Souris

Pour mettre au point des méthodes plus rapides de suivi de l'infection des puces par le bacille de la peste, 4 113 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ce sont des souriceaux de 2 à 5 jours, exposés une heure sans contention au contact de puces qui se nourrissent de leur sang. Pour l'entretien des colonies d'insectes, plus de 1 000 puces s'alimentent en même temps sur un même souriceau, ce qui provoque une perte de sang massive, une perte de conscience puis la mort. Le porteur retient ce stade parce que la peau est fine et le système nerveux encore immature, et qualifie la douleur possible d'"intense mais très transitoire", tout en classant l'ensemble du projet en souffrance légère et modérée.

Objectifs

La peste, maladie vectorielle grave transmise par les puces, demeure un enjeu majeur de santé publique à l’échelle internationale. Elle est aujourd’hui absente du territoire français mais une réémergence en Europe reste possible en lien avec les changements climatiques et la mobilité des populations et des animaux. Les méthodes actuelles de suivi expérimental de l’infection des puces par le bacille de la peste sont complexes, longues à maîtriser et coûteuses, ce qui freine les études et la reproductibilité. Ce projet vise à développer et valider deux outils complémentaires afin de faciliter ces travaux. Le premier est une méthode simplifiée, rapide et moins coûteuse pour quantifier la charge bactérienne au cours de l’infection chez la puce avec une évaluation comparative aux méthodes de référence. Le second établira une méthode opérationnelle de diagnostic de l’état infectieux des puces, facile à apprendre et à mettre en œuvre par du personnel non spécialiste, permettant de classer de manière fiable les individus pour les études de transmission.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer des méthodologies d’analyse et de suivi de l’infection des puces plus rapidement maîtrisables, moins coûteuses et faciles à mettre en œuvre sans formation spécialisée. Ces avancées accéléreront les recherches sur la peste et contribueront, à terme, au développement de stratégies de lutte plus efficaces. Les approches proposées sont conçues pour être transposables à l’étude d’autres vecteurs impliqués dans la transmission de pathogènes, élargissant ainsi la portée du projet au-delà du seul cadre du bacille de la peste.

Procédures

Les animaux seront exposés une seule fois au contract de puces pendant une durée d'une heure.

Impact sur les animaux

L’exposition aux puces peut entraîner deux types de nuisance. D’une part, les piqûres elles-mêmes, atténuées par les propriétés analgésiques et anti-inflammatoires de leur salive. D’autre part, la perte sanguine liée à l’alimentation des insectes. Lors d’expositions avec un nombre limité de puces, la quantité de sang prélevée demeure faible et n’entraîne pas d’effet physiologique observable dans nos conditions. A l’inverse, lors du nourrissage de colonies établies sur souriceaux, l’alimentation simultanée d’un très grand nombre de puces provoque une perte de sang importante, conduisant rapidement à une perte de conscience puis au décès très rapide. Dans ce contexte, la phase consciente est brève et la perception nociceptive potentielle reste transitoire.

Devenir

Quel que soit la procédure, les animaux ne seront pas maintenus en vie après leur utilisation. Leur prise en charge en fin de protocole est strictement encadrée et conforme aux exigences sanitaires et réglementaires en vigueur, afin d’éviter tout risque de contamination croisée et de garantir la sécurité des installations expérimentales.

Remplacement

A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro capable de reproduire le cycle biologique complet des puces ni leurs interactions physiologiques avec un hôte. Les puces sont des insectes hématophages stricts, et la prise de repas sanguin constitue un déclencheur physiologique essentiel à leur développement, leur reproduction et leur ponte. Ce processus dépend non seulement de la disponibilité du sang, mais aussi de signaux sensoriels et hormonaux issus du contact avec un hôte vivant. L’utilisation de systèmes artificiels de nourrissage, comme des membranes synthétiques, reste inadaptée à notre contexte expérimental. Ces dispositifs ne permettent ni une alimentation efficace ni une reproduction stable chez les espèces ciblées ici. Ils exposent également les puces à des anticoagulants et à des contaminations bactériennes ou fongiques, nécessitant l’ajout d’antimicrobiens qui altèrent leur physiologie et compromettent la validité des données. Enfin, il n’existe actuellement ni lignée cellulaire, ni modèle substitutif permettant de reconstituer ex vivo les interactions complexes entre la puce et son hôte.

Réduction

L’utilisation de souriceaux permet de nourrir un grand nombre de puces tout en mobilisant un nombre réduit d’animaux. Un seul souriceau remplace le volume sanguin fourni par 4 à 5 souris adultes dans un système artificiel équivalent, ce qui contribue significativement à la réduction du nombre total d’animaux utilisés. Nous avons aussi choisi de travailler avec une souche de puce dont le cycle biologique permet un nourrissage bihebdomadaire, contrairement à d’autres espèces qui nécessitent un nourrissage tous les deux jours à minima. Ce choix permet de réduire sensiblement le nombre de souriceaux requis. Par ailleurs, notre expérience montre qu’il est possible d’interrompre un nourrissage une semaine par mois sans compromettre la survie des colonies, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour leur maintien. Concernant les images nécessaires au développement de la méthode de diagnostic visuel, les puces saines photographiées seront systématiquement remises dans l’élevage après prise de vue. Elles pourront ainsi être réutilisées ultérieurement pour des infections expérimentales, évitant d’utiliser des animaux supplémentaires pour générer deux types d’images (puces saines et infectées).

Raffinement

Plusieurs mesures ont été intégrées pour minimiser la contrainte associée aux nourrissages. Les souriceaux seront exposés sans contention, pendant une durée limitée à une heure. Ce choix contribue au raffinement en réduisant stress et douleur. Les stades utilisés (2 à 5 jours) correspondent à une période de développement où la perception nociceptive est présente, mais encore partiellement intégrée, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Des observations seront menées pendant et après l’exposition afin de détecter tout signe de souffrance (vocalisation, évitement, apathie). Enfin, les puces injectant naturellement des molécules salivaires aux propriétés analgésiques et anti-inflammatoires, cette particularité constitue une forme de raffinement biologique supplémentaire. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure afin de permettre l’identification précoce de signes de souffrance justifiant l’interruption de l’expérimentation et l’euthanasie immédiate de l’animal.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), qui constitue un hôte naturel ou compatible pour de nombreuses espèces de puces ciblées par le projet. Elle est couramment utilisée pour le nourrissage de puces en contexte expérimental,, sa physiologie bien connue, et sa compatibilité avec les besoins alimentaires des puces en font un choix scientifiquement pertinent et largement validé pour ce type de protocole. Souriceaux âgés de 2 à 5 jours. Il s’agit du stade privilégié pour les nourrissages expérimentaux. A ce stade, les souriceaux sont glabres, leur peau est fine, et leur système nerveux est encore en développement. Bien que la perception nociceptive soit présente dès la naissance, son intégration centrale est partielle, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Lorsqu’ils sont exposés à un grand nombre de puces (>1000), l’exsanguination entraîne une perte rapide de conscience suivi du décès rapide. La perception nociceptive potentielle est intense mais très transitoire, et ne s’accompagne d’aucun signe comportemental prolongé. Par ailleurs, l’utilisation de souriceaux permet de réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés: un seul individu alimente les puces alors qu’il faudrait 4 à 5 souris adultes nécessaires pour obtenir un volume sanguin équivalent lors d’un nourrissage artificiel. La faible pilosité des souriceaux permet également de limiter les risques de fuite des insectes, ce qui sécurise la procédure. Ces animaux seront exposés sans contention, pendant une durée maximale d’une heure, ce qui réduit le stress. Ce stade est également optimal pour les puces, en raison de la vascularisation cutanée. Leur utilisation répond donc à la fois aux objectifs scientifiques et au principe de raffinement.

Âgées de trois semaines, les souris utilisées servent à reproduire la méningite de l'enfant, et certaines lignées génétiquement déficientes portent un risque accru d'infection. 3 700 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit une injection bactérienne sous anesthésie générale d'environ trois minutes, puis jusqu'à deux injections supplémentaires de trente secondes, le porteur indiquant que l'infection peut provoquer douleur, prostration et retrait du groupe social pendant seize heures au plus. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau et analyser la réponse inflammatoire, seul moyen selon le porteur d'identifier les molécules qui abîment le cerveau au cours de l'infection.

Objectifs

La méningite est une infection du cerveau qui est associée à un taux de mortalité élevé ou laisse chez 30 à 50 % des survivants, des séquelles neurologiques. Lorsqu'un microorganisme envahit le cerveau, une réponse immunitaire est déclenchée afin de combattre l’infection. Cependant,cette réponse peut aussi causer des dommages au cerveau responsable en partie des séquelles neurologiques. Notre objectif est de caractériser la réponse immunitaire du cerveau lors de l’infection et d’identifier des molécules inflammatoires qui pourraient jouer un rôle néfaste sur le cerveau.

Bénéfices attendus

L'identification de ces molécules inflammatoires impliquées dans les dommages au cerveau lors de la méningite accélérera le développement de thérapies visant à réduire les séquelles neurologiques à long terme.

Procédures

Les animaux seront infectés par injection sous anesthésie générale (1 injection pour une durée totale d'environ 3 min). Des injections supplémentaires permettant l'administration de traitement ou d'anesthésie seront réalisées (jusqu'à 2 injections/animaux durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les injections causent un stress de courte durée (quelques secondes). L'infection est susceptible de générer douleur, prostration, et une mise en retrait du groupe social (16h maximum). Certaines souris génétiquement déficientes qui seront élévées présentent un risque accru de développer une infection.

Devenir

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de reproduire la complexicité du cerveau et du système immunitaire in vitro. L'analyse de la réponse inflammatoire du cerveau nécessite le prélevement des organes justifiant la mise à mort des animaux.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas l'étude de la réponse inflammatoire du cerveau qui peut mettre en jeux de nombreux types de cellules. Aussi, le modèle animal est indispensable à ce projet qui permettra d'identifier l'ensemble des cellules et molécules inflammatoires impliquées dans ce processus et également d'analyser l'impact de l'inflammation systémique sur le déclanchement de la neuroinflammation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum mais suffisant pour permettre une analyse statistique fiable. Chaque expérience indépendante comportera au moins un groupe témoin d'animaux et un groupe test et les différences entre les souris test et les témoins seront analysées par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

L’infection se fera sous anesthésie générale. Les animaux bénéficieront d’un hébergement adapté et d'un milieu enrichi. Nous avons optimisé les inocula bactériens et les temps d’étude de manière à minimiser les effets de l’infection sur les animaux. Ce protocole inclut des points limites spécifiques au projet qui permettront d'évaluer les animaux, à l'aide d'une grille de score. En cas de point limite atteint, les animaux seront mis à mort de façon anticipée. Dans le cas où certains animaux peuvent être malades, des croquettes imbibées d’eau sont systématiquement introduites directement dans la cage pour favoriser la prise alimentaire. Pour les souris immunodéprimées, un hébergement sans orgganismes pathogène sera mis en place;

Choix des espèces

La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire la physiopathologie de l'infection tels qu’ils peuvent se développer chez l'enfant. Nous utiliserons des souris juvénile de 3 semaines qui constituent notre modèle d'étude de méningite. D’autre part, les modèles animaux comme la souris offrent la possibilité d’investiguer des cibles spécifiques in vivo à l’aide d’animaux génétiquement modifiés, ce qui permet d'approcher ou d'élucider de plus près les mécanismes impliqués

19 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs vivent cinq ans en isolement intermittent, ne rejoignant des femelles qu'une nuit à la fois, et sont tués au gaz carbonique avant leurs douze mois. Les donneuses reçoivent deux injections hormonales à quarante-huit heures d'intervalle puis sont tuées par dislocation cervicale pour la récolte des embryons, les receveuses subissent un transfert d'embryons sous anesthésie générale et sont tuées en fin de procédure, un second transfert leur étant refusé. Le porteur reconnaît que l'isolement peut générer de l'anxiété chez un animal social, et présente cette plateforme de création de lignées comme un moyen d'obtenir des souris modifiées "en utilisant peu d'animaux".

Objectifs

Les équipes des instituts de recherche utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez la souris, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées sous une forme similiaire chez des patients humains, à évaluer des stratégies thérapeutiques adaptées en conséquence. La plateforme a pour objectif la génération de tels modèles murins transgéniques sur site, par approche Crispr/Cas 9.

Bénéfices attendus

L'application du système Crispr/Cas9 à l'embryon de souris permet l'obtention de souris d'intérêt génétiquement modifiées dans des délais courts, en utilisant peu d'animaux (de part l'efficacité des réactifs utilisés), et ce directement dans un fonds génétique d'intérêt donné. Les lignées génétiquement modifiées créées par notre plateforme sont des modèles de choix pour la communauté scientifique. En effet, ce sont des modèles pour la recherche fondamentale, mais aussi des modèles de pathologies humaines servant à mieux comprendre les processus de développement de ces maladies et voire même à tester des molécules/médicaments afin de valider (ou invalider) des cibles thérapeutiques potentielles.

Procédures

Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs seront herbergés en situation d'isolement sur 5 ans. Les femelles donneuses seront soumises à une stimulation hormonale (2 injections intra-péritonéales (durée inférieure à 5 secondes) à 48h d'intervalle). Les femelles receveuses recevront des embryons par transfert d'embryons dans l'oviducte sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 40min). Les souriceaux fondateurs seront suivis pour de potentiels phénotypes dommageables. Les souriceaux issus des accouplements des fondateurs seront suivis pour de potentiels phénotypes dommageables.

Impact sur les animaux

Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs sont hébergés en situation d'isolement intermittent entre deux périodes d'accouplement, ces accouplements n'ayant lieu que sur des périodes courtes (une nuit) pour permettre le contrôle et la synchronisation de l'initiation des pseudo-gestations (dans le cas des mâles vasectomisés) ou pour permettre la production d'embryon un jour donné (dans le cas des mâles reproducteurs). L'isolement peut générer de l'anxiété, la souris étant un animal vivant en groupes sociaux. Les femelles pseudo-gestantes peuvent faire l'objet de douleurs post-chirurgicales suite à la réimplantation des embryons. Les animaux issus de ces manipulations peuvent potentiellement avoir un phénotype dommageable. Une fiche de suivi sera attribuée à chacun d'entre eux.

Devenir

Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs en situation d'isolement seront mis à mort par inhalation de CO2 via un système dédié avant qu'ils aient 12 mois. Les femelles donneuses sont mises à mort par dislocation cervicale afin de récolter les embryons post-mortem. Les femelles receveuses ne peuvent pas être sujettes à un deuxième transfert d'embryons, elles sont donc mises à mort par inhalation de CO2 via un système dédié en fin de procédure.

Remplacement

Il est impossible de remplacer l'utilisation de ces animaux, la génération de nouveaux modèles murins transgéniques impose l'utilisation d'animaux donneurs/receveurs d'embryons.

Réduction

La création de nouvelles lignées transgéniques sera limitée aux lignées qui ne sont pas disponibles, que ce soit sous forme respirante, d'embryons congelés, ou de semence congelée. L'estimation des nombres maximum d'animaux à utiliser dans ce projet a été faite en se basant sur la litterature scientifique. La grande effiacité des réactifs utilisés et des techniques de reproduction permettent de diminuer drastiquement le nombre d'animaux utilisés pour la génération d'une lignée

Raffinement

La potentielle douleur liée à la procédure de transfert d'embryons est prise en charge par une injection d'analgésie, et fait l'objet d'un suivi étroit des animaux.

Choix des espèces

Pas d’autres possibilités que l’utilisation de souris pour la production de lignées de souris génétiquement modifiées. Les animaux utilisés sont des reproducteurs à l'âge adulte pour les femelles receveuses,les males vasectomisés et les mâles reproducteurs, aprés la puberté et avant tout vieillissement. Les femelles donneuses utilisées sont des femelles impubéres (4 semaines) pour faciliter l'efficacité du traitement de superovulation.

Importées d'autres établissements ou déjà hébergées sur place, les lignées de souris concernées doivent changer de statut sanitaire, ce qui passe par la mort de toutes les femelles servant au transfert d'embryons. 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les donneuses, âgées de quatre à six semaines, reçoivent deux injections hormonales à deux jours d'intervalle avant d'être tuées pour la récolte des embryons, les receveuses subissent une chirurgie de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale puis partent chez un prestataire où elles sont tuées pour vérifier leur statut sanitaire. Celles chez qui la réimplantation échoue sont tuées faute de pouvoir être réutilisées, et le porteur affirme qu'un tel projet ne peut pas se faire sans souris, l'étude du cerveau étant selon lui hors de portée des modèles in vitro.

Objectifs

Les recherches réalisées dans l'établissement portent sur les maladies neurologiques telles que la maladie de Parkinson, Alzheimer, la sclérose en plaques et sur les maladies psychiatriques telles que la schizophrénie ou les troubles de l’humeur. Ces projets de recherche visent à développer les connaissances sur ces sujets et identifier des axes thérapeutiques innovants pour améliorer la prise en charge des patients. Les lignées murines nécessaires pour ces projets sont élevées en interne. Afin de pouvoir importer de nouvelles lignées d’intérêt possédant des caractéristiques génétiques précises il est parfois nécessaire de les décontaminer, de même pour certaines lignées déjà hébergées sur place mais nécessitant un statut sanitaire plus strict, notamment pour leur élevage. La décontamination des lignées et leur hébergement dans une zone protégée (exempte d’agent pathogènes et opportunistes pour les souris, ou SOPF) permettra un meilleur contrôle de leur statut sanitaire et une amélioration de leurs conditions d’hébergement. La décontamination se fera par la technique de transfert d’embryons se basant sur le principe que l’embryon est protégé de tout contaminant présent chez sa mère. Les embryons à transférer seront récoltés, puis lavés et réimplantés chez une femelle dite receveuse (pseudogestante) dans la zone protégée de l’animalerie dans le but d’obtenir des souriceaux de statut sanitaire SOPF.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer les conditions d’élevage des lignées murines concernées, grâce à un meilleur contrôle du statut sanitaire des animaux et de leurs conditions d’hébergement. En effet la zone protégée bénéficie d’un accès très restreint et donc un environnement plus calme, permettant aux animaux de ne pas être exposés au stress lié aux nombreux passages de personnes fréquentant l’animalerie, mais également aux pathogènes pouvant être amenés via ces mêmes personnes. Les animaux d’élevage seront donc placés dans des conditions optimales pour se reproduire. Les petits générés dans cette zone protégée pourront ensuite être récupérés par les chercheurs dans la zone expérimentale pour participer aux projets de recherche et donc contribuer à l’avancée de la recherche pour différentes pathologies du cerveau telles que la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, la sclérose en plaques, l’épilepsie, les tumeurs cérébrales, etc…

Procédures

Des souris femelles recevront 2 injections d’hormones à 2 jours d’intervalle (durée quelques secondes par injection, souris vigile) pour obtenir une superovulation. D’autres souris femelles auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour réimplanter les embryons (durée environ 45 minutes, une fois).

Impact sur les animaux

Lors des injections les animaux ressentiront une légère et brève douleur au niveau des zones de piqûre. La chirurgie sera associée à un risque de douleur et d’inconfort post-opératoire. L’anesthésie générale nécessaire pour la réaliser sera associée à des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et plus rarement un risque de difficultés cardiaque et, ou respiratoire. Il est possible que certaines lignées à transférer soient à phénotype dommageable. Pour la majorité de ces lignées le phénotype dommageable ne s’exprimera qu’à partir de l’âge adulte (plus de 8 semaines, exemples : perte de poids, apparition de tumeurs, difficultés motrices, etc.), ici nous utiliserons des femelles jeunes (moins de 6 semaines), les phénotypes dommageables que nous prévoyons de rencontrer pour ces jeunes animaux pourraient consister en des tremblements, des anomalies cognitives ou une différence de poids par rapport aux souris non génétiquement modifiées.

Devenir

Toutes les souris utilisées pour la production des embryons seront euthanasiées pour pouvoir récupérer ces embryons. Les souris réimplantées avec succès seront transférées à un prestataire pour la confirmation de leur statut sanitaire, ceci nécessitera leur euthanasie afin de réaliser des prélèvements d'intérêt post-mortem pour les différentes analyses nécessaires à la validation du statut sanitaire. Les femelles pour lesquelles la réimplantation n'aura pas fonctionné seront euthanasiées car elles ne pourront pas être réutilisées.

Remplacement

Ce projet consistant à décontaminer des lignées murines il ne peut se faire sans l’utilisation de souris. Cette décontamination intervient dans le contexte de souris utilisées pour des projets de recherche dédiés à l’étude du cerveau. Ces études ne peuvent s'effectuer que sur des modèles animaux car les modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires ne suffisent pas à représenter les interactions complexes mises en jeu au niveau cérébral. De plus lorsqu’il est nécessaire d’étudier des composantes comportementales ou motrices, notamment pour certaines maladies du système nerveux, il est indispensable de recourir à l’utilisation de modèles animaux car cela ne peut pas être représenté in vitro.

Réduction

Nous utiliserons au total 600 souris pour ce projet. Nous avons défini cet effectif par rapport à notre expérience de la technique et au taux de réussite de chaque étape. Ainsi nous avons estimé que 6 souris donneuses étaient nécessaires pour obtenir un nombre suffisant d’embryons fécondés et viables à réimplanter. Ces femelles recevront un traitement de stimulation hormonale pour augmenter le nombre d’embryons récoltés permettant ainsi de réduire le nombre de femelles donneuses nécessaires pour chaque transfert. Pour les femelles receveuses nous avons défini qu’il nous faudrait 4 femelles maximum afin de prendre en compte le risque lié à la chirurgie et le risque de perte de la portée lié aux aléas de l’élevage. Nous avons choisi une souche de souris spécifique comme receveuses car elle permet d’avoir un bon rendement de réimplantation et présente un comportement maternel fort permettant ainsi de réduire le nombre de femelles à réimplanter pour obtenir un nombre de souriceaux suffisants. Nous estimons que nous aurons au maximum 12 lignées à décontaminer par an. Les mâles vasectomisés ne sont pas soumis à déclaration dans ce projet, mais, à titre informatif ils seront conservés pendant 10 mois afin de participer à plusieurs sessions de transfert dans un souci de réduction plus global.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu avec un carré de coton et un bâtonnet de bois à ronger au minimum, complétés par une maisonnette pour les femelles gestantes. Les animaux en provenance extérieure bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine minimum avant leur entrée en procédure. La chirurgie s’effectuera sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésique adaptée. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter toute sécheresse oculaire. Leur température corporelle sera maintenue grâce à l’utilisation de chambres d’induction et de réveil chauffées et d’un tapis chauffant thermorégulé. Le réveil des animaux sera surveillé, et des croquettes et de l’hydrogel seront mis à disposition dans le fond de la cage pour faciliter leur récupération la première journée. Une évaluation de leur état général sera assurée en période post-chirurgicale. Tous les animaux seront observés quotidiennement. En cas d’anomalie, celle-ci est transmise à la structure chargée du bien-être animal (SBEA), au vétérinaire et à notre équipe afin d’assurer la meilleure prise en charge des animaux. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance. Il est possible que certaines lignées à transférer soient à phénotype dommageable, pour les femelles génétiquement modifiées qui pourraient être impliquées dans ce projet (cas des mutations génétiques complexes) nous nous assurerons que le phénotype ne soit pas impactant pour la reproduction et, ou, qu’il ne soit pas encore exprimé. Nous utiliserons des femelles très jeunes à un âge auquel nous ne devrions observer (au maximum) que des signes cliniques légers en lien avec ces phénotypes dommageables.

Choix des espèces

Ce projet portant sur le transfert d’embryons de lignées de souris transgéniques, il est impératif de conserver la même espèce. Le choix de cette espèce sera justifié dans les différentes demandes d’autorisation de projet afférentes aux lignées utilisées dans ce projet. Les femelles donneuses d’embryons seront utilisées à un jeune âge de 4 à 6 semaines. A cet âge la maturité sexuelle n’est pas complète et la souris n’est pas cyclée. Ainsi le traitement hormonal déclenche une maturation folliculaire massive et une ovulation. Les femelles receveuses seront utilisées à un âge compris entre 2 et 8 mois afin d’être sexuellement matures mais pas trop âgées pour conserver de bonnes capacités reproductives et maternelles. Cet âge permet également à la femelle de bien supporter la chirurgie.

Injectés vigiles avec des globules rouges parasités, 2 822 souris et 150 rats sont ensuite piqués à la queue chaque jour pendant environ huit jours pour un prélèvement d'une goutte de sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur annonce une parasitémie faible et aucun signe clinique attendu, tout en indiquant que le paludisme cérébral peut provoquer des mouvements désordonnés, une paralysie partielle puis un coma irréversible. L'objectif déclaré est d'identifier les gènes qui commandent la multiplication du parasite, une centaine de gènes pouvant désormais être modifiés en une seule expérience. Tous sont tués à la fin de la procédure, leur sang étant prélevé après la mort pour récupérer les parasites.

Objectifs

Malgré de nombreux efforts depuis des décennies, le paludisme reste un problème de santé majeur dans le monde. Il touche environ 100 pays, et 40 % de la population mondiale vit dans des zones à risque. En 2020, on a recensé 241 millions de cas, entraînant 627 000 décès, principalement chez les enfants de moins de 5 ans. Le paludisme est causé par un parasite appelé Plasmodium, qui a besoin de deux hôtes pour survivre : un moustique du genre Anopheles et l’être humain, dans le cas du paludisme humain. Chez ce dernier, le parasite se multiplie dans les globules rouges, provoquant les symptômes de la maladie. Bien qu’il existe des médicaments, leur efficacité diminue à cause de l’apparition de résistances. Il est donc crucial de mieux comprendre ce parasite pour développer de nouveaux traitements. Notre projet vise à étudier comment le parasite contrôle son cycle de vie et se développe dans les globules rouges. Nous cherchons à identifier les gènes clés impliqués dans sa multiplication. Pour cela, nous allons créer des parasites fluorescents, puis les modifier afin de bloquer l’expression de certains gènes. Cela nous permettra de comprendre leur rôle et d’identifier de nouvelles cibles pour lutter contre le paludisme. Nous utiliserons Plasmodium berghei, un parasite qui infecte les rongeurs. Il est très similaire à Plasmodium falciparum, le plus dangereux pour l’Homme. De plus, il permet de mener des expériences en laboratoire qui sont impossibles à réaliser avec Plasmodium falciparum. Grâce à une technique innovante de transformation des parasites, nous pourrons réduire drastiquement le nombre d’animaux nécessaires, tout en obtenant des résultats robustes qui permettront d’ouvrir de nouvelles voies de lutte contre cette maladie toujours aussi dramatique.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels contre le paludisme ne sont plus assez efficaces, car les parasites deviennent de plus en plus résistants. Il est donc urgent de trouver de nouveaux médicaments pour éliminer cette maladie. Pour cela, il faut chercher des solutions innovantes et viser de nouvelles cibles afin de limiter l’apparition de résistances. Notre projet va aider à mieux comprendre la biologie du parasite responsable du paludisme, d’abord chez la souris, puis chez l’Homme.Cette meilleure compréhension pourrait permettre de découvrir de nouveaux moyens de lutter contre le paludisme, surtout dans les pays où la maladie est très présente et où les résistances augmentent.

Procédures

Dans chacune des procédures, les animaux seront infectés par injection de globules rouges parasités. Les animaux sont vigiles ; il s’agit d’une injection unique. Tout au long de l’infection, environ 8 jours, un prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue sera réalisé, de manière journalière. Cette procédure ne prend que quelques secondes, et correspond à un prélèvement identique à celui de la glycémie. Finalement, à la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et un prélèvement total du sang sera fait de manière post-mortem. Au total, 2 822 souris et 150 rats seront injectés vigiles, monitorés par prélèvements sanguins et euthanasiés dans cette étude.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un léger stress lors de la contention ainsi qu’une légère douleur lors de l’injection ou du prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue, sur animaux vigiles. Lors de notre étude, nous atteindrons uniquement une faible parasitémie (correspondant au nombre de globules rouges infectés sur la totalité des globules rouges). À ce niveau-là, aucun signe clinique n’est à prévoir. Cependant, dans les cas rares de paludisme cérébral, la parasitémie reste faible, mais les souris peuvent développer des signes cliniques tels que : l’apparition de mouvements du corps désordonnés ou mal contrôlés, puis paralysie partielle allant jusqu’au coma irréversible.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des procédures, pour récupérer le sang contenant les parasites pour la suite des analyses in-vitro.

Remplacement

Plasmodium falciparum est le parasite responsable du paludisme le plus dangereux pour l’Homme. Pour bien comprendre comment il vit et se développe, il faudrait l’étudier directement dans un organisme vivant, mais cela est très difficile. Cependant, il existe un parasite très proche, Plasmodium berghei, qui infecte les rongeurs et que l’on peut étudier de manière in vivo. Cela permet de mieux comprendre le cycle de vie du parasite et donc de pouvoir lutter plus efficacement contre la maladie. Pour cette étude, nous ne pouvons pas remplacer complètement l’étude sur les rongeurs, mais nous faisons d’abord le plus d’expériences possibles en laboratoire pour limiter le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Pour limiter l’utilisation d’animaux dans nos recherches, nous avons mis en place une méthode innovante permettant d’étudier plusieurs gènes en une seule expérience. Plutôt que de tester un gène à la fois, nous pouvons désormais modifier une centaine de gènes en une seule étape, en infectant un seul groupe de souris, réduisant considérablement le nombre d’animaux nécessaires. De plus, Plasmodium berghei infecte systématiquement les rongeurs, ce qui nous permet d’optimiser nos expériences en utilisant le strict minimum d’animaux. Le nombre de rongeurs est calculé en fonction de la quantité de globules rouges infectés dont nous avons besoin pour nos analyses.

Raffinement

Avant l’expérimentation, durant toute la période d'acclimatation d'une durée d'une semaine minimum, les souris sont manipulées de manière journalière pour éviter un stress lors de l'expérience. Lors des expérimentations, les animaux seront manipulés et injectés le plus rapidement possible, de manière à les remettre avec leurs congénères rapidement, et ainsi éviter un trop grand stress d’isolement. Lors de notre étude, nous nous limiterons à de faibles taux de parasitémie. Cela nous permettra d’obtenir une quantité de parasites suffisante pour une étude robuste, tout en évitant l’apparition de signes cliniques chez l’animal. Les animaux seront monitorés de manière journalière, l'observation de leur comportement ainsi qu'un examen clinique sera retranscrit sur une grille de score, que nous avons établi préalablement, et qui permettra de s'assurer de leur bonne santé. Cette grille comporte des critères considérés comme points limites, s’ils sont atteints les animaux seront immédiatement euthanasiés, afin d'éviter toute souffrance animale

Choix des espèces

Les recherches sur Plasmodium falciparum nécessitent généralement des modèles animaux complexes, comme certains singes ou des souris génétiquement modifiées, qui sont rares, difficiles à élever et très coûteux. Grâce à un génome très proche de ce dernier, nous pouvons utiliser Plasmodium berghei, qui infecte naturellement les rongeurs, pour mieux comprendre le paludisme humain. De plus, ces parasites murins ne présentent aucun risque pour l’Homme et ne se transmettent entre rongeurs que par la piqûre de moustiques Anopheles, absents en France métropolitaine. Nous utilisons des souris et des rats âgés de 8 à 12 semaines, car à cet âge, ils sont assez développés pour fournir un volume de sang suffisant pour nos analyses, tout en restant en bonne santé pour supporter l’infection.