Souris

936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour que leur cerveau soit observé au microscope. Chacune subit une chirurgie cérébrale de quarante minutes, six à huit injections sur animal vigile et jusqu'à treize séances d'observation de trente minutes, autour d'une exposition à la cocaïne. L'objectif est de tester si la kétamine efface la mémoire associative qui déclenche la rechute, les femelles n'étant incluses que si les effets se confirment chez les mâles. Le RNT indique lui-même que des essais cliniques de cette molécule contre la dépendance à la cocaïne sont déjà en cours chez l'être humain.

Objectifs

La toxicomanie est un problème de santé, social et économique majeur qui coûte des milliards d'euros à notre société. En France, on constate une augmentation de la consommation de cocaïne (plus d'un million de consommateurs en France, soit 2,7 poucents en 2023 contre 1,6pourcents en 2017 et 0,6pourcents en 2005) et près de 10 pourcents de la population générale a consommé de la cocaïne au moins une fois (chiffre enregistré en 2023, www.ofdt.fr). L'une des principales caractéristiques des troubles liés à l'usage de substances est l'association persistante entre la drogue et le contexte, et le fait que l'exposition à des signaux associés déclenche la consommation et entraîne une rechute. Cela concorde également avec les nombreuses preuves démontrant que la toxicomanie recourt à des mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent les souvenirs associatifs à long terme, avec notamment la formation de nouvelles connexions neuronales. À ce jour, il n'existe aucun médicament approuvé spécifiquement pour le traitement de la dépendance à la cocaïne. Cependant, des essais cliniques utilisant une molécule pour traiter la dépendance à la cocaïne sont en cours. Lette molécule est actuellement un traitement efficace contre la dépression. Les études pré-cliniques montrent que cette molécule réorganise la connectivité neuronale, qui est justement un mécanisme cellulaire clé dans la formation de l’association entre cocaïne et contexte. Les associations apprises tout au long de la vie entre la cocaïne et certains stimuli ne conduisent pas seulement à la consommation, mais aussi à la rechute, donc ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique de la molécule pour disrupter la mémoire pathologique induite par la cocaïne, et étudier les effets de la kétamine sur la réorganistion des connexions neuronales.

Bénéfices attendus

Ce projet testera les effets d’une molécule sur la caractère renforcant de la cocaïne et sur la rechute dans la consommation. Le bénéfice possible est de révéler une stratégie médicamenteuse contre l’addiciton à la cocaïne, pour laquelle aucun traitement n’existe à ce jour.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule opération chirurgicale (durée 40minutes) sous anesthésie générale en condition d'analgésie pendant et après l'opération. Les animaux vigiles seront soumis à des injections (de 6 à 8), et seront placés dans une enceinte pour observer leur comportement spontané pendant 30 minutes (de 4 à 13 fois).

Impact sur les animaux

Les injections engendrent une douleur de très courte durée au niveau de l’abdomen. Lors des actes chirurgicaux, l’anesthésie peut engendrer une baisse de température corporelle et une déshydratation. Dans de très rares cas, l’anesthésie peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire. En post opératoire de la chirurgie, les nuisances possibles sont une douleur, et une infection au niveau de la suture de la peau du crâne. La manipulation des animaux par l’expérimentateur, ainsi que l’exposition à un nouvel environnement (cage de test de comportement) peut engendrer un stress.

Devenir

La totalité des animaux seront euthanasiés afin d'étudier le cerveau. Il est nécessaire de prélever le cerveau car seule une observation par microscopie permettra de connaître les événements cellulaires associés aux effets thérapeutiques attendus.

Remplacement

Les études in vitro et sur invertébrés ne permettent d’étudier les comportements de type addictif car la neuropathologie de ces troubles psychiatriques est complexe, évolutive et multicellulaire. La stratégies à visée thérapeutique développée dans ce projet ne peut se faire qu’avec des animaux. L’utilisation de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender ces études, ni de développer des stratégies à visée thérapeutique pour obtenir des preuves de concepts en vue d’une application translationnelle. Cependant, avant chaque procédure décrite dans ce projet, des résultats obtenus sur des cultures de cellules ont permis d’obtenir des résultats préliminaires solides afin de limiter les études in vivo chez la souris.

Réduction

Le projet impliquera un nombre maximum de 936 animaux. Les résultats publiés par de nombreux laboratoires dont le nôtre nous ont permis de déterminer précisément le nombre d’animaux par groupe expérimental permettant de générer des données statistiquement solides. Il est bien établi que 18 animaux par groupe sont nécessaires, ce nombre est établi pour minimiser le nombre d'animaux tout en assurant de générer des résultats fiables, autant pour l'analyse comportementale que pour l'analyse de la connectivité neuronale. Notre équipe réalise ce test comportemental et l'analyse des connexions depuis des années avec de nombreuses publications. De plus, nous réaliserons les expériences avec plusieurs lots de 6 souris par groupe expérimental, de sorte que dans le cas où 2 lots (12animaux) suffiraient (ce n'est pas systématique, mais il arrive que 12 souris suffisent pour obtenir un résultat fiable), nous ne réaliserons pas cette expérience avec le 3ème lot, donc pour chaque expérience le nombre de souris pourrait être 12 au lieu de 18. Selon les résultats, la généralisation de l'effet thérapeutique sera testée chez des animaux femelles, mais ces expériences ne seront réalisées que si les effets thérapeutiques chez les mâles sont robustes.

Raffinement

Les animaux font l’objet d’un contrôle au moins quotidiennement par une personne compétente qui surveille posture, pelage, mobilité. Des points limites ont été définis qui permettent de s'assurer du suivi du bien-être animal. Afin de réduire la douleur, les animaux sont sous analgésie avant, pendant et après la phase opératoire qui est réalisée sous anesthésie générale. La température de l'animal est régulée lors de l'induction de l'anesthésie, de l'injection et du réveil de l'animal au moyen d'un tapis chauffant. Durant la chirurgie, une difficulté respiratoire est un point limite. Suite à la chirurgie, les animaux sont pesés quotidiennement pendant 3 jours. En cas de perte de poids, l’animal est pesé aussi les jours suivants, et de la nourriture est placée au fond de la cage, ainsi que de l'hydrogel. En cas d'infection au niveau de la suture de la peau une médication appropriée est appliquée. Les souris récupèrent au minimum 1 semaine avant les tests comportementaux. Les animaux sont habitués progressivement afin de réduire stress pouvant être induit par la manipulation, la contention et l’injection. L’utilisation d’une aiguille de taille minimale contribue à diminuer l’impact des injections. Les souris recevront l’injection d’un sédatif avant l'euthanasie pratiquée par une personne formée et réalisée dans le cadre réglementaire.

Choix des espèces

La souris est reconnue comme modèle animal idéal pour l'expérimentation et la translation vers les thérapies. Les régions cérébrales, les types de neurones et les circuits neuronaux ainsi que les mécanismes cellulaires de l'addiction sont largement conservés entre le rongeur et l'être humain. Les animaux seront au stade adulte, car notre projet vise à développer des approches thérapeutiques destinées aux patients adultes souffrant d'addiction.

La finalité déclarée est méthodologique, mettre au point et standardiser les tests auditifs eux-mêmes et harmoniser les pratiques entre expérimentateurs. 525 souris vont y être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue, aucune réutilisation n'étant prévue. Elles subissent des mesures auditives sous anesthésie générale jusqu'à six fois chacune, une chirurgie d'une heure pour implanter des électrodes sur le crâne, et pour certaines une exposition unique de deux heures à 100 décibels destinée à provoquer un traumatisme sonore. Le porteur annonce que l'harmonisation des protocoles "contribuera à limiter le stress ressenti par les animaux", dans le même document qui décrit le confinement, une hypothermie de un à deux degrés à l'induction de l'anesthésie et une désorientation de plusieurs heures au réveil.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’optimiser et/ou de mettre au point des tests de mesures auditives et vestibulaires sur les rongeurs. Pour certains tests, nous partons de zéro, tandis que d'autres sont déjà utilisés dans le cadre d'autres projets de l'établissement. Ces tests sont essentiels pour mieux comprendre les troubles auditifs et vestibulaires, qui peuvent aussi affecter les humains. Nous souhaitons : 1. Identifier les facteurs influençant les résultats des tests 2. Etablir des protocoles consensus et normaliser les pratiques pour les tests de phénotypage auditif et vestibulaire de base sur les rongeurs et pour l’application de traumatismes sonores Cette approche nous permettra d’améliorer l’accompagnement des expérimentateurs dans leurs travaux en permettant la transmission des bonnes pratiques associées aux tests auditifs, favorisant la transversalité entre recherche préclinique et clinique. Ces travaux contribueront à améliorer la compréhension et l’évaluation des atteintes sensorielles, ouvrant la voie à de futures stratégies de prévention et d’intervention.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des bénéfices directs pour la qualité et la fiabilité des recherches menées sur les troubles auditifs et vestibulaires. L’identification et la stabilisation des paramètres critiques qui influencent les tests permettront de réduire la variabilité des résultats, souvent liée à des différences dans les conditions expérimentales ou dans l’utilisation du matériel. En proposant des protocoles mieux maîtrisés, le projet contribuera à limiter le stress ressenti par les animaux, ce qui se traduit non seulement par une amélioration de leur bien-être, mais aussi par une meilleure qualité des données recueillies. Parallèlement, l’harmonisation des pratiques offrira un cadre plus clair pour la formation et l’accompagnement des expérimentateurs renforçant leur formation, leur autonomie et leur efficacité dans la conduite des expériences. Ce travail favorisera la mise en place de modèles expérimentaux plus robustes et plus représentatifs, capables de mieux prédire les phénomènes sensoriels étudiés. Cela constitue un enjeu majeur pour progresser dans la compréhension des troubles auditifs et vestibulaires, qui représentent une problématique importante de santé publique. En parallèle, l’amélioration de la reproductibilité et de la comparabilité des résultats obtenus entre différents laboratoires contribuera à réduire le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des données significatives. Le projet illustre la volonté de maximiser la valeur scientifique de chaque expérimentation tout en minimisant le recours et l’impact sur les animaux. Au-delà de l’amélioration immédiate des pratiques, le projet contribue à inscrire la recherche dans une dynamique durable et responsable, répondant aux attentes de la société en matière d’éthique et de transparence. En résumé, ce projet représente une opportunité importante pour : - Renforcer la qualité et la fiabilité des recherches actuelles, - Améliorer le bien-être des animaux utilisés, - Offrir une meilleure formation aux expérimentateurs, - et préparer des avancées scientifiques qui bénéficieront à terme à la santé humaine. Il constitue ainsi un levier pour faire progresser à la fois les pratiques expérimentales et les perspectives cliniques dans le domaine de l’audition et de l’équilibre.

Procédures

Tests auditifs standards réalisés sous anesthésie générale, d'une durée de 30 à 45 minutes, pouvant être répétés jusqu'à six fois par animal. Evaluation des réflexes acoustiques : un test réalisé une à deux fois par animal pendant 30 minutes sous sédation légère, un autre sur deux à trois sessions consécutives de 45 minutes sur animal éveillé, répétable sur plusieurs semaines. Induction d'un traumatisme sonore par exposition unique de deux heures à 100 décibels sur animal éveillé, suivie de contrôles auditifs post-exposition sous anesthésie générale. Intervention chirurgicale d'une heure sous anesthésie générale pour l'implantation d'électrodes sur le crâne, suivie d'enregistrements physiologiques de 30 minutes réalisés une à deux fois par animal sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Ce projet ne concerne que des procédures de classe légère et modérée. Bien que les techniques de mesure auditive soient qualifiées de non invasives, plusieurs effets indésirables ponctuels et réversibles peuvent survenir. La manipulation et la contention physique nécessaires au positionnement dans les cabines de test induisent un stress aigu caractérisé, une accélération du rythme cardiaque. Une anesthésie injectable est requise pour certains enregistrements, il peut survenir une dépression cardiorespiratoire transitoire, une hypothermie rapide (1 à 2 °C en quelques minutes) lors de l’induction, ainsi qu’une période de désorientation post-réveil pouvant aller jusqu’à quelques heures. Le confinement dans des espaces réduits par rapport à l’hébergement standard, combiné au transport entre animalerie et salle d’expérimentation (vibrations) génère un stress multisensoriel. Enfin, dans les rares cas où se déclareraient les critères d’arrêt prédéfinis: une perte de poids atteignant ou dépassant 10 % du poids initial traduisant une détresse métabolique et déshydratation, des altérations faciales (score de grimace modifié) révélant une souffrance douloureuse non contrôlée, un pelage hirsute témoignant d’une défaillance de régulation de la température corporelle ou nutritionnelle, et un retrait comportemental caractéristique d’une anxiété ou d’une détresse physiologique majeure.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront systématiquement euthanasiés. Aucune réutilisation ne sera envisagée, afin de garantir à la fois leur bien-être et l’absence de biais expérimental liés aux procédures déjà subies.

Remplacement

Plusieurs approches alternatives existent dans le domaine de l’audition, notamment les cultures cellulaires, les organoïdes, les modèles tissulaires ex vivo et les outils de modélisation informatique. Ces approches ne permettent pas de reproduire l’organisation multi-échelle et la dynamique fonctionnelle du système auditif. Les modèles cellulaires, tissulaires et organoïdes auditifs, ne permettent pas encore de simuler la complexité anatomique et physiologique du système auditif complet, ni de prendre en compte les réponses comportementales ou l’intégration corticale des sons. Quant aux modèles informatiques ou mathématiques, ils reposent sur des simplifications nécessaires qui ne capturent pas la totalité des processus physiopathologiques ni les réponses de l’organisme dans son ensemble. Ainsi, bien que ces alternatives contribuent à améliorer nos connaissances, elles ne suffisent pas à répondre aux objectifs visant à étudier le fonctionnement global du système auditif, l’évolution des atteintes auditives et l’évaluation de stratégies thérapeutiques dans un contexte physiologique réaliste. Dans ce cadre, l’utilisation d’animaux vivants demeure indispensable. Elle permet de travailler dans un environnement anatomique et biologique complet, de prendre en compte la variabilité interindividuelle et d’évaluer à la fois les réponses physiologiques et comportementales aux stimulations sonores ou aux traitements. La souris est particulièrement adaptée à ces recherches : son système auditif est proche de celui de l’homme, tant au niveau de l’organisation cellulaire et moléculaire que des mécanismes de transduction et de plasticité neuronale. De plus, la disponibilité de nombreuses lignées génétiquement modifiées permet d’explorer le rôle de gènes impliqués dans les surdités humaines, tandis que la rapidité de son cycle de vie et la standardisation des protocoles garantissent la reproductibilité et la robustesse des résultats.

Réduction

La stratégie expérimentale retenue pour ce projet a été conçue de manière à limiter au maximum l’utilisation d’animaux, tout en assurant la robustesse scientifique et la fiabilité des résultats. Le nombre d’animaux prévu a été déterminé à partir d’une analyse de puissance statistique. Nous utilisons la méthode adaptée aux données appariées. Cette approche permet d’estimer un effectif compris entre 10 et 15 animaux par groupe selon les procédures, garantissant un dimensionnement précis et évitant aussi bien la sous-utilisation que la surutilisation d’animaux. Tout au long du projet, l’inclusion des deux sexes est prévue afin d’éviter de multiplier les expérimentations futures et d’assurer la représentativité des résultats. L’ensemble des protocoles est conçu pour minimiser le stress et la souffrance des animaux, conformément au principe de raffinement, ce qui contribue également à obtenir des données de meilleure qualité.

Raffinement

Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement pris en charge. Selon la situation, des soins appropriés seront apportés (ajout du gel nutritif, maintien au chaud, soins locaux). Si nécessaire, une mise à mort sera effectuée afin d’éviter toute souffrance. L’emploi d’analgésiques et d’anesthésie sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des chirurgies de souris adultes. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront auscultés et pesés tous les jours par l’expérimentateur pendant une semaine détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort sur la base d’observations cliniques établies.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour ce projet en raison de leurs caractéristiques biologiques et comportementales qui permettent d’étudier de manière fiable les fonctions auditives et les réponses aux stimulations sonores. Leur petite taille, leur cycle de vie relativement court et la grande connaissance scientifique accumulée sur cette espèce facilitent la planification des suivis longitudinaux et le développement de méthodes reproductibles. Les souris utilisées dans ce projet auront entre 4 semaines et 5 mois. Elles seront assez âgées pour que l’audition soit pleinement développée, mais suffisamment jeunes pour que les fonctions auditives restent intactes et que les tests soient réalisables. Cela permet d’obtenir des résultats précis sur l’impact du bruit sur l’audition.

Jusqu'à quarante séances comportementales par animal, cinq par semaine pendant huit semaines, dont une qui dure quatre heures. 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour vérifier la position des implants et analyser leur cerveau. Avant cela, les souriceaux sont brièvement séparés de leur mère pour une biopsie de l'oreille destinée au génotypage, puis chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'une heure sous anesthésie profonde, le projet portant sur les effets aversifs des opiacés et la rechute. Le porteur justifie le choix de l'espèce par une lignée transgénique disponible seulement chez la souris et affirme qu'aucun autre animal ne permet une manipulation aussi précise de la zone cérébrale visée.

Objectifs

Le noyau tegmental rostromédian (RMTg) est une région du cerveau qui agit comme un frein naturel sur les neurones impliqués dans le circuit de la récompense. Ce circuit joue un rôle clé dans la manière dont nous ressentons le plaisir et la motivation, ainsi que dans la dépendance aux substances comme les opiacés. Jusqu’à récemment, il était difficile d’étudier cette région spécifiquement car il manquait d’outils précis. La découverte d’un marqueur génétique particulier, a permis de développer une lignée spéciale de souris qui permet une manipulation ciblée du noyau tegmental rostromédian. Notre projet cherche à mieux comprendre comment le noyau tegmental rostromédian régule l’équilibre entre sensations agréables et désagréables, influence les comportements addictifs, et agit sur la dopamine, une substance chimique clé du cerveau. Nous utiliserons pour cela des techniques innovantes permettant d’activer ou d’inhiber sélectivement les neurones du noyau tegmental rostromédian et d’observer les effets sur le comportement des souris. Ces recherches ouvriront de nouvelles pistes pour traiter les addictions en visant directement cette région du cerveau.

Bénéfices attendus

À l'issue de ce projet, nous espérons mieux comprendre le rôle du noyau tegmental rostromédian (RMTg) dans les comportements de type addictif et identifier un candidat clinique capable de réduire de manière significative les comportements addictifs sans compromettre les effets analgésiques de la morphine. Enfin de compte, ce programme de recherche débouchera sur une meilleure connaissance du noyau tegmental rostromédian (RMTg) et des potentiels cibles thérapeutique pour le traitement des troubles de l'usage des opiacés et d'autres troubles liés à l'utilisation de drogues d'abus.

Procédures

Une biopsie de l’oreille sur animal vigile pour permettre le génotypage des animaux transgéniques (1/2 minute). Une chirurgie unique sur animaux anesthésiés profondément (1 heure). D'un à 40 tests comportementaux de 6 minutes à une heure (avec un minimum de 24 heures entre chaque test)réparti comme suit : 5 sessions comportementales par semaine seront réalisées pendant 8 semaines (2 jours de repos par semaine), les sessions seront limitées à 60 minutes, sauf pour une session qui sera limité à 4 heures, après un délais de 4 semaines après la chirurgie.

Impact sur les animaux

Un stress induit par la séparation brève souriceaux/ mère, et une douleur légère due à la biopsie (durée 1heure). -Chirurgie : Après la chirurgie, Il existe aussi un risque d’inflammation de la plaie, d’infection et de douleur post-opératoire (durée 48 heures). -Tests : les tests comportementaux choisis ne posent aucun risque corporel pour l’animal. Les animaux peuvent également présenter des états de stress en lien avec les expérimentations (durée 24 heures).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de verifier l'emplacement des implants quand cela est nécéssaire et pour faire des analyses moléculaire sur les cerveaux.

Remplacement

Ce projet étudie une zone du cerveau appelée le noyau tegmental rostromédian, ou RMTg, qui joue un rôle important dans les comportements liés à la dépendance aux substances. Pour mieux comprendre ses fonctions, nous utilisons des souris comme modèle, car leur cerveau reproduit la complexité du cerveau humain, notamment les nombreuses interactions entre différentes régions cérébrales. Les modèles en laboratoire faits uniquement de cellules ne permettent pas d’étudier les comportements ni les interactions complexes entre les régions du cerveau. L’addiction agit justement sur ces réseaux neuronaux complexes, ce qui rend indispensable l’étude d’animaux vivants entiers pour mieux comprendre ses mécanismes. C’est pourquoi notre projet se concentre sur des organismes vivants afin de mieux cerner ces effets.

Réduction

Dans ce projet, nous utilisons le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir des résultats fiables, en tenant compte des différences naturelles entre les individus. Chaque groupe expérimental sera composé de 15 souris mâles et 15 femelles afin de pouvoir comparer les deux sexes. Même si cela double le nombre d’animaux, il est important d’étudier ces différences car la dépendance aux opiacés touche les hommes et les femmes de façon différente, et nous voulons mieux comprendre pourquoi. Cette approche permet aussi de valoriser pleinement tous les animaux issus de la reproduction. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques reconnues pour bien interpréter les effets observés.

Raffinement

Raffiner" : Nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés aversives des opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs. Enfin, lors de la réalisation de procédures chirurgicales, les animaux seront sous anesthésie générale profonde avec analgésie per et postopératoire (anesthésique local autour du site de chirurgie et traitement par un anti- inflammatoire non stéroïdien), et maintien de la température corporelle.De plus, des points limites seront déterminés avant et après les procédures chirurgicales afin d’apporter un suivi individuel à chaque animal permettant de limiter ou arrêter la souffrance de l’animal. . Du gel ophtalmique sera mis sur les yeux pendant la chirurgie, de plus les souris seront maintenues à la température corporelle par un tapis chauffant pendant toute la chirurgie et la phase de réveil. Avant de commencer les expérimentations les animaux seront habitués à l’opérateur, à la manipulation et aux dispositifs expérimentaux, pour réduire leur stress.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris car c’est aujourd’hui l’animal de laboratoire le plus courant pour étudier de nombreuses maladies grâce à la connaissance de son génome. La souris permet aussi de créer des lignées génétiquement modifiées, ce qui signifie que l’on peut changer un gène précis ou cibler certains neurones spécifiques. Pour notre étude, nous utilisons une souche spéciale, qui est uniquement disponible chez la souris. Ces souris, âgées de 8 semaines, nous permettent de manipuler uniquement les neurones d’une zone précise du cerveau, le RMTg, qui joue un rôle important dans la dépendance. Aucun autre animal ne permet d’utiliser cette technique aussi précise pour étudier les comportements liés à l’addiction. Nous choisissons des souris adultes de 8 semaines car les comportements complexes que nous voulons étudier nécessitent un cerveau mature. Pour ce projet, des animaux adultes, âgés de 8 semaines au début de l’expérience, seront utilisés puisque l’étude repose sur l’exploration de comportements complexes qui nécessitent des systèmes neurobiologiques matures.

Vingt-six semaines de régime gras et enrichi en cholestérol, puis cinq injections quotidiennes pour déclencher un diabète, avant d'être tuées sous anesthésie sans réveil pour le prélèvement de leur aorte ou d'un rein : c'est le parcours des souris donneuses de greffon. Les receveuses sont opérées de quarante-cinq à soixante minutes pour recevoir ce greffon, subissent une néphrectomie, jusqu'à soixante injections d'inhibiteurs et des prélèvements sanguins hebdomadaires à la lancette dans la joue, puis vivent seules en cage pour qu'elles ne rongent pas leurs sutures. 5 742 souris vont être utilisées au total dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, le porteur retenant surtout des mâles, "plus faciles à opérer du fait de leur grande taille", et comptant 10 % de mortalité périopératoire. Toutes sont tuées, les donneuses pour livrer leur organe, les receveuses pour l'analyse du greffon, du sang et des cellules immunitaires.

Objectifs

La transplantation d’organes est le traitement de référence en cas de défaillance chronique terminale d’un organe vital (rein, cœur, poumon, foie). Malgré le recours aux traitements immunosuppresseurs, la dysfonction chronique du greffon, se manifestant à partir d’un an après transplantation, demeure un problème médical majeur, limitant la longévité du greffon ainsi que la qualité et l’espérance de vie des patients transplantés. La vasculopathie de transplantation (VT) est une lésion fréquemment observée après la greffe, qui se traduit par une sténose des vaisseaux sanguins du greffon, entraînant un défaut d'approvisionnement en sang. Les signatures histologiques de la VT se retrouvent particulièrement dans le coeur et le rein greffés : dans 10-50 % des cas plus d’un an après la greffe rénale et avec une prévalence de 40 % 8 ans après transplantation cardiaque. La sévérité de la VT est notamment associée aux facteurs de risque cardiovasculaires classiques, dont le diabète. Ainsi plusieurs larges études récentes réalisées entre 1995 et 2019 et regroupant les données de plus de 200 000 patients, démontrent que les greffons rénaux provenant de donneurs diabétiques présentent une survie diminuée par rapport aux donneurs non diabétiques. Sachant qu’en 2045, 46 % de la population, donc des donneurs potentiels, sera diabétique, il est primordial de comprendre les mécanismes sous-jacents à la dysfonction des organes greffés issus de donneurs diabétiques. Ceci permettra d’augmenter le taux d’acceptation de ce type de greffons, ce qui élargira le pool de greffons disponibles et permettra de mieux prendre en charge les patients greffés avec des organes de diabétiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier des nouvelles cibles thérapeutiques pertinentes et efficaces pour prévenir le développement de la vasculopathie de transplantation, notamment lorsque les patients reçoivent un organe issu de donneur diabétique. Ceci permettra de rendre l’utilisation d’organes donneurs diabétiques plus sûre, et donc à la fois de diminuer le temps passé sur liste d’attente pour un greffon, et d’augmenter la qualité et la durée de vie des patients transplantés avec des greffons diabétiques.

Procédures

Tout ou partie des animaux enrolés dans les procédures seront soumis: 1/un régime enrichis en gras et cholestérol pendant 26 semaines 2/une chirurgie sans réveil : prélèvement du greffon aortique (30 min) 3/ une chirurgie avec réveil : implantation du greffon aortique (45 min) 4/ une chirurgie sans réveil : prélèvement du greffon rénal (45 min) 5/ une chirurgie avec réveil : implantation du greffon rénal (60 min) 6/des injections tous les jours pour induire un diabète (5 jours, 5 injections, durée: 30 sec) 7/ des injections tous les jours pour induire un diabète (2 jours, 2 injections, durée: 30 sec) 8/ des injections d'inhibiteurs de cibles thérapeutiques (15 jours, 15 injections, durée : 30 sec ou 1 mois, 30 injections, durée : 30 sec ou 2 mois, 60 injections, durée : 30 sec) 9/ des prélèvements sanguins sur le donneur de greffon (7 fois en 26 semaines, ou 6 fois en 6 semaines, durée : 5 sec) 10/ des prélèvements sanguins sur l'animal greffé (6 fois en 2 mois, durée : 30 sec) 10/un prélèvement sanguin le jour de la mise à mort sur animal anesthésié (durée: 1 min).

Impact sur les animaux

L’implantation du greffon aortique ou rénal (durées de la chirurgie : respectivement 45 et 60 min) ou la néphrectomie (15 min) sont des procédures de gravité modérée qui doivent être exécutées avec une technicité sans faille et dans le temps imparti afin d’éviter des complications, dont le décès périopératoire ou la douleur et le mal-être postopératoires. Les chirurgies peuvent entraîner une hypothermie (max. 12h) et une douleur post-opératoire (en général moins de 24h et max. 5 jours). Une perte de poids légère peut survenir après la chirurgie. La chirurgie peut causer un stress (max. 3 jours), et les points de suture sont un danger potentiel en cas de contact avec les pairs. Le prélèvement sanguin à la veine mandibulaire à l’aide d’une lancette de 5mm effectué de manière hebdomadaire pour les souris transplantées rénales entraîne une douleur légère et de courte durée.

Devenir

Les animaux donneurs de greffon sont mis à mort pour le prélèvement de leur greffon aortique ou rénal, utilisé pour être implanté aux animaux receveurs. Les animaux receveurs de greffon sont mis à mort pour analyse de la vasculopathie de transplantation sous l'impact du diabète du receveur, en combinaison ou non avec différents traitements ou modifications génétiques. Seront analysés les greffons ainsi que le sang et les cellules immunitaires des souris receveuses de greffon.

Remplacement

Notre équipe développe des modèles 2D et 3D de vaisseaux sanguins afin d’analyser et de modéliser les structures des artères, afin d’éviter d’avoir recours à des animaux quand cela est possible. Cependant, la vasculopathie de transplantation est un contexte pathologique complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires de la paroi vasculaire, le microenvironnement rénal, ainsi que des facteurs circulants, en particulier les cellules immunitaires. De ce fait, les mécanismes étudiés ne sont pas toujours modélisables in vitro, le recours aux modèles animaux est donc nécessaire et indispensable. De plus, dans notre contexte d’étude, une transplantation d’organes in vivo est la seule approche expérimentale permettant de mimer la transplantation d’organes chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum, en respectant les exigences des publications, sans nuire aux objectifs du projet et en garantissant des analyses statistiques de qualité . Par ailleurs, les expérimentations ont été optimisées de manière à regrouper les analyses sur un même animal chaque fois que cela est possible. Des groupes de 11 animaux sont requis pour obtenir une distribution normale, compenser la variabilité entre individus et tenir compte de la mortalité périopératoire (10%). La plupart des manipulations seront réalisées sur des souris mâles, plus faciles à opérer du fait de leur grande taille, et seuls les résultats les plus porteurs (espoir d’une nouvelle thérapie etc) seront validés sur des groupes de souris femelles. La transplantation rénale, plus lourde que la transplantation aortique, ne sera utilisée que pour la preuve de concept des résultats obtenus avec les transplantations aortiques. Le choix du groupe contrôle a été réfléchi afin de pouvoir le comparer à plusieurs groupes expérimentaux. Enfin, les tissus non prélevés chez l’animal pourront être récupérés par d’autres membres de l’équipe ou de l’institut pour optimiser la nécessité d’une mise à mort d’un animal.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées conformes aux normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement approprié (igloo, bâtonnets de bois, coton, sizzle nest) et un statut sanitaire sans pathogène fixe, contrôlé tous les trimestres. Les souris receveuses ayant reçu une greffe d’organe sont hébergées de manière individuelle afin d’éviter les accidents potentiels (grignotage des points de suture, compétition pour la nourriture). Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont mises en place. Les protocoles d’anesthésie utilisés lors des chirurgies sont éprouvés par notre équipe et ont été réfléchis en concertation étroite avec le vétérinaire. Ils garantissent la narcose, la myorelaxation et l’analgésie de manière stable. En particulier, un anti-douleur fort (opioïde de palier 3), agit au niveau de la moelle épinière et du cerveau, ce qui permet d’interférer à plusieurs niveaux du trajet de la nociception. Le cocktail anesthésique est antagonisé chez la souris receveuse à la fin de la chirurgie afin d’éviter le développement de l’hypothermie ou autres effets indésirables dus à une anesthésie trop longue (dépression respiratoire, cardiaque). A ce moment-là, une administration d'anti-douleur avec un temps d'action long prend le relais. Le personnel de zootechnie suit les animaux au quotidien et utilise une grille de scoring validé par la structure chargée du bien-être des animaux. Si un animal présente des signes cliniques comme la perte de poids, la prostration ou des blessures, l’état général pourra être évalué par la structure chargée du bien-être des animaux et le vétérinaire désigné pour décider des soins à mettre en place pour réduire le stress, la douleur, l’incofort de l’animal. Si l’état est jugé négatif, l’animal sera sorti de l’étude et mis à mort. Les procédures de mise à mort sont réalisées sous anesthésie et analgésie afin de diminuer au maximum la douleur des animaux. Des molécules analgésiques sont administrées en post-opératoire suite à la chirurgie et sont étendues jusqu’à 5 jours, jusqu’à rétablissement complet de l’animal. Des suppléments nutritionnels sont donnés aux animaux post-chirurgie pour faciliter l’accès à la nourriture et éviter une perte de poids. Si l’hyperglycémie des souris donneuses induit une diurèse plus fréquente, les litières seront changées plus fréquemment pour que les animaux aient un environnement propice au bien-être.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle expérimental pour lequel il existe des animaux génétiquement modifiés pour lesdifférentes cibles thérapeutiques étudiées dans ce projet. Du fait de sa petite taille et de son cycle de reproduction rapide, la production de générations successives facilite la mise en œuvre des protocoles expérimentaux. La souris possède également des paramètres physiologiques similaires à ceux de l'Homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude des pathologies chroniques, en particulier consécutives à la transplantation d’organes. Les animaux enrôlés dans les procédures seront âgés de 7 à 35 semaines. Il est nécessaire d’utiliser des animaux adultes avec un système vasculaire mature, donc des animaux de plus de 7 semaines. Dans la plupart des cas, les animaux utilisés auront entre 7 et 12 semaines, donc des jeunes adultes, ce qui permet de ne pas tenir compte du vieillissement. Lorsque les animaux donneurs de greffons seront soumis au protocole d’induction du diabète impliquant une mise sous régime spécial, ils seront utilisés à 33-35 semaines car leur régime alimentaire de type western diet dure 26 semaines.

Les souris qui perdent 15 % de leur poids, cessent de s'alimenter plus de vingt-quatre heures ou deviennent apathiques sont retirées de l'étude et tuées par dislocation cervicale. 106 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus. Certaines subissent une inoculation de bactéries directement dans une dent, refermée ensuite, sous anesthésie générale, d'autres un badigeonnage de la bouche cinq fois par semaine pendant cinq semaines, et une partie une chirurgie de réduction de l'estomac de trente à quarante-cinq minutes, avec un régime riche en graisses et des ponctions répétées à la veine de la queue. Les retombées annoncées, des tests salivaires et une médecine personnalisée pour les personnes obèses ou diabétiques, sont renvoyées au long terme, alors que la chirurgie de l'estomac et l'infection dentaire sont, elles, immédiates.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’étudier le rôle du microbiote oral dans l’aggravation des maladies cardiométaboliques et d’évaluer son influence sur la réponse au traitement chirurgical de l’obésité. Des données récentes suggèrent que la translocation bactérienne depuis la cavité buccale pourrait influencer la physiopathologie de pathologies telles que l’obésité, l’hypertension artérielle et le diabète de type 2. Ce projet propose une approche intégrée combinant modèle murin d’obésité, dysbiose orale induite et chirurgie bariatrique pour explorer ces interactions. Les objectifs spécifiques sont : • Analyser la composition et la dynamique du microbiote oral dans un contexte d’obésité induite par un régime riche en graisses. • Évaluer l’impact d’une dysbiose orale sur l’inflammation systémique et la régulation glucidique, en lien avec les paramètres métaboliques majeurs. • Étudier l’influence du microbiote oral sur l’efficacité métabolique de la chirurgie bariatrique, notamment sur la perte de poids et l’amélioration de la tolérance au glucose.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des avancées significatives dans la compréhension du rôle du microbiote oral dans les maladies cardiométaboliques, en explorant ses interactions avec l’inflammation systémique, la régulation glycémique et la réponse métabolique à la chirurgie bariatrique. À court terme, il fournira des données inédites sur l’impact d’une dysbiose orale sur la prise de poids, la tolérance au glucose et l’inflammation dans un contexte d’obésité induite par régime riche en graisses. L’intégration de la chirurgie bariatrique dans le protocole permettra d’évaluer l’influence du microbiote oral sur la variabilité interindividuelle des résultats post-opératoires. Grâce aux approches métagénomiques et métabolomiques, ce projet vise à identifier : • des signatures microbiennes spécifiques corrélées à l’aggravation des troubles métaboliques, • des biomarqueurs prédictifs de la réponse à la chirurgie. Ces connaissances permettront d’évaluer la pertinence du microbiote oral comme biomarqueur des complications métaboliques et ouvriront la voie à des stratégies de modulation ciblée (probiotiques, traitements antimicrobiens, hygiène bucco-dentaire optimisée). À long terme, ces données pourraient contribuer au développement d’outils diagnostiques non invasifs (tests salivaires) et à une médecine personnalisée, améliorant la prise en charge des patients obèses ou diabétiques

Procédures

Pendant l’étude, les souris subiront : • Colonisation buccale : -Option 1 – Badigeonnage buccal : application locale sur les joues et dents, 5 fois/semaine pendant 5 semaines (durée : 1 à 2 minutes par animal). -Option 2 – Inoculation intra-dentaire : acte unique sous anesthésie générale avec fermeture de la dent (durée : 10 à 15 minutes par animal). • Prélèvements sanguins : réalisés une fois par semaine (durée : 1 à 2 minutes par animal). • Prélèvements de salive : réalisés une fois par semaine (durée : 1 minute). • Mesures du poids : deux à trois fois par semaine (durée : moins d’1 minute par animal). • Tests de glycémie : plusieurs fois pendant l’étude, notamment avant et après certains tests (durée : 1 à 2 minutes par mesure). • Chirurgie gastrique (pour certains groupes) : réalisée sous anesthésie complète (durée : 30 à 45 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent principalement les interventions expérimentales et leur suivi : • Manipulations répétées (prise de poids, prélèvements sanguins) : induisent un stress modéré et une contention brève (quelques minutes), pouvant générer une anxiété transitoire (quelques minutes). • Administration orale (inoculation microbiote) : inconfort léger lors des instillations de l’inoculum bactérien, sans effets prolongés (quelques minutes) car acclimatation au geste au préalable et sans anesthésie générale. • Tests de tolérance au glucose (IPGTT) : ponctions répétées à la veine caudale, risque mineur d’hématome ou douleur locale, résolutifs en quelques heures. • Chirurgie bariatrique : Inconfort, voir douleur légère en phase postopératoire immédiate (24–72 h). Risques associés : perte de poids excessive, ralentissement de la reprise alimentaire, déshydratation. • Prélèvements terminaux : réalisés sous anesthésie profonde, sans douleur pour l’animal. • Régime gras prolongé : peut induire une diminution de mobilité et une surcharge pondérale, sans souffrance directe. Tous les animaux feront l’objet d’un suivi clinique renforcé et de points limites prédéfinis, afin d’interrompre ou adapter les procédures en cas de signes de détresse (perte de poids ≥15 %, apathie, altération de la prise alimentaire). En cas d’atteinte des points limites l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale.

Devenir

Les analyses prévues (tissus et organes) ne peuvent être réalisées que sur des animaux euthanasiés, afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Actuellement, aucune méthode in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière fiable la complexité des interactions entre microbiote oral, système immunitaire et métabolisme de l’hôte dans un contexte d’obésité et de chirurgie bariatrique. Les raisons principales sont : • Absence de modèles alternatifs intégratifs : les cultures cellulaires ou organoïdes ne permettent pas de simuler la circulation systémique, la translocation bactérienne et la réponse immuno-inflammatoire à l’échelle de l’organisme. • Complexité des interactions microbiote-hôte : la composition et la dynamique du microbiote dépendent de facteurs multiples (alimentation, état inflammatoire, chirurgie) qui ne peuvent être reproduits que dans un organisme vivant. • Objectifs du projet : évaluer l’impact d’une dysbiose orale sur la régulation glycémique, l’inflammation et la réponse métabolique à une chirurgie bariatrique nécessite une approche intégrée impliquant plusieurs organes et systèmes physiologiques. En conséquence, le recours à un modèle animal est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Les données obtenues serviront toutefois à alimenter des modèles prédictifs in silico, qui pourraient, à terme, réduire l’utilisation d’animaux dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d’animaux a été défini à partir : • d’un calcul de puissance statistique fondé sur les données de variabilité issues de notre étude pilote (et complétées par notre expérience en nutrition expérimentale. Ce calcul indique qu’au moins 10 animaux par groupe sont nécessaires pour détecter une différence significative sur les paramètres métaboliques (glycémie, inflammation systémique). • d’une marge de 10 % pour anticiper les pertes (points limites, complications postopératoires). Ainsi, nous retiendrons 12 animaux par groupe, pour un total de 105 animaux répartis en 4 groupes expérimentaux, ce qui assure la robustesse des résultats tout en respectant la règle des 3R. Mesures mises en œuvre pour réduire l’utilisation des animaux : • Suivi longitudinal des mêmes individus pour réaliser plusieurs mesures (poids, glycémie, prélèvements biologiques), réduisant le besoin de groupes supplémentaires. • Analyses multi-omiques sur les mêmes échantillons (métagénomique, métabolomique, marqueurs inflammatoires) pour maximiser l’information par individu. • Utilisation des données existantes et comparaisons avec des cohortes antérieures (approches de modélisation in silico en cours de développement), afin de limiter le recours à des expérimentations répétées. Ces pratiques garantissent que le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, tout en assurant une puissance statistique suffisante pour des résultats interprétables.

Raffinement

Afin de limiter la douleur, le stress et les complications, plusieurs mesures spécifiques seront mises en place en plus des obligations réglementaires : Gestion de la douleur et anesthésie • Utilisation systématique d’une anesthésie générale à l’isoflurane pour toute procédure invasive (inoculation orale sous sédation légère, chirurgie bariatrique). • Mise en place d’une analgésie multimodale pendant 3 jours après la chirurgie. • Surveillance renforcée des signes de douleur (score clinique) avec adaptation du traitement si nécessaire. Soins postopératoires et surveillance accrue • Suivi clinique biquotidien pendant les 72 heures postopératoires, puis quotidien jusqu’à cicatrisation complète. • Maintien sur tapis chauffant en phase de réveil et mise à disposition de gel oculaire pour prévenir les lésions cornéennes. • Mise à disposition d’une alimentation enrichie (gel diet) et eau gélifiée pour favoriser la reprise alimentaire. • Réhydratation sous- cutanée (deux fois par jour) si signes de déshydratation ou perte de poids postopératoire. Surveillance du poids et critères d’arrêt • Pesée au minimum 2 à 3 fois par semaine pendant toute la durée du protocole (au lieu d’une fois toutes les deux semaines). • Points limites précoces : retrait de l’étude si perte de poids ≥15 % par rapport au poids initial, altération de la mobilité, anorexie >24 h. Autres mesures de raffinement • Hébergement en groupes homogènes (même sexe) pour éviter les conflits. • Utilisation d’isolateurs ventilés (IVC) pour réduire le risque infectieux, notamment chez les souris transgénique à déficit immun. • Manipulations réalisées en poste de sécurité microbiologique (PSM) pour limiter le stress et garantir l’asepsie. • Aucun transport inter-établissement. Outils d’évaluation • Application d’une grille d’évaluation clinique incluant score de douleur, état du pelage, posture, activité et hydratation, pour ajuster les soins et déclencher les points limites. Ces mesures permettent de réduire la douleur et le stress, d’assurer une récupération rapide après chirurgie et de maintenir un haut niveau de bien-être tout au long du protocole expérimental.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce la plus pertinente pour ce projet car : •Microbiote comparable à celui de l’Homme : le microbiote intestinal et buccal de la souris présente une composition et une diversité proches de celles observées chez l’Homme, permettant des études translationnelles fiables. •Contrôle des variables expérimentales : la souris offre des conditions expérimentales homogènes (statut génétique, alimentation, environnement), indispensables pour analyser l’impact spécifique du microbiote oral sur les paramètres métaboliques et la réponse à la chirurgie bariatrique. •Adaptation aux approches multi-omiques : la taille de l’animal permet la réalisation de prélèvements biologiques et tissulaires multiples (sang, salive, organes), nécessaires pour les analyses métagénomiques, métabolomiques et immunologiques prévues. L’étude sur ces espèces permettra de comparer un contexte immunocompétent et un contexte d’immunité adaptative altérée, garantissant la robustesse des conclusions sur le rôle des réponses immunitaires dans les interactions microbiote/métabolisme.

Une minipompe implantée sous la peau du dos infuse en continu de la bléomycine pendant six semaines, jusqu'à épaissir la peau comme dans la sclérodermie et parfois atteindre les poumons. 3 000 souris vont subir ce protocole dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec des pesées quotidiennes, jusqu'à dix prélèvements sanguins et des administrations de composés pouvant aller jusqu'à deux fois par jour. Le porteur écrit que la gestion de la douleur est délicate parce que certains analgésiques pourraient fausser les résultats, et s'en remet à une surveillance quotidienne avec retrait de l'étude en cas de détresse. La mise à mort finale se fait par ponction cardiaque sous anesthésie, sans réveil, pour prélever les organes et mesurer les biomarqueurs.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de tester l’efficacité de nouveaux traitements contre la sclérodermie systémique, une maladie auto-immune rare mais grave qui provoque un durcissement progressif de la peau et des organes internes comme les poumons, le cœur ou les reins. Cette affection touche principalement les femmes entre 45 et 65 ans et entraîne des douleurs, une perte de mobilité, une baisse de qualité de vie et un risque élevé de mortalité. En France, on estime qu’entre 6 000 et 9 000 personnes en souffrent, et malgré les traitements actuels qui visent à soulager les symptômes et ralentir la progression, il n’existe aucun remède capable d’inverser la fibrose, principal facteur de gravité. Les options disponibles, comme les immunosuppresseurs ou les antifibrosants, offrent des résultats limités, ce qui rend urgent le développement de thérapies innovantes ciblant les mécanismes précoces de la maladie et la fibrose. Notre projet consiste à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques dans un modèle expérimental chez la souris, reproduisant la fibrose systémique grâce à une infusion continue de bléomycine, afin d’identifier des solutions plus efficaces qui pourraient transformer la prise en charge et améliorer la survie et la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Les études prévues dans ce projet serviront à tester si de nouveaux médicaments peuvent être efficaces contre la fibrose systémique. À court terme, elles permettront de décider de la suite du projet : si les résultats sont insuffisants, nous chercherons à améliorer le médicament (par exemple en modifiant sa structure pour qu’il agisse mieux), ou nous arrêterons le projet. Si les résultats sont encourageants, nous passerons à l’étape suivante, qui consiste à vérifier comment le médicament se comporte dans l’organisme et s’il est bien toléré. À plus long terme, ces recherches aideront à déterminer les doses à utiliser chez les patients et, nous l’espérons, à proposer un traitement efficace et mieux toléré pour les personnes atteintes de sclérodermie systémique.

Procédures

• Les gestes techniques concernent tous les animaux. • Pesées : Durée 30 secondes, sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour pendant 6 semaines. • Implantation d’une minipompe osmotique en sous-cutanée sous anesthésie générale gazeuse. Durée 5 minutes. 1 fois par animal. • Prélèvements de sang via la veine caudale, saphène ou mandibulaire : Durée 30 secondes, sur animal vigile ou sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. Jusqu’à 10 fois par animal. • Prélèvement de sang terminal par ponction cardiaque : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. 1 fois par animal. Sans réveil. •​Administrations des composés à potentiel thérapeutique : Durée 10-30 secondes, 1 fois par semaine à 2 fois par jour, pendant 6 semaines, sur animal vigile ou anesthésié selon voie d'administration.

Impact sur les animaux

Pour provoquer la fibrose cutanée, une petite pompe est implantée sous la peau du dos des souris afin d’infuser en continu une solution qui entraîne un épaississement localisé de la peau, similaire à ce qui se produit dans la sclérodermie, et parfois une atteinte légère des poumons. Les animaux peuvent perdre du poids de manière transitoire et présenter des signes d’inconfort liés à l’inflammation et à l’épaississement cutané. Ce modèle est considéré comme étant de gravité modérée selon les normes du bien-être animal. La gestion de la douleur est délicate, car certains analgésiques pourraient fausser les résultats. Les animaux sont donc surveillés quotidiennement et retirés de l’étude en cas de détresse.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour permettre le prélèvement des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses comme le dosage de biomarqueurs et les paramètres pharmacocinétiques.

Remplacement

Notre analyse des recherches existantes montre qu’il n’existe pas aujourd’hui de systèmes mathématiques ou de modèles en laboratoire capables de reproduire toute la complexité de la sclérodermie systémique et d’évaluer correctement l’effet de nouveaux traitements. Les modèles les plus avancés, comme les organoïdes, ne représentent que des versions simplifiées d’organes, alors que cette maladie touche plusieurs tissus et organes (vaisseaux, peau, poumons, reins, système immunitaire, sang…). Pour comprendre ces interactions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal. Cependant, nous limiterons autant que possible le recours à l’animal en nous appuyant sur des études réalisées sur des cellules en culture et d’autres systèmes en laboratoire. L’utilisation d’animaux reste une étape indispensable pour vérifier l’efficacité des nouveaux traitements avant de passer à des essais chez des volontaires sains, puis chez des patients

Réduction

Avant d’être testés chez l’animal, les médicaments candidats passent par une série de tests en laboratoire et in silico. Ces tests permettent de vérifier comment le médicament se comporte (par exemple, s’il peut être bien absorbé et distribué dans l’organisme) et s’il agit sur la cible prévue. Seuls les candidats les plus prometteurs sont retenus pour les études chez l’animal, ce qui augmente les chances d’obtenir des résultats utiles. Le nombre d’animaux utilisés est calculé à partir de données scientifiques et de méthodes statistiques pour garantir que les résultats soient fiables tout en limitant le recours à l’animal. Les mesures comme l’épaisseur de la peau ou certains marqueurs biologiques seront analysés avec des outils statistiques afin de confirmer que les différences observées entre les groupes sont réelles et non dues au hasard. Cette approche rigoureuse est essentielle pour valider l’efficacité des traitements avant de passer aux étapes suivantes de développement.

Raffinement

Toutes les procédures susceptibles d’induire douleur ou stress seront réalisées sous anesthésie afin de prévenir toute souffrance. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel qualifié, sous la responsabilité du vétérinaire désigné. Des soins appropriés seront administrés en cas de besoin. Tout animal présentant des signes de détresse sera retiré de l’étude et euthanasié conformément à la réglementation en vigueur. Le nombre de manipulations sera limité au strict nécessaire afin de réduire le stress, susceptible d’altérer la qualité des données. Des critères d’arrêt prédéfinis permettront d’interrompre l’expérimentation avant l’apparition de douleurs ou lésions irréversibles. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes aux prescriptions réglementaires et aux recommandations en matière de bien-être (température, hygrométrie, cycle lumineux). La taille des groupes sera adaptée à la souris et donc à son comportement social, afin de favoriser les interactions naturelles et prévenir l’isolement ou la surpopulation. Des dispositifs d’enrichissement environnemental seront mis en place pour stimuler les comportements exploratoires et réduire le stress. Ces mesures visent à garantir le respect des principes de raffinement tout en assurant la fiabilité scientifique des résultats.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés en recherche médicale et pharmaceutique ont été développés chez le rat et la souris. Ces espèces sont les plus couramment utilisées car elles permettent d’obtenir des résultats fiables tout en limitant la douleur et la souffrance, conformément à l’article R.214-106 du Code rural. De nombreuses données existent déjà dans la littérature sur les modèles de maladies auto-immunes chez la souris, notamment pour la sclérodermie systémique, ce qui facilite la mise en place des protocoles et l’interprétation des résultats. L’utilisation de la souris, espèce bien caractérisée et adaptée aux études précliniques, répond ainsi à l’exigence de choisir les animaux les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants tout en minimisant les dommages durables. Les données de la littérature indiquent que la sclérodermie systémique expérimentale peut être induite chez la souris adulte, généralement entre 6 et 12 semaines d’âge. Ce stade est choisi pour des raisons scientifiques : il correspond à un organisme pleinement développé, avec un système immunitaire mature et une physiologie stable, ce qui est indispensable pour reproduire les mécanismes complexes de la maladie et évaluer la réponse aux traitements. L’utilisation de souris adultes permet également de limiter la variabilité liée à la croissance ou à l’immaturité des organes, garantissant ainsi la fiabilité des résultats tout en respectant le principe de réduction et de pertinence scientifique.

Pour reproduire une dégénérescence de la cornée provoquée par la section des nerfs qui l'innervent, 600 souris et 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les nerfs ciliaires d'un œil sont sectionnés sous anesthésie générale, puis chaque animal reçoit des collyres jusqu'à six à huit fois par jour pendant une à quatre semaines, des injections intra- ou péri-oculaires parfois quotidiennes et un prélèvement sanguin hebdomadaire, avec examens à la lampe à fente, esthésiométrie et imagerie cornéenne. Une centaine d'animaux écartés avant l'induction pourront être réutilisés dans d'autres protocoles, tous les autres sont tués pour des analyses histologiques et biochimiques. Le porteur annonce une kératite pouvant aller jusqu'à l'ulcération et une opacification de la cornée, et écrit dans le même paragraphe que ces manifestations ne devraient pas générer de douleur manifeste après le réveil.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est de développer un modèle expérimental de kératopathie neurotrophique chez le rongeur afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la dégénérescence cornéenne liée à une altération de l’innervation sensitive. La kératopathie neurotrophique est une affection rare mais sévère de la cornée, résultant d’un dysfonctionnement du nerf trijumeau, et observée dans diverses pathologies humaines telles que l’herpès oculaire, le diabète, ou après des interventions neurochirurgicales. Les modèles développés permettent de reproduire de manière contrôlée une dénervation cornéenne, entraînant une perte de trophicité, une altération de la cicatrisation épithéliale, une inflammation chronique et une apoptose des cellules épithéliales. L’activation des cellules immunitaires locales et la perturbation de l’homéostasie des cellules de la cornée contribuent à la progression de la maladie. Ces modèles offrent une plateforme pertinente pour l’analyse des voies de signalisation impliquées dans la régénération nerveuse, la réponse inflammatoire et le stress oxydatif. Ils permettent également d’évaluer l’efficacité de stratégies thérapeutiques neuroprotectrices, régénératives ou anti-inflammatoires, en amont d’études cliniques. En résumé, ces modèles constituent un outil essentiel pour mieux comprendre la physiopathologie de la kératopathie neurotrophique et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est la mise au point de modèles expérimentaux robustes permettant d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques visant à préserver ou restaurer l’intégrité cornéenne après une dénervation. La kératopathie neurotrophique (KN) constitue une pathologie sévère, souvent consécutive à des atteintes du nerf trijumeau, et pour laquelle les options thérapeutiques restent limitées. Il est donc essentiel de disposer de modèles fiables reproduisant les mécanismes physiopathologiques observés chez l’humain, afin de tester ces traitements dans des conditions rigoureuses et contrôlées, tout en respectant les principes du bien-être animal. Ces modèles permettront de simuler les altérations cornéennes caractéristiques de la KN, telles que la perte de sensibilité, la diminution de la sécrétion lacrymale et la dysfonction épithéliale. Ils offriront la possibilité d’évaluer avec précision l’effet des traitements sur la régénération nerveuse et la cicatrisation épithéliale. Ces études contribueront à identifier les molécules les plus prometteuses, à optimiser les schémas posologiques et à approfondir la compréhension des mécanismes d’action, tout en garantissant une approche éthique et conforme aux standards réglementaires.

Procédures

Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à différentes interventions réparties sur une période de 1 à 4 semaines, selon les objectifs et les résultats obtenus avec les traitements testés, parmi lesquelles : 1. La procédure chirurgicale d’induction de la pathologie avec lésion mécanique unilatérale des nerfs ciliaires. Durée estimée à 10 minutes sous anesthésie générale avec prémédication d’une analgésie administrée en sous-cutanée. 2. Les examens ophtalmologiques : . Comme l’observation à la lampe à fente, le prélèvement des larmes par capillarité et l’esthésiométrie réalisés en baseline, au premier, troisième, cinquième, septième et quatorzième jour après l’induction. La durée de ces examens ne dépasse pas cinq minutes par animal : . Comme la tomographie en cohérence optique (OCT) ou microscopie confocale in vivo seront réalisées avant l’induction et une fois par semaine. Ces deux examens se font après une anesthésie légère afin d’immobiliser l’animal et permettre l’obtention de résultats interprétables. 3. Les administrations de traitements comme : . Les instillations topiques (collyres) durent d’une à deux minutes par application sur animal vigile à une fréquence de trois fois/jour en moyenne (max. six à huit fois/jour) sur la durée totale de l’étude à savoir 1 à 4 semaines ; . Les injections intra- ou péri-oculaires sous anesthésie locale et générale qui ne durent que quelques minutes et peuvent être quotidiennes, comme les injections systémiques sur animal vigile et réparties sur l’ensemble de l’étude à savoir 1 à 4 semaines. 4. Les prélèvements sanguins généralement réalisés une fois par semaine sur animal vigile sont définis en fonction du volume de prélèvement et du temps de récupération de l’animal. Ce prélèvement veineux est rapide puisqu’il ne dure qu’une à deux minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables anticipés dans le cadre de ce projet sont considérés comme modérés. Les données issues de la littérature et des expériences antérieures indiquent que les manifestations les plus fréquentes incluent : une hyperémie conjonctivale liée à une inflammation locale modérée, notamment après les procédures d’induction ou d’administration; un saignement léger et transitoire au site d’incision ou d’injection; des troubles cornéens, tels qu’une opacification, une kératite superficielle à profonde avec ulcération. Une perte de sensibilité cornéenne induite par la dénervation est également attendue et constitue un élément central du modèle. Elle peut aussi s’accompagner d’une diminution de la sécrétion lacrymale et d’une altération de la cicatrisation épithéliale. Toutes ces manifestations ne devraient pas générer de douleur manifeste après le réveil de l’animal, conformément aux observations des modèles de référence et qu’une prémédication analgésique pourra être administrée pour limiter d'éventuelle douleur. Les examens et administrations nécessitent une contention brève, pouvant induire un stress ponctuel de quelques minutes. Des mesures spécifiques (habituation, manipulation douce, environnement calme) seront mises en place pour limiter cet impact. Les procédures plus invasives, telles que les injections péri-oculaires ou les examens nécessitant une immobilisation prolongée, seront réalisées sous anesthésie légère afin de garantir le confort de l’animal. Ces anesthésies peuvent occasionner une gêne transitoire mais ne présentent pas de risque significatif à long terme.

Devenir

À l’issue de la procédure expérimentale, tous les animaux ayant suivi l’intégralité du protocole seront euthanasiés de manière éthique et réglementée, afin de permettre la réalisation des analyses ex vivo nécessaires à la validation des résultats scientifiques (analyses histologiques, dosages biochimiques, études moléculaires, etc.). Cependant, les animaux n’ayant pas été inclus dans la totalité de la procédure — estimés à environ 10 %, hors exclusions liées aux points limites — pourront être réutilisés dans d’autres protocoles expérimentaux compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Ces animaux sont généralement exclus en raison d’un défaut anatomique ou physiologique détecté lors des examens de baseline, notamment au niveau de l’œil, avant le début de l’induction de la pathologie. Ces individus n’auront reçu ni induction de la kératopathie neurotrophique, ni administration de traitement, mais auront uniquement été soumis à des examens non invalidants, parfois réalisés sous anesthésie légère. Leur réutilisation, lorsqu’elle est possible, s’inscrit dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R, tout en garantissant le respect du bien-être animal et des exigences scientifiques.

Remplacement

L’œil est un organe sensoriel d’une grande complexité, composé de structures anatomiques et physiologiques très diverses (cornée, cristallin, rétine, nerf optique...), interagissant de manière dynamique avec leur environnement local et systémique. Il est soumis à des variations mécaniques, physicochimiques et biologiques constantes, qui influencent directement sa fonction et sa réponse aux traitements. Bien que des méthodes alternatives aient été développées ces dernières années, telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modélisations in silico, ces approches, bien qu’utiles, ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions fonctionnelles et pharmacocinétiques observées dans un œil vivant. En particulier, elles ne permettent pas de simuler de manière fiable les effets de la dénervation sensitive, les altérations de la cicatrisation cornéenne, ni les réponses neurodégénératives complexes impliquées dans la kératopathie neurotrophique. Dans ce contexte, le recours à un modèle animal reste actuellement indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, notamment pour : 1. Reproduire fidèlement les conditions pathologiques de la kératopathie neurotrophique, 2. Évaluer l’efficacité et la tolérance de nouvelles approches thérapeutiques dans un organisme vivant, 3. Étudier les effets à long terme sur la cornée et les structures nerveuses associées dans un environnement physiologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques liés à l’expérimentation animale, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour permettre une analyse fiable et reproductible des résultats et déterminer l’effectif optimal nécessaire à la détection d’un effet significatif. Ce calcul permettra, le cas échéant, d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Dans une démarche active de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs stratégies complémentaires seront mises en œuvre. L’utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie, telles que l’imagerie cornéenne en temps réel (OCT, microscopie confocale), permettra de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, évitant ainsi la nécessité de sacrifices à chaque point d’analyse. Lorsque cela est scientifiquement pertinent, les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, l’optimisation des protocoles expérimentaux (standardisation des conditions d’induction de la dénervation, contrôle rigoureux des paramètres environnementaux et biologiques) contribuera à limiter la variabilité interindividuelle et à maximiser la robustesse des résultats. Enfin, une attention particulière sera portée à la formation des opérateurs et à la qualité des soins apportés aux animaux, afin de garantir leur bien-être tout au long de l’étude.

Raffinement

Un suivi quotidien rigoureux des animaux sera assuré tout au long des études afin de détecter rapidement tout signe de stress, d’inconfort ou d’effet indésirable lié aux procédures expérimentales. Cette surveillance permettra une intervention rapide et adaptée, conformément à des points limites prédéfinis, conçus pour être précoces, prédictifs et spécifiques à la pathologie étudiée. Ces points limites visent à réduire toute douleur potentielle et à garantir une prise en charge éthique et réactive des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages enrichies, avec accès libre à la nourriture et à l’eau (ad libitum). L’environnement sera optimisé par des abris, des matériaux à ronger et des structures d’exploration favorisant le bien-être psychologique et comportemental. Une attention particulière sera portée à la qualité des conditions d’hébergement, à la réduction du stress et à la stimulation des comportements naturels. Dans le cadre du projet, une anesthésie générale sera indispensable lors des chirurgies d’induction afin d’assurer l’immobilité de l’animal. Elle pourra être complétée par une anesthésie locale si nécessaire. Une prémédication analgésique sera administrée pour limiter la douleur, et une antibioprophylaxie locale pourra être appliquée au niveau de l’œil ou de l’incision en cas de risque infectieux. Les examens destinés à évaluer la kératopathie neurotrophique seront principalement non invasifs et similaires à ceux pratiqués en ophtalmologie humaine ou vétérinaire, tels que l’imagerie cornéenne, la mesure de la sensibilité cornéenne et l’évaluation de la cicatrisation épithéliale. Ces techniques permettront des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, réduisant le nombre d’animaux nécessaires et évitant leur euthanasie à chaque point d’analyse. Lorsque l’immobilité est requise, une anesthésie légère et courte pourra être administrée pour assurer le confort et limiter le stress. Après chaque anesthésie, les animaux seront sous environnement chauffant pour prévenir l’hypothermie. Une hydratation locale sera réalisée sur les cornées jusqu’au réveil afin d’éviter les complications oculaires. Les animaux seront ensuite replacés dans leur environnement habituel pour réduire le stress post-manipulation. Ce projet a été validé par un comité d’éthique sera suivi par la structure en charge du bien-être animal.

Choix des espèces

Les espèces sélectionnées pour ce projet, le rat et la souris, présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques bien documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, notamment dans le contexte des pathologies cornéennes telles que la kératopathie neurotrophique. Ces deux espèces sont couramment utilisées dans les modèles expérimentaux validés de dénervation cornéenne et de régénération nerveuse, et leur emploi repose sur une expérience étendue au sein de la communauté scientifique. Leur utilisation permet une grande flexibilité expérimentale, notamment en termes de suivi longitudinal, d’imagerie cornéenne et de quantification des marqueurs moléculaires. L’expérience accumulée avec ces modèles garantit la reproductibilité des résultats, la comparabilité avec d’autres études précliniques, et la pertinence des données obtenues pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Le choix de ces espèces s’inscrit dans une démarche scientifique rigoureuse, éthique et translatoire, visant à maximiser la qualité des résultats tout en respectant les principes de l’expérimentation animale. Les animaux utilisés dans ce projet seront des jeunes adultes, âgés d’au minimum 6 semaines pour les rats et d’environ 5 à 6 semaines pour les souris, correspondant à une maturité fonctionnelle et physiologique des structures cornéennes et nerveuses impliquées dans la kératopathie neurotrophique. Ce stade de développement garantit une réponse cohérente aux protocoles d’induction de la pathologie, ainsi qu’une meilleure reproductibilité des résultats. Le choix de cette tranche d’âge permet également d’éviter les biais liés à la croissance ou à la sénescence, tout en assurant une bonne tolérance aux procédures expérimentales.