Souris
Thérapie génique par sonoporation sur un modèle murin de glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Ouverture du crâne, injection de cellules tumorales dans le cerveau, pose de cathéters, ultrasons focalisés associés à des microbulles de gaz: chaque chirurgie dure jusqu'à une heure. 2 081 souris vont être utilisées, dont 1 481 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 600 un niveau modéré, toutes mises à mort pour prélever le cerveau et d'autres organes. Le porteur décrit la sonoporation comme une technique non invasive et indique que les ultrasons ne sont pas censés provoquer de nuisances. Il ajoute que des paramètres non optimaux pourraient entraîner des atteintes tissulaires et des troubles fonctionnels sévères, situations qu'il dit rares.
Objectifs
Contexte : La barrière hémato-encéphalique (BHE) agit comme un filtre protecteur entre le sang et le cerveau. Elle empêche 98% des petites molécules thérapeutiques d’atteindre le système nerveux central (SNC), limitant ainsi l'efficacité des traitements. Le glioblastome, cancer cérébral le plus fréquent avec 3500 nouveaux cas annuels, demeure incurable malgré les thérapies actuelles, en raison notamment de l’imperméabilité de la BHE. Ce projet explore une stratégie de thérapie génique utilisant le principe de sonoporation : il s’agit d’ouvrir temporairement la BHE grâce à des ultrasons focalisés (FUS) associés à des microbulles de gaz (MBs) afin de faire pénétrer des acides nucléiques (ANs) directement dans la tumeur. Objectifs de l’étude : 1) Vérifier que l’utilisation des MBs combinée aux FUS est sûre, reproductible et efficace pour permettre aux vecteurs thérapeutiques de franchir la barrière et d’atteindre la tumeur. 2) Analyser la biodistribution des vecteurs et des MBs après la sonoporation. 3) Suivre l'expression du vecteur dans la tumeur au fil du temps et évaluer son potentiel thérapeutique en déterminant les effets biologiques et cellulaires du traitement sur la tumeur.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal de ce projet sera la mise en place d’une preuve de concept d’un protocole de thérapie génique contre le cancer du système nerveux central (SNC). Il permettra d’étudier et de valider, dans un contexte physiopathologique pertinent, l’efficacité de la délivrance d’acides nucléiques dans la tumeur, de manière sûre, reproductible et efficace. L’expression du transgène dans la tumeur offre plusieurs avantages : -La charge thérapeutique est délivrée au plus près des cellules cibles, limitant l’exposition des tissus sains et les effets indésirables systémiques. -Elle constitue un marqueur direct d’efficacité, validant la capacité de la technologie à cibler, pénétrer et transfecter spécifiquement la tumeur. -Elle permet d’étudier in situ les effets moléculaires et cellulaires de la thérapie génique, y compris les interactions avec la vascularisation et le système immunitaire local. Ce projet s’appuie sur l’expérience acquise lors de deux projets précédents. Ces travaux ont permis d’identifier des paramètres acoustiques sûrs et efficaces pour perméabiliser la BHE et délivrer des acides nucléiques efficacement dans le SNC. Ils ont permis de maitriser les procédures ultrasonores, la manipulation des microbulles et des vecteurs, ainsi que la mise en place de technique d’imagerie in vivo (fluorescence, bioluminescence, échographie de contraste). Ces acquis garantissent que le protocole proposé pour les modèles tumoraux repose sur des bases solides. Sur le plan scientifique, les avancées attendues comprennent le criblage in vivo de molécules efficaces, l’étude de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats pour une éventuelle utilisation en clinique. Enfin, le projet vise à apporter une nouvelle approche thérapeutique spécifique et efficace pour lutter de façon durable contre le glioblastome.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux ne subiront aucun prélèvement. Certains animaux subiront une injection intracrânienne de cellules tumorales. Cette phase de chirurgie comprend l'anesthésie, l'ouverture du crâne de la souris, l'injection des cellules tumorales ainsi que la fermeture et pose de points de suture, nécessitant une durée d'une heure maximum. Les autres interventions comprennent les poses de cathéters pour l'injection des agents de contrastes pour le suivi tumoral par échographie et l'injection d’un mélange microbulles de gaz/acides nucléiques dans le cadre d’une procédure de sonoporation. La sonoporation est une technique non invasive utilisant des ultrasons pour augmenter temporairement la perméabilité des membranes cellulaires et faciliter l’entrée de molécules thérapeutiques dans les cellules. Lors de ces injections, les animaux seront sous anesthésie générale pour une durée comprise entre 30 min et 1 heure. Enfin, certains animaux sont soumis à une chirurgie terminale réalisée sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues dans ce projet sont principalement liées aux interventions chirurgicales, aux injections, à la pose de cathéters et à l’anesthésie générale. L’implantation de cellules tumorales entraîne le développement progressif d’une tumeur, susceptible d’affecter le bien-être des animaux. Les interventions chirurgicales peuvent occasionnellement entraîner des effets indésirables modérés, tels qu’un retard de cicatrisation ou un risque infectieux. Les procédures impliquant l’utilisation d’ultrasons ne sont pas censées provoquer de nuisances dans les conditions expérimentales prévues. De manière exceptionnelle, en cas de paramètres non optimaux, des atteintes tissulaires pourraient survenir et se traduire par des troubles fonctionnels transitoires ou plus sévères. Ces situations restent rares et ont été très peu observées lors de projets antérieurs. Enfin, les manipulations et la contention des animaux, bien que de courte durée, peuvent générer un stress ou une anxiété temporaire, susceptibles d’altérer transitoirement leur bien-être.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever les cerveaux et autres organes pour des analyses approfondies. Ces analyses permettront notamment d’étudier l’état des tissus, d’évaluer la toxicité de la procédure et d’analyser l’expression de gènes d’intérêt impliqués dans les mécanismes biologiques étudiés.
Remplacement
Le modèle animal est essentiel pour étudier l'impact de nos protocoles de thérapie génique sur l'organisme entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires, organes et vascularisation, éléments qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico. Dans le cas du glioblastome, la forte hétérogénéité de la structure et de la perméabilité de la barrière tumorale hémato- encéphalique (BTHE) rend quasiment impossible l’utilisation d’un modèle 3D in vitro. Bien que des études in vitro aient permis de démontrer certains mécanismes de perméabilisation cellulaire et d’expression génique (modulation de la perméabilité endothéliale sous ultrasons, étude de transfection dans des cultures cellulaires), ces modèles ne reproduisent pas la complexité de la tumeur notamment la vascularisation dynamique et les interactions cellulaires entre cellules tumorales et l’endothélium, mais également l’absence de système immunitaire et du microenvironnement tumoral. De plus, l’utilisation d’ultrasons focalisés couplés à des microbulles implique des phénomènes physiques complexes tels que la cavitation, la modulation transitoire de la perméabilité vasculaire et la pénétration dans le tissu tumoral, qui ne peuvent être reproduits de manière pertinente qu’en modèle in vivo. Enfin, le but ultime de cette recherche est de développer une stratégie thérapeutique transposable en clinique chez l’homme pour le traitement du glioblastome, l’étape préclinique est donc indispensable car elle fait partie d’un processus réglementaire.
Réduction
Afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux, des études préalables ont été réalisées en laboratoire, sans recours à l’animal, pour vérifier le bon fonctionnement et l’innocuité de la technologie développée. Seules les conditions ayant montré des résultats satisfaisants lors de ces études préliminaires ont été retenues pour la suite du projet. Des travaux antérieurs menés chez la souris ont également permis de valider le principe général de la méthode utilisée. Toutefois, la présence d’une tumeur peut modifier la réponse au traitement, ce qui rend nécessaire l’ajustement de certains paramètres dans le cadre de ce projet. L’expérience acquise lors de ces études précédentes permet néanmoins de réduire fortement le nombre de conditions à tester et, par conséquent, le nombre d’animaux utilisés. Le protocole expérimental a été conçu de manière à comparer, lorsque cela est possible, des zones traitées et non traitées chez un même animal. Cette approche permet de réduire le nombre total d’animaux tout en garantissant des comparaisons fiables. Enfin, le nombre d’animaux a été estimé de façon rigoureuse afin d’obtenir des résultats scientifiquement exploitables tout en utilisant le strict minimum nécessaire. Seules les expériences indispensables et justifiées seront réalisées.
Raffinement
Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale, associée à une prise en charge adaptée de la douleur afin de la réduire au maximum. Une analgésie sera administrée avant l’intervention et maintenue après la chirurgie afin d’assurer l’absence de douleur pendant et immédiatement après la procédure. Pendant la phase expérimentale, l’administration prolongée de traitements contre la douleur sera limitée lorsque cela est nécessaire pour garantir la validité scientifique des résultats, tout en veillant à préserver le bien-être des animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne attentive, et des critères cliniques prédéfinis permettront de décider d’une mise à mort anticipée si l’état de l’animal l’exige. Une partie des évaluations sera réalisée à l’aide de techniques non invasives, permettant de limiter les manipulations et le stress. Ces examens seront effectués sous anesthésie de courte durée. Enfin, après toute manipulation ou intervention, des mesures de confort et de bien-être seront mises en place, notamment par l’enrichissement du milieu de vie et l’utilisation de renforcements positifs.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est indispensable pour étudier in vivo la perméabilisation dynamique de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et de la barrière hémato-tumorale (BHTE), notamment avec les ultrasons focalisés couplés à des microbulles. La souris offre un compromis optimal entre complexité physiologique, accessibilité expérimentale et disponibilité d’outils (lignées tumorales, ressources génétiques et immunologiques, protocoles chirurgicaux). Les modèles in vitro, bien que précieux en amont et déjà employés pour caractériser les microbulles, ne reproduisent pas fidèlement les interactions complexes entre BHE/BHTE, système vasculaire, inflammation et microenvironnement tumoral, ni les contraintes mécaniques et réponses immunitaires de l’organisme entier. Nous utilisons une lignée tumorale murine, avec ou sans marqueur fluorescent, greffée sur des souris ayant un système immunitaire efficace, assurant un modèle pertinent et proche des conditions cliniques humaines. L’emploi de la souris, modèle robuste et largement validé en oncologie préclinique, est donc indispensable avant toute extrapolation clinique. Nous utiliserons les souris au stade adulte (à partir de 8 semaines environ) où le comportement est supposé être stabilisé. Les animaux seront donc adultes au moment de l’injection des cellules tumorales, à un stade où le pouvoir prolifératif reste important sans pour autant avoir à toucher au développement normal de l’animal . De plus, les glioblastomes de grade IV touchent majoritairement les adultes chez l’Homme, d’où le choix de travailler sur des souris adultes.
Thérapie cellulaire de tumeurs solides réfractaires au traitement
- Recherche appliquée
- Cancers
840 souris greffées d'une tumeur sous la peau du flanc puis irradiées sous anesthésie générale reçoivent aussi des injections de monocytes dans la queue. Parmi elles, 300 sont utilisées dans des procédures menées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les 540 autres subissant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort à la fin pour analyse des tumeurs. Le porteur attend une perte d'appétit, une perte de poids et une prostration liées aux symptômes tumoraux, et présente la thérapie testée comme un espoir pour des cancers du sein, du pancréas ou pédiatriques. Sur le remplacement, il affirme que seul un animal vivant et entier permet d'étudier le microenvironnement de la tumeur, et qualifie d'"irremplaçable" le rôle de la voie intraveineuse pour acheminer les monocytes.
Objectifs
Il y a une grande urgence médicale d’établir une thérapie cellulaire capable d’infiltrer les tumeurs solides et de détruire les cellules cancéreuses. Les monocytes sont des cellules immunitaires qui possèdent une capacité intrinsèque à migrer dans les tumeurs solides et à se différencier en macrophages associés aux tumeurs. Récemment, on a démontré que le transfert adoptif des monocytes augmentés pour leurs capacités de se différencier en macrophages phagocytaires à des modèles de souris de leucémies lymphoblastiques aigues T, réduisait la progression leucémique et prolongeait significativement la survie des souris. La radiothérapie, outre ses effets provoquant la mort des cellules cancéreuses, elle induit la sécrétion tumorale des chimiokines qui augmentent l’infiltration des cellules immunitaires et particulièrement les monocytes. De ce fait, dans ce projet on souhaite cibler les tumeurs solides difficiles à traiter par la thérapie cellulaire, basée sur le transfert adoptif des monocytes, seule ou en combinaison avec la radiothérapie.
Bénéfices attendus
Les tumeurs solides difficiles-à-traiter appartenant aux cancers du sein triple négatif, cancers ovariens, mélanomes, adénocarcinomes canalaires pancréatiques et aux cancers pédiatriques (tels que les gliomes, l’ostéosarcomes et les neuroblastomes), sont toutes caractérisées par une forte récurrence après la première ligne de traitements standards et une liste d’options thérapeutiques très limitée. La thérapie cellulaire des monocytes en combinaison avec la radiothérapie offre un espoir thérapeutique grâce à son pouvoir de résider la tumeur solide et de la tuer de l’intérieur en boostant une immunité antitumorale. Nous espérons pouvoir améliorer la survie de ces patients à court et à long terme.
Procédures
Deux injections sous anesthétique locale, durée maximale 2 minute. Radiothérapie ponctuelle ciblée sur la tumeur sous anesthésie générale une séance de 5 minutes. Certains animaux auront un prélèvement de sang sans réveil sous anesthésie générale et analgésie, durée maximale 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées aux symptômes tumoraux: perte d'appétit, perte de poids et prostration des animaux. Ces effets attendus sont de gravité modérée. Des nuisances transitoires attendues qui sont liées aux rasages du flanc droit de la souris, les injections sous-cutanées des cellules tumorales et les injections intraveineuses des monocytes dans la queue. Aucune perte de poids, splénomégalie ou prostration des animaux ne sont observées et causées par les injections des monocytes seuls.
Devenir
Les animaux inclus dans l'expérimentation seront mis à mort à la fin de la procédure pour analyse des tumeurs.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier le micro-environnement cellulaire de la tumeur solide et l’immunité anti tumorale dans sa globalité avec toutes les interactions nécessaires (système immunitaire, voies hormonales, médiateurs physiologiques). Cet environnement est impossible à reproduire dans toute sa complexité et sa régulation in vitro ou ex vivo.
Réduction
Tous les modèles des tumeurs qui seront utilisés dans ce projet sont déjà criblés et validés in vitro comme cibles de phagocytose par les macrophages dérivés des monocytes augmentés pour la phagocytose. En plus, tous les modèles de tumeurs solides utilisés dans ce projet sont déjà établis au laboratoire. Cela permet donc de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour répondre à la thérapie cellulaire ainsi pour la mise au point des modèles des tumeurs solides. De plus, les animaux développent des tumeurs de façon homogènes et reproductibles (100% de prise tumorale). On a aussi eu recours à des méthodes statistiques pour réduire au maximum le nombre de souris par groupe.
Raffinement
Les animaux seront pesés trois fois par semaine et examinés quotidiennement pour examen clinique. Dès l'apparition d'un signe clinique, les animaux recevront un antalgique. Les injections sous-cutanées des cellules tumorales et intraveineuses des monocytes seront réalisées après une anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe avec un enrichissement de la cage type sizzlenest et recevront nourriture et boisson ad libitum. Les études d’efficacité chez la souris dans d’autres types tumoraux n’ont montré aucun effet toxique de l’injection des monocytes. Aucune perte de poids, splénomégalie ou prostration des animaux étaient observées causées par les injections des monocytes seuls. En cas de perte d'appétit ou d'amaigrissement, les animaux auront un aliment adapté, appétent, plus riche et plus préhensile. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La thérapie cellulaire est un traitement systémique dans les voies intraveineuses qui ont un rôle irremplaçable dans l’acheminement des monocytes thérapeutiques jusqu’au site tumoral. Les modèles de souris sont les modèles de références en cancérologie. L'utilisation des modèles de souris immunocompétentes et immunodéprimées permet la prise de greffe de tumeurs et de lignées cellulaires cancéreuses murines et humaines, respectivement et le transfert adoptif des monocytes. Les animaux utilisés auront entre 4 et 8 semaines correspondant à l’âge du jeune adulte. Nos études préalables nous ont montrées qu'il n'y avait pas différences de prise de greffe chez des animaux juste sevrés (4 semaines) et des animaux adultes (plus de 6 semaines). Cependant, on attend d’avoir plusieurs souris avec une régression totale de la tumeur et qu’on va garder longtemps et pour cette raison nous utiliserons des animaux jeunes afin de ne pas avoir un état général dégradé qui pourrait être dû à la dégénérescence du modèle dû à la longévité.
Exploration d’un marqueur métabolique dans les lésions précancéreuses induites ou dans le vieillissement chez la souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Biopsie de deux millimètres au bout de la queue, tatouage des coussinets avant le sevrage, gavage oral, prélèvement de sang à la joue toutes les deux semaines, jeûne de douze à quinze heures, puis mise à mort par dislocation cervicale. 20 960 souris vont être utilisées, 20 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 800 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur annonce que les souris seront étudiées avant l'apparition du phénotype dommageable, et décrit aussi une baisse d'appétit, un amaigrissement et une diminution de l'activité liés aux lésions prétumorales et au vieillissement accéléré. Rien ne justifie un effectif de 20 960 animaux au-delà d'une phrase sur le "nombre minimum d'animaux nécessaires".
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de développer de nouvelles lignées de souris présentant une activation ou diminution d’une molécule d'intérêt récemment identifiée impliquée dans le métabolisme des lipides et qui serait responsable du vieillissement cellulaire. Nous souhaitons moduler génétiquement son expression dans un contexte de lésions précancéreuses et tester son effet thérapeutique sur la progression des lésions dans le tissu. Nous souhaitons confirmer des données obtenues dans un modèle cellulaire sur sa capacité à induire le vieillissement cellulaire.
Bénéfices attendus
Dans un contexte de recherche physiopathologique sur des lésions prétumorales ou le vieillissement, les expérimentations chez la souris ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences sur un modèle cellulaire unique, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses cellulaires ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus sur des modèles cellulaires ont permis d'identifier un gène d'intérêt.
Procédures
-avant le sevrage, (2 contentions, quelques secondes ) pour biopsie de queue de 2 millimètres et pour le tatouage aux coussinets -lors des pesées (1 contention, quelques secondes ) - gavage oral à 3 ou 6 semaines de vie (1 ou 5 fois, avec 1 minute par gavage) -prélèvement de sang à la joue (1 fois toutes les 2 semaines, quelques minutes -1 jour avant la mise à mort (mise à jeun (1fois, 12 à 15H) mise à mort précoce par dislocation cervicale et prélèvement des tissus pour différentes analyses.
Impact sur les animaux
-léger stress due à la contention pour biopsie, identification, pesée et prélèvement sanguin -Le gavage oral quotidien peut engendrer des risques de fausse route. -Les souris induites développent des lésions non dommageables à un âge précoce et seront étudiées avant le phénotype dommageable. -Les lésions prétumorales et le vieillissement accéléré peuvent entraîner à un stade avancé une baisse de l’appétit, un amaigrissement et une diminution de l’activité.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure pour renouveler les croisements ou pour exploration des tissus et organes d'intérêt.
Remplacement
Dans un contexte de recherche physiopathologique sur des lésions prétumorales ou le vieillissement, les expérimentations chez la souris ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences sur un modèle cellulaire unique, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses cellulaires ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus sur des modèles cellulaires ont permis d'identifier un gène d'intérêt.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'obtention d'un résultat significatif déterminé par des tests statistiques adaptés, et qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés dans ce projet.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'un enrichissement. Les souris seront hébergées en groupes sociaux en cage ventilée. Une surveillance accrue sera mise en place tout au long de la procédure. Cependant, tout animal en souffrance sera mis à mort avant l'apparition des points limites stricts et spécifiques définis selon les recommandations en vigueur.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Ces souris sont particulièrement intéressantes pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Les jeunes souris de trois semaines sont utilisées car il est nécessaire que les organes soit suffisament matures et fonctionnels.
Maintien et gestion de lignées de souris immunodéprimée pour des études en cancérologie.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Toutes seront tuées à l'issue des projets dans lesquels elles seront versées, et aucune ne sera élevée en surnombre. 2 000 souris immunodéprimées vont être élevées et utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun geste expérimental n'est décrit au-delà de l'hébergement en armoires ventilées et de la manipulation sous hottes filtrantes, la contrainte tenant au déficit immunitaire lui-même, qui expose ces souris à une infection mortelle en quelques jours si les barrières sanitaires cèdent. L'élevage interne est justifié par la disponibilité de souris hôtes d'âge et de sexe voulus, à synchroniser avec les cultures de cellules tumorales humaines à greffer, condition que le porteur qualifie d'"indispensable".
Objectifs
L’objectif est d’entretenir et de gérer des lignées de souris immunodéprimées utilisées pour les travaux sur un plateau technique dédié cancérologie. Ces souris, fragiles en raison de leur déficit immunitaire, servent surtout à greffer des cellules tumorales, ici des tumeurs solides. Leur élevage nécessite des soins particuliers et un hébergement adapté pour éviter que leur fragilité ne s’exprime. La mise en place d’un élevage interne est justifiée par des contraintes expérimentales. Elle permet d’assurer la disponibilité de souris hôtes en nombre, d’âge et de sexe précisément définis, condition indispensable à la synchronisation avec les manipulations cellulaires réalisées en amont et les analyses prévues en aval. Par ailleurs, l’élevage interne garantit la maîtrise des conditions d’élevage et d’hébergement et permet d’assurer une traçabilité individuelle complète des animaux utilisés, tant sur le plan sanitaire qu’expérimental.
Bénéfices attendus
L’utilisation de souris immunodéficientes en cancérologie permet le développement de modèles expérimentaux pertinents pour l’étude de la tumorigenèse humaine. L’absence ou l’altération de la réponse immunitaire chez ces animaux autorise l’implantation et la croissance de cellules tumorales humaines, permettant ainsi l’analyse des mécanismes biologiques impliqués dans l’initiation, la progression et la dissémination tumorales. Ces modèles constituent un outil essentiel pour l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment l’étude de l’efficacité et de la toxicité de traitements anticancéreux, dans un contexte in vivo contrôlé. Ils contribuent également à l’identification de biomarqueurs pronostiques ou prédictifs de réponse aux traitements. Enfin, le recours à ces modèles permet de limiter le nombre d’animaux utilisés grâce à une meilleure reproductibilité des protocoles expérimentaux et à une réduction de la variabilité biologique.
Procédures
La manisfestation du phénotype dommageable d'immunodéficience soumet les souris à un risque d'infection par des agents pathogènes extérieurs. En conséquence, elles sont hébergées dans des cages ventilées et manipulées sous hottes filtrantes pour garantir les barrières sanitaires afin de les protéger de ce risque.
Impact sur les animaux
L’immunodéficience de ces souris les rend plus sensibles aux infections que les souris classique dites "immunocompétentes", c'est à dire capable de se défendre contre un agent pathogène par le biais du système immunitaire. Un risque rare, mais possible, de développer des infections peu apparaitre. Ce risque est présent en cas de mise en défaut des mesures barrières sanitaires lors de l’hébergement de ces lignées (Dysfonction du système de filtration des armoires ventilées, de la hotte de change, rupture de la stérilité de l'aliment ou de l'eau de boisson etc.). Dans ce cas, les animaux seraient exposés à des agents pathogènes et développeraient un syndrome infectieux qui conduiraient à leur mort en quelques jours.
Devenir
Tout les animaux seront mis à mort en fin de procédure dans les DAP dans lesquelles ils seront inclus. Tous les animaux générés seront utilisés.
Remplacement
Malgré le développement de technique in vitro sur cellules permettant de limiter l’utilisation des animaux, il est impossible à ce jour de remplacer totalement le modèle animal car celui-ci nous permet de comprendre les interactions entre les cellules tumorales et le microenvironnement dans toute sa complexité.
Réduction
La reproduction n’est utilisée que pour produire le nombre d’animaux prévu dans les projets autorisés. Cette production est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistiques pour chaque projet. Les caractéristiques de reproduction propres à chaque lignée (nombre de petits par portée, nombre de modifications génétiques, …) sont prises en compte pour planifier la fréquence et le type de croisements dans le but de ne produire aucun animal superflu et se limiter au nombre d'animaux requis pour chaque étude.
Raffinement
Afin d’éviter toute contamination, les animaux sont hébergés en armoires ventilées dans un secteur spécifique pour les animaux à risque d'infection. Des contrôles sanitaires réguliers (tests bactériologiques sur gélose une fois par an) sont réalisés, l’eau est autoclavée, la nourriture est irradiée, l’air des enceintes d’hébergement est filtré, nous réalisons un change de tenue et protections individuelles réguliers concernant le personnel en contact avec les aniaux. Les animaux sont surveillés tous les jours pour vérifier l’absence d’atteintes des points limites. Les points observés sont les suivants : -Hyperactivité ou hypoactivité -Isolement et indifférence au milieu extérieur -Modifications des périodes de sommeil (Hyperactivité en période diurne) -Tout comportement inhabituel (activité stéréotypée, déplacement erratique, passivité à l'environnement, interaction sociale modifiée...). -Dos vouté, yeux enfoncés, poils hérissés -Perte de poids (supérieur à 10% pendant plus de 24h). Lors des reproductions, le nid est également enrichi par des frisottis et du coton pour accompagner les femelles durant leur gestation. Pour limiter le stress, le nid parental est conservé pendant le change. Afin de faciliter l’accès à la nourriture aux petits lors des sevrages, des croquettes sont mises directement dans la cage. Dans le but de limiter le risque d’infection par des agents opportunistes, la fréquence des changes est augmentée et l’ensemble du matériel d’hébergement est autoclavés (cages, biberons, grilles, enrichissements...). Les animaux seront hébergés à raison de 2 à 5 par cages.
Choix des espèces
Les souches de souris élevées sont choisies en fonction des besoins des projets de recherche autorisés. Grâce à la bonne connaissance de ces souches d'un point de vue biologique, leur utilisation en cancérologie est très standardisée. Ce sont des modèles étudiés depuis longtemps, avec beaucoup de données scientifiques disponibles, ce qui permet de préparer les expériences avec précision et de prévoir leurs réactions grâce aux données accumulées dans la littérature. Les souris seront mises en accouplement entre 6 et 24 semaines (période de capacité de reproduction optimale) pour une durée correspondant aux recommandations spécifiques de chaque souche, en fonction des objectifs de production pour nos projets. Le phénotype dommeageable d'immunosensibilité n'a pas d'impact sur la reproduction puisque les animaux sont maintenus en condition stérile qui empêche sa manisfestation.
Marquage des noyaux de la jonction myotendineuse par administration de Cre via un AAV.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Marquer les seuls noyaux situés à la jonction entre le muscle et le tendon, faute de lignée de souris qui les distingue aujourd'hui : c'est l'objet de cette étude pilote. 36 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour biopsie musculaire. Un groupe reçoit un virus adéno-associé dans les deux pattes arrière, l'autre dans le sinus rétro-orbitaire, sous anesthésie et sous analgésique. Le porteur n'attend pas de douleur au-delà d'une gêne du membre injecté, et prévoit qu'une souris cotée au niveau maximal reçoive un antalgique deux fois par jour, puis soit mise à mort si la douleur n'est pas revenue à zéro deux heures après la seconde injection.
Objectifs
Les muscles sont constitués de longues fibres qui contiennent de nombreux noyaux cellulaires. Ces noyaux ne sont pas tous identiques : certains ont des fonctions spécifiques dépendantes de leur emplacement dans le muscle. À l'extrémité des fibres musculaires, à l’endroit où elles s'attachent aux tendons, se trouve une région appelée jonction myotendineuse (JMT). Cette région absorbe la majeure partie de la force de traction lorsque les muscles travaillent et c'est souvent à cet endroit que se produisent les blessures. À l'heure actuelle, les scientifiques ne disposent pas de lignées de souris génétiquement modifiées pour étudier uniquement les noyaux de cette jonction. Les méthodes existantes affectent tous les noyaux d'une fibre musculaire à la fois, ce qui rend impossible d'observer précisément le rôle des noyaux de la JMT. Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons créer de nouvelles lignées génétiquement modifiées chez la souris dont seuls les noyaux de la JMT seraient marqués. Cela nous permettrait de les observer et de les étudier en détail.
Bénéfices attendus
Grâce à ces nouvelles lignées de souris, les scientifiques pourront observer le comportement des noyaux de la jonction myotendineuse dans des muscles sains, lors d'une blessure et en cas de maladie. Cela nous aidera à comprendre un aspect important mais peu étudié de la biologie musculaire. À l'avenir, ces connaissances pourraient orienter le développement de nouveaux traitements visant à protéger ou à réparer les muscles.
Procédures
Le 1er groupe d’animaux sera injecté très rapidement, en environ 30 secondes, par voie locale dans les 2 membres postérieurs avec un virus adéno-associé pour activer le marquage des noyaux de la jonction myotendineuse des muscles injectés. Le 2éme groupe d’animaux sera injecté très rapidement, en quelques secondes, par voie systémique dans le sinus retro-orbital avec le même virus pour activer le marquage des noyaux de la jonction myotendineuse de tous les muscles accessibles par cette voie. Les injections de virus des 2 groupes seront faites sous anesthésie générale grâce à une injection qui sera réalisée en quelques secondes. 30 min avant l’injection du virus nous injecterons un antalgique qui prendra en charge la douleur de la procédure et celle résultant de la procédure. Après les injections de virus adéno-associés un antidote à l’anesthésie sera injecté pour accélérer et améliorer le réveil. .
Impact sur les animaux
Notre projet n'entraîne aucune nuisances ou effets néfastes au-delà des injections locales et systémiques de vecteurs viraux, et des injections d’anesthésiques et d’analgésiques. Les souris mutantes utilisées expriment une protéine rapporteuse fluorescente dans les noyaux des cellules, fonctionnellement neutre, dont l’expression est dépendante d’une protéine qui n’a pas d’effet nocif..
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Bien que les cellules musculaires puissent être différenciées in vitro, elles ne forment pas de jonctions myotendineuses (JMT), car cela nécessite des interactions complexes entre le tendon et le muscle. Par conséquent, cet aspect de la biologie musculaire ne peut pas être étudié à l'aide de modèles de culture cellulaire.
Réduction
Il s'agit d'une étude pilote visant à tester notre stratégie de marquage dans différentes conditions. Le projet est intentionnellement conçu pour être réduit avant d'être étendu à des expériences à plus grande échelle. Nous avons déterminé que 3 animaux/groupe (3 femelles et 3 mâles) seront suffisants pour obtenir une robustesse statistique. Nous analyserons les données des femelles et des mâles séparément et si les résultats sont statistiquement semblables alors nous regrouperons les données des 2 sexes. Afin de minimiser davantage l'utilisation d'animaux, nous procéderons de manière séquentielle, en testant d'abord l’injection intramusculaire avec la concentration de virus adéno-associé la plus forte. Si le virus fonctionne comme attendu alors nous testerons dans un second la concentration intermédiaire, puis la plus faible. Dans cette voie d’administration, les deux membres postérieurs seront injectés afin de maximiser les données provenant de chaque animal. Si le virus fonctionne avec ce mode d’administration alors nous testerons l’injection au sinus retro-orbital qui touche tout l’organisme. Nous ferons 2 analyses différentes sur le même animal pour les 2 procédures ce qui réduira ainsi le nombre d’animaux qui seront utilisés par 2. Les tests statistiques appropriés seront utilisés pour analyser les résultats obtenus.
Raffinement
Nous ne nous attendons pas à voir apparaitre un phénotype douloureux résultant des injections de virus adéno-associés mais uniquement une gêne transitoire suite à l’injection intramusculaire (IM) qui sera réalisée sous anesthésie et couverture antalgique, néanmoins tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Nous n’attendons pas de douleur supérieure à une douleur de niveau 1, c’est-à-dire une douleur légère comme un inconfort du membre injecté ou une légère boiterie. Si une douleur sévère (niveau 3) venait à être observée alors un antalgique serait injecté à l’animal concerné 2 fois/ jour. Si 2h après la 2é injection le niveau de douleur n’est pas redescendu à 0, alors l’animal sera mis à mort. Les souris seront surveillées quotidiennement les 3 jours suivants l’injection du virus puis 2 à 3 fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, motricité, apathie, aspect du pelage, aspect physique, vigilance, interaction sociale, toilettage). Cette observation est visuelle car nous n’attendons pas de phénotype douloureux et aucune dégradation de l’état général des animaux, en dehors de la gêne transitoire suite à l’injection local ou systémique de virus adéno-associé qui sera faite sous anesthésie générale et sous couverture d’un analgésique. Une attention particulière sera également portée aux sites d’injections. Mais si un signe d’inconfort, de détresse ou de douleur était constaté lors de la surveillance alors celle-ci deviendrait quotidienne pour les animaux concernés. De plus si des souris devaient présenter des difficultés à se déplacer et donc des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage et le suivi serait renforcé avec avis vétérinaire en cas de besoin.
Choix des espèces
Les virus adéno-associés que nous utiliserons ont tous été développés pour les souris et sont spécifiquement conçus pour infecter efficacement les muscles. De plus la validation de l’activité du promoteur utilisé qui cible notre région d’intérêt, la jonction myotendineuse, résulte d’une étude précédente (APAFIS #37568-202206031219283 v4) réalisée chez la souris. Par conséquent, le modèle murin est le choix le plus approprié. Les injections seront effectuées sur des souris âgées d’au moins 10 semaines. Cet âge correspond au début de l'âge adulte, lorsque le développement musculaire est achevé et que des titres viraux plus faibles peuvent être utilisés efficacement.
Création d’un modèle de souris transgéniques permettant d’évaluer le rôle de la production rénale de glucose au cours du jeûne et du diabète.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Biopsiées à l'âge de sept à dix jours, puis injectées sous la peau cinq jours de suite pour éteindre dans leurs reins un gène de la fabrication du glucose, des souris sont ensuite privées de nourriture pendant vingt-quatre à quarante-huit heures. 180 souris vont être utilisées, 72 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 80 un niveau modéré et 28 un niveau léger, toutes tuées à l'issue pour prélever foie, reins et intestin. L'objectif déclaré est de mesurer la part des reins dans la production de sucre pendant un jeûne prolongé, et de reproduire l'atteinte rénale d'une maladie rare. Le porteur écrit que le ciblage des seuls reins évitera aux souris de fortes baisses de sucre dans le sang, et décrit aussi faiblesse, frissons, inactivité et injection de glucose en urgence si l'hypoglycémie devient trop marquée.
Objectifs
Pour que notre corps fonctionne correctement, il est essentiel de maintenir le taux de sucre (glycémie) dans le sang autour de 1 g/L. Lors d’un repas, ce sucre, appelé glucose, est apporté par la nourriture et est stocké dans le foie sous forme d’une molécule complexe, le glycogène. Entre les repas, le foie va d’abord dégrader ses stocks de glycogène, puis si le jeûne se prolonge, le corps peut produire lui-même du glucose, en utilisant d’autres substances (comme certains acides aminés ou des lipides). Alors que le foie est reconnu depuis longtemps comme l’organe central de la production de glucose par l’organisme, on sait aujourd’hui que les reins et l’intestin peuvent aussi produire du glucose de novo. Après utilisation du glycogène, le foie ralentit sa production de glucose, alors que les autres organes augmentent leur production au cours du jeûne prolongé, pour éviter une chute de la glycémie (hypoglycémie) qui peut être fatale. Des études ont montré que : -qu’une production trop importante de glucose par le foie peut dérégler l’équilibre glycémique et énergétique et favoriser le développement du diabète, caractérisé par des hyperglycémies ; -à l’inverse, l’induction de la production par l’intestin peut avoir des effets bénéfiques, comme lutter contre le diabète et le développement de foie gras. Aujourd’hui, la contribution des reins à la production endogène de glucose est encore mal comprise, et souvent sous-estimée. Ce projet vise à mieux comprendre cette fonction physiologique, en particulier lors du jeûne prolongé dans le maintien de l’équilibre glycémique et énergétique. Pour cela, nous allons créer des souris génétiquement modifiées dans lesquelles le rein ne pourra plus produire de glucose. Après validation du modèle, nous analyserons comment cette suppression affecte régulation de la glycémie pendant un jeûne court ou long. Nous étudierons aussi le rôle du rein dans le diabète, en nourrissant ces souris avec un régime très riche en calories, pour voir si les reins ont un effet protecteur ou néfaste sur le métabolisme. Ce modèle pourrait aussi devenir un outil précieux pour mieux comprendre la maladie rénale associée à la glycogénose de type I, qui est une maladie rare induite par une perte de la production de glucose par l’organisme. Les patients développent de graves hypoglycémies, des problèmes de foie et des maladies rénales à long terme
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de créer une souris « génétiquement modifiée » dans laquelle les reins ne produisent plus du tout de glucose. Cela permettrait de mieux comprendre à quel point les reins participent à la production de sucre dans le corps, surtout pendant un jeûne prolongé. Ce modèle de souris pourrait aussi aider à mieux comprendre comment les reins contribuent à maintenir l’équilibre énergétique dans le corps — ce qui est très important pour développer de nouveaux traitements contre des maladies comme le diabète. On sait déjà que diminuer la production de sucre par le foie est un objectif important pour limiter le développement du diabète. Des études récentes montrent à l’inverse que l’induction de la production de glucose par l’intestin a des effets positifs contre le diabète et contre l’accumulation de graisse dans le foie. Dans ce contexte, il devient donc essentiel d’étudier aussi le rôle des reins dans la production de sucre, car cela pourrait influencer le développement ou la prévention du diabète. Plus globalement, ce projet remet en question l’idée que seul le foie est responsable de produire du glucose quand on jeûne. Il pourrait permettre d’en apprendre davantage sur la façon dont le sucre est fabriqué et utilisé dans l’organisme. Enfin, ce modèle de souris pourrait aussi servir à mieux comprendre une maladie rare appelée glycogénose de type Ia (GSDIa), qui touche les reins. Cette maladie a beaucoup de points communs avec la maladie rénale observée chez les personnes diabétiques. Ces souris pourraient donc aider à tester de nouveaux traitements, utiles en diabétologie et en néphrologie. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement qui empêche efficacement l’aggravation des maladies rénales sévères sur le long terme. Pourtant, de plus en plus de patients diabétiques ou atteints de GSDIa en souffrent. Par exemple, 70 à 80 % des personnes atteintes de glycogénose de type I développent une maladie rénale chronique.
Procédures
Interventions réalisées sur toutes les souris : Dans le cadre de ce projet de recherche, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées pour mieux comprendre certaines maladies liées au métabolisme du sucre. Pour identifier les souris porteuses des modifications nécessaires, nous prélèverons un petit échantillon de tissu (biopsie) de manière rapide (quelques secondes). Les souris recevront ensuite une injection quotidienne, sous la peau et pendant 5 jours, d’une solution permettant de bloquer un gène impliqué dans la production de glucose. Ce traitement vise à reproduire, dans leurs reins, une glycogénose de type I. En fin de toutes les procédures, toutes les souris seront mises à jeun pendant 6h et une prise de sang sera réalisée, juste avant la mise à mort, pour des mesures biochimiques. Cette prise de sang sera réalisée en environ 20 secondes. -Interventions spécifiques: -Un premier lot de souris nourris ad libitum sera utilisé pour valider le modèle et évaluer le bien-être. Ces souris ne subiront pas d’autres interventions que celles décrites ci-dessus. - Deux lots de souris seront mis à jeun pendant 24 heures ou entre 30 heures et 48 heures au maximum. Une goutte de sang sera prélevée après l’incision de l’extrémité de la queue pour la mesure de la glycémie grâce à un glucomètre (appareil utilisé par les diabétiques). Ce geste n’est réalisé qu’une seule fois et est très rapide (1-2 secondes). Le massage de la queue permet d’obtenir les prélèvements suivants. Ce geste peut induire un léger stress. - Un lot de souris sera mis à jeun 24h et leur glycémie sera mesurée régulièrement (sept fois, comme décrit ci-dessus) pendant 2 heures après l’injection d’un substrat. Le même test sera réalisé avec un autre composé à une semaine d’intervalle. L’injection du composé sera réalisée en moins d’une minute. Toutes les injections de substrat qui seront réalisées nécessitent une contention en main de la souris de quelques secondes.
Impact sur les animaux
À l’âge de 7 à 10 jours, un petit prélèvement de tissu sera effectué, ce qui peut provoquer une légère douleur de très courte durée ; le risque de saignement est extrêmement faible. Ce moment peut être légèrement stressant pour les petits, car ils doivent être immobilisés quelques secondes. Les injections sous la peau peuvent également entraîner une courte sensation de douleur et un peu de stress. Les injections dans le péritoine sont généralement un peu plus douloureuses et nécessitent une contention en main entrainant un léger stress. Deux lots de souris seront privées de nourriture pendant une période de 24h ou au maximum 48 heures. Ce jeûne prolongé peut provoquer un inconfort, une perte de poids (principalement liée à la perte d’eau et à la fonte musculaire), ainsi que des changements de comportement : au début, elles peuvent devenir anormalement actives, puis s'affaiblir progressivement en cas de jeûne prolongé. Les animaux peuvent aussi devenir plus agressifs. Leur température corporelle peut baisser, mais ces effets sont réversibles dès qu’ils sont réalimentés. Si la perte de poids dépasse 20% de leur poids initial, les animaux seront retirés de l’étude pour éviter toute souffrance. Le suivi de la glycémie permettra aussi de vérifier leur état de santé : une baisse modérée du glucose dans le sang ne provoque pas de gêne, mais si ce taux devient trop bas, les souris peuvent présenter des signes de mal-être importants (faiblesse, inactivité, frissons), nécessitant alors une intervention rapide (injection de glucose ou nécessité de mise à mort de l’animal pour raisons éthiques). Le prélèvement de sang à l’extrémité de la queue est limité en quantité et n’entraine pas de mal-être. La première incision de la queue peut être cependant légèrement douloureuse. D’autres prélèvements sanguins seront effectués par une piqûre sous la mâchoire, ce qui peut causer une gêne passagère et, dans de rares cas, un petit saignement. La maladie rénale étudiée dans ce projet n’entraîne généralement pas de signes visibles de souffrance chez les souris, même lorsqu’elles sont nourries avec une alimentation riche en graisses et en sucres. Toutefois, si une insuffisance rénale devait survenir, les signes suivants seraient surveillés de près : perte de poids importante, léthargie, absence de toilette, yeux mi-clos, et respiration rapide. Ces signes déclencheront des mesures appropriées pour préserver le bien-être des animaux.
Devenir
Les animaux transgéniques seront produits en zone d’élevage et seront mis à mort en fin d’expérimentation pour le prélèvement des tissus (foie, rein et intestin) qui seront analysés au niveau structurel et moléculaire
Remplacement
Même si les chercheurs savent aujourd’hui fabriquer en laboratoire de petites structures qui ressemblent à des petits reins, appelées organoïdes, il est encore nécessaire d’étudier certaines fonctions complexes, comme la production de sucre par le corps, directement chez des animaux. En effet, des organes comme le foie, les reins et l’intestin travaillent ensemble pour réguler le taux de sucre dans le sang, en particulier pendant le jeûne, et ces mécanismes impliquent aussi des signaux hormonaux et nerveux qu’on ne peut pas reproduire en laboratoire. De plus, certaines maladies rénales, comme la maladie rénale chronique, mettent des mois à se développer, dans l’organe complexe qu’est le rein, ce qui n’est pas possible à observer avec des cellules cultivées en laboratoire. Pour étudier une maladie rare appelée glycogénose de type 1a, les scientifiques utilisent un modèle de souris spécialement modifiées. Ces souris reproduisent les symptômes rénaux de la maladie tout en maintenant la production de sucre par le foie et l’intestin, ce qui est essentiel pour comprendre la maladie dans son ensemble. De plus, il est très difficile d’étudier cette maladie directement chez les patients, car elle est extrêmement rare (seulement 1 naissance sur 100 000). Enfin, la souris est aussi un modèle très proche de l’humain en ce qui concerne le métabolisme.
Réduction
Pour planifier ces expériences, nous avons utilisé un logiciel spécialisé afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires, en tenant compte de la précision des mesures, de la variabilité entre les individus, et du fait que nous devons inclure aussi bien des mâles que des femelles, car le métabolisme est régulé différemment selon le sexe. Au total, le projet nécessitera 180 souris : 90 souris ne produisant pas de sucre au niveau des reins et 90souris en bonne santé servant de groupe témoin. Les naissances de souris seront arrêtées dès que nous aurons atteint ce nombre. Enfin, toutes ces expériences sont prévues avec le plus grand soin pour limiter le nombre d’animaux utilisés, en s’appuyant sur nos connaissances antérieures et en appliquant des méthodes statistiques rigoureuses pour garantir la fiabilité des résultats.
Raffinement
Pour réduire la douleur, les prélèvements de tissus (biopsies) seront réalisés sur des souriceaux âgés de 7 à 10 jours, à un moment où leurs terminaisons nerveuses ne sont pas encore totalement développées. Afin d’éviter le stress dû à la séparation d’avec leur mère, les soigneurs manipuleront les petits en portant des gants imprégnés de la litière de leur cage, pour conserver leur odeur familière. Pour habituer les souris à être manipulées et réduire leur stress, elles seront régulièrement en contact avec les expérimentateurs et seront prises en main à l’aide d’un petit tunnel plutôt qu’attrapées directement. Quand cela est possible, les injections seront réalisées sous la peau plutôt que dans le ventre, pour réduire la douleur due aux injections. Les points d’injection seront changés chaque jour pour limiter les irritations. Dans cette expérience, seuls les reins sont ciblés génétiquement, ce qui évitera aux souris de souffrir de fortes baisses de sucre dans le sang, car leur foie et leurs intestins continueront de produire du glucose. Lors des périodes de jeûne, les souris resteront en groupe dans de grandes cages enrichies (petites maisons, tunnels) pour limiter leur stress et éviter qu’elles deviennent agressives entre elles. Une partie de la cage sera chauffée. Pour les prises de sang, la queue des souris sera réchauffée pour faciliter le prélèvement et nettoyée pour éviter les infections. Les volumes de sang prélevés resteront très limités conformément aux recommandations internationales sur le bien-être animal. Pour les mesures répétées de la glycémie, une petite incision de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une pommade anesthésiante. Le sang sera ensuite prélevé sans autre incision en grattant la croute pour éviter toute autre incision. Les prélèvements d’urine se feront de manière naturelle, sans avoir besoin d’isoler les souris. Au début, la maladie rénale étudiée n’aura pas d’effet visible sur la santé des souris. Ce n’est que plus tard, en cas d’insuffisance rénale, qu’on pourra observer une perte de poids importante. Grâce à une bonne connaissance de ce modèle, des critères précis (une grille d’évaluation avec des points limites) permettront de suivre l’évolution de la maladie et de décider quand il sera nécessaire de mettre fin à la vie des animaux pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris pour notre projet de recherche car, contrairement à d’autres espèces comme le poisson, elle possède des mécanismes de régulation de la glycémie similaires à ceux de l’être humain. De plus, il est possible dans cette espèce de désactiver précisément un gène important dans les reins grâce à des techniques génétiques avancées. Ce modèle de souris devrait imiter très fidèlement la maladie chronique rénale associée à la glycogénose de type I, ce qui en fait un outil précieux pour mieux comprendre cette pathologie et développer de nouvelles approches. Au laboratoire, tous les outils nécessaires, comme des anticorps spécifiques à la souris, sont disponibles pour analyser les effets de la maladie et des traitements. Les manipulations sur les souris seront limitées et réalisées à différents âges : une petite biopsie de l’oreille sera faite chez les bébés souris (entre 7 et 10 jours) pour vérifier leur patrimoine génétique. Ensuite, un traitement spécifique sera administré à l’âge de 6 à 8 semaines pour déclencher la modification du gène étudié. Les tests pour mesurer l’impact de cette modification seront réalisés quand les souris seront adultes, entre 2 et 4 mois après le traitement. L’étude se terminera avant que les souris n’atteignent 6 mois.
Évaluation dans un modèle murin de formulations vaccinales antipaludiques à base d’ARNm
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections d'un vaccin à ARN messager espacées de trois semaines et des prélèvements de sang à la queue avant chaque injection, puis une partie d'entre elles reçoit une injection de Plasmodium berghei, suivie d'imagerie sous anesthésie et d'une prise de sang tous les un à deux jours. Le porteur indique que l'infection peut provoquer un affaiblissement, une anémie et des symptômes neurologiques, avec difficulté à se mouvoir et à s'alimenter, et prévoit de tuer les souris avant l'atteinte des points limites. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune culture cellulaire ne recrée la complexité d'un "organisme entier" doté d'un système immunitaire, tout en annonçant recourir à des cultures pour mesurer l'effet neutralisant des sérums.
Objectifs
Le paludisme reste un problème majeur de santé dans le monde. Les vaccins actuellement disponibles ou en développement sont malheureusement peu efficaces. Nos recherches visent à identifier de nouvelles cibles vaccinales ciblant les premières étapes d'infection chez l'homme après la transmission de Plasmodium, le parasite responsable du paludisme, par un moustique. Pour cela, nous utilisons un modèle murin d’infection par Plasmodium berghei, qui peut être étudié à tous les stades du cycle parasitaire et permet de valider par des tests pré-cliniques l'efficacité de formulations vaccinales. L'objectif du projet est d'évaluer dans ce modèle murin de nouvelles cibles vaccinales, en utilisant des formulations à base d'ARN messager.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de valider dans un modèle pré-clinique que des formulations à base d'ARNm d'antigènes de Plasmodium sont immunogènes et permettent d'induire une protection contre une infection d'épeuve. La validation pré-clinique chez la souris de nouvelles cibles vaccinales pourrait ouvrir de nouvelles perspective pour lutter contre le paludisme chez l'homme, qui chaque année touche plus de 250 millions de personnes et cause plus de 600000 morts.
Procédures
Un premier groupe d'animaux sera soumis aux interventions suivantes: immunisation par vaccin ARN (3 injections espacées de 3 semaines, durée du geste 10 secondes, sous anesthésie gazeuse), prélèvement de quelques gouttes de sang à la queue (avant chaque immunisation, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), anesthésie gazeuse (acte unique, durée 10 minutes) suivie d’un prélèvement de sang d'un volume plus important (acte unique, durée 10 minutes, sur animaux anesthésiés) puis d'une euthanasie selon une méthode réglementaire. Un second groupe d'animaux sera soumis aux interventions suivantes: immunisation par vaccin ARN (3 injections espacées de 3 semaines, durée du geste 10 secondes, sous anesthésie gazeuse), injection de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), imagerie intravitale sous anesthésie gazeuse (durée 10 minutes), prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 5 à 8 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles).
Impact sur les animaux
La contention des animaux pourra induire un stress de courte durée. Les différents types d'injection pourront entraîner une douleur de courte durée. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie. L’anesthésie, pour l'imagerie et pour les prélèvements sanguins en fin de procédure, pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. L'infection par P. berghei pourra engendrer un affaiblissement, une anémie, voire des symptômes neurologiques, générant une douleur modérée à l’animal associée à une difficulté à se mouvoir et s’alimenter.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.
Remplacement
Le projet vise à évaluer dans un modèle murin des vaccins à base d'ARNm ciblant des antigènes de Plasmodium, l'agent du paludisme. L'analyse de l'effet d'une immunisation nécessite le recours à un organisme muni d'un système immunitaire pour pouvoir étudier les réponses anticorps. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués. Par contre, nous utiliserons des systèmes de cultures cellulaires pour analyser in vitro l'effet neutralisant des serums des animaux immunisés.
Réduction
760 animaux seront utilisés pour ce projet. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. L'utilisation d'une méthode d'imagerie intravitale permet de suivre l'infection au cours du temps et ainsi de réduire le nombre d'animaux. L'utilisation d'un groupe témoin pour plusieurs groupes tests permet également de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum (kraft ou coton pour nidification, croquettes déposées au fond de la cage pour mastication) et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été conçu afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Une période d'habituation de 5 minutes est également respectée dans l'appareil de contention avant les injections sur animaux vigiles, afin de réduire le stress. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur. Les cages des souris en cours de procédure sont clairement identifiées par une étiquette colorée afin de faciliter le suivi clinique. Les souris soumises aux procédures impliquant une infection par Plasmodium sont pesées deux fois par semaine. La présence de points limites définis permet d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection par Plasmodium berghei. Afin de faciliter l’alimentation et l'hydratation chez les animaux fortement infectés par Plasmodium (parasitémie élevée), la nourriture sera donnée sous forme de bouillie ou de gel directement dans la cage. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
La souris représente un hôte permissif à l'infection par Plasmodium berghei, permettant d'évaluer l'efficacité de stratégies d'immunisation contre la phase initiale d'infection du foie. Nous utiliserons deux souches de souris commerciales adaptées aux tests d'immunogénicité et aux tests d'efficacité. Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures, permettant d'avoir un système immunitaire mature.
Impact du microbiote des puces sur leur dynamique de reproduction et d’infection
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Un seul souriceau de deux à cinq jours fournit aux puces le volume de sang que donneraient quatre à cinq souris adultes. 2 602 souris vont être utilisées, 1 324 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 278 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Le projet cherche à savoir comment le microbiote des puces modifie leur reproduction et leur aptitude à transmettre le bacille de la peste, et annonce la mise au point d'une lignée cellulaire de puce qui remplacerait plus tard certaines expériences. Le stade de deux à cinq jours est retenu parce que la peau des souriceaux est fine et glabre, ce qui limite aussi les fuites d'insectes, et parce que leur perception de la douleur ne serait, selon le porteur, encore que partiellement intégrée.
Objectifs
La peste est une maladie mortelle transmise par les puces. Ce projet vise à étudier comment le microbiote influence la physiologie des puces et leur capacité à transmettre le bacille de la peste. Il s’agira également d’identifier les mécanismes moléculaires associés à ces effets. Dans une perspective de réduction du recours aux animaux, nous tenterons de développer une lignée cellulaire de puce permettant l’étude de ces mécanismes in vitro. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les interactions entre microbiote, physiologie vectorielle et dynamique épidémique, d’améliorer les modèles prédictifs, de contribuer au développement de nouvelles stratégies de lutte, et d’éclairer les conditions ayant conduit à la disparition historique de la peste en Europe ainsi que les risques actuels de réémergence.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances inédites sur l’impact d'endosymbionte sur la dynamique de reproduction des puces, leur infection par l’agent de la peste et les mécanismes moléculaires sous-jacents. Ces résultats permettront d’améliorer la compréhension des interactions entre microbiote, physiologie vectorielle et transmission du bacille de la peste. Ils contribueront également à renforcer les modèles prédictifs utilisés en santé publique pour évaluer les risques de réémergence de la maladie, notamment dans les zones anciennement touchées. A terme, ces travaux pourraient orienter le développement de nouvelles stratégies de surveillance ou de lutte ciblant les vecteurs, tout en favorisant la réduction du recours aux animaux grâce à la mise au point d’une lignée cellulaire de puce.
Procédures
Les animaux seront exposés une seule fois au contract de puces pendant une durée d'heure
Impact sur les animaux
L’exposition aux puces peut entraîner deux types de nuisance. D’une part, les piqûres elles-mêmes, atténuées par les propriétés analgésiques et anti-inflammatoires de leur salive. D’autre part, la perte sanguine liée à l’alimentation des insectes. Lors d’expositions avec un nombre limité de puces, la quantité de sang prélevée demeure faible et n’entraîne pas d’effet physiologique observable dans nos conditions. A l’inverse, lors du nourrissage de colonies établies sur souriceaux, l’alimentation simultanée d’un très grand nombre de puces provoque une perte de sang importante, conduisant rapidement à une perte de conscience puis au décès très rapide. Dans ce contexte, la phase consciente est brève et la perception nociceptive potentielle reste transitoire.
Devenir
Quel que soit la procédure, les animaux ne seront pas maintenus en vie après leur utilisation. Leur prise en charge en fin de protocole est strictement encadrée et conforme aux exigences sanitaires et réglementaires en vigueur, afin d’éviter tout risque de contamination croisée et de garantir la sécurité des installations expérimentales.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro capable de reproduire le cycle biologique complet des puces ni leurs interactions physiologiques avec un hôte. Les puces sont des insectes hématophages stricts, et la prise de repas sanguin constitue un déclencheur physiologique essentiel à leur développement, leur reproduction et leur ponte. Ce processus dépend non seulement de la disponibilité du sang, mais aussi de signaux sensoriels et hormonaux issus du contact avec un hôte vivant. L’utilisation de systèmes artificiels de nourrissage, comme des membranes synthétiques, reste inadaptée à notre contexte expérimental. Ces dispositifs ne permettent ni une alimentation efficace ni une reproduction stable chez les espèces ciblées ici. Ils exposent également les puces à des anticoagulants et à des contaminations bactériennes ou fongiques, nécessitant l’ajout d’antimicrobiens qui altèrent leur physiologie et compromettent la validité des données. Enfin, il n’existe actuellement ni lignée cellulaire, ni modèle substitutif permettant de reconstituer ex vivo les interactions complexes entre la puce et son hôte. Dans le cadre de ce projet, nous visons à développer une lignée cellulaire de puce qui pourra remplacer certaines expériences in vivo dans de futures études.
Réduction
Nos approches expérimentales ont été conçues pour réduire significativement le recours aux animaux. (1) L’utilisation de souriceaux permet de nourrir un grand nombre de puces tout en mobilisant un nombre restreint d’animaux. Un seul souriceau fournit un volume sanguin équivalent à celui obtenu à partir de quatre à cinq souris adultes dans un système artificiel comparable, ce qui contribue à une diminution notable du nombre total d’animaux utilisés. (2) Notre expérience montre qu’il est possible d’interrompre le nourrissage des colonies pendant une semaine chaque mois sans compromettre leur survie, permettant ainsi de réduire la fréquence des nourrissages et, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires à leur maintien. (3) Nous avons également choisi de collecter des puces vierges d’âge similaire directement à partir des cocons présents dans les pots d’élevage pour les expériences de développement. Cette approche évite la mise en place de sous-colonies dédiées pendant deux mois, une méthode plus simple mais qui nécessiterait entre 16 et 24 souris par colonie, par traitement et par répétition, soit environ 384 à 576 souris. (4) Les expériences d’infection durent habituellement 27 jours. Nous avons choisi de les limiter à 20 jours, car notre expérience montre qu’il n’est plus nécessaire de prolonger les essais à 27 jours pour obtenir des données robustes et statistiquement fiables. Cette adaptation permet de réduire significativement le nombre de souris utilisées. (5) Ce protocole est mutualisé avec un autre projet impliquant le maintien des souches parentales. Les mêmes colonies de puces sont donc utilisées pour plusieurs projets, évitant la duplication des élevages et réduisant significativement le nombre total de souriceaux nécessaires. (6) Dans la mesure du possible, nous maximisons également les données obtenues à partir d’une seule expérience, en regroupant plusieurs tests sous une même condition témoin.
Raffinement
Plusieurs mesures ont été intégrées pour minimiser la contrainte associée aux nourrissages. Les souriceaux seront exposés sans contention, pendant une durée limitée à une heure. Ce choix contribue au raffinement en réduisant stress et douleur. Les stades utilisés (2 à 5 jours) correspondent à une période de développement où la perception nociceptive est présente, mais encore partiellement intégrée, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Des observations seront menées pendant et après l’exposition afin de détecter tout signe de souffrance (vocalisation, évitement, apathie). Enfin, les puces injectant naturellement des molécules salivaires aux propriétés analgésiques et anti-inflammatoires, cette particularité constitue une forme de raffinement biologique supplémentaire. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure afin de permettre l’identification précoce de signes de souffrance justifiant l’interruption de l’expérimentation et l’euthanasie immédiate de l’animal
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), qui constitue un hôte naturel ou compatible pour de nombreuses espèces de puces ciblées par le projet. Elle est couramment utilisée pour le nourrissage de puces en contexte expérimental. Son statut d’espèce modèle, sa physiologie bien connue, et sa compatibilité avec les besoins alimentaires des puces en font un choix scientifiquement pertinent et largement validé pour ce type de protocole. Souriceaux âgés de 2 à 5 jours. Il s’agit du stade privilégié pour les nourrissages expérimentaux. A ce stade, les souriceaux sont glabres, leur peau est fine, et leur système nerveux est encore en développement. Bien que la perception nociceptive soit présente dès la naissance, son intégration centrale est partielle, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Lorsqu’ils sont exposés à un grand nombre de puces (>1000), l’exsanguination entraîne une perte rapide de conscience suivi du décès rapide. La perception nociceptive potentielle est intense mais très transitoire, et ne s’accompagne d’aucun signe comportemental prolongé. Par ailleurs, l’utilisation de souriceaux permet de réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés: un seul individu alimente les puces alors qu’il faudrait 4 à 5 souris adultes nécessaires pour obtenir un volume sanguin équivalent lors d’un nourrissage artificiel. La faible pilosité des souriceaux permet également de limiter les risques de fuite des insectes, ce qui sécurise la procédure. Ces animaux seront exposés sans contention, pendant une durée maximale d’une heure, ce qui réduit le stress. Ce stade est également optimal pour les puces, en raison de la vascularisation cutanée. Leur utilisation répond donc à la fois aux objectifs scientifiques et au principe de raffinement.
Étude du contrôle moléculaire du développement des vaisseaux lymphatiques et de leurs fonctions chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
Modifiées génétiquement pour rendre leurs vaisseaux lymphatiques visibles et pour permettre d'éteindre certains gènes au moment voulu, 1 846 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent d'une à quinze injections en étant vigiles, des instillations dans le nez, et une à deux injections après incision de la peau sous anesthésie. Le projet vise à décrire comment se met en place, après la naissance, le réseau lymphatique qui draine le cerveau. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur précisant que l'irritation liée aux incisions dure les deux heures qui séparent le réveil de la mise à mort.
Objectifs
Les vaisseaux lymphatiques ont pour fonction le nettoyage des tissus en drainant les fluides et les déchets dans les différents organes. Ils participent aussi à la réponse immunitaire. Nous nous intéresserons aux vaisseaux lymphatiques autour du système nerveux central. Ils sont capables de drainer les débris, les antigènes cérébraux et le liquide céphalorachidien. Leur implication a été démontrée dans de nombreux modèles de pathologies neurologiques. Ce réseau se développe après la naissance chez la souris et est à l’heure actuelle peu étudiée. Nos objectifs sont d'étudier le développement postnatal des vaisseaux lymphatiques drainant le cerveau et d'identifier les mécanismes qui contrôlent leur fonction.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser la mise en place des vaisseaux lymphatiques et leur fonction. Les mécanismes biologiques seront caractérisés dans le but développer des outils moléculaires capable de moduler les différentes fonctions des vaisseaux lymphatiques méningés et de la réponse immunitaire. À long terme, les informations recueillies grâce à ce projet pourraient contribuer au développement de nouvelles thérapies pour les troubles neurologiques.
Procédures
Injections de molécules sur souris vigiles : entre 1-15 injections, durée geste: entre 1 et 10 min. Incisions cutanées et injections sous anesthésie : 1-2 injections, durée geste: entre 10 et 15 min
Impact sur les animaux
L'anesthésie, les instillations intranasales et les injections de modulateurs et de traceurs peuvent provoquer une légère douleur et un certain stress au moment de leur administration. Les incisions cutanées peuvent entraîner une irritation modérée pendant les deux heures séparant le réveil de l'anesthésie de la mise à mort des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de réaliser des études des vaisseaux lymphatiques méningés et du cerveau des animaux.
Remplacement
Les médiateurs de croissance des vaisseaux lymphatiques que nous caractériserons dans ce projet ont été sélectionnés parmi un ensemble de médiateurs candidats en fonction de leur capacité à moduler de manière reproductible la migration des cellules endothéliales lymphatiques in vitro. Afin d'étudier leur rôle spécifique dans le drainage lymphatique cérébral et leur potentiel thérapeutique, le recours à des modèles animaux est indispensable. Cependant, à chaque fois que ce sera possible, l’étude des mécanismes moléculaires identifiés in vivo sera approfondie sur des cellules lymphatiques in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. La taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats a été déterminée à partir de données collectées au cours d’expériences précédentes, ainsi que par utilisation de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les souris sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichie. Ils sont anesthésiées pour toute intervention. Nous avons défini une grille de score avec des points limites adaptés. En cas d'une altération modérée ne répondant aux critères de mise-à-mort, les soins à apporter seront définis avec la personne responsable du bien-être animal. Pour les incisions cutanées, les souris sont maintenues sur un tapis chauffant thermostatée. Du gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter l’assèchement. Les souriceaux seront placés dans une chambre de réveil chauffée et hydratée afin de faciliter leur rétablissement post-opératoire.
Choix des espèces
Notre objectif est d'identifier les mécanismes moléculaires du remodelage et de fonction lymphatiques. Le modèle animal est donc indispensable à notre recherche. L’existence de modèles génétiques permettant de visualiser les vaisseaux lymphatiques et d’inactiver de manière temporelle et spatiale des gènes d'intérêt fait de la souris le modèle de choix pour décrypter les mécanismes contrôlant les différentes fonctions des vaisseaux lymphatiques. Les souris seront analysées à différents jours après la naissance et chez l’adulte pour étudier les effets de nos gènes d’intérêt et/ou des agents activant ou bloquant les voies de signalisation impliquées dans la mise en place et le maintien du réseau vaisseaux lymphatiques.
Microévolution du bacille de la peste dans le vecteur puce : dynamiques et conséquences fonctionnelles
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Exposés une heure au contact de puces, des souriceaux de deux à cinq jours sont utilisés pour nourrir les colonies d'insectes. 5 104 souris vont être utilisées, 2 760 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 2 344 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Le porteur indique qu'au-delà d'un millier de puces l'alimentation simultanée provoque une perte de sang importante, une perte de conscience puis un décès rapide, et qualifie la phase consciente de brève. L'objet du projet est de savoir si le bacille de la peste mute dans la puce, où et quand, et la description des procédures tient en une phrase, sans dire combien de souriceaux sont exposés à ces effectifs de puces.
Objectifs
Le bacille de la peste, responsable de la maladie du même nom transmise par les puces, connaît des phénomènes de microévolution, révélés par des signatures génétiques partiellement documentée. Toutefois, on ignore encore si ces microévolutions surviennent dans le vecteur. Si c’est le cas, on ne sait ni où ni quand elles apparaissent, ni quelles fonctions elles remplissent dans la colonisation de la puce. Ce projet vise à lever ces inconnues en identifiant ces signatures moléculaires, en les localisant de façon spatio-temporelle chez la puce, puis en évaluant leur impact sur la capacité du bacille à produire une infection transmissible chez l’insecte. En améliorant notre compréhension des mécanismes d’adaptation du bacille dans son vecteur, cette recherche contribuera à évaluer le risque d’émergence épidémique et à concevoir de nouvelles stratégies de lutte.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances inédites sur les mécanismes d’adaptation de Y. pestis à ses vecteurs, en identifiant les mutations associées à la persistance et à la transmission. Ces données permettront d’évaluer plus finement le risque d’émergence épidémique et de cibler de nouvelles stratégies de lutte. Les bénéfices attendus sont en santé publique, animale, comme en recherche fondamentale.
Procédures
Les animaux seront exposés une seule fois au contract de puces pendant une durée d'heure.
Impact sur les animaux
L’exposition aux puces peut entraîner deux types de nuisance. D’une part, les piqûres elles-mêmes, atténuées par les propriétés analgésiques et anti-inflammatoires de leur salive. D’autre part, la perte sanguine liée à l’alimentation des insectes. Lors d’expositions avec un nombre limité de puces, la quantité de sang prélevée demeure faible et n’entraîne pas d’effet physiologique observable dans nos conditions. A l’inverse, lors du nourrissage de colonies établies sur souriceaux, l’alimentation simultanée d’un très grand nombre de puces provoque une perte de sang importante, conduisant rapidement à une perte de conscience puis au décès très rapide. Dans ce contexte, la phase consciente est brève et la perception nociceptive potentielle reste transitoire.
Devenir
Quel que soit la procédure, les animaux ne seront pas maintenus en vie après leur utilisation. Leur prise en charge en fin de protocole est strictement encadrée et conforme aux exigences sanitaires et réglementaires en vigueur, afin d’éviter tout risque de contamination croisée et de garantir la sécurité des installations expérimentales.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro capable de reproduire le cycle biologique complet des puces ni leurs interactions physiologiques avec un hôte. Les puces sont des insectes hématophages stricts, et la prise de repas sanguin constitue un déclencheur physiologique essentiel à leur développement, leur reproduction et leur ponte. Ce processus dépend non seulement de la disponibilité du sang, mais aussi de signaux sensoriels et hormonaux issus du contact avec un hôte vivant. L’utilisation de systèmes artificiels de nourrissage, comme des membranes synthétiques, reste inadaptée à notre contexte expérimental. Ces dispositifs ne permettent ni une alimentation efficace ni une reproduction stable chez les espèces ciblées ici. Ils exposent également les puces à des anticoagulants et à des contaminations bactériennes ou fongiques, nécessitant l’ajout d’antimicrobiens qui altèrent leur physiologie et compromettent la validité des données. Enfin, il n’existe actuellement ni lignée cellulaire, ni modèle substitutif permettant de reconstituer ex vivo les interactions complexes entre la puce et son hôte.
Réduction
L’utilisation de souriceaux permet de nourrir un grand nombre de puces tout en mobilisant un nombre réduit d’animaux. Un seul souriceau remplace le volume sanguin fourni par 4 à 5 souris adultes dans un système artificiel équivalent, ce qui contribue significativement à la réduction du nombre total d’animaux utilisés. Notre stratégie expérimentale a également été conçue pour limiter le recours aux animaux, tout en maintenant la robustesse scientifique du modèle. Nous avons aussi choisi de travailler avec une souche de puce dont le cycle biologique permet un nourrissage bihebdomadaire, contrairement à d’autres espèces qui nécessitent un nourrissage tous les deux jours à minima. Ce choix permet de réduire sensiblement le nombre de souriceaux requis. Par ailleurs, notre expérience montre qu’il est possible d’interrompre un nourrissage une fois par mois sans compromettre la survie des colonies, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour leur maintien. Pour l’étude sur l’émergence de nouveaux variants, nous avons choisi un nourrissage tous les deux jours. Ce rythme est plus fréquent que le bihebdomadaire habituel, mais reste inférieur au quotidien. Il maximise les chances de détection d’un événement évolutif sans pour autant mobiliser davantage d’animaux qu’un nourrissage quotidien, qui ne nous apporterait pas d’information supplémentaire utile. Enfin, nous regroupons autant que possible plusieurs tests en présence d’une condition témoin.
Raffinement
Plusieurs mesures ont été intégrées pour minimiser la contrainte associée aux nourrissages. Les souriceaux seront exposés sans contention, pendant une durée limitée à une heure. Ce choix contribue au raffinement en réduisant stress et douleur. Les stades utilisés (2 à 5 jours) correspondent à une période de développement où la perception nociceptive est présente, mais encore partiellement intégrée, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Des observations seront menées pendant et après l’exposition afin de détecter tout signe de souffrance (vocalisation, évitement, apathie). Enfin, les puces injectant naturellement des molécules salivaires aux propriétés analgésiques et anti-inflammatoires, cette particularité constitue une forme de raffinement biologique supplémentaire. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure afin de permettre l’identification précoce de signes de souffrance justifiant l’interruption de l’expérimentation et l’euthanasie immédiate de l’animal.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), qui constitue un hôte naturel ou compatible pour de nombreuses espèces de puces ciblées par le projet. Elle est couramment utilisée pour le nourrissage de puces en contexte expérimental. Son statut d’espèce modèle, sa physiologie bien connue, et sa compatibilité avec les besoins alimentaires des puces en font un choix scientifiquement pertinent et largement validé pour ce type de protocole. Souriceaux âgés de 2 à 5 jours. Il s’agit du stade privilégié pour les nourrissages expérimentaux. A ce stade, les souriceaux sont glabres, leur peau est fine, et leur système nerveux est encore en développement. Bien que la perception nociceptive soit présente dès la naissance, son intégration centrale est partielle, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Lorsqu’ils sont exposés à un grand nombre de puces (>1000), l’exsanguination entraîne une perte rapide de conscience suivi du décès rapide. La perception nociceptive potentielle est intense mais très transitoire, et ne s’accompagne d’aucun signe comportemental prolongé. Par ailleurs, l’utilisation de souriceaux permet de réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés: un seul individu alimente les puces alors qu’il faudrait 4 à 5 souris adultes nécessaires pour obtenir un volume sanguin équivalent lors d’un nourrissage artificiel. La faible pilosité des souriceaux permet également de limiter les risques de fuite des insectes, ce qui sécurise la procédure. Ces animaux seront exposés sans contention, pendant une durée maximale d’une heure, ce qui réduit le stress. Ce stade est également optimal pour les puces, en raison de la vascularisation cutanée. Leur utilisation répond donc à la fois aux objectifs scientifiques et au principe de raffinement.
Impact de la fibrose sur la régénération musculaire et sur des stratégies thérapeutiques innovantes chez la souris dystrophique MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 284 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles et leurs organes. Une partie reçoit une injection de myotoxine dans le muscle de la patte, une autre une greffe musculaire de trente minutes sous anesthésie, une autre encore des injections ou un gavage jusqu'à deux fois par jour pendant treize semaines. Certaines sont immunodéficientes, donc exposées aux infections, et la mesure finale de contractilité du muscle se fait sans réveil. Cette modification du projet augmente l'effectif pour tester de nouvelles molécules antifibrotiques, et le porteur affirme que thérapie cellulaire, thérapie génique, régénération et fibrose ne peuvent s'étudier qu'in vivo, sans autre argument.
Objectifs
Nous nous intéressons aux dystrophies musculaires, un groupe de maladies génétiques qui touchent le muscle squelettique. Elles sont caractérisées par une faiblesse musculaire, une dégénérescence progressive des muscles du corps. Dans certains types de dystrophies musculaires, comme par exemple la dystrophie musculaire de Duchenne (incidence 1 sur 3500 naissances de garçons), la dystrophie musculaire oculo-pharyngée (1 sur 100000) ou la dystrophie musculaire des ceintures (prévalence entre 1 et 3 personnes sur 125000) entre autres, l’apparition de tissu cicatriciel (appelé fibrose) dans les muscles est également observée. Le processus fibrotique représente une réponse progressive qui aboutit, suite à la production excessive de tissu cicatriciel remplaçant le tissu, à une dysfonction de l’organe et à dans certains cas peut amener à la mort de l’individu. Dans le muscle squelettique (comme dans nombreux autres tissus), le processus qui amène l’apparition de tissu cicatriciel reste un processus très peu connu et son impact sur la régénération musculaire et son influence sur certaines des thérapies innovantes utilisées dans des essais cliniques dans le cadre des dystrophies musculaires, reste mal compris. Ce projet consiste à 1) étudier l'impact de la fibrose musculaire sur la régénération musculaire; 2) étudier comment la fibrose musculaire peut influencer certaines approches thérapeutiques comme la thérapie génique et la thérapie cellulaire; 3) tester des approches thérapeutiques visés à diminuer la fibrose et améliorer la fonction musculaire dans des modèles de dystrophie musculaire. Le projet nécessite une modification avec augmentation du nombre d'animaux afin d'étudier de nouvelles approches thérapeutiques anti-fibrotiques chez la souris dystroophique.
Bénéfices attendus
Ce projet aidera à comprendre comment la présence de tissu cicatriciel (fibrose musculaire) au sein du muscle squelettique est capable de modifier la régénération du muscle. Également, il permettra de comprendre comment la fibrose peut influencer l’efficacité de certaines stratégies thérapeutiques, comme la thérapie cellulaire par transfert de myoblastes et la thérapie génique, qui représentent des thérapies envisageables pour des maladies génétiques comme les dystrophies musculaires. Enfin, il permettra de tester des approches thérapeutiques visés à diminuer la fibrose et améliorer la fonction musculaire dans des modèles de dystrophie musculaire.
Procédures
Différents groupes d’animaux seront soumis à différentes procédures. Un lot d'animaux sera soumis à l'injection d'une toxine musculaire sous anesthésie. Il s'agit d'une intervention de très courte durée (l'injection de la toxine elle-même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes); Un lot d'animaux sera soumis à l’injection de molécules thérapeutiques ou de cellules (sous anesthésie/analgésie). Il s'agit également d'une intervention de très courte durée (l'injection elle-même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes); Un lot d'animaux sera soumis alternativement pour une durée de traitement estimé à environ 13 semaines à :i) l’injection d’une molécule thérapeutique (maximum deux fois par jour, sur animaux vigils) ; ii) le gavage d’une molécule thérapeutique (maximum deux fois par jour sur animaux vigils) ;iii) l’administration d’un molécule thérapeutique dans la nourriture (animaux vigils); iv) l’injection de molécules thérapeutiques sous anesthésie. Les manipulations des souris dans ces interventions sont de très courte durée (moins qu’une minute) ; Un lot d'animaux sera soumis à une greffe musculaire, une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et analgésie d’une durée de 30 minutes ; Un lot d'animaux sera soumis à une mesure in situ de la contractilité du muscle squelettique (durée de 15 minutes) qui est un acte sans réveil effectuée sous anesthésie et analgésie. Cet acte est suivi de l’euthanasie (réalisée sous anesthésie et analgésie) des tous les animaux afin de permettre le prélèvement des organes d’intérêt.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés présentent une fibrose musculaire à partir de 2 mois (selon le modèle utilisé) sans signe clinique associés. Certains animaux seront également immunodéficients et sont donc plus sensibles aux infections. Dans notre projet, nous injectons des cellules ou des molécules à effet thérapeutique chez la souris. Pour certaines souris cela sera après avoir effectué un dommage musculaire du muscle tibialis anterior. D’autre animaux auront une greffe musculaire. L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection, l'animal pourrait alors ressentir une douleur locale au niveau du site d'injection. Certains animaux auront un traitement en systémique. L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection ou un des effets secondaires liés à la molécule administrée. Lors des anesthésies effectuées pour l'ensemble des gestes techniques, les risques/contraintes peuvent être les suivants : effets sur les variables physiologiques affectant le maintien de l'homéostasie pendant l'anesthésie (hypothermie, hypotension, hypoxie)
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. L’analyse des muscles injectés et des autres organes (foie, etc) est indispensable pour ce projet. L'euthanasie de l’ensemble des animaux est donc requise.
Remplacement
La thérapie cellulaire, génique, la régénération musculaire et la fibrose sont des processus qui peuvent être investigués exclusivement in vivo et pour le quel un remplacement in vitro en respect de la règle de 3R n’est pas encore possible.
Réduction
Chaque groupe sera constitué de 8-20 animaux pour obtenir des résultats statistiques. Dans le respect de la règle des 3R, une première série d’ expériences sera réalisée sur 5-12 souris. Le nombre sera incrémenté exclusivement si besoin. En outre, afin de réduire le nombre de souris utilisées (dans le respect de la règle des 3R) pour chaque souris, quand possible, les deux muscles Tibialis Anterior (gauche et droite) seront injectés. Au maximum un total de 1284 souris seront utilisées dans ce projet. Afin de comparer les groupes de sujets, nous réaliserons une analyse statistique.
Raffinement
Pour le raffinent, les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons ou tunnel en carton ou carré de coton compacté. Suite à la procédure chirurgicale, qui est réalisé sous anesthésie/analgésie, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience afin de déceler des signes de douleur. Pour l’injection de vecteurs AAV- virus adéno-associés- en intramusculaire, pour l’injection de la myotoxine et l’injection de cellules, les souris sont anesthésiées. Les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la perte de poids, des plaies au site d’injection, une croissance excessive des dents seront évalués régulièrement. Les animaux qui montrent un signe quelconque de détérioration de leur santé seront euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est le modèle le plus commun utilisé dans des études de régénération musculaire et de compréhension des mécanismes physiopathologique du muscle squelettique, ainsi que dans des études pour évaluer la participation des myoblastes humains à la régénération musculaire et de thérapie génique. Nous utiliserons de souris présentant de la fibrose musculaire pour pouvoir étudier l’effet de la fibrose sur la régénération musculaire, la thérapie cellulaire et génique et tester des approches thérapeutiques visés à diminuer la fibrose et améliorer la fonction musculaire dans des modèles de dystrophie musculaire. Nous utiliserons des souris d’âge adulte (2 mois et plus): puisque c’est à partir de cet âge qu’elles présentent de la fibrose au niveau musculaire.
Rôle du variant K460X-ANGPTL6 dans l’anévrisme intracrânien chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Piquées chaque semaine pour la glycémie, tous les quinze jours pour les lipides, puis cinq fois en deux heures lors d'un test de tolérance au glucose et sept fois lors d'un test à l'insuline, 144 souris porteuses d'une mutation liée à l'anévrisme intracrânien sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le gavage et l'injection intrapéritonéale de ces tests provoquent, selon le porteur, un stress et une douleur qu'il qualifie de petits. Il écrit être "malheureusement contraint" de recourir aux modèles animaux, faute de pouvoir étudier le métabolisme énergétique in vitro. Les 144 souris sont tuées par ponction cardiaque sous anesthésie, pour prélever leurs organes.
Objectifs
Notre objectif global est d'améliorer notre connaissance des mécanismes physiopathologiques de l'anévrisme intracrânien. L'anévrisme est une anomalie cérébrovasculaire fréquente et généralement asymptomatique affectant environ 3 % de la population générale. L'anévrisme intracrânien se caractérise par une dilatation localisée et un amincissement de la paroi des artères intracrâniennes, le plus souvent au niveau des bifurcations des artères cérébrales. La complication dévastatrice de l'anévrisme est sa rupture et l'hémorragie intracrânienne qui en résulte, mortelle dans la moitié des cas ou laissant des séquelles neurologiques majeures. Encore aujourd’hui, il n'existe aucun traitement permettant de prédire la formation ou le devenir d'un anévrisme. Les facteurs de risque tels que l'hypertension, l'âge, le tabagisme, les antécédents familiaux d'anévrisme mais également le sexe féminin, prédisposent à la formation et à la rupture de l'anévrisme. Le laboratoire a récemment identifié une mutation dans plusieurs familles atteintes d’anévrisme. Ce gène code pour une protéine circulante, essentiellement exprimée au niveau du foie, et décrite pour favoriser la croissance et le développement des vaisseaux sanguins. Cette mutation conduit à l'expression d'une protéine plus petite, non sécrétée. Cette protéine est également connue pour être impliquée dans le métabolisme énergétique, le métabolisme du glucose mais aussi celui des lipides. Pour comprendre pourquoi cette mutation prédispose à l'anévrisme, nous avons développé un modèle de souris exprimant cette mutation. Nos premiers résultats suggèrent que cette protéine joue un rôle majeur dans la physiopathologie de l’anévrisme, avec un impact plus fort chez les femelles que chez les mâles. La compréhension des mécanismes physiopathologiques conduisant à la formation de l’anévrisme intracrânien est donc une condition préalable à l'amélioration de l'évaluation de la maladie et de la prise en charge des patients atteints d'anévrisme intracrânien.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont: 1) Apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires à l'origine de la formation de l'anévrisme et identifier les voies régulées par la mutation de notre gène d'intérêt. Notre projet pourrait ainsi, à court terme, contribuer à clarifier le lien entre les troubles métaboliques et l'anévrisme, et permettrait d'améliorer la qualité de vie des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. 2) Identifier les voies dérégulées par notre mutation d'intérêt. Notre projet, à court terme, pourrait ainsi aider à clarifier le lien entre les troubles métaboliques et l'anévrisme, et ouvrirait de nouvelles voies pour la recherche de biomarqueurs de progression de l'anévrisme afin d'optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies intracérébrales aiguës. 3) Découvrir de nouvelles cibles pharmacologiques potentielles qui, à moyen/long terme, pourraient être utilisées pour développer des thérapies innovantes afin de limiter ou de prévenir la progression de l'anévrisme.
Procédures
1fois/semaine, prélèvement de sang pour contrôler la glycémie (1 min). Toutes les 2 semaines, 1 prélèvement de sang réalisé pour contrôler les concentrations plasmatiques lipidiques (durée 2min). Pour le test de tolérance au glucose, glycémie contrôlée toutes les 30 minutes pendant 2heures, soit 5 prélèvements. Durée de chaque prélèvement : 1 à 2 minutes. Pour le test de tolérance à l’insuline, 7 prélèvements de sang pour contrôler la glycémie (durée: 1 à 2 min). Enfin, prélèvement de sang par ponction cardiaque lors de l’euthanasie (animal sous anesthésie pendant le prélèvement: durée: 5 minutes)
Impact sur les animaux
Il s’agit d’une procédure légère, nous n’attendons pas d’effets indésirables notables. Les nuisances pourraient concerner : - les prélèvements de sang : petite douleur possible au niveau de l’incision, - le gavage lors du test de tolérance au glucose peut induire un stress - l’injection intrapéritonéale lors du test de tolérance à l’insuline (stress lié à la contention et douleur liée à l’introduction de l’aiguille).
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour réaliser des prélèvements d'organes en vue d'analyses histologiques, biochimiques et transcriptomiques.
Remplacement
Le métabolisme énergétique et le développement de l'obésité sont des processus physiologiques complexes, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier ce paramètre d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini avec un logiciel de statistique. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant la lignée murine la plus adaptée à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
Les procédures, de classe légère, ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. Les animaux seront hébergés à 4 ou 5 par cage dans un environnement contrôlé. Les cages seront enrichies par des frisottis et un dôme en carton. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée. Une grille de score et de points limites seront mises en place pour permettre d'identifier tout signe précoce de souffrance et y remédier si besoin. Si la douleur ne peut être traitée, l’animal sera alors mis à mort. De plus, tout geste invasif sera réalisé sous analgésie et/ou anesthésie adaptées.
Choix des espèces
Pour le système vasculaire et les mécanismes de régulation de l’homéostasie énergétique, il est fondamental d’étudier les potentielles anomalies sur l’animal entier, soumis à l’ensemble des systèmes régulateurs, de façon parfaitement intégré. Le modèle murin reste donc le modèle de choix. Nous choisissons donc de travailler sur la souris, cette dernière nous permettant plus facilement de mettre en œuvre l’étude du gène Angptl6 identifié en amont Les procédures débuteront chez des animaux adultes jeunes, matures, soit à partir de 8 semaines de vie.