Souris

Traitées par chimiothérapie puis par morphine pendant leur adolescence, à partir de cinq semaines, 920 souris reçoivent vingt injections quotidiennes sur animal vigile, dont une injection sous la plante de la patte que le porteur décrit comme aiguë et inflammatoire. 600 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 320 d'un niveau sévère, et toutes sont tuées pour analyse post-mortem. Il s'agit de mesurer, une fois adultes, leur sensibilité à la douleur, leur humeur et leurs comportements de dépendance, la morphine induisant l'état de dépendance physique que le protocole cherche précisément à provoquer. Les tests comportementaux sont annoncés par grandes catégories, seuils nociceptifs, anxiété, récompense, sans qu'aucun soit nommé.

Objectifs

Environ 70 % des jeunes patients souffrant de cancers pédiatriques rapportent également des douleurs sévères. Ces dernières peuvent être le résultat des traitements destinés à éliminer les cellules cancéreuses. En effet, la plupart des agents chimiothérapeutiques détruisent les microtubules dans les nerfs périphériques, favorisent les processus inflammatoires et le dysfonctionnement axonal, provoquant ainsi des douleurs neuropathiques et des douleurs musculaires ou osseuses qui sont fréquemment décrites 4 à 5 jours après les cycles de traitement. Pour soulager ces douleurs, pour l’heure, les opioïdes tels que le tramadol ou la morphine restent le traitement de référence. Cependant, nous ne savons que peu de choses sur les effets à long terme de l'utilisation répétée d'opioïdes à un stade précoce de la vie. Il est donc urgent de mieux comprendre les effets à long terme de l'utilisation d'opioïdes chez les enfants atteints de cancer et ce sous différents angles. Il semble notamment crucial de comprendre les effets sur la sensibilité à la douleur, l'humeur et l'utilisation abusive d'opioïdes une fois que ces jeunes enfants atteignent l’âge adulte. Ainsi, ce projet pilote, réalisé sur un modèle murin, sera développé autour de deux objectifs principaux : (i) évaluer l'impact de l'utilisation répétée d'opioïdes au début de la vie (adolescence), suite à des traitements chimiothérapeutiques, sur la nociception, l'humeur et les comportements d’addiction à l'âge adulte ; (ii) identifier les régions du cerveau affectées par l'utilisation d'opioïdes au début de la vie (adolescence) en se concentrant particulièrement sur les structures impliquées dans la matrice de la douleur et le traitement de la récompense.

Bénéfices attendus

Ce projet, validé par un comité d’évaluation scientifique, a le potentiel d'apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur les effets comportementaux à long terme d’une traitement anti-cancéreux combiné à la prise de morphine à un stade précoce de la vie. De plus, ce projet apportera les premières informations permettant de comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans ces effets et permettra de mettre en évidence de potentielles différences sexuelles, souvent sous-estimées dans les études axées sur les adolescents. A long-terme, ce projet permettra d’améliorer le soin des cancers pédiatriques et surtout la gestion de la douleur associée aux traitements utilisés.

Procédures

Le but de ce projet est d’étudier l’effet à long terme d’un traitement anti-cancéreux combiné à des morphiniques effectué lors de l’adolescence. Nous évaluerons les effets nociceptifs, émotionnels et en lien avec les comportements d’addiction. Ainsi des groupes de souris seront traitées avec ce traitement [20 injections au total (1/jour), sur animal vigile; durée d'une injection ~10sec]. Les différentes procédures expérimentales mettront en jeu des tests comportementaux (de 5 min à 30 min de test) évaluant les seuils nociceptifs, les comportements anxiodépressifs et les en lien avec la récompense. Un seul test sera réalisé par jour et un délai minimal de 24h sera respecté entre chaque test. MODIFICATION : UNE INJECTION SUR ANIMAL VIGILE D'UNE DUREE DE 10 SECONDES SERA EFFECTUEE. Des chirurgies sur animal anesthésié seront nécessaires (1 chirurgie d'une heure maximum / animail). La combinaison du traitement anti-cancéreux et l'étude de la chornification de la douleur peut entrainer une nuisance sévère pour les animaux.

Impact sur les animaux

L’ensemble des procédures nécessitent un traitement anti-cancéreux qui peut provoquer une douleur modérée aux animaux. L’administration aigue ou répétée de morphine peut induire un état de dépendance physique. De plus, la répétition des injections peut provoquer une douleur aigue transitoire, une inflammation locale au niveau du site d’injection, voire une induration. Certaines des procédures de ce projet nécessitent des chirurgies sur animal anesthésié (1 chirurgie d'une heure maximum / animal) pouvant induire une douleur modérée, une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. MODIFICATION : L'INJECTION SOUS CUTANEE AU NIVEAU PLANTAIRE induit UNE DOULEUR AIGUE AINSI QU’UNE POTENTIELLE INFLAMMATION AU NIVEAU DU SITE D’INJECTION nécessaires à l'étude réalisée. La combinaison du traitement anti-cancéreux et l'étude de la chornification de la douleur peut entrainer une nuisance sévère pour les animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.

Remplacement

Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l’évaluation de réponses nociceptives, de comportement émotionnels et de type addictifs nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vigile.

Réduction

Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance (power analysis) qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 20 animaux/groupe pour le comportement et 10 pour les analyses immunohistologiques. Bien que de nombreux groupes contrôles soient nécessaires pour ce projet et que les deux sexes soient utilisés, les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation d’enregistrement longitudinaux permettra de réduire grandement le nombre d’animaux nécessaire pour notre projet et les approches sur cerveau entier permettront d’identifier un grand nombre de cibles potentielles sans avoir à répéter les expériences.

Raffinement

Tout au long des expériences, les souris sont hébergées en cage collective, dans un milieu enrichi (matériel de nidification et bâton), et observées quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Pour le suivi du bien-être animal lors du traitement à la vincristine, une grille de score sera utilisée permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale. Cette grille de score visera également à évaluer la zone d’injection et d’ainsi vérifier l’absence d’inflammation locale, d’induration ou de dommages cutanés. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire. De plus, en complément de la grille de score du suivi, après chaque chirurgie, l’état de santé des animaux sera évalué à l‘aide d’une grille de score spécifique à la procédure chirurgicale permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale.

Choix des espèces

Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, entier et complexe afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’humain, le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences. Enfin, les outils viraux nécessaires à ce projet ont été développés et validés chez la souris, qui apparait encore donc comme le modèle le plus adapté à ce projet. Par ailleurs, d’autres expérimentations portant sur les conséquences d’une douleur neuropathiques ont déjà été réalisées par notre équipe sur des souris mâles et femelles. De ce fait, par soucis de cohérence et reproductibilité, nous souhaitons conserver la même souche de souris pour ce projet. Des animaux adolescents seront utilisés (début des procédures à 5 semaines pour le traitement anti-cancéreux/morphine) car l’objectif de l’étude est d’évaluer l’effet à long terme des traitements subis à un stade précoce de la vie.

Pour provoquer puis suivre un anévrisme de l'aorte, 512 souris subissent l'ouverture puis la fermeture de la cage thoracique sous anesthésie, une opération d'environ vingt-cinq minutes. 432 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 80 d'un niveau modéré, et toutes sont tuées pour prélever le cœur. Chacune reçoit ensuite des injections deux fois par semaine pendant six mois au plus et passe jusqu'à treize échographies sous anesthésie gazeuse. Le porteur écrit que la dilatation de l'aorte ne provoque généralement pas de symptômes, tout en indiquant qu'elle peut comprimer les organes voisins et se rompre en hémorragie interne.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre comment certaines cellules des vaisseaux sanguins se comportent et interagissent lors du développement d’un anévrisme de l’aorte, une maladie caractérisée par une fragilisation et une dilatation de l’aorte. Plus précisément, ce projet vise à : 1-Mettre en place un modèle expérimental de l’anévrisme de l'aorte thoracique chez la souris à l’aide de techniques chirurgicales de précision guidées par l’imagerie. 2- Identifier les premiers signes biologiques associés à l’apparition et à l’évolution de l’anévrisme. 3-Tester et valider de nouvelles cibles pouvant conduire à de futurs traitements. 4- Développer des « jumeaux numériques » de souris, c’est-à-dire des modèles informatiques combinant les données d’imagerie et les informations biologiques, afin de mieux prédire l’évolution de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de certaines cellules dans la fragilisation de l’aorte lors d’un anévrisme. En identifiant les mécanismes moléculaires responsables du durcissement et de l’affaiblissement de la paroi du vaisseau, ces travaux pourront contribuer à mieux évaluer le risque de rupture de l’aorte, une complication grave et potentiellement mortelle. Les connaissances obtenues aideront à orienter le développement de nouveaux traitements visant à réduire la gravité de la maladie et à améliorer la survie des patients. Par ailleurs, l’utilisation de techniques d’imagerie avancées permettra d’identifier de nouveaux indicateurs mesurables de la maladie, ouvrant la voie à un diagnostic plus précoce, un meilleur suivi de l’évolution de l’anévrisme et une évaluation plus précise de l’efficacité des traitements.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale d’une durée approximative de 25 minutes, réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptées, permettant l’induction d’un anévrisme de l’aorte. Un suivi non invasif par imagerie échographique, d’une durée d’environ 20 minutes, sera réalisé sous anesthésie gazeuse deux fois par mois, pour un maximum de 13 examens par souris. Les animaux recevront des traitements expérimentaux administrés par voie orale dans l’eau de boisson et par injections, à raison de deux injections par semaine pendant une période maximale de six mois. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel formé. À l’issue des procédures, les animaux seront euthanasiés conformément aux recommandations réglementaires afin de permettre la collecte des organes destinés aux analyses histologiques et moléculaires.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale, impliquant l’ouverture puis la fermeture de la cage thoracique, est susceptible d’entraîner une douleur post-opératoire au réveil des animaux, ainsi qu’une perte de poids légère et transitoire et une augmentation temporaire du stress. L’anévrysme de l’aorte thoracique correspond à une dilatation anormale de la principale artère du corps. Cette anomalie ne provoque généralement pas de symptômes. Elle peut toutefois entraîner des douleurs ou une gêne lorsqu’elle compresse les organes voisins. Dans les cas les plus graves, l’anévrysme peut se rompre et provoquer une hémorragie interne. Le suivi par imagerie échographique constitue une approche non invasive et non douloureuse ; le stress associé à cet examen est limité à une courte phase de manipulation par l’expérimentateur, suivie d’une anesthésie, pour une durée totale d’environ 20 minutes par animal. Les injections réalisées chez des animaux vigiles peuvent entraîner une gêne ou une douleur légère et transitoire au niveau du site d’injection.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de procéder au prélèvement du coeur pour des analyses histologiques et moléculaire

Remplacement

Le développement de modèles murins de pathologies cardiovasculaires, telles que l’anévrisme de l’aorte, joue un rôle essentiel en recherche préclinique pour la compréhension des fonctions physiologiques intégrées, en particulier lorsque les méthodes substitutives ne permettent pas d’obtenir des informations équivalentes. Le suivi de processus physiologiques tels que le métabolisme, la perfusion tissulaire, la fonction d’organes complexes ou les effets des médicaments sur l’organisme fournit des informations précieuses sur le fonctionnement global des systèmes biologiques, qui ne peuvent être reproduits fidèlement par des modèles cellulaires. Par ailleurs, les données fonctionnelles issues de l’imagerie échographique seront utilisées et partagées afin de développer, à terme, des jumeaux numériques de souris. Ces modèles informatiques, combinant les données d’imagerie et les informations biologiques, permettront de simuler les perturbations du flux sanguin avant, pendant et après traitement, offrant ainsi un outil prédictif avancé pour optimiser les stratégies thérapeutiques et améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-jacents.

Réduction

La procédure chirurgicale induisant l’anévrisme de l’aorte sera guidée, en amont, par des données échographiques précises, permettant ainsi de réduire la mortalité opératoire et périopératoire, ce qui contribue à diminuer le nombre d’animaux nécessaires. L’imagerie non invasive en temps réel permettra d’évaluer l’apparition des premiers signes de dysfonction aortique, évitant ainsi l’euthanasie prématurée des animaux pour confirmer le succès de la procédure. Chaque animal servira de témoin à lui-même, ce qui optimise le nombre total d’animaux requis grâce à des mesures répétées sur le même individu.

Raffinement

La procédure chirurgicale destinée à induire un anévrisme de l’aorte sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie appropriée, et guidée par des données échographiques précises afin de limiter la durée et le caractère invasif de l’intervention. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne assurée par du personnel formé, avec une évaluation rigoureuse de leur bien-être fondée sur des grilles standardisées de points limites. Les mesures d’analgésie seront adaptées en fonction de cette évaluation, en étroite collaboration avec l’équipe de zootechnie.

Choix des espèces

Le modèle d’anévrisme de l’aorte thoracique chez la souris jeune adulte (mâles et femelles) est un modèle de référence largement utilisé dans de nombreuses études précliniques. La souris représente un organisme particulièrement pertinent pour l’étude de cette pathologie en raison de la forte conservation des mécanismes moléculaires, cellulaires et physiopathologiques impliqués dans les maladies vasculaires entre la souris et l’Homme, ainsi que de la disponibilité de nombreux outils génétiques permettant un ciblage cellulaire précis.

Greffées de cellules humaines par injection dans la veine de la queue, ou dans le cœur pour les souriceaux de deux jours, 450 souris immunodéficientes subissent ensuite des prises de sang toutes les deux semaines, des greffes de tumeurs et parfois des traitements anti-lymphocytaires. Quatre cents d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, cinquante d'un niveau modéré, et toutes sont tuées pour prélever rate et ganglions. L'objectif est de faire fabriquer un anticorps antitumoral par des lymphocytes B humains, dans des souris dépourvues de défenses immunitaires et donc exposées à tout pathogène de leur environnement. Le porteur annonce que peu de nuisances sont à attendre, tout en listant la maladie du greffon contre l'hôte, la fièvre, les vomissements, les diarrhées et les tremblements liés aux traitements.

Objectifs

L'objectif de ce projet est la mise au point d’une stratégie permettant de faire produire aux lymphocytes B un anticorps choisi, ciblant spécifiquement une protéine exprimée par les cellules tumorales. Ce système permettra alors d’induire une réponse immunitaire spécifique contre les tumeurs. Nous allons donc modifier génétiquement les lymphocytes B humains ou leurs précurseurs puis injecter ces cellules à des souris immunodéficientes, souris qui ne pourront pas rejeter les cellules humaines. Nous quantifierons alors la production des anticorps dans les souris et implanteront les tumeurs spécifiques des anticorps induits pour évaluer la capacité antitumorale de nos anticorps.

Bénéfices attendus

L'utilisation des souris immunodéficientes est un excellent modèle pour notre projet. En effet, ces souris ne possèdent plus de lymphocytes et ne peuvent alors plus détruire les cellules étrangères injectées. Elles sont donc capables de recevoir différentes cellules humaines, comme des lymphocytes B qui produiront des anticorps ou même des cellules précurseuses des lymphocytes, qui pourront alors produire des lymphocytes B humains dans les souris. Avec ce projet, nous testerons donc la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B des anticorps thérapeutiques. Ce projet pourra ensuite être valorisé (essai clinique de phase I) et potentiellement ouvrir une autre voie dans les traitements d'immunothérapie.

Procédures

La greffe des cellules sera unique et se fera soit par injection intraveineuse dans la veine de la queue chez les souris adultes soit par injection intracardiaque chez les souriceaux nouveau-nés. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 2 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution immunologique au cours du temps. Ensuite, des immunisations et des greffes de cellules tumorales pourront être appliquées sur les animaux si la reconstitution immunitaire a été jugé optimale. Des Lipid NanoParticules pourront également être injectés aux souris reconstituées afin d'explorer la possibilité de modifier le génome de nos cellules d'intérêt directement in vivo. Enfin, des traitements anti-lymphocytaire pourront être administrés aux animaux en cas d'apparition de la maladie du greffon contre l'hôte.

Impact sur les animaux

Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection intraveineuse de cellules. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention afin de chauffer leur queue avant l'injection. Un léger inconfort pourra être ressenti à cause de la chaleur et une douleur pourra être ressentie lors de la piqure dans la queue au moment de l'injection. Les autres nuisances attendues viendront de l'injection intracardiaque du nouveau-né. En effet, la mère pourrait ne pas vouloir récupérer son souriceau si celui a été trop manipulé. Des efforts afin de masquer les odeurs liées à la manipulation seront réalisés pour favoriser la réadoption des souriceaux par leur mère. Des effets indésirables pourront également survenir après les greffes de tumeurs, des points limites concernant la taille des tumeurs seront mis en place afin d'éviter trop d'inconfort et de souffrance aux souris. Des nuisances pourraient aussi survenir après l'injection de LNP par voie intraveineuse (perte de poid essentiellement) mais aussi après l'administration de traitements anti-lymphocytaires (fièvre, frissons, vomissements, flush, diarrhées et tremblements).

Devenir

A l'issue de chaque expérimentation, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution du système immunitaire humain dans la souris ainsi que sur le développement de la réponse immunitaire.

Remplacement

Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules précurseuses du système immunitaire. Ces dernières sont en effet capables de se différencier dans la moelle osseuse de la souris après injection et de fabriquer dans ces souris diverses populations immunitaires humaines, dont les lymphocytes B. Il est actuellement possible de différencier ces précurseurs in vitro mais uniquement vers quelques voies données, et non vers la différenciation en lymphocyte. Aucun modèle in vitro ne permet une différenciation complète vers toutes les lignées du système immunitaire. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes de cellules, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon des critères généraux permettant de quantifier le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes choisies pour ce projet sont complètement dépourvues de lymphocytes, ce qui permet donc d'éviter le rejet des cellules humaines. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé de prise de xénogreffes, que ce soit des lymphocytes B humains ou leurs précurseurs. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de contamination par divers pathogènes car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Dans un premier temps, l’expérimentation sera commencée chez des animaux de 4 à 6 semaines. En effet, une meilleure prise de greffe des cellules humaines a lieu chez les animaux jeunes, en particulier pour les lymphocytes. Dans un second temps, l’expérimentation sera commencée chez les souriceaux nouveau-nés de 2 jours. En effet, il est maintenant démontré que la prise de greffe des cellules humaines est meilleure quand les cellules sont injectées chez les nouveau-nés, ceci rendant nos expérimentations plus faciles à réaliser et nos résultats plus faciles à analyser (plus de cellules humaines dans la souris donc des effets plus facilement monitorables).

Rendues immunodéprimées par deux injections de cyclophosphamide, 120 souris sont infectées par une Klebsiella pneumoniae multirésistante instillée dans le nez sous anesthésie. Cent d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, vingt un niveau sévère, et toutes sont tuées pour que la rate et les poumons soient prélevés. Elles peuvent présenter des difficultés respiratoires douze à dix-huit heures après l'inoculation, sans recevoir d'antalgique ni d'anti-inflammatoire, le porteur indiquant que ces produits interféreraient avec l'infection ou resteraient sans effet sur ses symptômes. Aucun médicament n'est évalué à ce stade: l'étude sert à caler un modèle de pneumonie destiné à tester ensuite des composés anti-infectieux.

Objectifs

La résistance des bactéries aux antimicrobiens (AMR) représente actuellement un problème majeur de santé publique, et menace notre capacité à traiter des infections potentiellement mortelles telles que les pneumonies acquises à l’hôpital, dont le taux de mortalité peut atteindre 50 %. Klebsiella pneumoniae est une espèce bactérienne fréquemment retrouvée en milieu hospitalier et le traitement de ces infections requiert souvent l’usage d’antibiotiques de dernière ligne. Toutefois, l’activité de ces antibiotiques est largement compromise par le fait que les bactéries produisent des facteurs (appelés MBL pour certains) et capables de détruire ces antibiotiques, les rendant ainsi inefficaces. Dans ce cadre, des stratégies thérapeutiques innovantes sont attendues. Certains laboratoires s’intéressent au développement de médicaments capables de s’attaquer aux mécanismes de résistance des bactéries et ainsi de restaurer l’activité des antibiotiques disponibles. Aussi, de façon à évaluer ultérieurement l’activité in vivo de ces médicaments, il convient, dans un premier temps, de développer le modèle d’infection optimal permettant de répondre à la question. Pour cela, l’objectif de la présente étude consiste à développer un modèle prédictif d’infection pulmonaire à Klebsiella pneumoniae multi-résistante chez la souris. Ce modèle servira, par la suite, à l’évaluation de l’efficacité de nouveaux composés anti-infectieux en développement.

Bénéfices attendus

Les pneumonies bactériennes dues à des espèces multi-résistantes comme K. pneumoniae constituent un challenge pour les professionnels de santé, en raison de leur capacité à produire des facteurs capables de détruire les antibiotiques. L’étude de ces infections est donc primordiale. Le projet permettra de mettre à disposition un modèle de pneumonie à K. pneumoniae précieux, utile à l’évaluation de l’efficacité de composés anti-infectieux en développement, particulièrement attendus en thérapeutique.

Procédures

- Deux injections d’immunosuppresseur (5 secondes maxi) - Une instillation nasale sous anesthésie (temps d’infection 15 secondes maximum)

Impact sur les animaux

Avant l’infection, les souris seront immunodéprimées selon un protocole bien défini (150 mg/kg de cyclophosphamide à J-4 et 100 mg/kg à J-1). Ce protocole a déjà été utilisé dans plusieurs études et n’a montré aucun effet indésirable sur les animaux (injection de 5 secondes maximum en intrapéritonéal). A J0, l’administration intranasale de la suspension bactérienne sera réalisée par du personnel compétent et expérimenté (temps d’infection 15 secondes maximum, sous anesthésie volatile). La principale nuisance sera liée à l’installation et à la progression de l’infection pulmonaire ; les souris pourront présenter des signes de difficulté respiratoire environ 12-18h après l’inoculation et une altération de l’état général. Elles seront donc surveillées plus fréquemment sur la période 12h-24h. Sur des modèles similaires (utilisant des souches de Klebsiella pneumoniae exprimant d’autres mécanismes de résistance), aucune mortalité précoce et aucune atteinte des points limites n’avait été rapportée. Cela étant, s’agissant ici d’une phase pilote utilisant de nouvelles souches, une surveillance très rapprochée sur les 24h d’infection sera réalisée selon une grille de score précise.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mise à mort ; la rate et les poumons des animaux seront prélevés, de façon à quantifier la charge bactérienne

Remplacement

Actuellement, le recours au modèle murin est justifié par l’absence d’alternatives expérimentales capables de reproduire de manière pertinente la complexité des infections pulmonaires, intégrant la physiologie pulmonaire, l’infection et la diffusion intratissulaire des antibiotiques. Même si d’autres essais in vitro dynamiques sont en cours, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement robustes, tout en respectant la variabilité biologique inhérente à ce genre d’étude. Aussi, des expériences précédentes sur des modèles similaires nous permettent de dire que 5 animaux par groupe (au lieu de 10) et par temps sont suffisants pour cette phase de mise au point de modèle.

Raffinement

Les injections intra-nasales seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté et sous anesthésie volatile. Un programme d’enrichissement de l’environnement sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal. Les animaux seront hébergés à 5 par cage. La principale nuisance sera liée à l’installation et à la progression de l’infection pulmonaire. D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation, ce qui risquerait même de faire flamber l’infection. L’administration d’antalgiques n’aurait par ailleurs aucune action sur les symptômes liés à l’infection. Une surveillance accrue (toutes les 2-4h, selon le score clinique) sera réalisée à compter de 12h post-infection.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de choix pour la mise au point de ces modèles d’infection pulmonaire (largement décrit dans la littérature) ainsi que pour l’évaluation de thérapies antibiotiques ultérieures. Des souris de 8 semaines seront utilisées de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédents modèles).