Souris

Un cathéter est glissé dans l'urètre de souris et de rats anesthésiés, puis une bactérie est injectée directement dans leur vessie. 480 souris et 480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des traitements une à trois fois par jour pendant trente jours au maximum, avec jusqu'à deux séjours de 48 heures en cage individuelle et un prélèvement de sang par semaine, pour tester des candidats médicaments contre les infections urinaires. Le porteur chiffre l'inconfort du cathéter à trois minutes et la douleur des piqûres à cinq secondes, tout en décrivant par ailleurs la fièvre, la perte de poids, la baisse de la prise alimentaire et la détresse respiratoire que provoque l'infection.

Objectifs

Les infections urinaires figurent parmi les infections bactériennes les plus fréquentes, constituant un problème de santé publique majeur. La prévalence est très élevée, touchant plus de 150 millions de personnes par an dans le monde, avec une incidence particulièrement forte chez les femmes. Les solutions thérapeutiques existantes reposent principalement sur les antibiotiques, le choix dépendant du type et de la gravité de l'infection (cystite, pyélonéphrite). La nécessité de nouveaux traitements est urgente, car l'efficacité des antibiotiques actuels est rapidement compromise par l'évolution de la résistance aux antimicrobiens. Les recherches se concentrent sur des alternatives comme les vaccins, la thérapie par phages et les agents anti-virulence. L'objectif est de trouver des solutions à long terme, non-antibiotiques de préférence, pour gérer les infections urinaires récidivantes et préserver l'efficacité des traitements de dernier recours. Le projet propose l’évaluation préclinique de candidats médicaments pour déterminer leur efficacité contre des agents pathogènes responsables des infections urinaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont multiples avec un impact significatif sur la santé humaine. En caractérisant de nouveaux candidats médicaments, le projet vise à répondre à des besoins non satisfaits dans la lutte contre les infections urinaires, en particulier face à la résistance antimicrobienne. Le projet permettra de développer de nouveaux traitements ciblant plus efficacement les infections, en particulier dans les contextes où les thérapies actuelles échouent. Ce projet pourrait améliorer la gestion des infections résistantes et des cystites/pyélonéphrites difficiles à traiter.

Procédures

Pose d'un cathéter dans l'urètre sur animaux anesthésiés-3 min: 1 fois (modèle aigu) ou 2 fois (modèle chronique) au cours de leur vie. Les animaux seront infectés 1 fois (modèle aigu) ou 2 fois (modèle chronique) avec le germe pathogène par administration intra-vésicale sous anesthésie (1 min). Les animaux feront au maximum 2 sessions de 48 h en hébergement individuel et seront traités 1 à 3 fois par jour (selon les voies d'administrations) pendant 30 jours consécutifs maximum. Temps requis pour les différentes voies d’administration : Orale-10 à 20 secondes ; Intraveineuse - 30 secondes à 1 minute ; Sous-Cutanée- 5 à 10 secondes ; Intrapéritonéale- 5 à 10 secondes. Au maximum un prélèvement de sang hebdomadaire sur animaux anesthésiés. Le temps nécessaire pour effectuer un prélèvement de sang dans la veine caudale pour chaque souris est de 3-5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances principales concernent la douleur et l'inconfort induits par les injections, les inflammations, l'infection et l'isolement en hébergement individuel. L'anesthésie gazeuse induit un stress de courte durée (15 secondes). Les piqûres d’aiguille pour traiter les animaux entraînent une douleur légère de courte durée (5 secondes). L'installation d’un cathéter intraurétral peut induire une inflammation locale de la vessie, causant un léger inconfort temporaire (3 minutes). L'infection par les agents pathogènes induit la pathologie avec des symptômes potentiels comme la fièvre, la perte de poids, la diminution de la prise alimentaire et hydrique, détresse respiratoire et une mobilité réduite. L’isolement en hébergement individuel pendant 48h peut être perturbant pour les animaux et induit un stress.

Devenir

A la fin de chaque procédure tous les animaux sont mis à mort et des prélèvements d'organes et de sang sont réalisés pour des mesures de charge microbienne, de paramètres inflammatoires ou des études d'histologie.

Remplacement

Préalablement à toute utilisation d'animal, nous intégrons dans nos projets des modèles cellulaires in vitro, et 3D tissulaires, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d’optimiser les essais précliniques. Ces alternatives non animales ne peuvent pas remplacer totalement les tests sur les animaux utilisés dans ce projet dans lequel un des paramètres analysés est la fréquence et le volume d’urine produite.

Réduction

Le premier principe de réduction du nombre d’animaux sera appliqué via l'intégration dans ce projet, préalablement à toute utilisation d'animal, de modèles cellulaires et tissulaires. Le principe de réduction du nombre d’animaux sera appliqué aussi via l’estimation du nombre d’animaux permettant de garantir l’interprétabilité des résultats. L'estimation du nombre d'animaux nécessaire se fait par un calcul de puissance statistique: 12 animaux seront inclus par lot. En combinant ces approches, nous réduisons les expérimentations animales, tout en garantissant la précision des résultats.

Raffinement

La fréquence de surveillance des animaux est essentielle pour garantir leur bien-être. Les signes de détérioration de l’état de santé, tels que perte de poids, fièvre, modifications de la mobilité, ou respiration laborieuse, sont particulièrement surveillés. Si des signes de stress apparaissent, nous ajusterons l'environnement pour améliorer le bien-être des souris et notamment stimuler leurs sens et leurs comportements naturels. Nous augmenterons l’enrichissement physique par l’apport de cachettes (boîtes, tunnels) et de matériaux pour la construction de nids (papier déchiqueté, fibres) ainsi que l’enrichissement sensoriel par la modification régulière de la disposition de leur cage et des éléments à l’intérieur de la cage pour offrir de la nouveauté. L'introduction de nouveaux enrichissements se fera progressivement pour éviter un stress supplémentaire. Des critères d'arrêt stricts sont définis pour éviter la souffrance des animaux. L’objectif est de garantir que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux à chaque fois que cela sera nécessaire.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles pertinents pour la caractérisation pré-clinique de molécules ciblant les infections urinaires pour des raisons principalement liées à ses caractéristiques biologiques, et notamment en raison de : (i) la similitude anatomique et physiologique des systèmes humain et murin. L'anatomie du système urinaire du rongeur (reins, uretères, vessie, urètre) est suffisamment similaire à celle de l'humain pour permettre l'étude de la progression de l'infection et de la réponse de l'hôte. (ii) Les mécanismes d'infection : Les souches bactériennes responsables des infections urinaires chez l'homme, notamment E. coli , peuvent être utilisées pour infecter la vessie et/ou les reins de la souris et du rat, reproduisant ainsi les stades d'infection (cystite, pyélonéphrite) et les mécanismes de virulence clés, comme la formation de communautés bactériennes intracellulaires dans les cellules de la vessie. Des animaux adultes seront utilisés afin de mimer au mieux la pathologie humaine : • Âge le plus touché : Les infections urinaires sont beaucoup plus fréquentes chez les femmes adultes en bonne santé que chez les enfants. Utiliser des animaux adultes permet de modéliser l'âge où la maladie est la plus prévalente chez l'humain. • Maturation du Système Urinaire : Le tractus urinaire d'un rongeur adulte est anatomiquement et physiologiquement plus proche de celui d'un humain adulte que celui d'un animal juvénile. La structure et la fonction de la vessie et des voies urinaires sont complètement développées et matures. • Réponse Immunitaire Mature : Les infections urinaires impliquent une réponse immunitaire complexe de l'hôte. Les rongeurs adultes possèdent un système immunitaire totalement mature et compétent

60 souris reçoivent une irradiation qui détruit leur moelle osseuse, puis une greffe de cellules sanguines mutées, avant qu'un produit inflammatoire ne leur soit appliqué six jours de suite sur le dos rasé. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et toutes seront tuées. Le porteur qualifie ce modèle de non invasif et conclut à des nuisances "modérées, réversibles et limitées dans le temps, sans atteinte durable du bien-être animal", tout en indiquant que l'irradiation provoque perte de poids et diarrhées. Les prélèvements de tissus, effectués après la mise à mort, doivent relier l'anomalie sanguine à l'inflammation de la peau.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment certaines anomalies acquises de la production des cellules du sang, appelées hématopoïèse clonale, peuvent influencer ou aggraver les maladies inflammatoires chroniques de la peau, comme la dermatose inflammatoire (DI). À l’aide de modèles expérimentaux reproduisant des réactions cutanées inflammatoires proches de celles observées chez l’humain, nous étudierons comment ces cellules sanguines mutées entretiennent une inflammation persistante. L’objectif est d’identifier les mécanismes responsables et de tester des approches permettant de limiter cette inflammation, afin d’améliorer la prévention et la prise en charge des maladies auto-immunes et inflammatoires.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet aideront à mieux comprendre comment certaines anomalies du sang peuvent favoriser ou aggraver les maladies inflammatoires. Ces connaissances pourraient, à terme, permettre de développer des traitements plus précis pour contrôler l’inflammation et améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de maladies chroniques.

Procédures

Les interventions prévues concernent la mise en place et le suivi du modèle d’hématopoïèse clonale (HC) et de DI. Chaque souris sera exposée uniquement aux gestes correspondant à son groupe expérimental. Après une irradiation, étape de conditionnement permettant d’éliminer les cellules de la moelle osseuse afin de pouvoir réaliser ensuite la greffe de cellules d'intérêt dans la veine de la queue sur souris éveillée avec contention douce (durée: 1 min). La prolifération de ces cellules sera suivie grâce à l’analyse réalisée sur des prélèvements sanguins (fait au niveau de la veine de la joue, sur souris éveillées 2 fois par mois avec un maximum de 4 prélèvements). L’induction de la DI (environ 8 semaines après la greffe) sera effectuée par application sur la peau rasée du dos d’une molécule connue pour induire cette pathologie, une fois par jour pendant 6 jours consécutifs, sans anesthésie (durée: 1 min). Ce modèle est non invasif et entraîne uniquement une inflammation locale transitoire.

Impact sur les animaux

Les souris pourront présenter une inflammation cutanée légère à modérée (rougeur, épaississement local, petites croûtes) due à l’application du produit inflammatoire. Un léger stress lié aux manipulations est possible. Suite à l'étape d'irradiation, les animaux peuvent présenter une perte de poids et des diarrhées suivie d’une phase de récupération complète après la greffe. Ainsi, les nuisances attendues sont modérées, réversibles et limitées dans le temps, sans atteinte durable du bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérience afin de permettre des analyses approfondies des tissus et cellules. Ces prélèvements sont essentiels pour comprendre le lien entre le développement anormal des cellules du sang et un maladie inflammatoire de la peau.

Remplacement

Aucune alternative in vitro (cellules en culture) ou in silico (par analyse informatique) ne permet actuellement de reproduire la complexité des interactions entre le système sanguin et l'inflammation au niveau de la peau. Seule l'utilisation d'un modèle animal vivant peut permettre de reproduire cette complexité.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établi grâce aux études antérieures du laboratoire et notamment à l’utilisation de tests statistiques appropriés

Raffinement

Les protocoles expérimentaux incluent des mesures spécifiques pour réduire la douleur et le stress des animaux (analgésie, enrichissement du milieu de vie, manipulation douce et rapide, surveillance quotidienne des animaux) ainsi que la mise en place de points limites évalués lors du suivi clinique quotidien à l'aide d'une grille de critères observés. En cas de douleur, celle-ci sera prise en charge (administration d’anti-douleur, surveillance renforcée sur une période de 24 heures avant euthanasie si aucune amélioration n'est observée).

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car elles constituent un modèle bien établi pour l’étude des maladies inflammatoires et hématologiques. Les animaux utilisés auront entre 8 et 12 semaines, car à cet âge, leur système immunitaire est mature, ce qui permet d’obtenir des résultats représentatifs des processus biologiques étudiés.

Vingt et un gavages, plusieurs injections et quatre séances d'imagerie sous anesthésie, après une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau : 684 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La chirurgie de greffe dure jusqu'à trente minutes, et les souris développent ensuite une tumeur cérébrale avec les symptômes neurologiques et la perte de poids qui l'accompagnent. Leur immunodéficience sert à faire accepter sans rejet des cellules tumorales prélevées sur des patients. Le porteur reconnaît que des organoïdes remplacent déjà une partie des études précliniques et réserve le passage chez la souris aux molécules déjà actives in vitro.

Objectifs

L’organisation mondiale de Santé classifie les cancers du cerveau (ou glioblastomes) comme des tumeurs très agressives. Ils sont caractérisés par une hétérogénéité (zones de mort cellulaire, prolifération micro-vaisseaux sanguins) et une invasion importante du cerveau. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs se résume à un traitement chimio-thérapeutique concomitante à la radiothérapie. L’ablation partielle ou totale de la tumeur, lorsqu’elle est réalisable, demeure un élément déterminant de cette prise en charge et améliore la survie des patients. Toutefois, malgré la lourdeur des soins, la survie des patients est aujourd’hui évaluée à environ 18 mois. L’objectif de ce projet est d’étudier dans un premier temps l’inhibition de trois gènes impliqués dans la croissance des glioblastomes. Dans un second temps, il s’agit d’étudier l’effet de médicaments sur le développement de ces tumeurs. L’étude de l’inhibition de gènes, consistera à évaluer le rôle de ces gènes dans le développement des tumeurs et donc de la survie des animaux. Pour cela un groupe de souris recevra une injection intracrânienne de cellules dont l’expression du gène n’est pas modifiée, l’autre groupe des cellules dont l’expression du gène est inhibée. L’étude de l’effet de 5 médicaments sur la survie de souris greffées avec des cellules cancéreuses, consistera à comparer un groupe de souris traitées avec le médicament ou une combinaison de médicaments à un groupe de souris traitées avec un placebo.

Bénéfices attendus

Compte tenu de l’agressivité des glioblastomes, la recherche d’un nouveau traitement permettant de prolonger la survie des patients demeure une priorité. Ce projet se propose d’explorer l’intérêt du ciblage thérapeutique de différentes voies métaboliques récemment identifiées comme des acteurs importants du comportement agressifs des glioblastomes. Ces travaux devraient donc fournir de nouvelles pistes thérapeutiques pour ces tumeurs.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie unique de 30 minutes maximum sous anesthésie générale lors de la greffe des cellules tumorales dans le cerveau. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie adaptée en présence d’analgésie. Lors des traitements thérapeutiques (durée de trois semaines), certains animaux subiront des gavages (21 fois, 10 sec) ou des injections intraveineuses (3 fois, 50 sec). Au cours de la mise en place du traitement thérapeutique, la réalisation d’un suivi de croissance tumorale sera fait par imagerie (4 fois, 5 sec à 8 min) sous anesthésie générale. Ils recevront également une injection abdominale d’une molécule (4 fois, 2 sec) permettant le suivi en imagerie et pour les animaux qui seront suivis au scanner, ils recevront une injection intraveineuse (4 fois, 50sec).

Impact sur les animaux

Ces animaux développeront des tumeurs avec les nuisances liées aux cellules tumorales de cancer du cerveau qui auront été implantées dans le cerveau. Elles devraient développer comme chez l’homme des symptômes neurologiques, et une perte de poids. Les contentions multiples pour l'administration des traitements et la pesée peuvent entrainer un stress. Le gavage pourrait entrainer une légère irritation de l'oesophage. Les injections pourraient entrainer une légère douleur au moment où elles sont pratiquées. Ces traitements pourraient entrainer un inconfort ou des inflammations.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, afin de collecter les cerveaux pour analyses.

Remplacement

L’existence de modèles cellulaires en 3 dimensions appelés organoïdes permettent de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant in vitro l’efficacité des médicaments. Dans le cadre de notre projet, l’utilisation d’un modèle murin de greffe intracrânienne reste néanmoins le seul capable de modéliser finement les mécanismes et les interactions complexes qui prennent place dans une tumeur et son environnement biologique. Seuls les drogues ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales in vitro seront testées in vivo.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons utilisé des guides statistiques et des résultats préalables détaillés dans la littérature. Grâce à ces approches, nous avons déterminé que des groupes expérimentaux permettront d’obtenir des résultats statistiquement corrects qui ne compromettront pas l’interprétation de nos résultats. Les travaux seront réalisés sur des souris mâles et femelles. Le suivi longitudinale par imagerie permet de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi. Toutefois, en cas d’agressivité (surtout observé chez les mâles) et afin de garantir le bien-être animal et le succès de l’étude, les animaux pourraient être temporairement isolés. Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel animalier et les personnes en charge de l’expérimentation afin de d’observer leur comportement, leur apparence et les signes cliniques et identifier ainsi tous signes révélateurs de souffrance. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect du bien-être animal et avec pour objectif de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. C’est pourquoi, avant toute chirurgie, les souris recevront des analgésiques et seront anesthésiées (anesthésie générale et locale) lors de la chirurgie. Pendant, la chirurgie les souris bénéficieront d’un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle, du gel sera appliqué sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. L’administration d’analgésiques sera poursuivie pendant 48h après la greffe. Pendant l’imagerie, les souris seront sous anesthésie générale et déposées sur un plateau chauffant. Les animaux seront également suivis quotidiennement et l’atteinte d’un des points limites entraînera leur mise à mort. Si l'étude pilote concernant la prise spontanée est concluante, cette dernière se subsituera au gavage.

Choix des espèces

Dans le cadre de notre étude, nous utilisons des modèles qui sont bien caractérisés dans la communauté scientifique. Dans ce contexte, les modèles de souris immunodéficientes permettront de greffer des cellules tumorales de glioblastomes de patients sans rejet. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, pour les études avec des lignées de GBM humains adultes. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise de greffes.

840 souris subissent une injection intramusculaire qui leur lèse le muscle, sans recevoir le moindre anti-douleur. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées, entre trois heures et vingt-huit jours après la lésion, pour prélever leur muscle et leur tissu adipeux. Le porteur explique écarter tout anti-inflammatoire et tout antalgique parce qu'ils perturberaient la réponse qu'il veut mesurer, et annonce une mobilité réduite dans les six heures qui suivent, prolongée de quelques jours chez les souris âgées de 18 à 20 mois. Il indique par ailleurs qu'un autre projet du laboratoire développera des puces multi-organes à partir de prélèvements humains pour modéliser ces échanges sans animaux.

Objectifs

La taille de la population âgée dans le monde croît très rapidement. De ce fait, l'un des principaux défis consiste à s'assurer que les années supplémentaires de vie soient des années de qualité, on parle alors de vieillissement en bonne santé. La sarcopénie - une perte de masse et de fonction des muscles squelettiques liée à l'âge- représente aujourd’hui le risque majeur de dépendance des personnes âgées. Cette sarcopénie demeure un trouble dont les mécanismes sous-jacents ne sont pas entièrement connus et pour laquelle il n'existe pas de traitement efficace autre que l'activité physique qui, souvent, ne peut pas être proposée à tous les patients. Le muscle squelettique possède une extraordinaire capacité de régénération qui est fortement affectée par le processus de vieillissement. Notre équipe a démontré que le tissu adipeux (plus communément appelé « la masse grasse ») abrite une population cellulaire dotée d'un fort potentiel régénératif. En outre, nous avons montré pour la première fois chez l’individu jeune que le tissu adipeux libère des cellules souches spéciales en réponse à une lésion musculaire et qu’elles infiltrent le muscle pour soutenir la régénération. La présence de ces cellules souches dans le muscle aprés une lésion est requise pour obtenir une régénération efficace et ainsi restaurer la fonction musculaire. De manière très intéressante, nos travaux les plus récents montrent que la migration de ces cellules souches en dehors du tissu adipeux est dépendante de la présence d’un acteur protéique, une métalloprotéase matricielle absente chez l’individu âgé, ce qui pourrait expliquer la perte du potentiel de régénération avec l’âge et la faiblesse musculaire associée. Dans ce contexte, l’objectif principal de notre projet est d’évaluer l'importance de ce facteur protéique dans la migration des cellules souches infiltrant le muscle après la lésion chez la souris. Nous proposons de restaurer l’expression de cet acteur chez des souris âgées et d’évaluer l’impact sur l’infiltration musculaire des cellules souches modifiées et in fine si cette stratégie est suffisante pour restaurer une régénération musculaire et ainsi prévenir le déclin musculaire lié à l’âge.

Bénéfices attendus

Ce projet est susceptible de mettre en évidence pour la première fois un mécanisme régulateur de l’infiltration de cellules souches du tissu adipeux vers le muscle après une lésion. En effet, si nous démontrons que restaurer la protéine identifiée chez des individus jeunes chez la souris âgée améliore la régénération musculaire, il sera tentant de spéculer que cet acteur pourrait représenter une cible pour prévenir le déclin musculaire lié à l’avancement en âge. Avec le vieillissement de la population à un rythme sans précédent, il est crucial d'identifier des interventions efficaces pour ralentir ou inverser la fonte musculaire chez les personnes âgées et améliorer leur santé et leur bien-être général. Ainsi, les bénéfices attendus du projet seront à court/moyen terme de mieux comprendre comment les cellules souches du tissu adipeux soutiennent le processus de régénération musculaire. À plus long terme, nous anticipons que ces travaux pourraient avoir des répercussions en santé humaine, sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, en ciblant l’acteur que nous avons identifié. Ce projet pourrait notament participer au développement de nouvelles options thérapeutiques pour la sarcopénie pouvant être utilisées chez les personnes âgées qui ne peuvent pas être physiquement actives en raison de problèmes de mobilité.

Procédures

Intervention 1 : Injection sur animal révéillé: tous les animaux (480) recevront deux injections consécutives sur un intervalle de 24h d’une molécule pharmacologique ciblant la protéine candidate. Durée de la contention et de l’injection : moins d’1 minute. Intervention 2 : Injection sous-cutané (sous la peau) sous anesthésie générale gazeuse : tous les animaux (360) recevront une injection sous-cutanée de cellules souches sous anésthésie générale gazeuse. Durée de l’anesthésie et de l’injection : moins de 2 minutes. Intervention 3 : Injection intramusculaire sous anesthésie générale gazeuse : tous les animaux (840) recevront une injection intramusculaire d’un agent neutre ou provoquant une lésion musculaire. Durée de l’anesthésie et de l’injection : moins de 3 minutes. L’ensemble des animaux recevront les interventions 1 et 3, ou les interventions 2 et 3, consécutivement. L’injection intramusculaire sera réalisée 2h après la seconde injection de la molécule pharmacologique, ou une semaine après l’injection sous-cutané, respectivement. Suite à l’injection intramusculaire, il n’y aura pas d’autre geste technique et les animaux seront euthanasiés à des temps précoces (3, 14 et 24h après la lésion, dans le but d'évaluer l'infiltration msuculaire des cellules souches dans le muscle) ou à des temps plus tardifs (7, 14 et 28 jours pour évaluer l’avancement du processus de régénération musculaire).

Impact sur les animaux

La contention des animaux effectuée pour l’injection peut causer un léger stress, sur une durée inférieure à une minute. L’injection de cellules par voie sous-cutanée peut entraîner une réaction inflammatoire locale légère pouvant durer quelques heures post-injection (jusqu’ 6h). Un inconfort voire de la douleur peut être constaté(e) au réveil des animaux ayant reçu une lésion musculaire du côté de la patte lésée. Dans les 6 heures suivant la réalisation de la lésion, une mobilité réduite pourra être observée. Cette mobilité réduite temporaire n’entrave pas la prise alimentaire chez les animaux âgés cependant, la durée de l’inconfort pourrait être allongée à quelques jours, nécéssitant une surveillance plus accrue. L’anésthésie générale gazeuse des animaux peut induire une léthargie post-anesthésie se résolvant en quelques minutes.

Devenir

Afin de caractériser l’effet de la réexpression de notre protéine candidate sur l’infiltration des cellules souches du tissu adipeux dans le muscle et la régénération associée après lésion, tous les animaux impliquées dans le projet seront euthanasié pour réaliser des prélevements d’organes (tissu adipeux et muscle). Les différents tissus seront utilisés pour des analyses cellulaires et morphologiques.

Remplacement

Des expériences préliminaires sur des cultures primaires de cellules murines ont déja été réalisées et ont démontré l’importance de notre protéine candidate dans la migration de ces cellules et ont également permis de mettre au point des doses et des modalités pharmacologiques pour une application chez la souris. Pour mettre en évidence le rôle de cette protéine sur l’infiltration des cellules souches du tissu adipeux dans le muscle lésé et étudier les échanges inter-organes, nous devons nécessairement passer à un modèle intégré, qui rassemble les différents organes impliqués et les structures anatomiques qui les relient. L’utilisation d’animaux vivants est ainsi nécessaire pour atteindre les objectifs du projet car il n’existe pas de modèles ex vivo récapitulant le dialogue inter-organe entre tissu adipeux et muscle en contexte physiologique et en contexte lésionnel. Toutefois, un projet qui sera prochainement initié dans le laboratoire visera à développer à terme des puces multi-organes contenant des organoïdes de tissu adipeux et de muscle obtenus à partir de prélevements humains dans le but de modéliser ce dialogue ex vivo sans utiliser d'animaux.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaire et suffisant, nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées ainsi que sur les nombreuses expériences (passées et publiées) de lésion musculaire que nous avons réalisées au laboratoire. Ainsi, il en ressort que 15 animaux par groupe seront nécéssaires. Toutefois, dans le but de réduire l’utilisation d'animaux âgés, nous n’effectuerons des explorations qu’à deux temps de prélèvement pour ces animaux au lieu de 6, ceci permet ainsi de réduire considérablement le nombre d’animaux. De plus, pour les animaux jeunes des groupes contrôles, seulement 4 temps de prélévements des tissus seront effectués au lieu de 6. Ensuite, une étude rétrospective sera réalisée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d’animaux. D’autre part, nous optimiserons l’utilisation de tous les animaux par un partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies qui ne sont pas strictement nécessaires au projet.

Raffinement

Prévention des animaux isolés : selon les cinétiques de prélévement des tissus, les mises à mort des animaux seront echelonnées, ainsi nous veillerons à ce qu’un minimum de 2 souris soient laissées par cage. Tout au long de la vie de la souris, celle-ci aura accés à de l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois, sizzle-nest ou igloo dans les cages. Concernant les procédures expérimentales implicant des lésions musculaires, tout traitement anti-inflammatoire ou anti-douleur n’est pas compatible avec notre étude car nous savons qu’ils perturberaient la réponse immunitaire et inflammatoire ainsi que l’infiltration de cellules d’intérêt depuis le tissu adipeux sous-cutané (données publiées) nécessaire au procéssus de régénération musculaire. Ainsi, nous proposons de mettre en place certaines actions dans le but de réduire les effets indésirables causés par l’anésthésie et la lésion musculaire : un tapis chauffant sera positionné sous l’animal pendant l’anesthésie ainsi que sous la cage pour le réveil des animaux afin de prévenir l’hypothermie et un gel occulo-protecteur sera appliqué systématiquement aux souris anesthésiées afin de prévenir le déssechement occulaire. Des mesures de raffinement spécifiques aux procédures seront mises en place. En effet, pour les animaux âgés, quelques croquettes seront ajoutées en fond de cage pour faciliter la prise alimentaire et une surveillance plus soutenue sera effectuée les jours suivants la lésion. La lésion musculaire peut entraîner des signes cliniques tels que : gonflement de la patte droite lésée et un léger boitement. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités d’amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale.

Choix des espèces

Les processus du vieillissement musculaire et de régénération étudiés dans ce projet sont très bien caractérisés chez la souris. L’espèce, mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Plus spécifiquement, le processus de régénération musculaire, largement étudié dans ce projet, fait intervenir des populations cellulaires et des cinétiques d’évenements similaires chez l’Homme et la souris. De plus, les outils d’analyse nécessaires à la mise en oeuvre de cette étude sont tous disponibles et validés chez la souris. Pour l’ensemble de ces raisons, l’espèce murine paraît pertinente pour la réalisation de cette étude. Les animaux de ce projet seront soit des souris mâles jeunes adultes de 10 semaines soit des souris mâles âgés de 18-20 mois. Ces stades de développement ont été retenus car ils assurent un développement musculaire complet chez les souris âgées de 10 semaines, à l’inverse les souris âgées de 18 à 20 mois présentent un déclin de la masse et de la fonction musculaire (sarcopénie). Pour la cohérence de nos études nous préférons nous focaliser dans un premier temps sur des souris mâles et ainsi diminuer la variabilité inter-individuelle. En effet, nos précédents travaux sur la régénération et la santé musculaire ont été réalisé sur des souris mâles. Un dimorphisme sexuel du système musculo-squelettique a été largement décrit dans la littérature. Néamoins, l'analyse de cohortes de femelles fera l'objet d'une nouvelle demande d'autorisation de projet ou d’un amendement de ce projet après l’obtention des résultats expérimentaux.

5 040 souris âgées de 16 à 18 mois vont être utilisées, chacune opérée une fois par chirurgie stéréotaxique pour recevoir un peptide amyloïde dans le cerveau, puis traitée tous les jours pendant huit semaines au maximum. Elles passent jusqu'à quatre tests de mémoire de moins de quinze minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées pour prélever des échantillons biologiques. Le porteur évalue ainsi des candidats médicaments contre la maladie d'Alzheimer et choisit des souris âgées parce que la baisse de performance y est plus simple à mettre en évidence. Sur l'effectif, il écrit seulement que le nombre a été choisi pour obtenir des résultats statistiquement significatifs aux tests de mémoire.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est caractérisée par des troubles de la mémoire et du comportement, et affecte plus de 1 000 000 personnes en France. Elle est très invalidante. L'absence de traitements efficaces contre la maladie représente un défi majeur de santé humaine. L'objectif de ce projet est d'évaluer le potentiel neuroprotecteur de candidats médicaments dans un modèle animal de la maladie de Alzheimer.

Bénéfices attendus

En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats-médicaments pourra se poursuivra afin de proposer un traitement aux patients souffrant de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Les animaux seront soumis à de la chirurgie (une fois par étude), à des traitements quotidien, sur 8 semaines au maximum, et à des tests de comportement (4 fois par étude au maximum). Ces tests seront rapides et dureront moins de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une anesthésie gazeuse pour effectuer une chirurgie stéréotaxique pouvant causer de la souffrance post-opératoire. Les traitements quotidiens des souris peuvent induire un stress, particulièrement lors des premières administrations. Les tests de mémoire spatiale peuvent également induire un stress chez les souris puisqu'elles seront placées dans des environnements inhabituels. La souffrance post-opératoire sera limitée et prise en charge par des médicaments vétérinaires anti-douleurs.

Devenir

Mise à mort pour collecte d'échantillons biologiques.

Remplacement

La maladie d'Alzheimer est une maladie complexe qui affecte plusieurs régions du cerveau. Elle provoque également des troubles de la mémoire. Ce degré de complexité ne peut être modélisé qu’avec un modèle animal. L'analyse de la perte de mémoire ne peut se faire qu'avec des animaux.

Réduction

Le nombre de souris a été choisi pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs, pour les tests de mémoire.

Raffinement

Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement, (ii) la gestion de la douleur par voie médicamenteuse (iii) et le respect des besoins physiologiques des animaux. Les intéreactions sociales seront maintenues. Les signes de souffrance éventuels seront recherchés quotidiennement. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un traitement antidouleur sera administré. Si un point limite est atteint, durant l'étude, les souris seront euthanasiées en utilisant les méthodes d’euthanasie autorisées.

Choix des espèces

La souris possède un système cérébral complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude de la maladie d'Alzheimer. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Comme dans la plupart des cas les symptômes de la maladie d'Alzheimer apparaissent à un âge avancé. Comme nous cherchons dans ce projet à exacerber le déclin cognitif des animaux, nous utiliserons des souris âgées de 16 à 18 mois pour lesquels l’état cognitif est meilleur et donc la baisse de performance plus simple à mettre en évidence.

Enfermées seules cinq jours dans une cage d'analyse métabolique et soumises à une injection unique, 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées, le porteur jugeant que l'injection, l'isolement et leur génotype les rendent inutilisables ailleurs. Le projet cherche à préciser le rôle d'un second récepteur de la molécule MCH, ajouté par modification génétique pour imiter la situation humaine, dans le contrôle de l'appétit. Le contenu de l'injection n'est pas indiqué, pas plus que les points limites retenus, dont le porteur écrit seulement qu'ils ont été établis.

Objectifs

La prévalence de l'obésité s'accroit de façon alarmante en France et dans le monde, provoquant de nombreuses maladies (diabètes, maladies cardiovasculaires, cancers) et augmentant le risque de complications lors d'infections. Parmi les causes identifiées chez l’Homme, on note un dérèglement du contrôle de l'appétit au niveau du système nerveux central. Il a été montré chez le rongeur que la molécule MCH est un régulateur essentiel du comportement alimentaire. Alors qu’il existe un seul récepteur pour cette molécule chez les rongeurs, il en existe deux chez l’Homme. Nous avons donc développé un modèle de souris possédant un deuxième récepteur tel qu’il existe chez l’Homme, afin de mieux explorer comment ils fonctionnent. Ce projet fait suite à un projet précédent, dont l’objectif principal était d'identifier la contribution de ces molécules dans le comportement alimentaire et les maladies métaboliques dues à l'obésité, en utilisant différentes approches (études métaboliques et utilisation d’outils pharmacologiques). Au cours de ce projet, nous avons pu optimiser le protocole d’analyse du comportement alimentaire et de la dépense énergétique et nous avons identifié à la fin de celui-ci un nouvel outil pharmacologique performant. L’objectif du projet présenté ici est d’utiliser ce nouvel outil afin de valider nos résultats précédents et ainsi nous permettre de mieux comprendre le rôle de ces récepteurs et leur interaction dans la régulation du comportement alimentaire.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation du comportement alimentaire devrait contribuer à l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la lutte contre l'obésité et les maladies qui lui sont associées.

Procédures

Tous les animaux (384) seront hébergés individuellement pendant une durée de 5 jours dans des cages d’analyses métaboliques et seront soumis à une seule injection (quelques secondes).

Impact sur les animaux

L'analyse de l'activité métabolique nécessite que les animaux soient hébergés individuellement pour une durée de 5 jours dans des cages spécifiques au dispositif de mesure utilisé, la privation de congénères peut engendrer un stress. Les animaux subissent également une injection après 48h dans les cages d’analyses (durée : environ 10 secondes) pouvant entraîner une douleur légère et de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Le fait que les animaux aient reçu une injection, aient été hébergés individuellement ainsi que leurs caractéristiques génétiques les rendent dificilement utilisables dans d’autres projets. Par ailleurs, les expérimentations ayant lieu dans une zone de l’animalerie au statut sanitaire moins élevé que la zone dédiée à la production, empêche de réutiliser les animaux comme reproducteurs.

Remplacement

L’étude du comportement alimentaire et de la mise en place de l'obésité nécessite un système affectant simultanément plusieurs tissus (foie, graisse, pancréas, muscles et cerveau). Notre étude doit donc nécessairement se faire sur un animal dans sa globalité.

Réduction

Les animaux sont élevés au sein de notre établissement utilisateur nous limitons la production du nombre d’animaux au strict nécessaire pour leur utilisation dans les procédures. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque procédure est calculé par analyse prédictive (calcul de puissance) afin d’utiliser uniquement le nombre nécessaire.

Raffinement

Nous travaillons en cycle de lumière inversé (allumage de 19h à 7h ; obscurité de 7h à 19h) afin de se conformer au rythme physiologique des animaux, et de réaliser les expérimentations pendant la phase active des souris. Une lumière rouge, invisible pour les souris, est utilisée pour visiter les animaux. La température est maintenue à 26°C, proche de la zone de confort thermique des souris et facilitant la régulation de leur température corporelle. Le stress subit par les animaux dans les cages métaboliques est atténué par le fait que les animaux conservent un contact visuel avec leurs congénères. Ces cages présentent une grande surface au sol et un bon niveau d'enrichissement (litière au fond de la cage, mangeoire, biberon et maisonnette suspendus) qui offrent des occasions accrues d'interaction avec l'environnement. Des points limites ont été établis et seront appliqués.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence dans les études métaboliques, nous pouvons donc bénéficier d’un grand nombre de ressources et de données préliminaires existantes. Pour cette étude, nous utiliserons des souris adultes âgées d’au moins 12 semaines. Ce stade de développement, déjà retenu dans notre dernier projet, a été choisi afin de permettre une comparaison directe avec les résultats obtenus précédemment.

Pour mesurer ce qu'une infection simulée pendant la gestation et trois semaines d'isolement à l'adolescence font au cerveau, 1 392 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent une injection stéréotaxique dans le cerveau d'une heure ou un prélèvement de liquide cérébrospinal de vingt minutes. D'autres enchaînent les tests, trente minutes de locomotion, dix minutes pour l'anxiété, vingt minutes d'interaction sociale, huit minutes pour la dépression, vingt minutes de stéréotypie et six minutes de cognition. L'isolement de trois semaines constitue la procédure elle-même, et le porteur annonce en parallèle des cages enrichies pour rendre l'environnement plus apaisant, pour des bénéfices qui se limitent à mieux comprendre les mécanismes en jeu.

Objectifs

L'infection virale pendant la grossesse et l'isolement chronique pendant l'enfance sont des stress qui ont un impact sur le développement du cerveau et sont des facteurs de risques pour certaines maladies psychiatriques. Ces stress peuvent impacter des protéines sécrétées dans le liquide cérébrospinal qui régulent la plasticité du cerveau. Ce projet vise à quantifier l’impact de ces stress sur le comportement animal, la régulation immunitaire et l’activité sécrétoire des plexus choroïdes (qui produisent le liquide cérébrospinal). Ce projet étudiera également les différences liées au sexe. L'analyse du comportement des animaux adultes permettra d'évaluer la socialisation, la stéréotypie (répétition persistante d'un acte), la régulation sensorimotrice, la cognition et les phénotypes liés à l'anxiété.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l'origine des symptômes neurologiques liés aux infections virales subis pendant le développement embryonnaire et le stress subis pendant la petite enfance. Il permettra de suivre la localisation subcellulaire de protéines ciblées dans le plexus choroïde, la sécrétion de ces protéines dans le liquide cérébrospinal et leur distribution dans le cerveau. Ce projet vise à corréler l’effet cumulé de deux stress sur le comportement animal, la régulation immunitaire et l’activité des plexus choroïdes et vise à étudier les différences liées au sexe dans le développement des pathologies neurologiques.

Procédures

Une injection intrapéritonéale sera réalisée sur animaux gestantes et vigiles ; la procédure dure environ 1 minute en moyenne et sera effectuée une seule fois. Certains animaux seront hébergés en isolement pendant 3 semaines. Une prise de sang sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; la procédure dure environ 1 minute en moyenne et sera effectuée une seule fois. Certains animaux seront soumis à un seul test de locomotion qui dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau d'anxiété et dure 10 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test d’interaction social qui dure 20 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau de dépression et dure 8 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de stéréotypie qui dure 20 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test cognitif qui dure 6 minutes. Une injection stéréotaxique intracérébrale sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 1 heure et sera effectuée une seule fois. Certains animaux seront soumis à une injection dans la veine de la queue ; la procédure dure environ 30 secondes et sera effectuée une seule fois. Un prélèvement de liquide cérébrospinale sera effectué sur des animaux anesthésiés ; cette procédure dure environ 20 minutes et sera effectuée une seule fois.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite, une posture voûtée, une hyperactivité, et des difficultés respiratoires. Une injection intrapéritonéale ou prise de sang peut induire un stress et une douleur légère et de courte durée.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau sera collecté afin de permettre des analyses histochimiques ou biochimiques.

Remplacement

Nos recherches sur la sécrétion de protéines du plexus choroïde et de la distribution de protéines via le liquide cérébrospinal à la suite d’effets du stress sur la plasticité du cerveau nécessitent des modèles de souris. Ces expériences ne peuvent être reproduites ni in vitro, car elles dépendent d'un cerveau fonctionnel, ni sur des animaux non mammifères, car elles impliquent des analyses de comportements spécialisés.

Réduction

Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies d’analyses nous ont permis de définir le nombre d’animaux par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Nous effectuerons plusieurs analyses sur certaines souris, ce qui nous permettra de réduire davantage le nombre d'animaux.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée jusqu'à leur réveil. Une grille de suivi est utilisée pour évaluer les points limites des animaux et des points de vigilance précoce seront utilisés pour mettre en place des actions appropriées si nécessaire. Les souris, y compris celles en isolement social, seront hébergées dans des cages avec objets d’enrichissements afin d’avoir un environnement plus apaisant. Concernant l’analyse de comportement, les animaux suivront des phases d’habituation pour certains tests afin de réduire le stress et améliorer la reproductibilité.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour les études du développement du cerveau et des effets du stress en début de vie. Notre connaissance du modèle nous permet de réduire les conditions d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines. Ce projet nécessite des souris âgées de 0 à 4 mois car il porte sur l'analyse de l’impact des stress juvéniles sur le cerveau et comportements adolescents et adultes.