Souris
Evaluation de l’activité antitumorale d’un peptide contre la leucémie myéloïde aiguë.
- Recherche appliquée
- Cancers
Seize séances d'imagerie et seize injections de produit d'imagerie par animal, jusqu'à trente injections de peptide et dix-huit de chimiothérapie sur quatre à six semaines : le protocole occupe seize semaines de la vie de chaque souris. 319 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des tissus et des organes. Des cellules de leucémie myéloïde aiguë leur sont injectées et se répartissent dans tout le corps, avec des foyers possibles dans plusieurs organes. Le peptide testé a déjà montré son efficacité sur des tumeurs solides chez l'être humain, et le porteur retient la souris NSG immunodéficiente, utilisée dès quatre à cinq semaines, parce qu'elle laisse pousser des tumeurs d'origine humaine.
Objectifs
Notre laboratoire développe des peptides, petites molécules qui ont la capacité de perturber les mécanismes de mort cellulaire. L'un de ces peptides a déjà montré son efficacité sur des tumeurs solides chez la souris mais également chez l'humain et son mode d'action et les premiers résultats in vitro de notre laboratoire nous amènent à envisager une efficacité sur les cancers du sang, tels que les leucémies myéloïdes aigües. Après avoir mis en place le modèle de croissance tumorale et le suivi en imagerie d'une lignée cellulaire de leucémie myéloïde aigüe, nous souhaitons évaluer l'efficacité de notre peptide en monothérapie ou en combinaison avec le traitement de référence sur un modèle de souris adapté et ainsi améliorer la stratégie de prise en charge de ce type de cancer en élargissant l'éventail thérapeutique proposé aux patients.
Bénéfices attendus
Si une efficacité de notre peptide seul ou en association est établie sur ce modèle in vivo, cela permettra d'élargir son utilisation aux tumeurs hématologiques et d'orienter son développement clinique. En effet, si un effet potentialisateur de notre peptide est démontré avec les molécules de référence, cela permettra de diminuer les doses de ces traitements et ainsi d'en limiter les effets secondaires ou les risques de résistance.
Procédures
Injection de cellules tumorales : 1/souris. Implantation pratiquée sous anesthésie générale par inhalation ou locale par application cutanée d'un analgésique. L'injection dure 1 min. Suivi en imagerie 1 fois/semaine pendant 16 semaines maximum, soit 16 acquisitions/souris. Elle dure entre 5 et 15 min. Injection du produit d'imagerie : 1 fois/semaine pendant 16 semaines soit 16 injections/animal. Ce geste dure moins de 30 sec. Traitement chimiotherapie, 3 fois par semaine pendant 4 à 6 semaines (selon l'efficacité du traitement), soit 18 injections/souris max. L'injection dure moins de 30 secondes. Traitement Peptide, 5 fois par semaine pendant 4 à 6 semaines (selon l'efficacité du traitement), soit 30 injections/souris max. L'injection dure 1 minute. Traitement thérapie ciblée, 2 fois par semaine pendant 4 à 6 semaines, soit 12 administrations d'une durée de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Compte-tenu du type cellulaire et de la voie d'administration, les cellules tumorales se répartissent de façon systémique chez l'animal. Des foyers peuvent être localisés au niveau de différents organes. Les animaux seront traités entre 2 et 5 jours par semaine pendant 4 à 6 semaines selon le traitement. Les molécules testées ont déjà été administrées par cette voie, à ces doses, à cette souche murine, sans provoquer de toxicité. Chaque administration peut induire une gêne ponctuelle et de courte durée due à la contention, à l'injection ou à l'anesthésie. Cette gêne diminue au fur et à mesure du fait de l'habituation de l'animal à être manipulé.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour études sur tissus et organes post-mortem.
Remplacement
Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier, les interactions avec le microenvironnement, la dissémination métastatique, ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Ce modèle animal va permettre d'étudier l’efficacité de la molécule testée sur la leucémie myéloïde aiguë afin de proposer le meilleur traitement aux patients lors d’études cliniques.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, nous nous sommes appuyés sur les données bibliographiques, nos connaissances sur le modèle cellulaire utilisé et les traitements proposés ainsi que sur notre expérience consécutive aux résultats déjà obtenus avec les molécules thérapeutiques envisagées. Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficacité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire a permis d'établir le nombre d'animaux greffés pour chaque étape du projet.
Raffinement
Le suivi par imagerie permet une évaluation précise et précoce de la croissance tumorale. Les souris sont greffées sous anesthésie générale par inhalation ou par anesthésie locale par application cutanée d'un analgésique. Les administrations seront réalisées sous anesthésie locale par application cutanée d'un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement le développement de la tumeur ou l'apparition de signes cliniques. Des points limite précis ont été définis et seront strictement respectés. Si des signes de douleurs sont détectés, un analgésique adapté sera administré. Les animaux seront stabulés en groupe, aliment et eau ad libitum. Un enrichissement adapté sera présent dans toutes les cages. En cas de suspicion de mal-être, un enrichissement supplémentaire sera ajouté. L'atteinte d'un point limite entraînera l'euthanasie de l'animal sous 24h.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie, notamment du fait de l'existence de souches immunodéficientes permettant le développement de tumeur d'origine humaine. D'après la bibliographie, la souris NSG est la souche de référence pour l'étude des cancers hématologiques. Cette souche permet une croissance tumorale satisfaisant notre évaluation thérapeutique. La leucémie myéloïde aiguë est un cancer qui touche essentiellement les enfants. Les animaux seront utilisés à partir de 4-5 semaines.
Evaluation du rôle des cellules de l’immunité associées aux tumeurs dans un modèle de cancer agressif de la surrénale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Génétiquement modifiées pour développer un cancer agressif de la surrénale et des métastases, des souris sont utilisées à partir de quatre mois, âge auquel la tumeur devient agressive. 1 086 souris vont être utilisées, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour analyser leurs tumeurs. Certaines reçoivent jusqu'à 27 injections intrapéritonéales d'anticorps déplétant, jusqu'à dix prises de sang à la veine faciale et jusqu'à quatorze échographies de trente minutes sous isoflurane, le flanc rasé. Le porteur affirme que le modèle développe tumeurs et métastases "sans aucun signe de détresse ni de douleur", tout en déclarant l'ensemble de ces 1 086 souris en souffrance sévère.
Objectifs
Le cancer de la surrénale est un cancer agressif avec environ 35 % des patients présentant des métastases lors du diagnostic initial. Le mauvais pronostic de ce cancer peut être attribué au manque de thérapies efficaces. En effet, un traitement curatif n'existe que pour les patients porteurs de cancers à faible agressivité qui subissent une résection chirurgicale complète. Malgré des traitements lourds reposant sur le mitotane (un agent chimique dérivé d’un insecticide) et une tri-chimiothérapie, les patients présentant une récidive ou une maladie métastatique, pour lesquels la chirurgie n’est pas une option, ont de faibles chances de survie à long terme (médiane à 14,8 mois). Récemment, l’analyse d’un modèle de souris génétiquement modifiée, reproduisant des altérations génétiques identifiées chez les patients porteurs de cancers de la surrénale agressifs a permis de mettre en avant un rôle probable de certaines cellules de l’immunité dans la progression tumorale. Notre but est donc de décrypter le rôle de ces cellules dans la progression tumorale grâce à l’étude d’un modèle de cancer de la surrénale agressif chez la souris. L’objectif à long terme de ces expériences est de développer une nouvelle approche thérapeutique ciblant ces cellules pour moduler leurs fonctions, ce qui permettra d’améliorer le traitement et la survie des patients.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet nous permettra d’évaluer l’intérêt potentiel de cibler certaines cellules de l’immunité ainsi que les leviers d’action utilisables pour moduler leur activité dans un modèle de souris génétiquement modifiées reproduisant les deux altérations génétiques les plus fréquemment retrouvées chez les patients porteurs des cancers de la surrénale les plus agressifs. Ceci devrait permettre de proposer de nouvelles pistes de traitement et d’améliorer le pronostic de ce cancer, qui reste aujourd’hui défavorable.
Procédures
- Injection intrapéritonéale d’anticorps déplétant. Durée 15 secondes, sur animal vigile. 6 fois pour 1 lot de 12 souris ; 15 fois pour 12 souris ; 21 fois pour 12 souris ; 27 fois pour 36 souris. - Prise de sang mandibulaire (veine faciale). Durée 30 secondes, sur animal vigile. 1 fois pour 96 souris ; 2 fois pour 126 souris ; 3 fois pour 96 souris ; 6 fois pour 12 souris ; 8 fois pour 12 souris ; 9 fois pour 24 souris ; 10 fois pour 12 souris. - Rasage des flancs + mesure des tumeurs par échographie sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. Durée 30min. 1 fois pour 84 souris ; 5 fois pour 84 souris ; 10 fois pour 150 souris ; 14 fois pour 84 souris. - Injection intraveineuse (sinus rétro-orbitaire) d’anticorps fluorescent sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. Durée 5min. 1 fois pour 108 souris.
Impact sur les animaux
L’injection intrapéritonéale de l’anticorps déplétant peut engendrer un stress de courte durée dû à la contention, ainsi qu’une douleur légère et de courte durée au site d’insertion de l’aiguille. Il en est de même pour la prise de sang au niveau mandibulaire. Les deux manipulations seront réalisées par un opérateur expérimenté afin de limiter ces effets indésirables. De plus, pour réaliser les échographies de suivi, le rasage du flanc des souris sous anesthésie à l’isoflurane n’engendre pas de douleur mais peut induire un stress léger. Le modèle de souris génétiquement modifié utilisé présente un développement tumoral et éventuellement des métastases, sans aucun signe de détresse ni de douleur. L’injection intraveineuse de l’anticorps permettant le suivi de certaines cellules de l’immunité circulantes, réalisée sous anesthésie à l’isoflurane, peut engendrer un stress léger et de courte durée dû à la manipulation des animaux.
Devenir
Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer l’implication des cellules immunitaires dans la survenue du phénotype agressif du cancer de la surrénale, ainsi que leurs fonctions au sein de la tumeur agressive.
Remplacement
Le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information et ne pourront pas répondre à la question posée dans notre projet.
Réduction
Nous effectuerons une mise au point technique sur des souris sauvages, afin de limiter le recours à des animaux génétiquement modifiés qui présentent un phénotype dommageable. Les lots (taille et composition) ont été déterminés sur la base de l’article décrivant le protocole que nous appliquerons, ainsi que sur l’expérience acquise au laboratoire et la nécessité de recourir aux 2 sexes pour les expériences. Deux protocoles ont été prévus uniquement dans l’hypothèse où le premier ne fonctionnerait pas. Ainsi, si le premier donne satisfaction, le nombre de souris ne sera pas doublé. De plus, si cette preuve de concept échoue, une partie du projet ne sera pas réalisée. En ce qui concerne le recours à des souris génétiquement modifiées, les croisements effectués pour générer les souris d’intérêt seront optimisés et toutes les souris générées seront utilisées puisque les individus contrôles obtenus par ces croisements seront utilisés pour les reproductions suivantes et/ou comme souris contrôles des expériences.De plus, dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées. De même, le sang des animaux mis à mort sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques destinés à l’analyse de petits lots expérimentaux pour comparer les lots entre eux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et en présence de matériel spécifiquement conçu pour le bien-être des souris : ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate, et/ou de tunnels en plastique. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis seront établis et les expériences seront arrêtées en conséquence.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Le modèle de souris génétiquement modifié que nous allons utiliser, basé sur deux mutations majeures retrouvées chez les patients atteints de cancers de la surrénale agressifs, retrace les caractéristiques humaines principales de la pathologie. La connaissance approfondie du génome de la souris, la redondance des types cellulaires présents et la similarité des mécanismes immunitaires mis en place chez la souris et chez l’homme, ainsi que l’existence d’outils moléculaires permettant de suivre de nombreux paramètres biologiques en font un modèle de choix. Nous dépléterons certaines cellules immunitaires chez des souris sauvages adultes âgées de 7 semaines, âge auquel le système immunitaire est mature. La déplétion sera poursuivie pendant 2 mois car ces souris doivent servir de preuve de concept pour une déplétion dans le modèle génétiquement modifié, adulte également. Le modèle de souris génétiquement modifié que nous allons utiliser est connu pour développer des cancers de la surrénale agressifs à partir de 4 mois, la dissémination métastatique étant évidente à 6 mois. Nous dépléterons donc certaines cellules immunitaires dès le début de la progression vers le caractère agressif (4 mois) pour suivre l’importance de ces cellules dans ce processus et pousuivrons le traitement pendant 2 mois, tout en suivant la progression tumorale par échographe jusqu’à 6 mois. Nous souhaitons également étudier la variété/les fonctions de ces cellules immunitaires au cours du développement des tumeurs agressives dans le modèle de souris génétiquement modifié. Nous utiliserons donc des animaux entre 3 (contrôles pré-tumoraux) et 6 mois d’âge.
Effets de la nutrition sur le développement de tumeurs intestinale chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Une biopsie de la queue, des injections quotidiennes pendant quatre ou cinq jours pour bloquer un gène, un prélèvement de sang sous anesthésie : les actes décrits durent chacun quelques dizaines de secondes. 2 064 souris vont être utilisées, 1 104 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 960 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever l'intestin et les fèces. Les souris issues de l'élevage qui ne servent à aucune procédure sont tuées aussi. Le porteur veut comprendre comment une alimentation riche en lipides, le microbiote et le sexe influencent le cancer colorectal, et signale que le développement spontané des tumeurs provoque une douleur modérée. Il justifie l'effectif de 2 064 animaux en une phrase, les effectifs étant "déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés".
Objectifs
Les objectifs du projet sont de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement du cancer du côlon et du rectum. Des données de la littérature ont montré qu’une alimentation riche en lipides était un facteur de risque pour le cancer du côlon et du rectum. Une partie des effets délétères de ces régimes est médiée par des changement de la population microbienne de l’intestin. De plus, il existe une importante différence en fonction du sexe d’un individu en ce qui concerne la probabilité de développer un cancer du côlon et du rectum. Ce projet a pour but de comprendre comment les régimes alimentaire, le microbiote et le sexe influencent le développement de ce type de cancer.
Bénéfices attendus
Ces travaux devraient contribuer à une meilleure compréhension du rôle de la nutrition, du sexe de l’individu et du microbiote dans l’initiation et le développement du cancer du côlon et du rectum.
Procédures
1 biopsie de queue : 10 secondes. 1 Contention pour injection d’une molécule bloquant l’expression d’un gène : 20 secondes, (1X/jour pendant 5 ou 4 jours). 1 Contention pour injection d’une molécule marquant la prolifération cellulaire : 20 secondes. 1 Prélèvement sanguin : 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lors de la contention et des injections. L’adaptation des souris aux nouveaux régimes ainsi que le développement des tumeurs peuvent induire une perte de poids. Une douleur légère lors de la biopsie. Le développement spontané de tumeur peut engendrer un stress chez la souris et une douleur modérée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de leurs intestins et de leurs fèces, nécessaires aux différentes analyses. Quant aux animaux issus de l’élevage qui ne seront pas inclus dans les procédures expérimentales, ils seront également mis à mort de manière éthique et appropriée.
Remplacement
L’utilisation de cultures de lignées cellulaires ne reflète pas la complexité de l’épithélium intestinal ni les dialogues intercellulaires et ne peuvent reproduire les effets systémiques de l’alimentation. Il n’existe pas de méthode de remplacement.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux vivent en groupes sociaux dans un milieu enrichi et ils seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Des points limites spécifiques sont établis. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Pour ce projet, l'espèce animale choisie est la souris. En effet cette espèce permet d'étudier le rôle de différentes mutations géniques affectant le développement du cancer colorectal. Des souris adultes âgées de 2 à 4 mois, ayant un tractus digestif mature et un microbiote établi sont utilisées.
Evaluation de l’efficacité d’ondes électromagnétiques dans le traitement de la septicémie dans un modèle souris.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
462 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 102 un niveau léger. Elles sont infectées par des bactéries multirésistantes pour provoquer une septicémie, reçoivent jusqu'à quatre injections ou prises par jour pendant cinq jours, et sont exposées trois fois au maximum à des ondes électromagnétiques, une heure par séance, immobilisées dans un tube ou sous anesthésie. Le porteur décrit une fatigue, une respiration difficile, un arrêt du toilettage et une perte de poids qui s'accentuent sur 24 à 72 heures sans traitement efficace, avec une surveillance portée jusqu'à trois fois par jour. Des souris sans poil, génétiquement modifiées et immunodéprimées, seront utilisées pour améliorer le signal de bioluminescence, et le porteur conclut qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne remplace l'animal dans une infection généralisée.
Objectifs
D’après le site de l’Organisation Mondiale de la Santé et les données scientifiques, en 2017, près de 50 millions de cas de septicémie et 11 millions de décès liés à cette maladie ont été recensés dans le monde. Cela représente encore près de 20% de l’ensemble des décès dans le monde dont près de la moitié ont été enregistrés chez les enfants de moins de 5 ans. Le sepsis est généralement causé par des bactéries nosocomiales, bien souvent résistantes aux traitements disponibles sur le marché, induisant rapidement un choc septique généralisé conduisant au décès du patient. Il y a donc une urgence dans la recherche et dans la découverte de nouveaux traitements efficaces contre ces bactéries multi-résistantes aux traitements. L’utilisation des ondes électromagnétiques comme approche thérapeutique suscite un intérêt croissant en raison de leur potentiel à moduler des processus biologiques sans recours à des agents chimiques. Dans le contexte des infections septicémiques dues à des bactéries multirésistantes, cette stratégie innovante pourrait offrir une alternative ou un complément aux traitements conventionnels, en ciblant la physiopathologie de l’infection par des mécanismes non pharmacologiques. Ce projet consiste à évaluer l’efficacité thérapeutique des ondes électromagnétiques dans le traitement de sepsis générés par infection avec des souches de bactéries multirésistantes aux traitements, bioluminescentes ou non (de type E. Coli, K. Pneumoniae, A. Baumannii, P. Aeruginosa ou encore S. Aureus) en modèle murin.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra l’utilisation de nouvelles thérapies (expositions à des ondes électromagnétiques) appliquées seules ou en association avec des traitements antibiotiques existants pour potentialiser leur effet pour mieux contrôler et améliorer la prise en charge des infections bactériennes responsables de septicémies rencontrées notamment dans les hôpitaux.
Procédures
Les animaux seront infectés par une injection de bactéries. Chaque injection environ 1 à 2 minutes par animal. Les animaux pourront recevoir des traitements dans la limite de 4 injections ou prises par jour. Les injections sur animal vigile seront réalisées en 1 à 2 minutes. Celles réalisées sur animaux anesthésiés dureront (en comptant l’anesthésie) environ 5 minutes. La durée totale des traitements ne pourra être dépasser 5 jours. Les animaux seront également exposés aux ondes électromagnétiques sous anesthésie ou bien maintenu dans un tube/ boîte afin de limiter leur mouvement. La durée d’une session de traitement n’excèdera pas une heure et 3 sessions d’exposition seront réalisées au maximum. En cas d’utilisation de souches bactériennes bioluminescentes, des suivis de la bioluminescence au maximum pendant 7 jours sur toute la durée de l’étude seront réalisés sur animaux anesthésiés afin d’éviter tout mouvement des animaux pendant les phases d’acquisition des images. La durée de l’acquisition de bioluminescence, en comptant l’anesthésie, sera d’environ 10 minutes. Au maximum 4 prélèvements de sang à différents délais pourront être réalisés sous anesthésie ou en vigile en fonction de la voie de prélèvement. Le prélèvement durera 2 min en vigile et 5 minutes sous anesthésie (anesthésie comprise).
Impact sur les animaux
Les modèles étudiés dans ce projet correspondent à des infections généralisées qui peuvent provoquer, dans les heures suivant l’infection, différents signes de malaise chez les animaux : fatigue, diminution de l’activité, respiration plus difficile, manque de toilettage ou perte de poids. Sans traitement efficace, ces signes peuvent s’accentuer progressivement au cours des 24 à 72 heures suivant l’infection. Comme l’évolution peut varier d’un animal à l’autre, une surveillance clinique est réalisée au minimum une fois par jour. En cas de signes d’aggravation, la fréquence d’observation peut être augmentée jusqu’à trois fois par jour. Cette surveillance permet d’identifier rapidement un seuil défini à l’avance (appelé point limite) afin de mettre en place les mesures nécessaires pour limiter au maximum la souffrance animale. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les pesées, les examens cliniques ou les traitements. Certaines procédures demandent une anesthésie ou un temps de manipulation plus long (jusqu’à environ 1 heure), tandis que d’autres durent seulement quelques minutes. Ces étapes peuvent provoquer un stress passager ou, plus rarement, de petits effets indésirables comme un hématome après une prise de sang. Tout sera mis en œuvre pour réduire ces effets.
Devenir
Le modèle d’infection étant généralisé (septicémie) et les études d’évaluation de l’effet de l’exposition aux ondes électromagnétiques de la procédure n°1 et d’efficacité de la procédure n°2 nécessitant des prélèvements d’organes afin de réaliser des analyses, les animaux seront systématiquement euthanasiés en fin d’étude.
Remplacement
Malheureusement à ce jour, malgré les évolutions constantes des modèles in-vitro et in-silico, aucun modèle ne permet de remplacer totalement le modèle animal d’autant plus dans le cas d’une infection généralisée comme celui de la septicémie. Cependant, en amont de ce projet, des études in vitro de non-toxicité et d’efficacité ont été réalisées respectivement sur des cultures cellulaires humaines et des cultures bactériennes sur gélose.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera déterminé en fonction des besoins réels de chaque étape du projet. Une première petite étude sera réalisée pour vérifier l’effet de l’application d’ondes électromagnétiques sur la physiologie des souris. Pour cette étape, un minimum de six animaux par condition testée sera nécessaire. Pour les études principales, au moins deux groupes d’animaux seront constitués (un groupe traité et un groupe non traité), avec un minimum d’environ six animaux par groupe, afin d’évaluer l’effet potentiel du traitement. Pour certaines mesures nécessitant l’utilisation de bactéries produisant de la lumière, deux animaux supplémentaires seront inclus afin de mesurer le niveau normal de signal. L’utilisation de ces bactéries bioluminescentes permet de suivre l’évolution de l’infection chez les mêmes animaux au fil du temps, sans avoir à les euthanasier pour obtenir ces données. Cela contribue à réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour mener à bien le projet.
Raffinement
Une période d’acclimatation de minimum 5 jours sera respectée. Les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilés avec des enrichissements appropriés, en groupes sociaux, y compris les souris contrôles non infectées (nécessaire à l’évaluation du bruit de fond de bioluminescence) qui seront à minima au nombre de 2 par étude afin d’éviter leur isolement. En cas d’agressivité, des enrichissements supplémentaires (cachette supplémentaire et un morceau de papier en cellulose de bois) seront ajoutés dans la cage afin de réduire au maximum l’agressivité et de ne pas avoir recours à l’isolement de l’animal agressif en première instance. Les actes techniques, en particulier ceux nécessitant une anesthésie des animaux seront, autant que possible, regroupés pour limiter le nombre d’anesthésie. Lors de chaque anesthésie, un gel oculaire sera appliqué afin d’éviter le dessèchement cornéen et les animaux seront placés autant que possible sur tapis chauffant ou sous lampe chauffante pour éviter l’hypothermie. Au cours de ces études, les animaux seront suivis par du personnel formé et qualifié au minimum 1 fois par jour et jusqu’à trois fois par jour (poids, suivi clinique avec grille de scoring et éventuellement mesure de la température corporelle) en fonction de la virulence de la souche bactérienne inoculée ainsi que des stades de progression de l’infection. Cela permettra de détecter les stades précoces d’un état de santé dégradé afin de mettre en place des mesures de prises en charge aussi rapidement que possible (mesures de soutien de type hydratation, hébergement individuel, …) ou la mise à mort en cas d’état de santé considérablement dégradé et irréversible. Ce suivi renforcé pourra être complété par une visite vétérinaire.
Choix des espèces
L’espèce souris a été choisie car c’est un modèle standard, polyvalent (multiplicité des souches disponibles dont certaines sans poil) et couramment utilisé dans les études d’infections bactériennes. De plus, sa taille réduite permet l’utilisation de technique d’imagerie optique corps entier ce qui est cruciale pour le suivi d’une infection généralisée. Les souches de souris sans poil (immunocompétentes ou immunodéficientes) seront privilégiées dans le cas d’utilisation de souches bactériennes bioluminescentes pour obtenir les résultats les plus pertinents (absence de la bioluminescence naturelle des poils donc augmentation de la sensibilité). De ce fait des souris OGMs immunodéprimées pourront être utilisées. Les animaux seront hébergés en cage et manipulée en environnement confiné permettant ainsi de maintenir leur statut sanitaire et de ne pas observer de dommages liés à leur immunodépression. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes, des deux sexes sans distinction, entre 6 et 9 semaines au moment de l’infection ou du premier traitement. Ce stade de développement permet d’avoir des animaux avec un système immunitaire mature (pas d’autre contrainte spécifique liée à l’âge).
Évaluation de la distribution sanguine et tissulaire ainsi que de l’élimination d’une immunoglobuline A dans un modèle murin d’inflammation de l’intestin.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Porteuses d'un récepteur humain et issues d'une lignée fournie par l'entreprise cliente, 15 souris subissent une inflammation intestinale induite, puis reçoivent par la bouche un anticorps marqué à un isotope radioactif. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, réparties en groupes de trois. Toutes sont tuées par surdose d'anesthésiques, avec un prélèvement de sang terminal, pour mesurer la radioactivité dans les organes et les fluides. L'étude répond à la demande du conseil scientifique d'une entreprise, qui veut savoir où son candidat médicament se distribue et s'il s'accumule dans des organes non ciblés.
Objectifs
Les études de pharmacocinétique sanguine, de distribution tissulaire et d’élimination de candidats médicaments biologiques représentent une étape essentielle dans le développement d’un médicament. Ces études, demandées par les conseils scientifiques des entreprises clientes, ont pour but la compréhension et l’analyse du devenir du médicament dans l’organisme, d’évaluer une potentielle accumulation de ce dernier dans les organes et/ou tissus et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables. Cette distribution est rendue possible par le marquage du candidat médicament avec un isotope radioactif non toxique aux doses utilisées, la radioactivité pouvant être suivie dans les tissus animaux après prélèvements. Notre projet vise à suivre le candidat médicament de notre client dans différents organes et à plusieurs moments différents afin d’évaluer sa distribution et son élimination. La souche de souris sélectionnée pour l’évaluation du candidat médicament est la lignée de souris fournie par notre client. Une inflammation intestinale sera induite chez les animaux avant l’administration par voie orale du candidat médicament préalablement marqués à l'élément radioactif afin de le tracer et de le quantifier dans les différents tissus et fluides biologiques d’intérêt. Le candidat médicament a été testé au préalable chez notre client et est connu pour ne pas présenter d’effets délétères. Il est dilué dans une solution respectant la physiologie de l’animal (solution saline).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser la distribution tissulaire du candidat médicament de notre client dans l’organisme (organes cibles et organes non-cibles où ils pourraient s’accumuler de manière non désirée).
Procédures
Sur animal vigile : administration du candidat médicament (1 fois, 15 s) , administration d'un prétaitement (2 fois, 15 s). Sur animal anesthésié : prélèvement de sang terminal sous analgésie (1 fois, 5 min).
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère liés à l’administration du composé radiomarqué (environ 15 sec). Stress / douleur liés à l’injection du mélange d'anesthésiques (surdosage pour euthanasie) (environ 10 sec), perte de poids momentané n’excédant pas 10% du poids initial.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux de la procédure lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : prélèvement d’organe, atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animal, fin de l’étude.
Remplacement
Le candidat médicament de notre client a déjà fait l’objet d’études d’efficacité in vitro et d’études in vivo au préalable. Néanmoins, évaluer la distribution tissulaire et l’accumulation d’un composé thérapeutique dans un organisme vivant implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité finale dépendra entre autres de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement, ce qui n’est, actuellement, pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet. De plus, pour être efficace, le traitement testé a besoin de l’environnement cellulaire car il engendre des mécanismes cellulaires. Enfin la biodistribution du candidat médicament dépend de sa voie d’administration et cette étude in vivo nous permettra de vérifier l’accessibilité du traitement à la zone de l’inflammation.
Réduction
Les groupes d'animaux utilisés sont composés de 3 animaux par groupe car la méthode de quantification par mesure radioactive est très précise et répétable.
Raffinement
Afin de réduire le stress des animaux une période minimale de 5 jours d’acclimatation à la zone d’hébergement est effectuée. Ils sont également manipulés progressivement et régulièrement lors des changes et des surveillances afin de les habituer aux contentions et autres manipulations. Les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux harmonieux de 3 par cage dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Toutes les cages de nos animaux contiennent trois enrichissements : tunnel placé en hauteur ou en bas en alternance, frisottis et coton ou buchette alternativement. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. La lignée de souris a été spécifiquement développée pour l’étude de l’inflammation de l’intestin (récepteur humain spécifique du candidat médicament et système immunitaire immunocompétent). Les souris seront utilisées à un âge de 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.
Etude du muscle squelettique chez les rongeurs par Imagerie et Spectroscopie par Résonance Magnétique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
595 souris mâles vont être utilisées, chacune pouvant passer jusqu'à douze examens d'imagerie par résonance magnétique de trois heures sous anesthésie gazeuse, espacés de quinze jours au minimum. 315 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 280 un niveau léger, et toutes sont tuées pour prélever les muscles des membres postérieurs. Des lésions musculaires leur sont infligées par injection de notexine ou par électroporation, et un agent de contraste est injecté pendant l'examen. Le porteur présente la résonance magnétique comme relevant du premier principe des 3R, remplacer, parce qu'elle évite des prélèvements invasifs, et conclut par ailleurs que le recours aux modèles animaux reste "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant le muscle.
Objectifs
Le phénomène de résonance magnétique nucléaire (RMN), a permis de développer les techniques d’imagerie médicale non invasive depuis plusieurs décennies. Les nombreuses innovations qu'a connues la RMN, en imagerie (IRM) et aussi en spectroscopie (SRM), laissent entrevoir de nouvelles applications. Les techniques d’IRM et de SRM sont des outils puissants dans le domaine des pathologies neuromusculaires et cardiaques (suivi de l’infiltration graisseuse, de l’inflammation, de l’œdème, des atteintes métaboliques…) et sont sans cesse en développement. Le projet soumis ici a pour but de développer dans la durée de nouvelles méthodes d’imagerie et de spectroscopie RMN pour améliorer l’évaluation du muscle squelettique et cardiaque chez les rongeurs. Ces outils pourront ensuite être utilisés en routine dans les projets en expérimentation animale ou transposés en clinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - D’un point de vue cognitif, il va permettre d’améliorer notre connaissance sur le tissu musculaire, sa structure et son fonctionnement. - D’un point de vue recherche préclinique, il va permettre la mise en place d’outils d’évaluation du muscle et le développement de nouveaux biomarqueurs du tissu musculaire. Ces nouveaux outils et biomarqueurs pourront ensuite être transposés en recherche clinique.
Procédures
L’ensemble des examens par résonance magnétique nucléaire (RMN), ainsi que l’induction des lésions musculaires localisées, seront réalisés sous anesthésie gazeuse. La durée maximale des examens RMN sera de 3 heures. Chaque animal pourra être soumis à un maximum de 12 examens RMN, espacés d’un intervalle minimal de 15 jours. L’induction des lésions musculaires sera brève, ne dépassant pas 15 minutes. Une analgésie préalable à la lésion sera effectuée par injection d’un analgésique. Les injections d’agent de contraste seront effectuées sur animal sédaté pendant l’examen RMN et le volume d’agent de contraste sera calculé de façon à avoir une concentration adaptée au poids corporel. À l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés après sédation, afin de permettre le recueil des échantillons musculaires.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances qui sont attendues sont liés aux anesthésies mise en œuvre dans ce projet pouvant induire une détresse respiratoire, si une fréquence respiratoire inférieure à 60 cycles/minute persiste, et une hypothermie si le système de maintien de la température corporelle présente un défaut. Dans le cadre du développement des méthodes d’imagerie, l’utilisation d’un agent de contraste sera nécessaire. Cette injection n’induit pas d’effets secondaires sauf une légère irritation au moment de l’injection en qui s’accompagne d’une augmentation transitoire de la fréquence respiratoire (quelques secondes). Enfin les modèles utilisés pour la validation des méthodes d’imagerie sont des modèles de dégénérescence/régénération musculaire peu traumatiques. Les lésions musculaires mises en œuvre n’induisent pas de phénotype dommageable ni perte de fonction mais pourrait réduire transitoirement un inconfort et une réduction de la mobilité des animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de chaque procédure expérimentale, afin de permettre le prélèvement de tissus musculaires des membres postérieurs en vue d’analyses histologiques.
Remplacement
La résonance magnétique nucléaire (RMN) s’inscrit dans le premier principe des 3R, Remplacer, en permettant d’évaluer in vivo un grand nombre de paramètres du tissu musculaire, réduisant ainsi le recours aux techniques invasives telles que l’histologie ou la biochimie, qui nécessitent souvent l’euthanasie de l’animal pour le prélèvement d’échantillons. Toutefois, à ce jour, aucun modèle in vitro ne reproduit fidèlement la complexité architecturale ni le métabolisme énergétique du muscle, qu’il soit squelettique ou cardiaque. L’utilisation de modèles animaux demeure donc indispensable à l’étude de ces tissus. Divers modèles animaux de pathologies neuromusculaires sont disponibles, notamment chez les rongeurs, les chiens ou les chats. Les modèles murins sont particulièrement répandus en recherche fondamentale et préclinique en raison de leur facilité de manipulation liée à leur petite taille, ainsi que de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques phénotypiques des pathologies humaines, telles que la fibrose, les cycles de dégénérescence/régénération musculaire et les processus inflammatoires.
Réduction
La complémentarité des techniques d’imagerie et de spectroscopie permet d’acquérir des données multiples à partir d’un même animal. Il est donc possible à partir d’un même examen, consistant en acquisitions de plusieurs séquences d’imagerie er de spectroscopie RMN, d’extraire plusieurs paramètres d’évaluation du tissu musculaire. De plus, la nature non-invasive de l’examen par RMN autorise l’observation du tissu musculaire sans induire de modifications durables de ce dernier. Par son caractère atraumatique, la RMN offre la possibilité de réitérer un examen sur un même animal sans effets nocifs pour les individus rendant possible le suivi longitudinal de l’évolution des pathologies et l’étude de l’efficacité dans le cadre d’essais thérapeutiques. Ces 3 spécificités de la RMN permettent dans le cadre de l’expérimentation in vivo de réduire le nombre d’individus nécessaires à une expérience comme le stipule la règle des 3R avec le 2ème R, Réduire. Le nombre total d’individus est de 595 individus. Les sous-groupes d’animaux sont au minimum de 10 individus. Ce nombre a été estimé de façon à avoir un nombre suffisant d’individus par groupe pour réaliser des tests statistiques standards.
Raffinement
La résonance magnétique nucléaire (RMN) répond également au troisième principe des 3R, Raffinement, grâce à l’évolution continue des outils méthodologiques et aux avancées technologiques en électronique, qui permettent aujourd’hui d’atteindre, en préclinique, des résolutions environ 3000 fois supérieures à celles obtenues avec les dispositifs cliniques les plus performants. Le raffinement s’applique également aux conditions d’hébergement des animaux, maintenus en groupes dans des cages à usage unique placées sur des portoirs ventilés, avec un enrichissement de l’environnement (tubes en carton, copeaux pour la nidification). Toutes les procédures RMN seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de garantir l’immobilité des animaux et de minimiser leur stress. Les modèles lésionnels seront mis en œuvre par du personnel qualifié, notamment pour les injections de notexine, de peptides et pour l’électroporation, réalisée sous anesthésie. La température corporelle sera maintenue à 38 degrés Celsius grâce à un tapis chauffant, et la fréquence respiratoire suivie en continu à l’aide d’un capteur pneumatique amagnétique. L’état de santé des animaux fera l’objet d’une surveillance quotidienne, conformément à la législation en vigueur, et leur poids sera systématiquement contrôlé avant chaque expérimentation afin de détecter toute perte anormale. Des points limites liés à l’état général de l’animal, la réalisation des lésions et la réalisation des examens RMN ont été définis.
Choix des espèces
En raison de leur petite taille et des conditions d’hébergement relativement simples qu’elles requièrent, les souris constituent un modèle animal aisément manipulable et largement utilisé en recherche biomédicale. L’ensemble des procédures sera réalisé chez des animaux ayant atteint l’âge adulte, compris entre 2 et 15 mois. Ce choix vise à limiter les variations interindividuelles liées à la croissance, susceptibles d’affecter la qualité des mesures, notamment en termes de répétabilité et de reproductibilité. Le développement méthodologique prévu dans ce projet nécessitera, dans une première phase, le recours à des animaux issus d’élevages commerciaux, avant une application ultérieure à des modèles pathologiques bien caractérisés. Les modèles lésionnels induits permettent d’étudier les mécanismes impliqués dans le développement de pathologies humaines. Dans le cadre de cette demande d’autorisation, qui concerne exclusivement un développement méthodologique, le choix a été fait de restreindre l’étude à des animaux de sexe mâle.
Etude de l’effet antitumoral d’ARN thérapeutiques ciblant RBM39
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées à l'issue pour récupérer leurs tumeurs et leurs organes, 1300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des ARN thérapeutiques contre le cancer, en particulier colorectal. Des cellules tumorales, humaines chez des souris immunodéprimées ou murines chez des souris immunocompétentes, leur sont greffées sous la peau des flancs, puis chaque souris subit cinq à six injections de luciférine et autant d'imageries de 30 minutes sous anesthésie, trois prises de sang derrière l'œil et des injections de traitements dans la veine, dans la tumeur ou dans l'abdomen, trois à cinq fois par voie employée. La croissance des tumeurs entraînera une perte de poids, de la fatigue et une anémie, et le porteur écrit que le traitement par indisulam "pourrait engendrer certaines toxicités". Il affirme que le recours à la souris est "indispensable" pour comprendre l'effet des traitements dans un "organisme entier", notamment leur toxicité. Il indique ne pas avoir encore évalué la toxicité des ARN thérapeutiques, prévue lors des expériences de mise au point, et place leur éventuel développement en clinique à "plus long terme".
Objectifs
Ce projet de recherche a pour but d'évaluer le potentiel antitumoral d’ARN thérapeutiques sur des modèles précliniques de cancer. Malgré de nombreuses avancées, en particulier avec l’arrivée des thérapies ciblées puis des immunothérapies, les thérapeutiques anticancéreuses actuellement disponibles restent limitées et des résistances émergent le plus souvent, nécessitant un changement de stratégie thérapeutiques. Il est donc essentiel de développer des nouveaux traitements, dont les mécanismes d’actions seraient différents des traitements actuellement utilisés, afin d’élargir le spectre des options thérapeutiques ais également de pouvoir adapter le traitement au patient et aux caractéristiques biologiques et moléculaires tumorales. Les arylsulfonamides sont une classe de drogue dont l’intérêt pour le traitement des cancers a été évalué. Nous avons récemment développé une approche thérapeutique via des ARN thérapeutiques, et avons fait la preuve de concept in vitro de leur activité antitumorale. Nous souhaitons donc avec ce projet valider nos observations in vitro.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à valider l'utilisation d'ARN thérapeutiques pour le traitement des cancers, en particulier le cancer colorectal. A plus long terme, ce projet pourrait aboutir au développement en clinique de ces mêmes ARN thérapeutiques.
Procédures
- Greffe de cellules tumorales sous-cutanée dans les flancs : Durée 10 minutes - 1 fois par animal / Injection intrapéritonéale de luciferine pour bioluminescence : Durée 1 minute - 5 à 6 fois par animal - Anesthésie gazeuse durant l'imagerie : Durée 30 minute - 5 à 6 fois par animal / Prélèvements sanguins retroorbitaires - Durée 2 minutes - 3 fois par animal / Injection de traitements par voie IV - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal / Injection de traitements par voie intratumorale - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal / Injection de traitements par voie intrapéritonéale - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal
Impact sur les animaux
La greffe de lignées cellulaires tumorales, suivi de la croissance des tumeurs, engendreront une altération de l'état général des animaux avec perte de poids, fatigue, et anémie principalement. Le traitement par indisulam pourrait engendrer certaines toxicités, même si la littérature décrit des toxicités systémiques limitées chez l'homme et la souris (rares anémies). Nous n'avons pas encore évalué la toxicité potentielle des ARN thérapeutiques, mais celle-ci sera évaluée grâce aux expériences de mise au point.
Devenir
Des tests sur des cellules tumorales cultivées au laboratoire nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles animaux est indispensable mieux comprendre leur effet dans un organisme entier, nottament concernant la toxicité. Cette étape est primordiale puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme. Afin d'évaluer l'effet de nos traitements sur les tumeurs, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs des animaux traités. Nous devons pour cela procéder à l'euthanasie et mise à mort systématique de l'ensemble des animaux du projet. L'étude biologique des tumeurs au laboratoire, ainsi que celles des tissus des autres organes est indidspensable pour évaluer les effets antitumoraux mais également la toxicité des traitements testés.
Remplacement
Des tests sur des cellules tumorales et des cellules normales en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action du traitement dans un organisme entier proche de l'homme, incluant des paramètres comme le développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques etc. qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux, nous utiliserons les mêmes animaux pour évaluer à la fois la prise et la croissance tumorale, la dose des traitements et leur toxicité. Nous utiliserons également les mêmes souris pour nos contrôles positifs et négatifs dès que ce sera possible. Cette association nous permet de réduire le nombre de souris contrôles utilisées. Le nombre d’animaux par lot sera également réduit au maximum afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Des enrichissements (maisons rouges) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, de la nourriture humidifiée sera accessible directement dans la cage pour éviter la déshydratation des souris. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant les injections, et lors de la phase de réveil. Des injections d'analgésique pré et postopératoire pourront être réalisées en fonction de l'expérience et de la souffrance de l'animal. Un suivi attentif quotidien par du personnel compétent et formé, weekend compris, sera également mis en place. L'environnement des animaux sera enrichi par des tunnels en polycarbonate. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA).
Choix des espèces
La souris représente l'animal classiquement décrit dans littérature pour ce type d'éxpérimentation. Nous utiliserons des lignées génétiquement modifiée immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale des xénogreffes de cellules humaines. L'utilisation d'un modèle syngénique nous permettra de valdier nos observations dans un système immunocompétent ce qui est essentiel pour envisager un dévellopement chez l'homme par la suite. Comme ce qui est classiquement décrit dans littérature pour ce type d'expérimentation, les animaux utilisés seront de 8 à 12 semaines.
Profil et circuits socio-émotionnels de deux lignées de souris exprimant des mutations du récepteur nicotinique α5 impliquées dans l’alcoolisme MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Pour étudier comment des mutations du gène CHRNA5, liées chez l'humain à un risque accru de dépendance à l'alcool, modifient les émotions et le comportement social, des souris porteuses de ces mutations sont comparées à des souris non modifiées. 756 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue sous anesthésie profonde pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles ont accès chaque jour à un biberon d'alcool pendant 6 à 12 semaines (144 souris), subissent une chirurgie du cerveau pour y injecter un virus ou implanter un dispositif (468), un enregistrement de l'activité cérébrale d'une heure sous anesthésie profonde (144), une activation ou une inhibition de zones du cerveau par la lumière à l'état éveillé (180), une contention de 15 minutes jusqu'à quatre fois (144), un test de comportement social de 10 minutes par jour pendant cinq jours (612) ou un isolement de 10 jours en cage individuelle avec roue (72). Le porteur présente la contention comme un "léger stress" dans la liste des procédures, puis écrit que ce "stress est modéré" et que les souris "finissent par s'y habituer".
Objectifs
Les problèmes liés à la consommation d'alcool sont très courants et dangereux dans notre société. Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS), 5 % des décès dans le monde sont causés par une consommation excessive d'alcool. Pour mieux comprendre ce problème et trouver des solutions, il est important de savoir comment notre corps et notre environnement influencent cette dépendance. Des études ont montré qu'une petite différence dans un gène, appelé CHRNA5, peut augmenter le risque de devenir dépendant à l'alcool. Toutefois, il reste difficile d'étudier ce lien chez les humains. Pour mieux comprendre, des chercheurs ont utilisé des rats qui avaient cette différence génétique. Ces rats avaient un risque plus élevé de rechute dans l’alcool après une période d’abstinence. De plus, ce gène joue un rôle important dans certaines parties du cerveau qui sont liées à la mémoire et aux relations avec les autres. Et les connexions entre ces zones du cerveau sont aussi liées à l’anxiété et au comportement social. L’objectif de cette recherche est d’étudier comment cette différence génétique affecte les émotions et les comportements sociaux, ainsi que la communication entre certaines parties du cerveau. Pour cela, nous utiliseront des souris spéciales qui ont cette même différence génétique, et les compareront à des souris normales. Nous observerons comment cela influence leurs comportements et leur consommation d'alcool, en étudiant aussi les différences entre les mâles et les femelles. Ensuite, nous enregistreront l’activité du cerveau des souris pour comprendre comment cette différence génétique change la manière dont les parties du cerveau communiquent entre elles. Puis nous essayeront de manipuler cette communication pour voir comment cela affecte les comportements sociaux des souris. Enfin, nous tenteront de remettre en place la version normale du gène dans le cerveau des souris pour voir si cela améliore leur comportement.
Bénéfices attendus
Des études ont montré qu'une petite différence dans un gène, appelé CHRNA5, peut augmenter le risque de devenir dépendant à l'alcool. Mais on ne sait toujours pas vraiment comment cela fonctionne. Malgré les graves conséquences de la dépendance à l'alcool sur la société, il existe très peu de traitements qui fonctionnent bien, et la plupart des personnes dépendantes rechutent après avoir essayé d'arrêter de boire. Les personnes qui souffrent de dépendance à l'alcool peuvent avoir des comportements très différents. Par exemple, certaines peuvent être anxieuses ou avoir des comportements antisociaux. Il est cependant compliqué de savoir si ces comportements sont causés par la consommation d'alcool ou s'ils étaient déjà présents avant. Notre projet a pour but de mieux comprendre comment les émotions et les comportements sociaux sont liés à la consommation d'alcool. Nous voulons savoir si ces comportements viennent de la consommation ou s'ils existaient avant. De plus, nous voulons prendre en compte les différences entre les sexes, car les réactions des hommes et des femmes peuvent être différentes. Ce projet pourrait nous aider à plusieurs niveaux. En tenant compte des émotions et pas seulement de la quantité d'alcool consommée, nous espérons comprendre comment cette différence génétique augmente le risque de dépendance. Si nous découvrons des comportements chez les animaux qui ressemblent à ceux observés chez les humains, cela pourrait nous aider à tester des traitements adaptés aux différents types de dépendance. Cela pourrait aussi conduire à des soins plus personnalisés, qui prendraient en compte la personnalité, le type de consommation d’alcool et le sexe de chaque personne, pour une meilleure efficacité. Enfin, nous cherchons à comprendre quelles parties du cerveau sont affectées par l'alcool et comment cela influence les comportements sociaux et émotionnels. Cela pourrait permettre de créer de nouveaux médicaments pour aider les personnes à arrêter de boire et à éviter les rechutes, en fonction de leur profil émotionnel et social.
Procédures
Les animaux passeront par plusieurs étapes dans cette étude : Ils auront accès à un biberon avec une solution d'alcool, une fois par jour, pendant 6 à 12 semaines (144 animaux). Ils subiront une petite opération sous anesthésie, d'environ 30 à 45 minutes, pour implanter un dispositif dans le cerveau (468 animaux). L’activité de leur cerveau sera mesurée sous anesthésie profonde pendant environ 1 heure après avoir stimulé une région spécifique du cerveau (144 animaux). Une technique utilisant la lumière permettra d'activer ou de désactiver certaines parties du cerveau chez des animaux éveillés, pendant 3 minutes (180 animaux, dont 90 pour l'activation et 90 pour la désactivation). Ils participeront à un test pour observer leur comportement social pendant 10 minutes par jour, sur une période de 5 jours (612 animaux). Ils seront soumis à un léger stress de restriction de leurs mouvements pendant 15 minutes, jusqu’à 4 fois au total, avec au moins une semaine de repos entre chaque session (144 animaux). Un petit échantillon de sang sera prélevé sous leur mâchoire. Certains animaux auront ce prélèvement une fois (288 animaux), d'autres deux fois, avec au moins une semaine d'écart entre les deux prélèvements (252 animaux). MODIFICATION: CERTAINS ANIMAUX SERONT PLACES EN ISOLEMENT SOCIAL DANS UNE CAGE CONTENANT UNE ROUE D'ACTIVITE PENDANT UNE PERIODE DE 10 JOURS AVANT D'ETRE REPLACES EN CAGE COLLECTIVE (72 ANIMAUX).
Impact sur les animaux
Les animaux participeront à différents traitements et tests au cours de cette étude : Consommation d'alcool : Ils auront accès à un biberon contenant de l'alcool une fois par jour pendant 6 à 12 semaines. Cela peut leur donner une sensation de détente et d'euphorie. Opération du cerveau : Ils subiront une intervention sous anesthésie pour injecter un virus ou placer un dispositif dans leur cerveau, ce qui dure environ 30 à 45 minutes. Le jour suivant, ils peuvent perdre un peu de poids, mais ils le récupèrent généralement en trois jours. Ils ressentent une légère douleur, bien contrôlée par des médicaments contre la douleur qu’ils reçoivent avant et après la chirurgie. Il peuvent être confronté au saignement après la chirurgie, l’infection de la plaie qui est bien gérée par une désinfection à la Bétadine et un suivi par l’expérimentateur. Dans de rares cas le dispositif implanté dans leur cerveau peut se décrocher. Enregistrement de l'activité cérébrale : Nous allons enregistrer l'activité de certaines parties de leur cerveau pendant environ une heure, sous anesthésie générale profonde, après avoir stimulé une région spécifique. Activation ou inhibition du cerveau par la lumière : Nous utiliserons une technique spéciale qui permet d'activer ou de calmer certaines parties du cerveau des animaux éveillés pendant 3 minutes. L'activation peut causer une légère anxiété temporaire, tandis que l'inhibition a un effet de diminution du stress. Test de reconnaissance des émotions : Les animaux seront observés lors d’un test qui dure 10 minutes par jour pendant 5 jours, pour observer leur comportement et réaction emotionelle. Cela peut provoquer un léger stress. Stress modéré : Les animaux seront placés dans un dispositif qui limite leurs mouvements pendant 15 minutes, jusqu'à 4 fois, avec une semaine entre chaque session. Ce stress est modéré, et les animaux finissent par s'y habituer. Prélèvement sanguin : Un petit échantillon de sang sera prélevé sous leur mâchoire. Cela est rapide mais peut causer une légère douleur et un stress momentané au moment où l’aiguille entre dans la peau. Certains animaux subiront ce prélèvement une fois, et d'autres deux fois, avec une semaine d'intervalle. MODIFICATION: CERTAINS ANIMAUX SERONT HEBERGES INDIVIDUELLEMENT DANS UNE CAGE CONTENANT UNE ROUE D'ACTIVITE PENDANT UNE PERIODE DE 10 JOURS AVANT D'ETRE REPLACES EN CAGE COLLECTIVE CE QUI PEUT GENERER UNE STRESS TEMPORAIRE LIE A L'ISOLEMENT.
Devenir
A la fin des procédures les animaux sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde pour la conservation des tissus (cerveau), qui seront analysés ultérieurement.
Remplacement
Ce projet étudie la manière dont les souris reconnaissent les émotions et comment cela est lié à la consommation d'alcool. À ce jour, il n'existe pas d'autres méthodes pour faire ces recherches sans utiliser des animaux. De plus, nous voulons comprendre comment certaines mutations génétiques influencent ces comportements. C'est pourquoi nous devons utiliser des souris spéciales qui ont les mêmes mutations que celles que l'on retrouve chez l'humain
Réduction
Nous optimisons le nombre d'animaux utilisés en réalisant plusieurs tests sur chaque animal au lieu de multiplier les groupes. Ainsi, les animaux passeront par différentes étapes de manière séquentielle (comme des opérations, des prélèvements, ou des tests de comportement). Avant de lancer un protocole complet, nous faisons d'abord des essais sur un petit groupe de 4 à 5 animaux pour voir si cela vaut la peine de poursuivre. Cela nous aide à éviter d'utiliser trop d'animaux. Si les résultats sont prometteurs, nous passons à un groupe de 12 animaux, qui est le nombre minimum que l’on estime nécessaire pour avoir des résultats fiables. Nous vérifions également que les données sont bien réparties avant de les analyser avec des méthodes statistiques appropriées.
Raffinement
Nous ferons tout pour garantir le bien-être des animaux pendant l'étude. Lors des opérations, ils recevront une anesthésie pour les endormir et des médicaments pour soulager la douleur. Si l'opération dure longtemps, nous les hydraterons avec une injection pour qu'ils ne soient pas deshydratés au reveil. Tous les animaux vivront dans un environnement confortable, avec des matériaux pour construire des nids et des endroits où se cacher. Ils seront gardés ensemble pour maintenir leurs liens sociaux, et des techniciens vérifieront leur état chaque jour. Si un animal montre des signes de douleur, les techniciens préviendront immédiatement le responsable de l'étude pour prendre des mesures. Si nécessaire, nous donnerons des médicaments ou des crèmes pour les aider à guérir. Nous pouvons aussi leur fournir de la nourriture spéciale pour les aider à manger. Après certaines opérations, nous utiliserons des matériaux doux pour éviter d’endommager les implants. Les tests qui leur permettent d’interagir chaque jour contribuent aussi à leur bien-être. Tous ceux qui s’occupent des animaux sont formés pour le faire correctement. Enfin, si un animal doit être euthanasié, cela se fera de manière douce, sans douleur, pour minimiser ses souffrances.
Choix des espèces
La souris est un animal souvent utilisé pour étudier le cerveau chez les vertébrés. Son système nerveux est organisé de manière similaire à celui des humains, et elle partage environ 95% de ses gènes avec nous, ce qui permet de transposer les résultats obtenus chez la souris à l'humain de manière assez fiable. De plus, la souris peut être génétiquement modifiée, ce qui nous aide à comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans de nombreuses maladies. Par exemple, grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées, nous pouvons étudier comment certaines mutations génétiques humaines affectent des molécules ou des récepteurs spécifiques dans le cerveau. Les souris adultes ont été choisies pour cette étude car elles présentent une maturation complète des systèmes physiologique et neurologique, nécessaire à l’analyse des processus socio-emotionnels. Plus spécifiquement, nous utiliserons des souris modifiées pour exprimer des mutations des récepteurs nicotiniques, liées à la dépendance à l'alcool chez l'humain. Les souris montrent également une variété de comportements sociaux et de réponses émotionnelles, ce qui en fait un modèle pertinent pour notre recherche sur les émotions et la consommation d'alcool.
Conséquences de l’exposition prénatale aux substances per et polyfluoroalkylées (PFAS) sur le placenta et le développement fœtal chez la souris gestante.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
162 souris gestantes reçoivent un gavage de PFAS par jour pendant toute leur gestation, sept gavages de cinq minutes chacun. Leurs 1 296 souriceaux sont comptés dans le projet, ce qui porte à 1 458 le nombre de souris utilisées, 1 296 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 162 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever le sang et les organes. Le porteur indique que les petits pourraient présenter un retard de croissance, des anomalies du comportement social et de la vocalisation, voire une mortalité néonatale en cas d'exposition importante. Il revendique la souris gestante comme un "organisme entier", tout en décrivant le modèle cellulaire complexe de placenta humain qu'il utilise en parallèle.
Objectifs
Des données émergentes suscitent des préoccupations concernant les effets de l'exposition aux polluants de la famille des substances per et polyfluoroalkylées (PFAS), sur la santé placentaire et le développement du fœtus, augmentant ainsi la vulnérabilité maternelle et fœtale. Particulièrement, quatre substances PFAS associés soit à des modifications histologiques de la vascularisation placentaire, soit à un vieillissement précoce des villosités placentaires. Des études épidémiologiques ont montré que l'exposition gestationnelle aux PFAS est associée à un risque accru de complications de la grossesse, notamment le développement de maladies cardiovasculaires comme la prééclampsie, et pourrait également exposer le fœtus à des effets néfastes sur sa santé, tels qu'un faible poids à la naissance. Par ailleurs, des travaux récents chez l'homme et l'animal ont suggéré que l’altération de la fonction vasculaire feto-placentaire pourrait constituer un mécanisme clé de toxicité aux PFAS pendant la grossesse. Le projet global consistera à étudier les effets de l’exposition aux PFAS durant la grossesse sur le placenta et le fœtus en s’appuyant sur des données collectées sur une cohorte de patientes suivies pendant leur grossesse en France pour l'exposition aux polluants, y compris les PFAS. Les PFAS associés à des altérations histologiques du placenta feront l'objet d'une étude approfondie dans notre projet. Les impacts de l’exposition aux PFAS candidats seront d'abord étudiés sur un modèle de cellules placentaires, puis sur un modèle d’explants de placenta humain, et enfin sur un modèle de souris. L’ objectif de ce projet sera : D’évaluer l'impact de l'exposition à ces PFAS sur le développement placentaire et fœtal chez la souris gestante.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples et s'inscrivent dans une perspective de prévention et d'amélioration des connaissances sur les risques liés à l'exposition aux PFAS durant la grossesse. La caractérisation des mécanismes par lesquels les PFAS affectent la santé placentaire et fœtale est cruciale pour mieux comprendre les risques d'une exposition au cours de la gestation. En effet, la perte d'intégrité placentaire est un phénomène qui peut non seulement perturber le déroulement de la grossesse, mais aussi altérer le développement du cerveau fœtal. L’utilisation du modèle de souris gestante permettra d’évaluer l'impact de l’exposition aux PFAS dans un environnement biologique plus complexe, facilitant l’observation des effets sur la santé du fœtus et sur le développement de possibles pathologies futures. Toutefois, bien que certaines études aient exploré les effets des PFAS sur la santé placentaire, aucune n’a jusqu'à présent approfondi la caractérisation de l'impact de ces substances sur la structure placentaire, ni étudié leur effet potentiel sur l'interaction entre le placenta et le développement cérébral du fœtus. Ce projet permettra de combler ces lacunes en apportant une compréhension plus élargie de la réponse gestationnelle aux PFAS et d’identifier des altérations du cerveau fœtal, connues pour évoluer en troubles cognitifs durant l'enfance. À long terme, ce projet permettra de mieux évaluer les risques sanitaires associés à l'exposition aux PFAS et de définir des critères pour une réglementation plus stricte. Il permettra d'élaborer de nouvelles stratégies de surveillance, de prévention et d'atténuation des risques liés à l’exposition aux PFAS chez les femmes enceintes et les fœtus, tout en permettant l'établissement de valeurs seuils à ne pas dépasser afin de réduire les risques de pathologies chez les générations futures.
Procédures
Les gavages réalisés seront effectués une fois par jour chez les souris femelles adultes gestantes pendant toute la gestation. Celle-ci durera 5 min par gavage et par animal. Au total chaque souris recevera 7 gavages au cours de la gestation.
Impact sur les animaux
Le gavage avec une solution de PFAS peut provoquer un inconfort temporaire, notamment lors de l’introduction de la sonde, ce qui pourrait entraîner une douleur se limitant à la période de manipulation. La procédure de gavage, en particulier si elle est répétée peut entrainer du stress ainsi qu'une perte de poids modérée et une réduction de la mobilité. Des effets liés aux PFAS peuvent également être observés comme des troubles gastro-intestinaux (diarrhée, vomissements légers). Les souriceaux pourraient présenter un retard de croissance (un poids à la naissance inférieur à la moyenne), des anomalies comportementales (recherche de nid, comportement social, communication via vocalisation), voire une mortalité néonatale en cas d'exposition importante aux PFAS. A long terme, des signes d’altérations neurologiques pourraient persister. Ces paramètres seront surveillés de très près pendant toute l’étude.
Devenir
Afin de mener ce projet et d’évaluer les effets des PFAS, le sang ainsi qu’un ou plusieurs organes seront prélevés sur les animaux pour être analysés, ce qui implique que les animaux devront être euthanasiés avant de réaliser ces prélèvements.
Remplacement
Cette étude examine les effets de l'exposition prénatale aux PFAS chez la souris gestante et son fœtus. L'objectif est de mieux comprendre comment ces substances peuvent affecter le fonctionnement du placenta et, potentiellement, le cerveau du fœtus, un organe particulièrement vulnérable. Les perturbations dans le développement du cerveau du fœtus peuvent avoir des conséquences importantes sur la santé du fœtus, à long terme. L’étude a été initiée par l’étude les liens entre les niveaux de PFAS dans le sang des femmes enceintes et des anomalies dans la structure du placenta. Cette analyse a été effectuée sur des données collectées sur une cohorte de patientes enceintes suivies durant leur grossesse pour examiner les liens possibles avec des marqueurs de vieillissement ou de vascularisation dans le placenta. Avant de passer sur le modèle animal, nous avons réalisé des études cliniques, in vitro et ex-vivo qui confortent nos hypothèses et nous incitent à considérer un modèle in vivo. Le projet comprend plusieurs volets innovants qui visent à réduire/remplacer l'utilisation des animaux en utilisant: - Un modèle cellulaire complexe de placenta qui regroupe les différents types cellulaires présent dans le placenta humain sera également utilisé pour étudier l'impact des PFAS, en simulant les interactions entre tous les types de cellules présentes dans le placenta. - A la suite de la publication des résultats sur le placenta humain et en vue de l’intérêt suscité par cette étude, des expériences en laboratoire seront menées sur des cellules placentaires humaines pour étudier les effets des PFAS et leurs effets sur le placenta. En dépit de toutes les approches citées ci-dessous, notre projet ne pourra pas se passer du modèle animal. En effet, l’organisme entier offre la possibilité d’étudier les réponses globales des différents types cellulaires et d'analyser les interactions entre différents organes, cas du placenta et du cerveau fœtal. Les mécanismes recherchés ne peuvent être caractérisés que dans un contexte d’organisme entier, et non sur des cellules isolées au laboratoire dans un contexte non physiologique. L’utilisation du modèle de souris dans un contexte plus physiologique propose une recherche complète qui fournira des informations sur les effets potentiels à court et à long terme. Ainsi, ce projet vise à fournir une compréhension approfondie des effets des PFAS pendant la grossesse et leur impact potentiel sur la santé du fœtus.
Réduction
Il est prévu d’utiliser 162 souris femelles qui donneront naissance à environ 8 souriceaux chacune, soit 1458 souris au total sur une durée de 5 ans. Ces souris seront divisées en plusieurs groupes et recevront un traitement différent de PFAS. Le nombre de souris femelles a été calculé et réduit au minimum de façon à ce que les résultats puissent être exploités et interprétés de façon fiable d'un point de vue statistique. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous sommes appuyés sur des données de la cohorte sur les patientes enceintes qui a identifié les PFAS les plus pertinents à caractériser dans un organisme entier, la souris gestante. Le modèle murin sera exclusivement employé pour valider les effets observés et réaliser des expériences complémentaires, et non pour des identifications initiales.
Raffinement
Les souris seront suivies tous les jours de la semaine par les personnes impliquées dans le projet et les week-end par les personnes d’astreinte. Les souris gestantes ayant mis bas avec leurs souriceaux seront suivies tous les jours dès l’accouchement, jusqu’au moment de séparation des petits de leur mère (J42). Différents paramètres permettant le suivi de l'aspect général comme le comportement, la locomotion, ainsi que la perte de poids seront estimées de façon régulière. La mise à mort et la collecte des échantillons seront effectuées sous anesthésie. Des critères d'arrêt sont prévus dans le projet en cas de survenue d’effets inattendus.
Choix des espèces
Le modèle choisi pour cette étude est le modèle animal souris gestantes, âgées de 8 à 14 semaines, qui permettra de suivre toutes les étapes de la gestation. Le modèle souris est choisi pour sa gestation courte et proche de la gestation humaine. Comme chez l’humain, la placentation chez la souris est hémochoriale, c’est-à-dire que les échanges entre la mère et le fœtus se font à travers la barrière placentaire sans que le sang de la Maman et de son fœtus ne soient mélangés. Plusieurs études ont démontré qu’il existe une grande similitude dans l’expression et la régulation des gènes clés de la placentation chez les deux espèces et que plusieurs facteurs qui régulent la formation de nouveaux vaisseaux sont exprimés dans des types cellulaires similaires et régulés de la même façon.
Identification du rôle de l’additif alimentaire nanoparticulaire phosphate tricalcique dans la survenue de l’allergie au blé chez un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Trois administrations d'alun et d'allergène du blé à une semaine d'intervalle, quatre prélèvements de selles, trois prises de sang et un gavage final destiné à déclencher la réaction allergique : 180 souris subissent ce protocole entre leur quatrième et leur septième semaine de vie. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus du système immunitaire et de l'intestin. L'additif visé, un phosphate tricalcique nanoparticulaire, entre aujourd'hui dans les préparations infantiles et a servi d'adjuvant vaccinal. Le porteur écrit que le protocole ne suscite pas ou peu de douleur et n'emploie donc aucun anesthésique en dehors de la mise à mort, après avoir décrit des souris recroquevillées une à deux heures sous l'effet de l'alun, une chute de leur température corporelle et des respirations sifflantes d'anaphylaxie.
Objectifs
Le projet vise à identifier comment un additif alimentaire, reconnu comme un nanomatériau et incorporé dans les formulations alimentaires pour équilibrer l’apport en phosphate et calcium, peut conduire à des désordres du système immunitaire via sa capacité à stimuler le système immunitaire et/ou son affinité pour des protéines identifiées comme allergènes. L’augmentation de la prévalence des allergies alimentaires observée depuis une vingtaine d’années coïncide avec l’augmentation de la consommation d’aliments ultra-transformés. Parmi les aliments ultratransformés, on trouve ceux contenant des additifs alimentaires, dont le risque de déclencher des réactions allergiques commence à être évoqué pour ceux contenant des nanoparticules. Les nanoparticules ont une grande capacité de couplage avec des protéines et donc des allergènes. Ces mélanges nanoparticules/allergènes peuvent à la fois favoriser l’exposition des allergènes dans le corps et interagir avec le système immunitaire en impactant la réponse immunitaire du corps. L’une des formes de l'additif contient 100% de nanoparticules. Elle a servi pendant plusieurs années de support à des vaccins comme adjuvant et est actuellement employée dans les préparations infantiles pour augmenter l’apport en calcium des nouveaux-nés. Notre question est donc : est-ce que l’additif alimentaire a un potentiel effet adjuvant de la réaction allergique chez le jeune enfant et notamment vis-à-vis d’un allergène majeur chez l’enfant : le blé ? L’allergène choisi est la gliadine native de blé, une protéine du blé.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’apporter des connaissances sur le mécanisme d’action d’un additif alimentaire dans la sensibilisation au blé. Par la comparaison des différents paramètres mesurés, le protocole répondra aux hypothèses formulées suivant la bibliographie, à savoir : 1) L'additif participe à la sensibilisation et au déclenchement de l’allergie alimentaire en favorisant l’exposition des allergènes et/ou limitant la digestion des protéines dans l'intestin. Ce mécanisme est basé sur les grandes capacités de couplage entre l'additif et les protéines dont les allergènes. 2) L'additif a la capacité de stimuler le système immunitaire, comme lorsqu’il est adjuvant de vaccins.
Procédures
Lors de ce protocole, toutes les souris subiront 4 prélèvements de selles, un juste avant la sensibilisation 1 = S1, un avant la sensibilisation 2 = S2, un avant la sensibilisation 3 = S3 et un la veille de la mise à mort. Les souris auront également 3 prises de sang espacées d’une semaine au minimum (avant les sensibilisations 1, 2 et 3). Les groupes sensibilisés soit 90 souris par sexe subiront 3 administrations à 1 semaine d’intervalle (S1, S2, S3), puis toutes les souris, soit 180, subiront 1 gavage oral. Les prélèvements de selles, les prises de sang et le gavage oral sont réalisés sur souris vigile. Chaque prélèvement de selles dure 10 minutes par souris et chaque prise de sang dure entre 1 à 2 minutes par souris. Chaque gavage oral dure une quinzaine de secondes par souris.
Impact sur les animaux
La phase de sensibilisation et la phase de déclenchement de l’allergie alimentaire peuvent contribuer à des nuisances. Lors de l’administration de l'allergène une légère douleur passagère peut être ressentie au point d'injection. L’alun entraine aussi une douleur passagère, les souris se recroquevillent, qui dure 1 à 2h. Les souris sensibilisées à l’alun sont à nouveau surveillées 3h après. Une baisse de la température corporelle des animaux est également observée quand l’animal déclenche une réaction allergique. Les souris pourraient ressentir des douleurs stomacales liées à l’administration de l’allergène par gavage. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris. Aussi, des symptômes caractéristiques de l’anaphylaxie peuvent être observés comme une respiration difficile et sifflante. Généralement, les effets surviennent entre 0 et 30 minutes après le gavage pour déclencher la réaction allergique et peuvent persister pendant une trentaine de minutes. Lors de la prise de sang à la queue une irritation passagère à la queue peut être ressentie.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude du système immunitaire et de la fonction intestinale.
Remplacement
Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les phénomènes intervenant à la fois sur le système immunitaire et la physiologie. Pour étudier le mécanisme de la réponse allergique, le modèle in vivo est donc actuellement le seul adapté.
Réduction
Sur la base d’une étude menée récemment au laboratoire, le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement exploitables sur les molécules d'intérêt dans l'allergie conduit à utiliser des groupes de 30 souris chacun. Dans la mesure où cette étude pourrait générer une alerte en santé publique, nous avons des groupes de 30 animaux.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi des signes généraux et le suivi des points limites sont effectués au quotidien afin de minimiser l’inconfort et la douleur. Pour minimiser la douleur stomacale provoquée par l'alun, de la nourriture est déposée à proximité de la souris dans la cage pour faciliter son accessibilité. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront herbergées dans les cages d’un portoir ventilé (température, humidité). Les souris seront hébergées en nombre de 5 par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse. L’eau et la nourriture seront mises à volonté dans les cages. Ce protocole ne suscitant pas ou peu de douleur chez la souris et afi de ne pas interférer avec les résultats du protocole, aucun anesthésique ne sera utilisé, mis à part à la mise à mort.
Choix des espèces
Au cours de cette étude seront utilisées des souris mâles et femelles. Les souris constituent un modèle reconnu dans le cadre des études du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de cette espèce et de la bibliographie existante. De plus, nos modèles d’allergie ont été établis sur cette espèce. Des analyses des molécules impliquées dans l'allergie seront réalisées. L’utilisation de ces souris nous donne accès à de nombreux outils sur le système immunitaire, notamment les anticorps présents dans l'allergie. Les souris utilisées auront 3 semaines de vie à réception (fraichement sevrées), , 4 semaines de vie à la première sensibilisation (adolescence), 7 semaines au moment du gavage oral et de la mise à mort (âge de maturité sexuelle complète).
Rôle des cellules acquises pendant la gestation en conditions normales et pathologiques dans un modèle murin de polyarthrite rhumatoïde
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
459 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 260 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 199 un niveau léger. Chaque geste se fait sous anesthésie gazeuse, cinq prises de sang étalées sur sept mois pour 199 d'entre elles, quatre injections espacées de deux semaines puis neuf prises de sang sur cinq mois pour les 260 autres. Le projet cherche à comprendre pourquoi les femmes développent plus souvent une polyarthrite rhumatoïde, en suivant chez la souris les cellules échangées entre la mère et le fœtus, les thérapies personnalisées annoncées étant renvoyées au long terme. Leurs organes sont prélevés après la mise à mort et conservés en biobanque, pour un atlas que le porteur présente comme un moyen d'éviter d'utiliser de nouveaux animaux plus tard.
Objectifs
Il s’agit de comprendre pourquoi les femmes sont plus souvent atteintes par les maladies autoimmunes Rhumatismales. Une maladie autoimmune est une maladie où le corps se défend à tort contre soi, et ici il s’agit d’une maladie rhumatismale appelée polyarthrite rhumatoïde dont la cible est l’articulation. L’objectif est d’analyser le rôle des cellules semi-étrangères qu’un individu peut recevoir au cours de sa vie. Les femmes, comme les hommes, reçoivent des cellules maternelles pendant leur vie in utero. Chacun peut également recevoir des cellules d’un jumeau né ou non. Ces cellules issues d’un échange entre jumeaux s’appellent des cellules gémellaires ou fraternelles. Mais les femmes ont la particularité de recevoir, en plus de ces cellules maternelles et fraternelles, des cellules foetales quand elles sont enceintes. Ces cellules reçues à différents stades de la vie persistent des décennies chez leur hôte. La plupart du temps elles ne sont pas néfastes, voire même bénéfiques, pouvant contribuer à la réparation des tissus. Cependant, ces cellules, bien que peu nombreuses chez leur hôte, sont capables de produire des protéines appelées autoanticorps qui participent au développement des maladies autoimmunes rhumatismales. Elles y participent dans un contexte génétique particulier que nous étudions chez la souris. Nous pouvons réaliser des croisements différents mimant les différents contextes génétiques humains. Nous pouvons aussi visualiser et traquer ces cellules semi-étrangères issues des échanges foeto-maternels ou gémellaires grâce à des modèles de souris. Le but est de comprendre comment chaque source, maternelle, gémellaire et/ ou foetale peut indépendamment ou en collaboration avec d’autres, participer au déclenchement d’une maladie autoimmune rhumatismale chez leur hôte.
Bénéfices attendus
A court terme ce projet apportera de nouvelles connaissances. A plus long terme, ce projet permettra de proposer de nouvelles thérapies personnalisées en fonction du sexe, afin de cibler ces cellules et/ou de les orienter vers une influence moins néfaste et d’enrayer le processus d’auto-immunité.
Procédures
Les interventions sur les animaux seront toutes réalisées sous anesthésie gazeuse : - sur 199 animaux : 5 prises de sang (acte durant chacun moins d’une minute) par animal sur une durée de 7 mois - sur 260 animaux : 4 injections à 2 semaines d’intervalle et 9 prises de sang (actes durant chacun moins d’une minute) sur une durée de 5 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress lors de la manipulation pour les placer dans la boite d’anesthésie gazeuse, et lors du réveil. Les prises de sang et les injections (équivalentes à piqûre pour vaccination) sont susceptibles d’induire une douleur/gène au point d’injection.
Devenir
A l'issue de la chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs organes qui seront analysés grâce à des techniques courantes de laboratoire (microscopie, …) et conservés en biobanque.
Remplacement
Il n’est pas possible d’utiliser des modèles in silico (modèle informatique) ou in vitro pour étudier le rôle des cellules acquises pendant la grossesse chez l’hôte et en particulier son rôle immunitaire. Seul un modèle murin peut permettre d’analyser la réponse immunitaire dans son intégralité, et qui implique différents organes.
Réduction
Les travaux précédents nous ont permis de définir les conditions d’immunisation et les croisements les plus propices à obtenir des échanges foeto-maternels (nombre de gestations etc..) et de connaitre les pourcentages de souris qui produisent des anticorps après immunisation pour quelques groupes. Ceci permet de calculer au plus juste le nombre d’animaux utilisés. Pour les groupes pour lesquels nous ne connaissons pas les pourcentages, nous planifions de commencer par immuniser 12 souris, puis analyserons les statistiques et n'augmenterons les effectifs que si nécessaire pour réduire au maximum le nombre à utiliser. Un morceau de chaque organe prélevé après mise à mort de l’animal sera cryopréservé, extrait en ADN et/ou préparé pour des coupes microscopiques qui pourront permettre des analyses ultérieures de recherches plus précises de cellules maternelles, gémellaires et/ou foetales au fur et à mesure du développement de nouvelles technologies, évitant ainsi d’utiliser de nouveaux animaux. Cette biobanque permettra d’établir un Atlas complet de chaque organe et pourra être mise à disposition pour de futures études collaboratives. Par exemple ici nous ne disséquons pas le cerveau pour en connaitre la composition exacte et le type de cellules maternelles, mais un spécialiste dans le domaine pourra analyser ces échantillons sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux dans le futur.
Raffinement
Chaque cage sera pourvue d’un enrichissement, rouleau en coton/ dôme en cellulose/ papier de Kraft pour satisfaire l’instinct naturel de nidification et offrir un confort optimal et une sécurité pour les souris. Après les prélèvements ou immunisations qui sont faits après anesthésie gazeuse ( 5 à 6 min), les souris seront placées dans leur cage chauffée sous lumière chauffante pour que l’animal ait suffisamment chaud au réveil. A chaque prélèvement, l’animal sera pesé et observé pour être sûr de sa bonne santé. Une fiche d’observation sera remplie afin d’assurer un suivi de l’état des animaux et de prendre les mesures adaptées (surveillance accrue, apport de nourriture gélifiée) le plus précocement possible. Si ces mesures sont insuffisantes, et que l’état de l’animal ne s’améliore pas ou se dégrade, il sera euthanasié avant la mise à mort prévue initialement.
Choix des espèces
La femelle souris est un modèle très proche de la femme en termes de placentation et d’échanges de cellules foeto-maternelles ou gémellaires pendant la grossesse. C’est également un bon modèle pour le suivi d’une réponse immune. De plus, il est possible d’utiliser des souris de génétique différente, ce qui nous permet de tracer et d’évaluer le rôle de ces cellules semi-étrangères (acquises pendant la grossesse) dans les maladies autoimmunes. Pour comprendre où vont ces cellules semi-étrangères en condition normale, non pathologique, et comment elles évoluent au cours du temps, les animaux sont étudiés à diférents stades de développement après sevrage : à 3 à 4 semaines de vie, au stade jeunes adultes (
Rôle des lymphocytes T dans l’inflammation chronique et le cancer
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
169 des 316 souris passent jusqu'à sept minutes sous irradiation, les autres reçoivent des injections. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées pour prélever leurs organes. Une colite ou une tumeur leur est induite, avec diarrhée, déshydratation, perte de poids progressive et posture anormale, pour comprendre comment naissent des lymphocytes T dits de type souche, que le porteur déclare impossibles à produire in vitro faute d'en connaître les mécanismes, et dont ce même projet pourrait un jour permettre la production sans animaux. Le choix de la souris est justifié par les résultats antérieurs du laboratoire et par les lignées transgéniques disponibles, les cages étant placées sur un portoir réservé aux lignées immunodéprimées.
Objectifs
Les cellules du système immunitaire ne sont pas toutes identiques. Certaines, appelées lymphocytes T de type « souche », ont une capacité étonnante : elles peuvent se régénérer, vivre longtemps et donner naissance à d’autres cellules spécialisées chargées de défendre l’organisme. Dans le cas du cancer, ces cellules sont un atout : elles forment une réserve durable de lymphocytes capables de reconnaître et d’éliminer les cellules tumorales. Mais dans les maladies inflammatoires chroniques, comme les maladies inflammatoires de l’intestin, leur rôle semble moins favorable. Elles pourraient entretenir, au fil du temps, une inflammation excessive en servant de « réservoir » pour des cellules qui attaquent les tissus de manière continue. Nos travaux cherchent à mieux comprendre ces lymphocytes T de type souche. Nous voulons savoir comment ils apparaissent, quels signaux les transforment en cellules inflammatoires, et quel impact ils ont réellement dans des contextes aussi différents que le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Pour cela, nous utiliserons deux modèles expérimentaux chez la souris (un modèle de colite et un modèle de cancer) afin d’identifier ces cellules, d’étudier leur fonctionnement et, à terme, de mieux cibler leur action pour améliorer les traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à décrypter le rôle précis des lymphocytes T de type souche, en tant que réservoirs de lymphocytes T pro-inflammatoires ou anti-tumoraux à long terme. Mieux comprendre leur biologie pourrait permettre : - De développer des stratégies thérapeutiques ciblées visant ces cellules dans les maladies inflammatoires chroniques. - Et d’optimiser l’immunothérapie dans le cancer, en exploitant leur potentiel bénéfique.
Procédures
169 souris seront soumis à une irradiation qui durera quelques minutes (max 7 min). Les 316 souris vont être injectées et ces injections dureront quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables : Pour le modèle de colite sont : • Diarrhée ou selles molles, • Perte de poids progressive liée à l'inflammation intestinale. • Déshydratation, en cas de diarrhée importante. • posture anormale. Pour le modèle tumoral sont : • Inflammation locale : rougeur ou gonflement au site de la tumeur. • Perte de poids progressive, • Posture anormale. l’irradiation des souris peut provoquer une légère léthargie (activité diminuée) et une perte de poids modérée.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélevement d'organes afin d'analyser phénotypiquement et fonctionnellement les cellules immunitaires.
Remplacement
La génération des lymphocytes T de type souche est impossible in vitro car on ne connait pas encore les mécanismes moléculaires permettant leur génération. Pour l’instant, aucune méthode alternative in vitro n’est adaptée afin de remplacer totalement le modèle murin. Toutefois, nos résultats pourraient permettre à terme la génération des ces lymphocytes in vitro et permettrait de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés pour l’étude de cette pathologie.
Réduction
Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif pour ne pas à avoir à répéter des procédures. Chaque animal inclus dans l'analyse est utilisé de façon optimale pour permettre l'analyse simultanée d'un maximum de paramètres et réduire encore le nombre d'animaux. Nous ne produisons ni ne commandons plus d'animaux que ceux nécessaires à chaque expérience. Enfin, l’excédent de cellules sera congelé pour utilisation ultérieure ce qui nous permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans une animalerie à statut sanitaire contrôlé. Ils sont hébergés dans des cages ventilées, placées sur un portoir réservé aux lignées immunodéprimées. Les cages, la litière, l’enrichissement, la nourriture et l’eau sont stérilisés avant utilisation. Les animaux sont manipulés et transférés sous une hotte de change désinfectée selon un protocole spécifique. Ces mesures permettent de réduire au minimum le risque d’infection ou de pathologie non désirée.
Choix des espèces
Nos résultats précédents ainsi que la majorité des données de la littérature sur lesquelles nous nous appuyons ont été obtenus chez la souris. Il est à noter que les résultats que nous avons obtenu au niveau des lymphocytes T dans le modèle de colite chez la souris nous ont permis de valider ce mécanisme chez les patients, ce qui démontre la pertinence des approches que nous utilisons. Enfin, il existe déjà des modèles de souris transgéniques dont l'utilisation permettra de répondre à certaines de nos questions. La souris représente donc un modèle particulièrement adapté à notre étude pour décrypter les mécanismes qui contrôlent la génération de la population T de type souche et les facteurs qui influencent leur programme de différenciation en cellules nocives. Pour toutes les procédures, nous utiliserons des animaux adulte (entre 8 et 12 semaines) qui possèdent un système immunitaire mature.