l’implication de la parodontite dans la physiopathologie de cette maladie autoimmune rare permettra ainsi d’améliorer la compréhension de la sclérodermie systémique, ce qui nécessaire pour pouvoir développer de nouveaux traitements dans le futur. Il n’existe en effet pour le moment pas de traitement permettant de guérir cette pathologie, qui a un fort impact sur la qualité de vie et la survie des patients

Procédures

Les animaux recevront une injection d’une molécule induisant une fibrose cutanée permettant de reproduire les caractéristiques de la sclérodermie systémique. Les premières injections seront réalisées sur animal anesthésié, puis, après une phase d’habituation et la mise en place d’un système de récompense, elles seront effectuées sur animal vigile. Ces injections, réalisées cinq jours par semaine, nécessitent moins de deux minutes. Les animaux subiront une pose d’une ligature autour des molaires supérieures (une fois par semaine, durée de 10 minutes) et deux injections gingivales (deux fois par semaine, durée de 5 minutes), toutes réalisées sur animal anesthésié, pendant une période de quatre semaines. Les animaux subiront trois prélèvements de sang, réalisés sur animal anesthésié, d'une durée d’environ 5 minutes chacun.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables liés à l’anesthésie générale sont le refroidissement corporel et une respiration un peu modifiée. Pour limiter ces effets, les souris seront placées sur une plaque chauffante et surveillées en continu jusqu’à leur réveil complet. L’anesthésie gazeuse peut être légèrement désagréable pour les animaux au moment de l’induction (du fait de l’odeur désagréable), mais elle reste moins stressante que de réaliser les gestes alors qu’ils sont éveillés. L’injection de l’agent fibrosant provoquera une fibrose (épaississement de la peau) au niveau du haut du dos, mais cela n’aura pas d’impact sur la mobilité des souris. Une réaction locale peut apparaître juste après l’injection, mais elle est généralement légère et disparaît rapidement. L’agent fibrosant peut également entraîner une fibrose au niveau des poumons, mais les signes cliniques restent en général très faibles. L’induction de la parodontite par la pose de ligatures et des injections gingivales entraînera une inflammation gingivale locale pouvant provoquer un inconfort transitoire. Toutefois, la durée limitée du protocole n’entraînera pas de mobilité ni de perte dentaire, et n’altèrera pas l’alimentation ou l’hydratation des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans les procédures sera mis à mort à la fin des procédures (prélèvement post mortem de différents organes afin de réaliser les différentes analyses) ou en cas d'atteinte des points limites.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable dans le cas de ce projet. En effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier l’impact de la parodontite sur l’évolution de la sclérodermie systémique. Nous étudions notamment les réponses immunitaires, qui mettent en jeu la coopération de nombreuses cellulaires dans les organes tels que la rate et les ganglions. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à l'utilisation de modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire ainsi que les mécanismes physiopathologiques parodontaux, car les connaissances et les outils d’analyse chez la souris sont très développés dans les domaines de l'immunité et de la parodontologie.

Réduction

Afin de respecter pleinement le principe des 3R, une réduction du nombre d’animaux utilisés a été mise en œuvre. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été déterminé à partir de protocoles déjà bien établis dans la littérature et sur la base de calculs de puissance statistique. Ce travail a permis de définir, pour chaque question scientifique, le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Nous porterons une attention particulière au bien-être animal notamment via le raffinement des conditions d’hébergement. Les souris seront maintenues en groupes sociaux dans des cages expérimentales équipées d’un couvercle filtrant avec enrichissement (tubes en polycarbonate rouge translucides, nids, frisures de carton...) sur des portoirs ventilés deux semaines avant le début des procédures, afin de réduire au maximum le stress animal. Une habituation à la manipulation sera réalisée de façon quotidienne après la première semaine d’acclimatation, jusqu’au début de la procédure. La plupart des gestes sera réalisée sous anesthésie générale. Des soins péri- et post-opératoires seront également réalisés. Les souris anesthésiées seront placées sur une plaque chauffante afin de maintenir leur température corporelle jusqu’à leur réveil de l'anesthésie. Une application de gel ophtalmique sera réalisée à intervalles réguliers jusqu’au réveil pour lubrifier la surface des yeux et de prévenir la déshydration. La pose des ligatures au niveau des molaires doit être réalisée sous anesthésie générale car elle nécessite le maintien d’une ouverture buccale de la souris pendant quelques minutes. Les gestes réalisés ne sont pas des gestes douloureux et ne nécessitent pas la mise en place d'un traitement antalgique. Les animaux seront pesés et évalués cliniquement à l'aide d'une grille de scores définissant des points limites, afin de les soustraire à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé en immunologie, en particulier dans le domaine de l'auto-immunité, le système immunitaire des souris étant proche du système immunitaire humain. Nous disposons de nombreuses techniques d'analyse du système immunitaire chez la souris et de l'expérience requise pour le suivi des réponses immunitaires chez la souris, ce qui nous permet de limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons des souris âgées entre 8 et 12 semaines, qui sont des souris avec système immunitaire complètement mature et chez qui la croissance osseuse du maxillaire et la physiologie du parodonte sont établies.

Une première chirurgie de 35 minutes injecte dans le cerveau de 598 souris un composé qui déclenche une épilepsie, parfois complétée par la pose d'électrodes crâniennes. Deux semaines avant, cinq jours après ou quatre à six semaines après, une deuxième chirurgie d'une heure délivre les facteurs de reprogrammation, et certaines souris en subissent une troisième de 45 minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Celles dont les crises sont enregistrées vivent seules en cage pendant trois mois, un isolement que le porteur qualifie de stress modéré. Toutes sont tuées par surdose d'anesthésique, entre deux et soixante jours après la dernière opération, pour prélever leur cerveau.

Objectifs

La reprogrammation cellulaire, qui consiste en la conversion de cellules non-neuronales du cerveau, c-à-d les cellules gliales, en nouveaux neurones dits induits (iNs), a récemment émergé comme une nouvelle stratégie thérapeutique afin de remplacer les neurones perdus et restaurer les fonctions cognitives. Ainsi, nous avons récemment démontré dans un modèle d’épilepsie chez la souris que les cellules gliales du cerveau pouvaient être reprogrammées en nouveaux neurones inhibiteurs et que les iNs ainsi générés permettaient une réduction de moitié des crises d’épilepsie. Ces résultats démontrent pour la première fois l’intérêt de la reprogrammation cellulaire pour le traitement des épilepsies. La stratégie de reprogrammation utilisée dans cette étude se basait sur l’utilisation de rétrovirus permettant de cibler l’expression des facteurs de reprogrammation spécifiquement aux cellules gliales en division lors des stades précoces du développement de la maladie. Néanmoins, une telle stratégie ne pourrait pas être envisageable pour une application clinique où une stratégie thérapeutique basée sur la régénérescence des neurones perdus devra être mise en place lors de la phase chronique, c-à-d une fois la maladie diagnostiquée. Nos premiers résultats révèlent que les cellules gliales de la phase chronique ont cessé de se diviser. Le présent projet vise donc à étudier la possibilité de reprogrammer les cellules gliales en phase chronique de la maladie à l’aide d’autres outils viraux, les lentivirus, qui ne nécessitent pas une division cellulaire de la cellule d’intérêt pour intégrer leur génome à celui de la cellule gliale. Un autre projet actuellement en cours vise à étudier si la division des glies est nécessaire à leur reprogrammation. Dans le cas où celle-ci s’avérait nécessaire, nous incluons dans ce projet des expériences visant à stimuler la division des glies en phase chronique de la maladie. Le projet s’organise en 4 axes : 1) Validation de la stratégie de reprogrammation à l’aide de lentivirus en étudiant si ces outils permettent de cibler avec efficacité les cellules gliales 2) Comparer l’efficacité de reprogrammation de rétrovirus et lentivirus en phase aigüe et chronique de l’épilepsie 3) Valider une stratégie permettant de stimuler la division des glies en phase chronique 4) Etudier l’impact de la stimulation de la division des glies en phase chronique sur l’efficacité de reprogrammation et l’impact fonctionnel des iNs sur les crises d’épilepsie.

Bénéfices attendus

Le cerveau adulte étant incapable de se régénérer, le développement de stratégies thérapeutiques visant à remplacer les neurones perdus en cas de traumatisme ou de maladie cérébrale pourrait avoir à terme un fort impact dans le domaine de la santé. Nous avons précédemment démontré que la reprogrammation cellulaire permettait de réduire les crises dans un modèle d’épilepsie réfractaire aux médicaments chez la souris. Ces résultats sont très encourageants et représentent une première preuve de concept de l’utilisation de la reprogrammation pour le traitement des épilepsies. Cependant, de nombreuses limites doivent être surmontées avant de pouvoir envisager une thérapie en clinique. Notamment, le présent projet nous permettra de déterminer si la stratégie de reprogrammation des glies en neurones peut aussi être adaptée en phase chronique de l’épilepsie, moment le plus adéquat pour son application chez l’homme. La démonstration que les glies de la phase chronique peuvent être reprogrammées avec efficacité, même en absence de division, permettrait également d’envisager la généralisation de la reprogrammation cellulaire à d’autres pathologies, comme les maladies neurodégénératives, où la mort neuronale n’est pas accompagnée d’une division des glies.

Procédures

Le présent projet implique un modèle d’épilepsie chez la souris générée par injection d’un composé chimique. Ainsi, la totalité des animaux impliqués dans le projet subiront une chirurgie sous anesthésie générale et anesthésie locale renforcée afin d’injecter le composé (durée : 35 min). Pour certaines souris, nous profiterons de cette injection pour procéder dans le même temps à l’implantation d’électrodes pour enregistrement électroencéphalographique (EEG). Tous les animaux recevront une 2ème chirurgie sous anesthésie générale (durée : 1h) pour délivrer les facteurs de reprogrammation 2 semaines avant, 5 jours après ou 4-6 semaines après l’induction de l’épilepsie. Enfin, certaines souris impliquées dans l’étude recevront une 3ème injection (durée : 45 min), 6-8 semaines après la 2ème. Certains des animaux recevront une molécule par gavage (1X/jour sur une durée de 2-7 jours), 4 à 6 semaines après leur dernière chirurgie, afin d’induire la reprogrammation. Enfin, les animaux seront euthanasiés par surdose d’anesthésique entre 2 et 60 jours après la dernière chirurgie.

Impact sur les animaux

Au sortir de la chirurgie permettant de générer le modèle d’épilepsie, les animaux sont en « état de mal épileptique » non convulsif, c’est-à-dire que des décharges sont enregistrées sur un EEG dans leur cerveau. Cet état n’est pas douloureux mais induit des périodes d’immobilisation spontanée qui peuvent entraîner une perte de poids transitoire (48h), les animaux tendant à moins s’alimenter durant cette période. Par la suite, les animaux épileptiques peuvent présenter quelques légers troubles de mémoire et une faible élévation de l’anxiété. Toutes les procédures impliquent une deuxième chirurgie, une procédure implique quant à elle 3 chirurgies successives. A la suite de chaque chirurgie, malgré les mesures de raffinement, certains animaux peuvent rarement présenter de légères douleurs, une faible perte de poids ou un risque d’infection au site d’incision. L’administration par gavage nécessite d’introduite une canule de gavage dans l’œsophage de l’animal. Le maintien de l’animal et l’introduction de la canule peuvent induire un inconfort et un stress transitoires. Les animaux chez lesquels l’enregistrement EEG des crises est prévus seront hébergés en cages individuelles. L’isolement social (durée : 3 mois) peut induire un stress modéré.

Devenir

Les expériences réalisées dans ce projet nécessitent de prélever le cerveau pour soit (1) isoler les cellules afin d’analyser quels gènes sont exprimés, soit (2) effectuer des analyses histologiques directement sur tranches de cerveau. Ces différentes analyses n’ont pas d’alternative qui éviterait la mise à mort des animaux.

Remplacement

Ce projet vise à démontrer la possibilité de reprogrammer les cellules gliales de la phase chronique de l’épilepsie en neurones induits matures, capables de s’intégrer dans les réseaux neuronaux et de réduire les crises d’épilepsie. L’étude de l’impact fonctionnel des neurones ainsi générés sur les symptômes épileptiques nécessite donc de se placer dans un modèle animal. Ce projet vise aussi à identifier la capacité des glies à être reprogrammées dans un contexte pathologique, celui de l’épilepsie, et ce à différents stades de la maladie. Reproduire complètement in vitro la complexité de la structure cérébrale d’intérêt ainsi que la cinétique des changements s’opérant en conditions pathologiques est pour l’heure impossible. Par ailleurs, cette étude se situe dans la continuité directe d’expériences précédentes et nécessite de pouvoir intégrer les résultats avec ceux déjà obtenus afin de tirer des conclusions robustes. Pour ce faire, celle-ci doit donc être réalisée dans le même modèle murin que précédemment.

Réduction

Toutes les expériences sont planifiées avec le nombre minimal d’animaux permettant de garantir des résultats robustes, nombre qui a été déterminé préalablement grâce à des calculs statistiques et basé sur les données de la littérature. Ce projet implique par ailleurs des expériences permettant d’analyser les modifications de l’expression des gènes dans les glies en phase chronique selon qu’elles se divisent ou non. Ces expériences vont générer un grand nombre de données dont l’analyse s’étendra au-delà de ce projet. Des analyses comparées de ces données avec d’autres présentes dans la littérature et celles issues d’autres projets devraient permettre d’étudier un certain nombre de questions sans passer par l’utilisation de nouveaux animaux. Enfin, nous avons défini des points d’arrêt à différentes étapes du projet nous permettant d’évaluer si nous devons procéder ou non à la suite des expériences en fonction des résultats déjà obtenus. Ceci permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés le cas échéant.

Raffinement

Toutes les chirurgies se dérouleront sous anesthésie générale et analgésie locale renforcée pour éviter toute douleur ou souffrance durant l’opération. Pour éviter toute douleur après l’opération, les animaux recevront par ailleurs plusieurs injections d’anti-douleurs. Une surveillance sera mise en place avec un suivi renforcé dans les 72h post-chirurgie. Les animaux seront scorés selon une grille d’évaluation des signes clinique adaptée à notre étude afin de mettre en place les traitements adéquats en cas de besoin (anti-douleur, nourriture liquide et enrichie pour pallier à une éventuelle perte de poids, application d’antiseptique, etc..). L’interruption des expériences et l’euthanasie des animaux interviendra pendant la chirurgie ou en postopératoire dans le cas d’apparition de signes indicatifs de gêne/douleur sévères. Conditions d’hébergement : Une fois que les animaux ont récupéré de la chirurgie, ils sont regroupés avec leurs congénères. Les animaux bénéficient d’un milieu d’hébergement enrichi (nid en fibres de coton, tunnels en carton, igloos teintés en polycarbonate). Pour pallier à la légère augmentation de l’anxiété observée chez les souris épileptiques, celles-ci seront toujours manipulées et changées par le même expérimentateur. De même, les animaux seront hébergés au calme et avec une luminosité réduite. Ces mesure de raffinement ont pour but de compenser l’augmentation des comportements de dominance entre animaux observés chez les souris épileptiques et éviter les combats qui nécessiteraient de les isoler.

Choix des espèces

Ce projet fait suite à un projet précédent réalisé dans un modèle d’épilepsie chez la souris et vise à déterminer si les glies de la phase chronique de la maladie peuvent être reprogrammées avec la même efficacité que celles se divisant en phase aigüe. Pour ce faire, et afin que les résultats obtenus soient directement comparables aux données précédemment générées, ce projet doit donc être réalisé dans le même modèle. Ce modèle d’épilepsie généré chez la souris que nous utilisons reproduit la plupart des aspects de la pathologie humaine et a été amplement validé. Les injections seront réalisées chez des souris adultes d’au moins 8 semaines afin de rester dans les mêmes conditions expérimentales que celles utilisées dans les études précédentes, pour permettre une comparaison directe entre les résultats obtenus dans nos précédentes études et les résultats générés lors de ce projet.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune recevant treize injections après une opération de dix minutes qui implante des cellules de cancer du pancréas dans son pancréas. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec une masse tumorale intra-abdominale, des risques d'infection et de réouverture de la plaie, et une altération possible de l'état général. Le porteur écrit que l'association chimiothérapie et immunothérapie est "totalement" inefficace contre le cancer du pancréas chez l'être humain, et cherche à comprendre cette résistance en bloquant une molécule inflammatoire, l'IL-1β. Le passage à l'humain est renvoyé au long terme, le gain annoncé à court terme étant de justifier de nouveaux tests de molécules chez la souris.

Objectifs

Le cancer du pancréas fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies, qui malheureusement ne conduisent que rarement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. Une molécule, l'IL-1β, est impliquée dans les réponses inflammatoires et peut influencer la façon dont les traitements contre le cancer fonctionnent. Son rôle dans la réponse aux traitements est complexe et n’est pas totalement compris. Le but du projet est d’évaluer l’impact d’inhibiteurs de l’IL-1β sur l’efficacité antitumorale des chimio-immunothérapies utilisées en clinique. Ainsi nous pourrons évaluer l’efficacité des traitements et déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiés en présence ou non d’inhibiteurs de l’IL-1. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Les traitements combinant chimiothérapie et immunothérapie ont montré une réelle efficacité pour de nombreux cancers. En ce qui concerne le cancer du pancréas ces traitements sont totalement inefficaces chez l’Homme. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de cette résistance dans les tumeurs générées dans le pancréas. Notre travail précédent sur des tumeurs du pancréas orthotopiques montre un réel impact de cette voie sur la réponse à la chimio-immunothérapie. Mais ces résultats ont été obtenu avec des souris n’exprimant pas l’IL-1β ou son récepteur et doivent être complétés par une évaluation des effets d’inhibiteurs, pour pouvoir être transposés chez l’Homme. L’identification du rôle de l’inflammation dans la résistance aux traitements aura des avantages, comme valider l’intérêt de trouver et tester des molécules bloquant cette voie chez la souris (court terme) et d’envisager leur utilisation chez l’Homme (long terme).

Procédures

4 interventions : - Implantation chirurgicale de cellules de cancer du pancréas murines dans le pancréas : - Geste réalisé sous anesthésie - Une seule implantation chirurgicale par animal - Durée : 10 minutes - Nombre de souris : 540 souris - Traitements par chimiothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigile - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 540 souris - Traitements par immunothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - 6 injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 540 souris - Traitements par inhibiteur ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - 6 injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 540 souris

Impact sur les animaux

- Injection de cellules tumorales dans le pancréas : croissance d’une masse tumorale intra-abdominale. -Possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. - Possibles complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice : infection, déhiscence de la plaie, douleur. -Des effets cumulés liés à la chirurgie, l’implantation des cellules tumorales, le développement des tumeurs et les traitements ne sont pas attendus étant donné la chronologie et le temps écoulé entre chaque événement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tumeurs et réaliser des expériences.

Remplacement

L’adénocarcinome pancréatique est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

- Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, une étape de faisabilité pour évaluer la pertinence des modèles a déjà été réalisée dans le laboratoire. - Les expériences visant à étudier la taille des tumeurs et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris. - Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe et entretenue tout au long de la procédure, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte et surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires (Ketoprofen 4mg/kg-une fois par jour) seront administrés en sous-cutanée en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongé pendant 48h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux (lidocaïne 4mg/kg + bupivacaine 2mg/kg) au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidiennement pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. Durant toute l’expérience, suivi du poids et évaluation de la NEC (Note d’Etat Corporel) au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvements présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées sous anesthésie, puis elles reçoivent jusqu'à cinq injections d'une combinaison de molécules activant les récepteurs TLR et jusqu'à dix injections d'un agent qui bloque l'arrivée des neutrophiles, avec quatre prises de sang à la mandibule. Les tumeurs peuvent atteindre 1 500 mm³ avant la mise à mort et se nécroser, et les molécules testées peuvent provoquer un épisode de fièvre. Le porteur affirme avoir déjà guéri des souris avec cette combinaison, et conclut que déterminer le rôle des neutrophiles "nous oblige à utiliser l'organisme vivant entier".

Objectifs

Dans une DAP précédente, nous avons pu démontrer l’efficacité thérapeutique d’une combinaison de molécules activant des récepteurs (TLR) dans un modèle de cancer du côlon. Comme attendu, la réponse anti-tumorale était dépendante de l’activation du système immunitaire et nous avons pu démontrer que très rapidement après le début du traitement, les tumeurs étaient envahies par des cellules de l’immunité, les neutrophiles. Afin de pouvoir valider l’implication des neutrophiles dans l’activité anti-tumorale de cette combinaison de molécules activant les TLRs, nous devons inhiber leur infiltration tumorale et regarder si nous conservons ou non cette activité thérapeutique. Le but de ce projet consiste donc à inhiber l’infiltration tumorale des neutrophiles et d’investiguer l’efficacité thérapeutique de notre combinaison de molécules activant les TLRs.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour but de mieux comprendre le mécanisme anti-tumoral de notre combinaison thérapeutique à base de molécules activant les TLRs. Connaitre le rôle des neutrophiles dans l’efficacité thérapeutique de la combinaison est essentielle pour que les oncologues puissent déterminer quels sont les patients pouvant recevoir ce traitement, le but étant de pouvoir rapidement proposer cette thérapie aux patients porteurs de tumeurs du côlon.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale. Les traitements reçus par les souris seront : - injection (1 minute – 200 µL maximum) de combinaison de molécules activant les TLRs au maximum 2 fois par semaine, 5 injections maximum. - injection pendant 1 minute maximumde 200 µL de l’agent 1 (tous les 2 jours sur 20 jours maximum) ou de l’agent 2 (2X par semaine, maximum 5 injections) inhibant le recrutement des neutrophiles dans les tumeurs. Les prélèvements de sang à la mandibulaire (100 µL maximum pendant une durée maximale de 1 minute) seront réalisés sous anesthésie générale, 4 fois sur 3 semaines et en faisant bien attention à ce qu’il y ait une alternance de côté de prélèvement.

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées lors de l’injection des cellules tumorales et lors des prélèvements sanguins , , ce qui peut provoquer un stress de quelques minutes une fois dans la chambre d’endormissement, un léger refroidissement, ainsi qu’un léger stress et des vacillements au moment du réveil. - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs et des traitements pourrait provoquer un léger stress. - Le volume tumoral peut générer une gêne au mouvement et donc impacter son état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - Les injections répétées et les prélèvements sanguins à la mandibule) pourraient provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les molécules activant les TLR sont utilisés à des doses déjà bien établies dans les modèles murins. Ces molécules peuvent induire un léger épisode fébrile (

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences et leur tumeur sera prélevée.

Remplacement

Une grande partie de nos démonstrations a été réalisée in vitro avant de tester notre combinaison thérapeutique chez la souris et de constater sa très grande efficacité (souris guéries). La compréhension du mode d’action de cette thérapie et plus particulièrement la détermination du rôle des neutrophiles dans celle-ci nous oblige à utiliser l’organisme vivant entier.

Réduction

Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, les croissances tumorales seront réalisées sur des groupes de 8 souris. Nous répèterons l’expérience 1 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques, comme nous avons déjà pu le déterminer dans des expériences antérieures.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour tous les animaux, une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début de l’expérimentation. Ces animaux seront habitués aux gestes techniques (contention, injections…) avant toute expérimentation. Les injections se feront au même moment de la journée, pour perturber au minimum le cycle des souris. Les souris ayant un système immunitaire déficient (déplétion des neutrophiles), elles sont donc plus sensibles aux infections et seront hébergées sous couvercle filtrant. L’injection des cellules tumorales et les prélèvements de sang à la mandibule seront réalisés sous anesthésie et en tenant compte d’une alternance pour la mandibule prélevée. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude, la fréquence de surveillance étant augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux tels qu’une perte de poids (maximum 15%), des modifications du comportement, l’apparition de nécroses sur les tumeurs ou d’une période de fébrilité. En cas de changement de comportement ou d’apparence physique, une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage et les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas d’apparition de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront mises à mort. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant. En cas d’épisode fébrile de plus 24h post-injection des molécules activant les TLRs, les souris recevront 1 injection d’analgésique en sous-cutané toutes les 12h jusqu’à disparition des symptômes (le maximum retrouvé étant de 48h dans de très rares cas). Si la tumeur atteint une taille supérieure à 1500 mm3, en cas de perte de poids supérieure à 15% ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. L’efficacité anti-tumorale de la combinaison de molécules activant les TLRs ayant été démontrée dans la souris, nous utiliserons la même souche de souris. Les animaux devront avoir au moins 8 semaines pour que leur système immunitaire soit mature.

Une douleur chronique et un état anxio-dépressif sont installés chez 3 100 souris, qui subissent deux chirurgies sous anesthésie générale espacées de deux semaines, un jeûne de 24 heures et un isolement de 24 heures. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et se terminent par une chirurgie terminale, tous les animaux étant tués. Le porteur écrit que cette douleur et ce phénotype "ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude", tout en détaillant par ailleurs habituation, enrichissement et points limites. Les cerveaux sont prélevés pour comprendre pourquoi certains patients résistent à une neurostimulation déjà en essai clinique chez l'être humain.

Objectifs

La douleur chronique est étroitement liée aux troubles émotionnels et constitue la première cause d’invalidité dans le monde, impactant fortement la qualité de vie des patients. Elle représente également un enjeu socio-économique majeur, avec des coûts estimés à plus de 800 millions d’euros en Europe. Environ 30 % des personnes souffrant de douleur chronique développent des troubles anxieux ou dépressifs, soulignant la nécessité de stratégies thérapeutiques plus efficaces et adaptées. Cette étude vise à évaluer l’impact de la neuromodulation du cortex moteur et du cortex cingulaire antérieur comme approche thérapeutique sur un modèle murin de douleur associée à un état anxio-dépressif. Le protocole de stimulation utilisé est directement inspiré d’essais cliniques en cours chez l’humain, incluant deux modalités distinctes de neurostimulation, afin de favoriser la transposabilité des résultats. Ce projet financé par l’UE vise à adopter une approche de reverse translationnelle, c’est-à-dire partir des observations cliniques pour orienter les études précliniques. L’objectif est de mieux comprendre les mécanismes d’action impliqués et, à terme, d’améliorer les stratégies thérapeutiques. Les données cliniques préliminaires obtenues par nos collaborateurs indiquent une efficacité potentielle de ces approches, bien que certains patients demeurent résistants au traitement. Le recours à un modèle animal se justifie par la nécessité d’explorer les mécanismes neurobiologiques responsables de cette variabilité de réponse, d’identifier précisément les structures cérébrales et les populations neuronales impliquées et, in fine, d’optimiser les protocoles de neuromodulation pour une application clinique améliorée. Inscrit dans une démarche de recherche translationnelle, ce projet vise à rapprocher les modèles expérimentaux des pratiques cliniques. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action, les voies de signalisation impliquées et d’affiner les paramètres de stimulation. À terme, ces connaissances contribueront à orienter les choix thérapeutiques des cliniciens et à améliorer la prise en charge des patients souffrant de douleur chronique et de troubles émotionnels.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à approfondir la compréhension des mécanismes neurobiologiques impliqués dans deux protocoles de neuromodulation actuellement en phase d’essais cliniques, dans le but d’en optimiser l’efficacité thérapeutique et, in fine, d’améliorer la prise en charge des patients présentant une douleur chronique associée à des troubles émotionnels.

Procédures

- Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. - Les niamux subissent deux chirurgies espacées de 2 semaines. - Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1h. - Les animaux subissent 3 tests évaluant la douleur (15 minutes en moyenne - stimulation courte de maximum 20 secondes) et 6 tests évaluant l'anxio-dépression (durée de 5 minutes par test). - Les animaux subissent un jeûne unique de 24h pour un test comportemental et un isolement unique de 24h pour un autre test avec un délai minimal d’une semaine entre les 2 tests. - Les animaux subissent une chirurgie terminale pour prélèvement de tissus sous anesthésie profonde pour une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

- La présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. - Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48h. - La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. - Les animaux subissent un stress aigu ainsi qu’une douleur transitoire et de faible intensité lors des tests de comportement.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort et le tissu cérébral est prélevé pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxio-dépressive nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux de 3 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA (structure chargée du bien-être des animaux) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences.

Les tests sont interrompus dès qu'une souris cherche à s'échapper. 864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire leur est provoquée chimiquement par instillation d'un conservateur, une à deux fois par jour pendant cinq semaines, avec jusqu'à neuf tests de sensibilité oculaire sous contention et six anesthésies générales par animal. Le porteur présente ce travail comme la preuve de concept qu'exige la phase de prématuration d'une molécule déjà brevetée, conçue pour faire sécréter de l'eau par les glandes lacrymales.

Objectifs

La sècheresse oculaire (Dry Eye Disease ou DED) est l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez des sujets âgés de plus de 50 ans. Cette pathologie du segment antérieur de l’œil est caractérisée par des sensations de douleur variables en intensité, allant du simple inconfort à une douleur oculaire prononcée. Les douleurs oculaires sont très difficiles à traiter et leurs mécanismes physiopathologiques demeurent peu connus. Nous avons récemment conçu une molécule qui induit la sécrétion d’eau à partir des glandes lacrymales. Notre projet a pour but d’apporter la preuve de concept nécessaire pour proposer cette molécule comme thérapie de la sécheresse oculaire en recherchant 1) si la composition des larmes induites est équilibrée et stable au cours du temps et 2) si, en induisant cette sécrétion naturelle, la molécule prévient l’inflammation et réduit l’activation des nocicepteurs responsables de la douleur oculaire. Nous utiliserons un modèle pharmacologique de souris validé pour l’étude du DED, permettant d’étudier la mise en place et la progression du syndrome. Les effets de la molécule d’intérêt (sous brevet) seront analysés dans le modèle in vivo en utilisant différents tests (nociception, volume des larmes et aspect de la cornée) et post mortem par des techniques de biologie cellulaire et histologie. Cette étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée le potentiel thérapeutique de notre molécule pour le DED.

Bénéfices attendus

La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique, fréquemment associée à des troubles visuels et à une hypersensibilité à la lumière, et constitue l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. Elle altère significativement la qualité de vie, près de 60 % des patients rapportant une gêne dans leurs activités quotidiennes, et demeure insuffisamment prise en charge, 80 % des patients estimant que leur douleur est sous-évaluée. Malgré une prévalence croissante, liée notamment au vieillissement de la population, à l’usage accru des écrans et à la chirurgie réfractive, les options thérapeutiques actuelles restent limitées, peu efficaces et souvent invasives, faisant de la sécheresse oculaire un véritable désert thérapeutique. Dans ce contexte, nos travaux visent au développement d’une solution thérapeutique originale et plus performante que les traitements actuellement disponibles. Le projet proposé a pour objectif de contribuer à une amélioration significative de la prise en charge de la sécheresse oculaire et d’ouvrir la voie au développement d’un futur médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à des applications oculaires de solutions liquides, réalisées sur animaux vigiles sous contention légère, consistant en l’instillation de petites gouttes dans chaque œil. Tous les animaux inclus dans les procédures expérimentales recevront des applications oculaires quotidiennes, une à deux fois par jour selon les groupes et la procédure considérée, pendant une durée maximale de cinq semaines. Chaque application durera environ une minute. Dans la procédure n°1, les mêmes animaux sont suivis tout au long de l’étude. En plus des applications oculaires, ils participeront à des tests fonctionnels oculaires non invasifs réalisés à l’état vigile, sous contention douce, afin d’évaluer la sensibilité oculaire. Ces tests pourront être réalisés jusqu’à neuf fois par animal (habituation comprise) sur une période maximale de six semaines, avec une durée de trois à cinq minutes par session. À chaque temps de mesure, ces mêmes animaux subiront ensuite des examens oculaires non invasifs réalisés sous anesthésie générale brève par inhalation, sans intervention chirurgicale. Chaque animal pourra être anesthésié jusqu’à six fois au cours de la procédure n°1, avec une induction inférieure à deux minutes et une durée totale n’excédant pas quinze minutes. Les examens dureront environ une à deux minutes par œil. La procédure n°1 ne comporte pas de mise à mort systématique : les animaux sont réveillés après chaque anesthésie et retournent dans leurs cages. En fin de suivi de la procédure n°1 (J42), une partie des animaux sera réutilisée dans un objectif de réduction du nombre total d’animaux. Ces animaux subiront alors une seule fois une anesthésie générale brève permettant la réalisation de prélèvements biologiques oculaires, immédiatement suivis de la mise à mort. La procédure n°2 est distincte de la procédure n°1 et réalisée sur des animaux dédiés, utilisés une seule fois à un temps expérimental donné (J7, J14, J21, J28 ou J35). Les animaux sont brièvement anesthésiés afin de permettre la collecte d’échantillons biologiques oculaires, puis immédiatement mis à mort. Il n’y a pas de suivi longitudinal des mêmes animaux et les résultats obtenus ne sont pas appariés.

Impact sur les animaux

Inconfort voire douleur d’intensité légère à modérée résultant de la sécheresse oculaire induite chimiquement par l’application d’un conservateur traditionnellement utilisé dans les gouttes pour les yeux et le nez chez l’Homme. Très léger inconfort produit par les contentions nécessaires aux gestes expérimentaux, léger inconfort lors du test comportemental de douleur, très léger inconfort résultant d’une anesthésie générale. Ce modèle murin sera donc soumis, de par la génération du syndrome des yeux secs et des procédures appliquées, à des nuisances/effets indésirables d’intensité légère à modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.

Remplacement

De précédents travaux ont permis de caractériser et de breveter la molécule d'intérêt, de déterminer sa structure et son mode d'action dans différentes cultures cellulaires sur le transport de chlore. Cette phase de prématuration du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément et quantifier les effets de la molécule in vivo. Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nous mènerons en parallèle des analyses protéomiques sur des cultures immortalisées de cellules de l'oeil.

Réduction

Les effectifs minimaux permettant d’obtenir des résultats fiables et robustes ont été calculés selon la méthode statistique de référence. Nous avons utilisé le programme GPower 3.1 : F-tests ANOVA 2 ways : Fixed effects, special, main effects and interactions. Effects size (medium) : 0.25 alpha err prob : 0.05 Power (1-beta err prob) : 0.8 . Le nombre de prélèvements effectués par animal a été maximisé afin de limiter les effectifs d’individus nécessaire à la collecte des données.

Raffinement

Notre expertise nous permet de mettre en œuvre des mesures de raffinement directement liées aux procédures expérimentales de ce projet, afin de limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux. Des séances d’habituation sont mises en place en amont des tests afin de familiariser les animaux avec l’expérimentateur, la contention manuelle douce et les gestes expérimentaux. Cette habituation progressive permet de réduire les réactions de stress lors des manipulations et d’améliorer la tolérance des procédures répétées. Les évaluations fonctionnelles oculaires réalisées à l’état vigile sont choisies pour leur caractère non invasif et sont systématiquement interrompues dès l’apparition d’un comportement d’échappement, permettant de limiter l’inconfort des animaux. Lorsque cela est nécessaire, les examens oculaires sont réalisés sous anesthésie générale brève par inhalation d’isoflurane, afin d’éviter toute douleur ou stress liés à l’immobilisation. Cette anesthésie est utilisée pour la réalisation des tests de Schirmer, du temps de rupture du film lacrymal (tBUT) et du marquage cornéen à la fluorescéine. L’état des animaux est évalué tout au long de la procédure sur la base de critères cliniques et comportementaux, permettant une adaptation immédiate des manipulations, l’espacement des tests ou la mise en œuvre de points limites précoces lorsque cela est nécessaire.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Le modèle murins reproduisant le syndrome de l’oeil sec (DED, Dry Eye Disease) est un modèle validé et classiquement utilisé dans la littérature. Des animaux âgés de 3 à 5 mois seront utilisés. A cet âge les animaux sont de jeunes adultes, ce qui nous permet de déterminer l'efficacité de notre molécule sur la physiologie oculaire en nous affranchissant de biais potentiels liés au vieillissement.

Cinq gavages et cinq injections dans l'abdomen chaque semaine, jusqu'à ce qu'un point limite soit atteint : 5 898 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou, par chirurgie, directement dans le tube digestif, puis des injections hebdomadaires de bactéries dans la veine de la queue ou dans la tumeur, avec des prélèvements de sang à l'œil et au cœur. L'objet est de comparer des souches de bactéries probiotiques modifiées pour libérer des anticancéreux à l'intérieur des tumeurs colorectales. Le porteur décrit ces procédures comme des "expériences pilotes" dont les données "ne seront pas utilisées pour tirer des conclusions définitives", et annonce ensuite d'autres études, avec un effectif statistiquement pertinent.

Objectifs

Notre équipe travaille sur le développement de bactéries probiotiques modifiées afin d’agir comme agents thérapeutiques contre le cancer. Grâce à leur capacité naturelle à cibler spécifiquement les tumeurs et à stimuler la réponse immunitaire, ces bactéries constituent des candidats particulièrement prometteurs pour les thérapies contre le cancer. Notre projet consiste donc à introduire différentes thérapies dans ces bactéries dont la libération peut être contrôlées par l’administration de produits. Sur la base d’études antérieures, nous avons déjà déterminé les doses optimales de bactéries à administrer par différentes voies de manière à assurer une bonne tolérance sans induire de mortalité. Nous poursuivons désormais nos recherches en comparant plusieurs souches, incluant différentes thérapies, sur diverses lignées cellulaires de cancer colorectal. Pour ce faire, les différentes bactéries thérapeutiques seront tout d’abord testées dans des modèles de greffes sous cutanées ce qui permettra d’identifier le candidat le plus performant. Ce dernier sera alors ensuite testé dans un modèle de greffe dans le tube digestif afin d’évaluer leur efficacité et leur potentiel clinique dans un contexte plus proche de la réalité.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectif de développer de nouvelles approches de thérapies antitumorales. Plus précisément, nous visons à valider l’efficacité de nos bactéries thérapeutiques sécrétant des anti-cancéreux dans des modèles de cancer colorectal. Un second objectif est d’approfondir la compréhension des mécanismes de colonisation tumorale des bactéries thérapeutiques et de la réponse immunitaire en les testant sur des souris porteuses de greffes tumorales bilatérales. Enfin, l’élargissement du projet à un modèle de tumeur greffé directement dans le tube digestif permettra d‘approfondir nos connaissances des bactéries thérapeutiques dans un contexte clinique plus proche encore de la réalité médicale.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules sous la peau (30 secondes par souris) / Une fois par semaine et jusqu’à l’apparition de point limite, une injection de bactéries par la queue (30 secondes par souris) / une fois par semaine et jusqu’à l’apparition de point limite, une injection de bactérie à l’intérieure de la tumeur (15 secondes par souris) / un prélèvement de sang par l’oeuil (15 secondes par souris) / un prélèvement de sang par le coeur (30 secondes par souris) / 5 gavages par semaines jusqu’à l’apparition d’un point limite (5 secondes par souris) 5 injections par semaine dans l’abdomen par semaine jusqu’à apparition d’un point limite (5 secondes par souris) / une injection de cellules dans le tube digestif par chirurgie (30 minutes par souris)

Impact sur les animaux

Nous avons classé l’ensemble des procédures décrites dans cette DAP en niveau de gravité modéré. Les greffes, le développement tumoral et l’administration des bactéries thérapeutiques peuvent entraîner différents effets indésirables, tels qu’une diminution de l’activité des animaux, une perte de poids, ou encore des troubles du transit (diarrhée, constipation, présence de sang dans les selles, prolapsus, abdomen dur ou distendu, etc.). Les tumeurs sous-cutanées peuvent également présenter des zones d’irritation. Pour la procédure impliquant des chirurgies, des douleurs postopératoires sont possibles, se manifestant notamment par un dos voûté, une pilo-érection ou des signes de déshydratation. Enfin, sur la base d’études antérieures, la dose optimale de bactéries a déjà été déterminée, ce qui permet d’écarter tout risque de septicémie liée à leur administration.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour effectuer des analyses complémentaires sur les prélèvements réalisés.

Remplacement

L’efficacité des bactéries thérapeutiques a déjà été largement démontrée au laboratoire, dans des systèmes cellulaires simplifiés. Cependant, pour valider leur potentiel thérapeutique, il est indispensable de passer à une évaluation sur l'animal afin d’établir une première preuve de concept de l’utilisation de différentes souches bactériennes comme agents thérapeutiques anticancéreux. L’évaluation de l’efficacité thérapeutique de ces souches nécessite un système biologique complexe, reproduisant les interactions tumorales, immunitaires et microbiennes présentes dans un organisme entier. Cette complexité ne peut être reproduite de manière fiable au laboratoire ou sur modèles alternatifs à ce jour, ce qui justifie le recours à un modèle murin pour cette étape cruciale de validation.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons choisi des modèles murins bien caractérisés, permettant de réduire la variabilité expérimentale. Par ailleurs, des tests préliminaires ont permis de sélectionner les souches bactériennes les plus prometteuses, évitant ainsi l’utilisation d’animaux pour des souches moins efficaces. Enfin, l’ensemble de ces procédures correspond à des expériences pilotes : ces expériences préliminaires permettront d’observer l’existence d’une tendance d’effet en testant plusieurs bactéries dans différentes conditions. Le recours à un effectif réduit permet de limiter le nombre d’animaux utilisés à ce stade exploratoire. Les données obtenues serviront uniquement à estimer la taille d’échantillon nécessaire et à optimiser le design expérimental. Elles ne seront pas utilisées pour tirer des conclusions définitives. En fonction des résultats de ces expériences pilotes, de nouvelles études pourront être mises en place avec un effectif d’animaux statistiquement pertinent.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, un suivi clinique quotidien et minutieux des animaux sera assuré afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Si des signes de mal-être sont observés, alors ils seront reportés dans une fiche de suivi clinique. Les résultats de scoring de la fiche de suivi clinique pourront conduire à la mise en place de soin ou une décision d’euthanasier l’animal. Le suivi tumoral sera réalisé trois fois par semaine. Si le volume tumoral dépasse 1500 mm³, l’animal sera euthanasié immédiatement. Par ailleurs, une grille d’évaluation des nécroses à quatre niveaux sera utilisée : des soins pourront être réalisés et si la nécrose atteint un niveau 3, cela déclenchera également une euthanasie immédiate. En cas de perte de poids ou de signes de déshydratation, une alimentation riche gélifiée ainsi que de l’eau gélifiée seront mises directement à disposition dans la cage pour faciliter l’accès. Si nécessaire, des injections sous-cutanées de sérum physiologique seront administrées pour prévenir la déshydratation. Enfin, pour limiter la douleur, notamment après chirurgie, une analgésie sera assurée 2 fois par jour, pendant une durée maximale de 5 jours. Si au bout de 5 jours, aucun signe d’amélioration n’est visible, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris comme modèle expérimental se justifie par sa proximité biologique et génétique avec l’homme, ce qui en fait un organisme de choix pour l’étude des mécanismes du cancer. Cela va nous permettre d’évaluer la complexité des interactions cellulaires, immunitaires et tissulaires dans un contexte physiologique complet qui ne peut pas être reproduit par des modèles in vitro. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines. Elles seront receptionnées à l’âge de 6 semaines puis greffées une semaine plus tard (temps d’acclimation). Nous utilisons des souris jeunes adultes car leur croissance est stabilisée et leur système immunitaire est pleinement développé et fonctionnel ce qui nous permettra d’obtenir des résultats fiables.

Toutes tuées pour prélever leur foie et d'autres organes, 1 749 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une opération au cours de laquelle des cellules tumorales lui sont injectées dans la rate, dont la moitié est parfois retirée, la peau du flanc étant refermée par des agrafes gardées sept à dix jours. Suivent jusqu'à vingt et un traitements intraveineux, quinze séances d'imagerie sous anesthésie précédées chacune d'une injection de luciférine, et neuf prises de sang à la queue sur animal maintenu éveillé. Le porteur renvoie l'amélioration de la prise en charge des malades du cancer colorectal au long terme, et annonce comme retombée immédiate des "données de haute qualité" sur l'ingénierie cellulaire in vivo.

Objectifs

Lorsque les cancers métastasent, ils deviennent beaucoup plus difficiles à traiter et la mortalité augmente. Le foie est un site fréquent de métastases et 30 à 50 % des patients atteints d'un carcinome colorectal présenteront des métastases hépatiques. Le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par cancer dans le monde, et son incidence est en augmentation. Lorsque le cancer colorectal se propage au foie, la résection des lésions est une bonne option thérapeutique, mais seuls 10 à 20 % des patients sont éligibles. Pour ceux qui ne sont pas éligibles à la chirurgie, le taux de survie à 5 ans est inférieur à 10 %, ce qui indique que les options thérapeutiques actuelles ne sont pas suffisamment efficaces. Par conséquent, les métastases hépatiques du cancer du côlon restent un enjeu médical majeur non satisfait qui nécessite des recherches supplémentaires. Grâce aux récentes avancées dans le domaine de la technologie de l'ARN messager (ARNm), de nouvelles options thérapeutiques voient le jour. L'administration d'ARNm à des cellules spécifiques permet de modifier les cellules immunitaires ou même les cellules tumorales à l'intérieur de l'organisme, ce que l'on appelle également l'ingénierie cellulaire in vivo. Nous souhaitons ici explorer différentes possibilités d'ingénierie cellulaire in vivo afin d'améliorer l'activité antitumorale des cellules effectrices immunitaires, telles que les cellules NK et les cellules T. À des fins d'ingénierie in vivo, nous utiliserons des nanoparticules lipidiques (LNP), dans lesquelles l'ARNm peut être encapsulé et délivré spécifiquement aux cellules tumorales ou immunitaires, respectivement. En résumé, notre objectif est de développer des approches pour traiter le cancer du côlon métastatique, une maladie difficile à traiter et dont le pronostic est mauvais, en utilisant l'ingénierie cellulaire in vivo avec des LNP ciblées à ARNm.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter de nouvelles perspectives dans le domaine des traitements innovants contre les métastases hépatiques du cancer du côlon, qui font cruellement défaut. L'ingénierie cellulaire in vivo offre des possibilités que les traitements conventionnels ne permettent pas, comme la modification spécifique des cellules tumorales afin d'altérer leur immunogénicité. Nos recherches pourraient donc améliorer à long terme la prise en charge des patients atteints de cancer, mais elles aideront également la communauté scientifique en fournissant des données de haute qualité sur l'ingénierie cellulaire in vivo à court terme.

Procédures

Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale au cours de laquelle des cellules tumorales seront injectées dans la demi-rate (cellules tumorales MC38) ou dans la rate (cellules tumorales AKTPF). Dans le cas de la procédure sur la demi-rate, la moitié de la rate sera retirée, tandis que l'autre moitié restera en place pour continuer à remplir sa fonction. Afin de mesurer la charge tumorale, les souris seront imagées par bioluminescence, ce qui comprend une injection péritonéale de luciférine sur animaux vigiles et une anesthésie gazeuse pour immobiliser les souris pendant l'imagerie (2x/ semaine). Pour les groupes témoins, le jour prévu pour l'euthanasie est le jour 28, ce qui correspond à 7 imageries. Pour les souris ayant reçu une injection de ARNm-LNP, le jour maximum pour l'euthanasie est le jour 56, ce qui correspond à un nombre maximum de 15 imageries. Le traitement par ARNm-LNP ou les traitements témoins seront administrés par injection intraveineuse (3x/ semaine). Le nombre prévu est 10 injections intraveineuses pour les groupes témoins (PBS, ARNm-LNP constructions contrôles) et un nombre maximal de 21 traitements ARNm-LNP pour les groupes traités par ARNm-LNP. Les animaux vigiles subiront un prélèvement sanguin dans la veine caudale (100 µl 1 fois par semaine) en contention. 5 prélèvements sanguins pour les groupes témoins et un nombre maximum de 9 pour les groupes traités ARNm-LNP seront ainsi réalisés.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales sera effectuée dans l'hémi-rate (MC38) ou la rate (AKTPF). Cette injection est réalisée au cours d'une intervention chirurgicale, ce qui constitue une contrainte importante, mais de courte durée. L'intervention chirurgicale peut être douloureuse pour les animaux ; elle est donc réalisée sous anesthésie gazeuse et les souris recevront des analgésiques avant, pendant et après l'intervention. Le développement de métastases hépatiques est une contrainte qui peut entraîner des douleurs ou une perte de poids. Après l'intervention chirurgicale, la peau du flanc droit est refermée à l'aide d'agrafes, ce qui peut causer une gêne aux animaux. Les agrafes seront retirées une fois l'incision cicatrisée (entre le 7e et le 10e jour après l'intervention). Les ARNm-LNP ou les traitements témoins seront injectés par voie intraveineuse (3 fois par semaine) sur animaux vigiles en contention, ce qui peut engendrer un stress et une douleur modérée de courte durée. Afin de mesurer la charge tumorale des cellules tumorales exprimant la luciférase (2 fois par semaine), les souris recevront une injection intrapéritonéale de luciférine. Ensuite, les souris seront anesthésiées à l'isoflurane et imagées par bioluminescence. Cette procédure peut entraîner une douleur et un stress modérés de courte durée. Pour le prélèvement sanguin dans la veine caudale (1 fois par semaine) réalisé sur animaux vigiles en contention, les animaux pourront ressentir un stress et une douleur modérée de courte durée. Pour induire l'expression transgénique de lignées cellulaires tumorales transduites in vitro (système d’expression inductible activable par ajout d’un antibiotique), les souris recevront l’antibiotique dans leur eau de boisson, ce qui peut générer un goût amer.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure ou lorsque les critères terminaux seront atteints. L'euthanasie est nécessaire pour prélever le foie et autres organes des animaux.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons modéliser les métastases hépatiques, mais également le ciblage de cellules spécifiques par les LNP. Le microenvironnement tumoral des métastases hépatiques est complexe et se compose d'une variété de cellules parenchymateuses ainsi que de cellules immunitaires résidentes et infiltrantes. Bien que des modèles in vitro avancés tels que les organoïdes puissent modéliser certains aspects des métastases hépatiques, la complexité des cellules impliquées et d'autres facteurs nécessite un modèle animal. En ce qui concerne le ciblage des LNP sur des types de cellules spécifiques, nous réaliserons des expériences in vitro initiales afin d'optimiser autant de facteurs que possible avant de passer aux expériences in vivo, afin d'éviter des expériences in vivo inutiles. Cependant, des expériences in vivo sont nécessaires pour évaluer la toxicité, la biodistribution et la spécificité des types de tissus et de cellules.

Réduction

Nous réalisons des expériences d'optimisation in vitro initiales afin d'identifier les constructions de protéines thérapeutiques et les formulations LNP les plus prometteuses avant de passer aux expériences in vivo. Avant l'évaluation expérimentale des traitements avec les candidats ARNm-LNP, nous réalisons des expériences de recherche de dose. Grâce à cette approche, nous pouvons éviter d'appliquer plusieurs doses dans les expériences d'évaluation expérimentale, ce qui participe à la réduction du nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris bénéficient d'une période d'adaptation au minimum de 7 jours après leur arrivée dans l'animalerie avant le début des expériences. Les animaux sont hébergés conformément aux normes requises par la réglementation, en groupes sociaux, dans un environnement approprié et enrichi. Les souris seront manipulées à l'aide de la méthode « cup handling » dans la mesure du possible. Les souris sont surveillées régulièrement par le personnel selon la fiche de score. Cela permet de détecter rapidement les signes de douleur ou de souffrance et de mettre en place les traitements appropriés (analgésique pré et post opératoire, traitement analgésique si signe de douleur, nourriture humide si perte de poids importante, administration de sérum physiologique si déshydratation, ponction de l’ascite si trop important). L’antibiotique est administré dans l'eau de boisson plutôt que par injection afin de réduire le stress et la douleur et pour atténuer générant son goût amer, du saccharose sera ajouté à l'eau. Dans les procédures impliquant des tumeurs, les cellules tumorales sont porteuses de luciférase afin de permettre le suivi in vivo de la charge métastatique hépatique par bioluminescence, ce qui permet d'acquérir des points de données sans avoir à euthanasier les animaux.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle très couramment utilisé pour étudier l'immunologie en raison de la grande similitude entre les systèmes immunitaires murin et humain. Malgré les différences entre les systèmes immunitaires des deux espèces, les souris ont été d'une aide précieuse pour de nombreuses découvertes qui ont pu être transposées à l'être humain. Les outils que nous utilisons, tels que les cellules murines MC38 et la génération de métastases hépatiques, sont très bien établis et caractérisés. Les souris seront utilisées dans les expériences entre 7 et 16 semaines. À cet âge, leur système immunitaire est pleinement développé.