Souris
Etude de la cinétique de thrombose veineuse en Hypoxie et normobarie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une première chirurgie abdominale avec réveil de quarante minutes, six heures d'hypoxie reproduisant les conditions d'un vol long-courrier, puis une seconde chirurgie sans réveil pour prélever le caillot et le sang, certains groupes recevant en plus un gavage quotidien ou des injections répétées. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des douleurs après le réveil, une perte temporaire de mobilité et un stress accru, les souris génétiquement modifiées présentant un risque de saignement plus important. Il affirme que l'étude in vitro des plaquettes et des cellules endothéliales ne reproduit pas l'intégralité du vaisseau sanguin, ce qui fait à ses yeux de la souris un "modèle de choix" pour la thrombose veineuse.
Objectifs
Nous cherchons à comprendre comment se forment les caillots dans les veines, en comparant des conditions qui ressemblent à un voyage en train et à un vol long-courrier. Nos premiers résultats montrent que l’avion favorise la formation de thromboses, notamment par l’activation des plaquettes grâce à leur production d’énergie. Nous avons aussi observé que certains globules blancs ne participent pas au tout début, mais seulement après deux jours. Avec ce projet, nous voulons suivre plus finement l’évolution du caillot et la réaction de la paroi des veines. L’objectif est de mieux cibler les traitements pour prévenir les thromboses tout en limitant les risques de saignement.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de caractériser les étapes de formation et de lyse du thrombus en présence de l’endothélium. Cela permettra à long terme de prescrire aux patients une drogue pertinente en fonction des cellules intervenant en premier sur le site a de faibles doses pour éviter la comorbidité la plus commune le saignement.
Procédures
Les animaux sont dans un premier temps soumis à une chirurgie abdominale avec réveil de 40 minutes. Puis en fonction des lots; (à 6h, 24h, 48h,72h ou 96H) à une deuxième chirurgie ( 15 minutes) qui cette fois est sans réveil permettant le prélèvement du thrombus et du sang. Les deux chirurgies ainsi que les prélèvements ne sont réalisés qu'une seule fois par animal. Les differents lots sont exposés entre les deux chirurgies à 6 heures d'hypoxie ou de normoxie. Un groupe d’animaux pourra etre soumis à du gavage sur 3 jours à raison d’une fois par jour, ou a une injection en intraveineux ( 2 fois au total) ou en intra peritonéal (Une fois par jour durant 5 jours maximum).
Impact sur les animaux
Cette procédure est une procédure avec réveil et nécessite une chirurgie abdominale qui peut engendrer des douleurs post-opératoires les heures suivants le réveil des animaux. Les animaux du groupe test exposés aux conditions d'hypoxie hypobare après la chirurgie peuvent perdre temporairement un peu de mobilité et avoir une augmentation du stress. Enfin, les animaux génetiquement modifiés ainsi que ceux traités avec la molécule x présenteront des risques de saignements plus importants pendant la chirurgie que les souris wild type.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure après prélèvement sanguin et prélèvement de caillot sanguin.
Remplacement
A ce jour l’étude in vitro des neutrophiles, des plaquettes et des cellules endothéliales ne permet pas à elle seule de reproduire l’intégralité du vaisseau sanguin. De plus, l'induction de l'hypoxie à l'échelle cellulaire ne reproduit pas la complexité des pathologies thrombotiques veineuses auxquelles sont exposés les passagers d’un avion.
Réduction
Le nombre d’animaux annoncé a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats significatifs avec un risque de premier espèce égale à 5%. Dans le cas où une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant l’utilisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d’expérimentations supplémentaires. L’analyse du thrombus et des composés sanguins sera réalisée dans les mêmes animaux afin de respecter la règle des 3R (Reduction). Nous réitèrerons pas les groupes dont nous avons déjà réalisés l’étude du thrombus (40 souris en moins sur la totalité de l’etude).
Raffinement
Les animaux seront utilisés 4 jours après leur arrivée dans l'animalerie pour leur laisser le temps de s'acclimater. Afin de limiter le stress, les animaux seront transférés 24h avant la chirurgie dans la cage qui les hébergera tout le long de la procédure. Nous disposerons dans cette cage de l’enrichissement de type « Nestlets » qui correspond à des nids végétaux à base de fibres de coton. Ceci aura pour but de les habituer à leur nouvel habitat et de les acclimater à la prise d'eau gélifiée. Au cours de la chirurgie, les animaux suivants attendront dans une pièce d’hébergement afin de ne pas être perturbé par la chirurgie en cours. Les animaux seront opérés sur un tapis chauffant (39°C) afin de maintenir leur température pendant la chirurgie. Pour améliorer les conditions de réveil, les animaux seront placés sur une bouillotte dans la cage pour les maintenir au chaud. Une surveillance accrue sera réalisée après la chirurgie toute la durée de l’expérimentation (6H à 96h) ainsi que pendant l'exposition à l'hypoxie hypobare pour le groupe concerné pour évaluer le bien-être des animaux et détecter rapidement tout signe de souffrance. Une première dose de d’analgésique sera administrée aux animaux 30 minutes avant la chirurgie et une deuxième dès la fin de la chirurgie. Une troisième dose est injectée à la fin de la journée afin de limiter les douleurs durant la nuit. Nous disposerons en plus dans la boîte d’hébergement de l’eau gélifiée contenant un analgésique pour que les animaux y est accès tout au long de la nuit. Le lendemain matin, une dernière injection est réalisée avant de placer les souris en normoxie normobare ou en hypoxie hypobare (sauf pour le groupe de 6h qui aura déjà été euthanasiés). En cas de signes de douleurs chez un animal une nouvelle injection de lui sera administré. Si une souris montre des signes de douleur ou de difficultés à se déplacer, des soins supplémentaires sont administrés. En l’absence d’amélioration rapide, l’animal est euthanasié pour éviter toute souffrance prolongée. De même, si une souris ne réagit plus aux stimulations, elle est immédiatement euthanasiée.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix de thrombose veineuse et reproduit au mieux les mécanismes de thrombose présents chez l'humain. Les animaux sont utilisés entre 5 et 12 semaines afin d’avoir un système immunitaire et vasculaire fonctionnel et mature.
Rôle des plaquettes dans la plasticité cérébrale et dans la récupération post-AVC chez la souris (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Dix minutes de chirurgie suffisent à provoquer un accident vasculaire cérébral par occlusion permanente d'une artère, puis l'antiagrégant plaquettaire est versé dans l'eau de boisson jusqu'au jour de la mise à mort. 810 souris vont être utilisées ainsi, 690 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 un niveau léger, toutes tuées pour prélever leurs tissus cérébraux. S'y ajoutent deux injections, deux prélèvements sanguins, une évaluation neurologique et des tests comportementaux que le RNT ne nomme pas, alors que le traitement lui-même expose les animaux à un risque de saignement. Le porteur veut savoir si les plaquettes participent à la réparation du cerveau après un AVC, et retient la souris adulte au motif que les techniques décrites y sont déjà validées dans la littérature et dans son laboratoire.
Objectifs
En France, l’accident vasculaire cérébral (AVC) reste une cause majeure de handicap, de troubles cognitifs et de mortalité. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament ou d’un dipositif permettant de dissoudre le caillot de sang responsable de l’accident vasculaire cérébral. Seule une minorité de patients ont accès à ces traitements en raison de la fenêtre thérapeutique étroite, du nombre limité de centres spécialisés et des contre-indications. Aucun traitement ne prévient les troubles cognitifs post- accident vasculaire cérébral, qui touche 25% des patients. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements qui permettraient de traiter un plus grand nombre de patients d’une part et de prévenir les troubles de la mémoire qui se développent au décours de l’AVC d’autre part. Certains patients non traités peuvent s’améliorer spontanément suggérant ainsi l’existence d’une plasticité cérébrale c’est-à-dire d’une autoréparation. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques. Au-delà de leur rôle dans la formation du caillot sanguin, les plaquettes sont de plus en plus reconnues comme des modulateurs de processus physiopathologiques importants, tels l'inflammation et la régénération tissulaire. Cependant, leur contribution à la réparation dans l’accident vasculaire cérébral n’a été que très peu étudiée et uniquement à la phase précoce. Cette question est d’autant plus cruciale que de nombreux patients sont traités par des médicaments qui empêchent la formation de nouveaux caillots en empêchant l’activation des plaquettes pour prévenir la survenue d’un second accident vasculaire cérébral. Or, il semble qu’il y ait un plus grand nombre de troubles cognitifs chez les patients traités par antiagrégants plaquettaires. L’objectif de ce projet sera de déterminer la contribution des plaquettes et des médicaments qui empêchent leur activation dans la réparation neurovasculaire post – accident vasculaire cérébral à long terme. Le projet se deroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
L’hypothèse de ce projet est que les plaquettes contribuent à la réparation cérébrale après un accident vasculaire cérébral et qu'un traitement anti-coagulant, administré à la phase tardive pourrait avoir un impact négatif ou positif selon la cible pharmacologique sur cette récupération post-ischémie cérébrale. Au-delà des seuls domaines de la biologie plaquettaire et de la physiopathologie de l'accident vasculaire cérébral, cette approche originale fournira la base fondamentale pour les futures études précliniques sur la réparation post-ischémie cérébrale. De plus, les résultats pourraient avoir des implications cliniques importantes car la thérapie anti-plaquettaire est utilisée pour la prévention secondaire de l'accident vasculaire cérébral, avec pour seul objectif d’empêcher la formation d’un nouveau caillot mais sans aucune connaissance sur la réparation à plus long terme.
Procédures
Dans cette étude, un modèle murin d’accident vasculaire cérébral induit par une occlusion permanente procédure réalisée systématiquement sous anesthésie et analgésie sera utilisé. L’intervention chirurgicale dure environ 10 minutes. Chaque animal recevra deux injections (analgésie) ainsi que deux prélèvements sanguins (réalisé à J3 et le jour de la mise à mort). L’injection dure en moyenne 10 secondes, tandis que le prélèvement sanguin ne dépasse pas 2 minutes. Toutes les souris feront l’objet d’une évaluation neurologique qui dure environ 5 minutes. Ce modèle sera combiné à une administration dans l’eau de boisson d’un des traitements anti-plaquettaire dès l’induction de l’accident vasculaire cérébral jusqu’au jour de la mise à mort. L'intervention chirurgicale, l'évaluation neurologique, l'administration des traitements ainsi que les prélèvement sanguins seront réalisés dans l'EU1. L'enregistrement électrophysiologique sera réalisé dans l'EU2.
Impact sur les animaux
- Les injections d'anesthésiques et d'analgésiques causent un stress et une douleur modérée de courte durée les prélèvements sanguins causent un stress et une douleur modérée de courte durée. - L’induction de l’ischémie cérébrale provoque aussi une douleur modérée chez l’animal de courte durée lors de l’incision de la peau. - La prise des traitements anti-agrégants peut induire un risque de saignement. - Les tests comportementaux induisent un stress et de l’anxiété modéré et de courte durée.
Devenir
Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques.
Remplacement
Le modèle in vitro ne permet de rendre compte de la complexité des évènements qui se mettent en place à long terme dans le cerveau (plasticité cérébrale) après l’ischémie cérébrale. L’utilisation de souris déficientes en plaquettes ou de ses différents récepteurs permettra d’étudier leurs rôles respectifs dans le remodelage neurovasculaire post-ischémie cérébrale à long terme. Les modèles murins d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'accident vasculaire ischémique chez l'homme.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude statistique a été réalisée au préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Les groupes ont été conçus de manière optimisée, basée sur des études antérieures, garantissant ainsi l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. De plus, le modèle d’accident vasculaire cérébral utilisé est bien maîtrisé par l’équipe, avec une mortalité extrêment faible ce qui permet de mener les recherches de façon rigoureuse et éthique. Pour analyser les résultats, des méthodes statistiques adaptées seront appliquées, garantissant une interprétation fiable des données tout en respectant l’engagement à réduire l’usage des animaux.
Raffinement
Le bien-être des animaux est une priorité dans l’étude. Leur suivi sera assuré par une équipe qualifiée : un soigneur spécialisé s’occupera d’eux chaque jour, et un chercheur expérimenté effectuera un contrôle approfondi deux fois par semaine. Les souris seront hébergées par groupes de cinq dans des cages ventilées, équipées de materiel pour leur permettre de construire des nids et d’améliorer leur confort. Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé attentivement grâce à une grille de scores définie, prenant en compte des points limites stricts et adaptés au projet. Cette méthode permettra de détecter rapidement toute souffrance et d’y remédier. En cas de douleur, un traitement adapté sera administré, et si nécessaire, une mise à mort sera réalisée selon les réglementations en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature et notre laboratoire. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 12 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés et dans une perspective translationnelle, l’accident vasculaire cérébral survient à l’âge adulte.
Mécanismes neuronaux de l’attention tactile 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées pour que leur cerveau soit découpé en tranches et observé au microscope, 4 330 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce volet du projet porte sur une chirurgie d'injection virale de trente minutes à une heure et une implantation d'une à deux heures par animal. Suivent quatre semaines d'électrophysiologie, à raison de deux séances d'une heure par jour au maximum, la tête maintenue immobile, pour observer comment le cortex traite les informations captées par les vibrisses. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut convenir, le cerveau devant rester "intact" et l'animal éveillé au moment précis de l'attention.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment le cerveau perçoit le toucher et localise les objets dans l’espace. Pour cela, nous utilisons les vibrisses très sensibles des souris, qui leur servent à explorer leur environnement, comme nos mains. Nous pensons que certaines zones du cerveau intègrent différentes informations pour adapter la perception tactile selon la situation. Pour tester cette idée, nous observerons l’activité des neurones grâce à l’imagerie et à des enregistrements électriques chez des souris entraînées à effectuer des tâches tactiles. Nous utiliserons aussi des techniques pour activer ou désactiver certains neurones de manière ciblée. Ces recherches pourraient aider à mieux comprendre et traiter certains troubles sensoriels, comme ceux observés dans l’autisme ou chez les personnes amputées. Le projet se déroule dans deux EU.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une compréhension approfondie des mécanismes cellulaires et des circuits corticaux impliqués dans la perception tactile. Il visera à identifier les contributions spécifiques de différentes populations neuronales — excitatrices, inhibitrices et cholinergiques — ainsi que des systèmes neuromodulateurs dans le traitement de l’information sensorielle. L’étude mettra en évidence la manière dont le cortex somatosensoriel adapte ses calculs en fonction du contexte et des exigences de la tâche, tout en apportant de nouvelles connaissances sur la maturation des circuits corticaux durant les premiers jours de vie. Ceci représentera des nouvelles pistes pour comprendre les hallucinations tactiles : Par exemple, les sensations fantômes chez les amputés ou certains troubles de la perception dans la schizophrénie. Ciblage de circuits spécifiques pour la neuromodulation : À terme, cela pourrait appuyer le développement de traitements personnalisés par stimulation cérébrale ou thérapies ciblées
Procédures
EU1/2 Procédure chirurgicale pour injection de virus : Fréquence: 1 chirurgie par animal, durée: entre 30min et 1H, - procédure chirurgicale avec implantation : Fréquence: 1 chirurgie par animal, durée: entre 1H et 2H EU2/2 Électrophysiologie in vivo sur animal 1H pendant 4 semaines (2 sessions maximum par jour par animal)
Impact sur les animaux
Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte
Devenir
Mise à mort pour prélèvement et réalisation de tranches aigues pour l'electrophysiologie ou pour la microscopie
Remplacement
Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent une fonction cognitive complexe : l’attention tactile. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions les mécanismes neuronaux qui sont engagés au moment précis de l’attention. Le projet ne peut donc se faire que sur des animaux vivants éveillés. Cependant, la tâche comportementale est totalement non douloureuse et non stressante, et la chirurgie sera réalisée sur des souris anesthésiées dont le niveau de souffrance est contrôlé pharmacologiquement. La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici
Réduction
La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en oeuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique appropriée
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement (matériel de nidification et tunnels) et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires à l'échelle comportementale. Les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris largement transférables à l’homme. Les injections de virus seront réalisées sur des animaux de 0 semaine à 6 mois. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux de de plus de 5 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation.
Evaluation de l’effet anti-obésité de molécules biosourcées chez la souris sous régime obésogène.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Pour comparer des molécules biosourcées à un traitement de référence contre l'obésité, 200 souris mâles sont rendues obèses par un régime gras pendant dix à quinze semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes tuées à l'issue. Chacune subit treize prélèvements de sang obtenus en coupant un millimètre du bout de sa queue, neuf à quinze injections sous la peau, et des gavages de solution sucrée qui peuvent irriter la gorge. S'y ajoutent six privations d'eau de six heures, trente-six heures au total, et des isolements de quatre heures deux fois par semaine pour mesurer leurs préférences alimentaires. L'enjeu déclaré est de retenir l'une des deux molécules candidates pour la production pharmaceutique et le passage aux essais cliniques.
Objectifs
Des études montrent que l’obésité modifie le goût et augmente la préférence pour les graisses alimentaires. Pour y remédier, des composés d’origine naturelle ont été synthétisés pour diminuer la consommation des graisses alimentaires et augmenter la satiété. L’objectif de cette étude est de comparer l’effet des composés synthétisés à partir d’un ingrédient d’origine naturelle à un traitement de référence contre l’obésité sur la gestion de l’alimentation et du poids. Elle vise également à fournir des données comparatives entre différents molécules biosourcées. Les principaux buts de l’étude sont : 1. Évaluer l’impact des molécules biosourcées sur les préférences alimentaires chez des souris. 2. Comparer l’effet des molécules biosourcées à celui du traitement de référence et voir si leur combinaison aide à maintenir une perte de poids durable chez des souris obèses. 3. Vérifier si les molécules biosourcées peuvent prévenir la reprise de poids après l’arrêt d’un traitement contre l’obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comparer des molécules biosourcées par rapport à un traitement existant et de les évaluer en tant que traitement adjuvant ou d’entretien dans la gestion du poids. Nous évaluerons également des molécules biosourcées B et C et validerons l’un d’eux (B ou C) pour la production pharmaceutique et la réalisation des études cliniques.
Procédures
Les souris sous régime (obésogène ou standard), seront pesées hebdomadairement et subiront : - une mesure de glycémie toutes les deux semaines pendant 10-15 semaines (prélèvement d’une goutte de sang environ : technique de mesure peu invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute), - un isolement ainsi qu’une privation d’eau pendant 6 heures avant chaque test de préférence entre deux choix, à raison de 3 tests par semaine pendant 2 semaines (soit 6 périodes de restriction hydrique, totalisant 36 heures). Une privation d’eau de 6 heures sera également appliquée avant la réalisation du test pour mesurer leur réaction au sucre (test de tolérance au glucose). Pour la mesure du taux de sucre dans le sang, chaque souris subira 5 à 8 prélèvements. Les souris seront soumises à un test de tolérance au sucre impliquant une brève contention pour l’administration du sucre par gavage, suivie de cinq prélèvements sanguins de faible volume réalisés au niveau de la queue sous anesthésie locale. Un prélèvement sanguin d’un volume important sera réalisé sous anesthésie générale juste avant la mise à mort (elle aussi réalisée sous anesthésie générale). Après le décès de l’animal, certains de ses organes seront prélevés.
Impact sur les animaux
- Les souris recevront une alimentation pouvant les rendre obèse (grosse) et provoquer un certain inconfort. Mais cette période ne durera que le temps nécessaire pour voir si les substances testées fonctionnent, soit entre 10 et 15 semaines (incluant 2 semaines sans subir aucun protocole pour s’habituer à leur nouvel environnement et entre 8 et 13 semaines de test). Cela permet de limiter au maximum les effets désagréables pour les souris. - Les souris peuvent ressentir un peu de stress à cause de certaines manipulations. Par exemple, elles peuvent recevoir entre 9 et 15 petites piqûres sous la peau, ou plusieurs petites prises de sang au niveau de la queue : entre 5 et 8 pour mesurer le sucre dans le sang, et 5 autres pendant un test de tolérance au sucre (pour voir comment leur corps réagit au sucre) qui dure 2 heures. Elles peuvent aussi être mises seules dans une cage pendant 4 heures, deux fois par semaine, pendant 2 semaines, pour un test sur leurs préférences alimentaires. - Pour faire les tests, on doit prélever un peu de sang aux souris, environ la taille d’une petite goutte. Pour cela, on coupe un petit bout du bout de leur queue, à peine un millimètre, ce qui peut leur faire un peu mal et parfois provoquer une petite infection, mais c’est surveillé de près. Au total, chaque souris aura 13 prises de sang : 8 pour suivre l'apparition du diabète, faites toutes les deux semaines, et 5 autres pendant un test pour voir comment leur corps réagit au sucre. - Les administrations par la bouche de solution sucrée induisent un stress chez les animaux et sont susceptibles de provoquer une irritation au niveau de la gorge.
Devenir
À la fin de l’expérience, les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever des tissus et des organes nécessaires aux analyses scientifiques. Ces examens, notamment ceux qui regardent les cellules et les organes au microscope, ne peuvent pas se faire sur un animal vivant. La mise à mort est faite sous anesthésie générale pour que les animaux ne ressentent ni douleur ni stress.
Remplacement
L’obésité est une maladie qui touche plusieurs parties du corps en même temps et qui modifie la façon dont l’organisme utilise les graisses, les sucres et contrôle l’appétit. Pour comprendre tous ces changements, il faut les étudier dans un corps vivant, car ils dépendent de la communication entre les organes. Ainsi, les modèles cellulaires ne peuvent pas entièrement remplacer l’utilisation d’animaux vivants pour cette étude. En effet, bien que des résultats aient été obtenus sur des cellules en laboratoire, cela ne suffit pas pour comprendre les réactions complexes du corps, comme la manière dont il perçoit les saveurs et réagit à ce qu’il mange. C’est pourquoi on a besoin d’étudier ces effets chez des animaux vivants.
Réduction
En utilisant des cellules en laboratoire (in vitro), on a pu faire une partie des tests sans animaux. Cela nous permettra d’en utiliser moins pour comprendre comment les substances agissent dans le corps. 3. Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude a été réduit au minimum tout en permettant d’obtenir des résultats scientifiques fiables. Après estimation, 8 souris par groupe sont nécessaires. Pour tenir compte de possibles effets du transport sur leur comportement, 2 souris supplémentaires sont ajoutées, soit un total de 10 animaux par groupe.
Raffinement
• Prise en charge et environnement : • Les souris seront hébergées en groupes dans des conditions habituelles de l’animalerie. Le calme sera maintenu dans la pièce, et les animaux seront surveillés lors des pesées (2 fois par semaine) ; • Du matériel d’enrichissement (pour la construction de nids) sera fourni en continu, avec un accès permanent à la nourriture et à l’eau ; • Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la contention (par tunnel ou dans le creux des mains) quelques jours avant les expérimentations. • Gestion de la douleur : Pour limiter toute douleur ou souffrance, Les souris seront surveillées de près par l’équipe de recherche. Cela permettra d'intervenir rapidement en cas de problème et de garantir le bien-être des souris. Lors des tests pour mesurer le sucre dans le sang, une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue des souris quelques minutes avant la petite coupure nécessaire pour prélever le sang. La zone sera aussi nettoyée avant et après avec un produit désinfectant. Le matériel utilisé sera désinfecté à chaque fois. Pour réduire l’inconfort et le stress lors de l’administration des substances par la bouche, des sondes souples et adaptées à la taille des souris seront utilisées. L’animal sera maintenu seulement quelques secondes, et l’expérimentateur est formé pour faire cette manipulation de façon douce et rapide. Pour assurer une hygiène optimale lors des interventions : • Le personnel portera une blouse jetable propre et des gants désinfectés à l’alcool 70 % ; • Les surfaces de travail seront nettoyées, un champ stérile sera utilisé, et les instruments seront stérilisés ; • La zone d’incision sera tondue et la peau désinfectée avant toute intervention. Des points limites adaptés seront également mis en place .
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté, conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 8 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. Des souris mâles adultes âgées de 22 semaines seront utilisées dans cette étude. Certaines auront été rendues obèses en recevant une alimentation très grasse pendant plusieurs semaines. Pour évaluer leur état corporel, on utilise une méthode appelée Body Condition Score (BCS), qui donne une note de 1 à 5 (maigre à obèse) selon la quantité de graisse et de muscle. Cette estimation est faite en touchant doucement leur dos et leurs côtes. On utilise aussi un appareil de mesure spécialisé (appelé EchoMRI) pour avoir une estimation précise de la masse graisseuse. À la fin de l’étude, les animaux auront environ 37 semaines, un âge permettant d’observer les effets d’un régime riche en graisses sur le fonctionnement du corps à un stade avancé de leur développement.
Etude de l’efficacité de l’Apernavec sur le lymphœdème primaire et le lipœdème EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Opérées en moins de vingt minutes sous anesthésie gazeuse, injectées jusqu'à cinq jours de suite, transférées d'un établissement à l'autre pour une lymphographie suivie de leur mise à mort, 1 050 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Presque toutes sont des femelles, le lipœdème ne touchant que les femmes. Le porteur cherche à étendre au lymphœdème primaire et au lipœdème une thérapie déjà développée pour le lymphœdème secondaire, qui doit passer en clinique en fin d'année. Pour ces 1 050 souris, la description des atteintes tient en une phrase, la formation de l'œdème, la chirurgie, l'imagerie et les injections provoquant des douleurs modérées et un léger stress.
Objectifs
Le lymphœdème est une pathologie chronique résultant d’une accumulation massive de lymphe et de tissu adipeux dans un membre. Il existe deux sortes de lymphœdème : primaire et secondaire. Le lymphœdème primaire est d’origine héréditaire, lié à des mutations génétiques. Plus de 30 gènes ont été identifiés comme étant associés au lymphœdème primaire. Le lymphœdème secondaire survient à la suite d’une lésion du système lymphatique, souvent après une chirurgie, une radiothérapie ou une infection. Bien que cette maladie affecte 250 millions de patients, il n’y a à ce jour aucun traitement disponible. Notre équipe a développé une thérapie pour le traitement du lymphœdème secondaire qui passera en clinique en fin d’année. Notre objectif est maintenant d’évaluer son efficacité sur le lymphœdème primaire. Environ 30 mutations génétiques ont été identifiées comme responsables du lymphœdème primaire. Nous nous concentrerons sur les mutations les plus fréquentes. Dans un deuxième temps, nous allons étendre l’application de la thérapie au lipœdème. Le lymphœdème et le lipœdème sont des affections distinctes, mais partagent plusieurs caractéristiques cliniques communes. Tous deux se caractérisent par un gonflement persistant des membres, affectant généralement les membres inférieurs. Il est important de noter que le lipœdème ne touche que les femmes et qu’il n’existe à ce jour aucune thérapie curative. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
À ce jour, il n’existe aucune thérapie curative pour le lymphœdème primaire et le lipœdème. Cette étude permettra d’évaluer la possibilité d’étendre l’application de l’Apernavec au traitement de ces pathologies. Le lymphœdème primaire étant causé par différentes mutations, évaluer l’efficacité sur plusieurs d'entre elles permettra un champ d’application de la thérapie plus large.
Procédures
Dans l’EU 1/2, les animaux seront soumis à des injections en vigile ou sous anesthésie gazeuse qui auront une durée maximale de 2 minutes chacune. Les injections vigiles pourront être ponctuelles ou sur une semaine à raison de 1 injection par jour (soit 5 jours d’injections au total), chaque injection ne durera pas plus d’une minute. Les injections sous anesthésie seront au maximum de 2 tout au long du projet pour chaque animal. Ils pourront être aussi soumis à une intervention chirurgicale d'une durée inférieure à 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Une analyse de la composition corporelle serait faite par imagerie et aura une durée maximale de 6 minutes. Dans l’EU 2/2, les animaux recevront une injection intrapéritonéale d’anesthésie en vue d’une lymphographie ainsi que la mise à mort.
Impact sur les animaux
La formation d’œdème, la chirurgie, le minispec ainsi que les injections vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, certains animaux seront envoyés dans l’EU 2/2. Tous les animaux de la procédure seront mis à mort afin de prélever les organes nécessaires au projet.
Remplacement
Bien qu’il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico reproduisant fidèlement la réponse immunitaire et tissulaire à une injection intradermique de l’Apernavec ainsi que des lentivecteurs codant pour les mutations, une phase préliminaire a été conduite sur des cultures cellulaires (kératinocytes et fibroblastes murins) pour évaluer la transduction et la cytotoxicité, limitant ainsi le recours aux animaux. Le choix s’est orienté vers l’espèce animale car il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico reproduisant les paramètres physiologiques de la pathologie (réponse immunitaire, inflammation, formation d’œdème) nécessaires à la bonne évaluation de l’efficacité de l’Apernavec. Ces données permettront une étude plus fiable.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car ces pathologies touchent essentiellement les femmes. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre de souris a été calculé par une analyse statistique rigoureuse afin de garantir la significativité des résultats tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Les groupes expérimentaux sont restreints au strict nécessaire. Un lot contrôle (vecteur vide) est inclus afin d’évaluer l’effet de l’administration du vecteur indépendamment du gène muté qu’il contient. Toute mutation n'induisant pas d'effet pas d'effet pathologique ne sera pas retenue pour les tests d'efficacité de la thérapie afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. L’injection est réalisée sous anesthésie afin de réduire la douleur. Toute souffrance anormale entraînera une euthanasie immédiate. Les techniques d’injection et de manipulation sont assurées par du personnel expérimenté afin de limiter le stress. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les précédentes études menées sur l’Apernavec dans le lymphœdème secondaire ont été réalisées sur ces dernières. De plus, des lignées sur le même fond génétique précédemment établies dans l’équipe seront aussi utilisées pour les études sur le lipœdème en raison de leur pertinence scientifique. Le lymphœdème primaire et le lipœdème se caractérisent par une accumulation de tissus adipeux fibrotique dans les membres touchés. Ainsi, le modèle utilisé doit posséder un tissu adipeux suffisamment développé. Le choix s’est alors orienté vers des souris âgées de 10 à 12 semaines pour le lymphœdème primaire et de 5 à 12 semaines pour le lipœdème.
Entrainement et mise au point de procédures expérimentales d’échographie (EU2/2)
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Rats : 220
812 rongeurs, 592 souris et 220 rats, vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, les adultes tués à la fin de chaque mise au point et 212 animaux réutilisés. Des femelles gestantes subissent jusqu'à dix anesthésies gazeuses quotidiennes de trente minutes sur les vingt et un jours de gestation, et leurs nouveau-nés sont séparés d'elles jusqu'à quinze minutes pour être échographiés, au risque d'un rejet ou d'une agression au retour dans la cage. Le porteur présente l'échographie comme un raffinement qui remplacerait des dissections chez d'autres équipes, tout en visant un "catalogue de prestations techniques" et la formation d'utilisateurs. L'effectif, lui, n'est adossé à aucun calcul de puissance et correspond au "nombre moyen nécessaire et suffisant" pour évaluer la reproductibilité des mesures.
Objectifs
L’objectif de notre projet vise à prendre en charge la mise au point expérimentale de l’exploration de différents organes et phénomènes biologiques, physiologiques ou pathologiques, par échographie sur le rongeur. Une large partie de cette mise au point sera consacrée à l’exploration cardiaque où la reproductibilité des mesures est primordiale pour étudier les dysfonctions ou le vieillissement cardiaque. L’échographie sera également mise en œuvre pour la détection et le suivi du cancer (foie, pancréas, colon, sein, etc..), l’exploration du muscle (orientation, longueur de fibres, volume), l’étude de la perfusion cérébrale ou encore suivi du développement embryonnaire et du nouveau-né. Nous souhaitons également mettre au point des interventions guidées par échographie (administration et/ou prélèvement de substances dans des organes profonds) susceptibles de remplacer certaines interventions chirurgicales. La mise au point pourra aussi porter sur l’utilisation d’agents de contraste pour l’échographie (microbulles) pour mieux visualiser certaines structures ou étudier la perfusion sanguine dans de nombreuses situations. L’un des systèmes dont nous disposons permet de mesurer des différences de dureté tissulaire à l’intérieur d’un même organe et ainsi mettre en évidence de façon ultra précoce l’apparition de certaines lésions. Si cette application a été bien prise en main par les spécialistes du cancer du pancréas utilisant quotidiennement l’échographie dans le cadre de leurs recherches, nous devons la déployer sur d’autres thématiques pour la rendre accessible à des équipes non spécialistes en échographie. Notre ambition est de mettre en place un catalogue de prestations techniques aussi complet que possible et évolutif pour, in fine, pouvoir former les utilisateurs ou prendre en charge leur projet en tant qu’experts. Nous nous attacherons également à diffuser les méthodologies validées pour en faire un référentiel pour la recherche préclinique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Cette mise au point de procédures expérimentales robustes et reproductibles d’imagerie non invasive par échographie ou échocardiographie à destination de la communauté scientifique vise à faciliter l’accès au plus grand nombre à une modalité d’imagerie non invasive, peu stressante, ne nécessitant pas d’intervention lourde sur l’animal et permettant leur suivi longitudinal. Nous espérons que cette expertise apportée aux chercheurs permettra d’augmenter le recours à l’échographie en remplacement de méthodes invasives ou terminales (dissections). Ceci aura donc un impact positif sur deux critères de la règle de 3R : 1. Réduction : Suivi d’une même cohorte au cours du temps, détection plus précise (chaque animal étant son propre contrôle) afin de réduire la taille des lots d’animaux 2. Raffinement : Modalité atraumatique, générant un stress limité puisque l’animal est sous anesthésie, détection plus précoce des pathologies pour réduire la dégradation du bien être dans le cadre de modèle chronique. Raffinement de certaines procédures précédemment réalisées par chirurgie (injection de cellules tumorales dans des organes profonds comme le pancréas).
Procédures
Pour la mise au point d’exploration échographie non invasive, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse de 20 minutes maximum et cette anesthésie pourra être répétée 3 fois à 24h d’intervalle minimum. Pour la mise au point de procédures d’échographie avec injection d’agents de contraste, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum avec pose de cathéter veineux (5 minutes) avant début des acquisitions échographiques. Pour la mise au point d’interventions sous contrôle échographique, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum et, durant cette anesthésie, des injections ou des prélèvements seront réalisés (30 minutes). Pour l’optimisation du suivi du développement embryonnaire par échographie, les souris femelles non anesthésiées subiront deux injections d'hormones. Après fécondation, elles subiront une anesthésie générale gazeuse quotidienne de 30 minutes maximum, soit 10 anesthésies maximum sur les 21 jours de gestation. Toutes ces interventions pourront être réalisées alternativement ou successivement (à minimum 24h d'intervalle) dans les établissements utilisateurs (EU) 1 et 2. Les femelles gestantes pourront être transférées d'une EU à l'autre, par voie routière, sauf durant le dernier tiers de la gestation (à partir de 14 jours). Une échographie pourra être réalisée sans anesthésie sur les nouveaux nés (souris et rats) durant leurs premières heures de vie (moins de 48h) mais les nouveaux nés ne seront pas séparés de leur mère plus de 15 minutes. Le suivi pourra se poursuivre jusqu’au sevrage à raison d’une échographie par semaine maximum (soit 2 à 3 échographies par animal de 48 h à 21 jours de vie). Les explorations pourront se faire dans l'EU1 ou l'EU 2 mais aucun transfert ne sera autorisé avant sevrage.
Impact sur les animaux
L’exploration échographique du rongeur dans le cadre de mises au point techniques nécessite une anesthésie générale d’une durée relativement longue (20 minutes à 1h selon la procédure). La phase d’induction s’accompagne d’une phase d’excitation qui est un stress de faible niveau. La phase de réveil est également un moment critique. Selon la durée de l’anesthésie, l’animal peut voir sa température corporelle chuter. Il peut se déshydrater et perdre un peu de poids. Selon les modèles qui seront mis en œuvre, nous serons amenés à travailler sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) susceptibles d’entrainer stress, gêne respiratoire, difficulté de locomotion et / ou douleur. Les injections intraveineuses d’agents de contraste échographique (microbulles) pourront induire douleur locale et inflammation au niveau du site d’injection. Dans le cadre de suivis gestationnels, l’administration d’hormones (synchronisation de l’œstrus, facilitation de la mise bas) pourra se faire sur animal non anesthésié, sous contention, susceptible d’induire un stress. L’échographie néonatale, impose de séparer le nouveau-né de sa mère et du reste de la portée pour la durée de l’exploration échographique ce qui peut induire des comportements de rejet et / ou d’agressivité de la part de la mère à la réintroduction du nouveau-né dans la cage. L’anesthésie néonatale peut entrainer une dégradation des fonctions respiratoires et cardiaques, de l'hypothermie et une hypoglycémie.
Devenir
Tous les animaux adultes impliqués dans ce projet seront mis à mort à la fin de chaque projet de mise au point expérimentale échographique. Les animaux nés au cours des projets de suivi du développement embryonnaire et/ou mise au point d'injections et/ou prélèvements sous controle échographique et dont l'état général (santé et bien-être) le permettra seront proposés pour réutilisation aux chercheurs propriétaires des lignées en question et titulaires d'une autorisation de projet en cours de validité.
Remplacement
Pour certaines applications, mesure de dureté des tissus en particulier, nous pourrions avoir recours, pour les mises au point très préliminaires, à des objets mimant les tissus vivants (fantômes d’agarose) mais l’échographie est une modalité d’imagerie clinique et préclinique reposant sur les différences d’échogénicités entre les différents organes, fluides et tissus, in vivo, le recours aux animaux reste indispensable y compris dans notre démarche de mise au point expérimentale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre moyen nécessaire et suffisant pour être en mesure d’évaluer la reproductibilité de nos mesures. Ce nombre sera ré-évalué pour chaque nouvelle fonction étudiée, en fonction des spécificités de chaque projet et sur la base de recherches bibliographiques. Afin de réduire le nombre global d’animaux mis en œuvre, les animaux dont l’état de santé et de bien-être général le permet seront, autant que possible, réutilisés lorsque la procédure pratiquée ne remet pas en cause le bien-être et / ou la survie des animaux. Ce sont par ailleurs les mêmes animaux qui seront suivis au cours du temps pour mise au point d’un protocole expérimental donné. Tous les résultats obtenus seront mis à disposition des équipes de recherche pour servir d’études pilotes aux projets de recherches qui s’appuiront sur ces nouvelles méthodes. Ils leur permettront de déterminer la taille de leurs lots d’essais par une approche statistique.
Raffinement
L'imagerie échographique permet d’explorer et mesurer les organes, la circulation et la perfusion sanguine sans douleur avec un stress minimal lié à l’induction de l’anesthésie (isolement et perte de connaissance). Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (à l'aide de grilles d’évaluation et de points limites adaptés à chaque modèle) sera strictement respecté et effectué quotidiennement en concertation avec les équipes de zootechnie. Pour ceux qui devront être transférés d’un établissement utilisateur à un autre, le transfert se fera par voie routière (15 à 30 minutes) dans le respect de la charte de transport établie par notre structure. Pour limiter le stress dû au transport les animaux seront transportés dans leur cage d’origine afin qu’ils conservent leurs repères olfactifs. Lors des explorations échographiques, les animaux seront maintenus sur un support d’imagerie chauffant pendant toute la durée de l’anesthésie générale. Dans le cas des nouveaux-nés, une attention particulière sera portée au maintien de l’environnement olfactif : 1/ pendant la procédure pour réduire le stress du nouveau-né et 2/ pendant la phase de réveil pour qu’il ne soit pas rejeté par sa mère après réintroduction dans la cage. Nous travaillerons sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) mais dans le cadre de ce projet la phase la plus critique des mises au point expérimentales se situera dans les phases les plus précoces et ne devrait donc pas induire de nuisance particulière pour les animaux autres que celles en lien direct avec la méthode expérimentale. Si malgré tout nous devions voir apparaitre des signes de souffrances non soulagés par des traitements vétérinaires classiques (réhydratation parentérale, administration d’antidouleur de type morphiniques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens), les animaux seraient mis à mort rapidement. Nous veillerons à limiter autant que possible le stress subi par les animaux en employant des méthodes de manipulation les plus adaptées (préhension sans contention, maintien de l'environnement olfactif pour les nouveaux nés). Tout stress causé aux animaux serait par ailleurs rédhibitoire pour prétendre mesurer des paramètres physiologiques tels que ceux caractérisant la fonction cardiaque. Certaines injections pourront se faire sur animal non anesthésié (injection d'hormones) mais la plupart seront faites sous anesthésie générale, durant la procédure d'échographie.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de mettre au point et standardiser différentes procédures expérimentales d’échographie, d’échocardiographie et d’écho-élastographie ce qui ne peut se faire que chez l’animal vivant en l’absence de modèles in vitro appropriés. L'utilisation de rongeurs tels que la souris et le rat permet de reproduire les pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires, les cancers ou les maladies métaboliques ou encore le suivi du vieillissement. Le rat est plus particulièrement utilisé dans des applications de neurobiologie ou l’étude de la nécrose osseuse induite lors de radiothérapie du cerveau en particulier. Les rongeurs (souris et rats), grâce à leur courte durée de gestation (21 jours) sont également des modèles particulièrement adaptés pour mener des études de suivi de développement embryonnaire. L’échographie permet de détecter l’apparition de malformations éventuellement associées à certains génotypes et/ou observer le phénomène de résorption embryonnaire pouvant expliquer l’absence de certains génotypes à la mise bas (mortalité embryonnaire). Les animaux adultes seront âgés de 7 semaines minimum à réception dans nos zootechnies. Ils ne seront utilisés qu’après 5 à 7 jours de quarantaine. Les expériences seront majoritairement conduites chez de jeunes adultes de 8 à 12 semaines mais cet âge pourra varier en fonction de l’objet de l’étude (a minima après sevrage et jusqu’à 1 an). Une des procédures, qui nécessite la mise en œuvre de femelles gestantes. Ces femelles (souris et rates) seront mises en accouplement à partir de l’âge de 8 semaines. Les embryons pourront être objets de prélèvements et / ou injections guidées par échographie à tous les stades de développement donc y compris durant le dernier tiers de gestation. Les souriceaux et ratons issus de ces gestations pourront être imagés par échographie avant sevrage (de 1 à 21 jours).
Étude de l’effet d’un nouvel agent médicamenteux sur la thrombose artérielle et le temps de saignement en combinaison avec des traitements de référence chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
517 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucune ne se réveillant des actes chirurgicaux qu'elle subit. Chacune reçoit trois à quatre injections, dont certaines peuvent blesser l'œil ou provoquer des saignements internes, passe une heure sous anesthésie et subit une chirurgie de dix minutes, avant que le bout de sa queue soit sectionné pour mesurer son temps de saignement. Il s'agit d'évaluer un candidat antiplaquettaire associé aux traitements de référence, dont le porteur espère qu'il conservera leur efficacité en réduisant les hémorragies chez des millions de patients. Il écrit que ce traitement "n'augmente pas le risque de saignement", et décrit dans le même document une chirurgie et une section de la queue pouvant entraîner un saignement non contrôlé voire la mort de l'animal.
Objectifs
En France, les pathologies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité (environ 38% des décès) devant les cancers. Les complications majeures sont l’infarctus du myocarde et les accidents vasculaires cérébraux (AVC). Actuellement il existe plusieurs traitements de référence permettant de faire diminuer les risques. Toutefois, la prise de ces différents traitements comporte un risque majeur de saignement. Au vu de ce constat, il est aujourd’hui essentiel de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques dirigées contre des cibles originales impliquées dans ces processus. Des travaux récents ont permis de découvrir une cible majeure à l’origine de pathologies cardiovasculaires. Cette cible est impliquée dans l'activation des plaquettes sanguines. Des résultats obtenus au sein du laboratoire ont permis de démontrer que l’association de ce traitement avec un médicament fluidifiant le sang permettait de renforcer l’action de cette molécule sur des plaquettes humaines. Les objectifs de ce projet sont d'évaluer ce potentiel traitement en combinaison, ou non, avec des traitements de référence afin de comparer leurs efficacités et déterminer la stratégie de combinaison la plus pertinente associée à un risque de saignement réduit. La réalisation de ce projet permettra de confirmer la pertinence de la stratégie thérapeutique associée à ce nouveau traitement et de déterminer les avantages d'une telle combinaison par rapport aux traitements de référence.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont la conservation de l'efficacité des traitements de référence lorsque combinés avec notre traitement tout en diminuant leurs effets indésirables. Comme décrit précédemment, les traitements de référence existant actuellement sur le marché s’accompagnent généralement d’un risque accru de saignement. Notre traitement n’augmente pas le risque de saignement. Le bénéfice attendu de ce projet est une diminution du saignement après administration des traitements combinés par rapport à l'administration des traitements de référence seuls. Ce traitement pourrait donc entraîner un réel bénéfice clinique pour des millions de patients traités pour des pathologies cardiovasculaires. La réalisation de ce projet permettra de valider les résultats obtenus précédemment.
Procédures
Pour toutes les souris : Anesthésie (2 fois, temps maximal total : 1h) ; Injections (3 à 4 fois, temps maximal par injection : 30 secondes sur une durée totale de 3 à 4h) ; Procédure chirurgicale (1 fois, temps maximal : 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables peuvent être un stress physique ou thermique de courte durée et une douleur de courte durée à l’endroit des injections. Les injections peuvent en particulier générer des blessures au niveau de l’œil ou des saignements internes. La chirurgie peut aussi comporter un risque de saignement non contrôlé voire de mort de l’animal. La section de la queue peut entraîner une douleur et un risque de saignement non contrôlé.
Devenir
Les actes chirurgicaux induits par la procédure sur les animaux ne permettent pas le réveil des animaux. À la fin de l’expérimentation, l’ensemble des animaux sera mis à mort. Les animaux seront toujours sous anesthésie afin de garantir une mort sans douleur.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude réalisée précédemment. Ce modèle permettra de renforcer les preuves d’efficacité déjà obtenues. Il s’agit de plus d’un modèle bien caractérisé au sein du laboratoire, son utilisation est ainsi pertinente afin d’évaluer la combinaison avec des traitements de référence. De plus, les pathologies cardiovasculaires sont des phénomènes complexes et multifactoriels qui nécessitent l'utilisation de modèles animaux ne pouvant pas être modélisés ou reproduits.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées. Notons de plus que certaines expériences ne seront pas conduites si les expériences précédentes ne permettent pas d’obtenir des résultats concluants. Le bénéfice éventuel lié au traitement ou aux combinaisons de traitements sera évalué par la mise en évidence du maintien de l'efficacité des traitements d’une part et d'une diminution significative des effets indésirables, d’autre part, chez les animaux traités en combinaison par rapport aux animaux traités avec les traitements de référence. L'effet des traitements sur ces deux critères sera analysé avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Une observation quotidienne des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques et d'antidouleurs (kétamine/xylazine) permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Un gel protecteur sera de plus utilisé lors des injections. Une attention particulière sera portée à l’observation des critères limites fixés tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l’animal sera euthanasié. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne). Au cours de l’anesthésie, les signes vitaux seront surveillés avec une attention particulière portée à la respiration et au rythme cardiaque avec un maintien de la température corporelle grâce à une lampe chauffante et une plaque thermorégulée. Afin de limiter toute souffrance, dans le cas de dommages irréversibles dus à l’anesthésie, l’animal sera immédiatement euthanasié (l’animal sera, par conséquent, éliminé des études statistiques d’analyse du protocole). L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du protocole.
Choix des espèces
L'espèce animale choisie est la souris (Mus musculus). Il s'agit du modèle de référence pour l'étude de processus cardiovasculaires. Par ailleurs, l'animalerie est agréée pour l’espèce souris. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte (jusqu’à environ 1 an chez la souris).
Développement d’un modèle murin de lymphome: exploration du mécanisme d’action des cellules CAR-T – site 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Construire une souris porteuse de lymphome, puis y observer l'effet de cellules CAR-T sur les microbiotes pulmonaire et intestinal: 96 souris mâles de six semaines sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées au vingt-huitième jour. Irradiées aux rayons X la veille de l'injection des cellules tumorales, elles subissent trois prélèvements sanguins, des prélèvements de selles tous les deux jours et trois séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur prévoit une fatigue, une perte d'appétit, une perte de poids, puis dans les cas avancés une faiblesse ou une paralysie. Il présente ce travail comme le moyen d'être "les pionniers" de ce type de modèle et d'initier un programme de plus grande envergure déposable dans des appels à projets nationaux.
Objectifs
Les immunothérapies à base de cellules génétiquement modifiées pour reconnaitre spécifiquement la tumeur a récemment révolutionné la prise en charge de certains cancers hématologiques. Néanmoins, les effets secondaires comme des infections pulmonaires sont nombreux chez les patients traités par ces celluels et conditionne l’efficacité du traitement et le pronostic vital du patient. A ce jour, aucune étude expérimentale n’a été réalisée et les mécanismes physiopathologiques sous-jacents restent méconnus. L’ambition de ce projet est de développer un modèle murin de lymphome afin d’étudier l'efficacité des cellules thérapeutiques et leurs interactions avec les microbiotes pulmonaire et intestinal. Pour cela, des souris seront ayant développées un lymphome seront traitées par ces cellules. Les objectifs sont i) de valider l'efficacité d'un traitement par ces cellules et 2) d’étudier l’impact de ce traitement sur la composition des microbiotes pulmonaire et intestinal et l'emergence de bactéries nocives . Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet a deux effets levier majeurs. Le premier est expérimental puisque le projet a pour objectif de développer un modèle murin pour évaluaer l'efficacité d'un nouveau traitement d'immunothérapie à base de cellules génétiqument modifiées pour reconnaitre directement la tumeur et nous permettra ainsi d’être les pionniers dans la conception de ce type de modèle expérimental. Le deuxième levier majeur est clinique puisque le projet visant à étudier les interactions entre les ces cellules génétiquement modifiées et les bactéries du microbiote a pour but générer des nouvelles pistes thérapeutiques et améliorer la prise en charge des patients traités par ce type d'approche. Ainsi, les données acquises lors de ce projet permettront d’initier un programme de plus grande envergure qui pourra faire l’objet d’un dépôt dans le cadre d’appels à projets nationaux
Procédures
Les interventions suivront un calendrier précis sur une période de 28 jours. Jour -1 :Les animaux recevront une courte exposition aux rayons X dans le but de préparer le modèle expérimental (Laboratoire de Physique de Clermont rattaché à EU1). Cette étape dure quelques minutes et ne provoque qu’une gêne transitoire. Jour 0 : Une injection sera réalisée afin d’induire le développement de la tumeur (EU1). L’intervention est rapide et effectuée sur des animaux vigiles, avec manipulation douce et réchauffement préalable pour limiter le stress. Jour 2 : Une seconde injection sera réalisée pour administrer les cellules thérapeutiques ou de contrôle (EU1). Suivi du jour 0 au jour 28 : Des prélèvements de sang seront réalisés trois fois (EU1) au cours de l’étude pour suivre la réponse biologique. Des prélèvements de selles seront effectués tous les deux jours pour l’analyse du microbiote (EU1). Une surveillance clinique quotidienne (poids, aspect du pelage, activité, comportement) permettra de détecter précocement tout signe de souffrance (EU1). Des séances d’imagerie non invasives auront lieu à trois reprises (jours 7, 14 et 21)(EU2). Ces examens nécessitent une anesthésie courte (EU2) . Après chaque séance, les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil complet puis replacés dans leur hébergement habituel (EU1). Jour 28 : Les animaux seront euthanasiés (EU1) selon les méthodes réglementaires, afin de permettre la collecte des organes nécessaires aux analyses prévues.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient ressentir un léger stress ou une gêne passagère liés aux manipulations, aux anesthésies courtes ou aux déplacements nécessaires aux observations. Ces effets sont temporaires et limités grâce à l’utilisation de cages adaptées, au suivi attentif du personnel et à des conditions d’hébergement confortables. La maladie induite par la tumeur peut provoquer une fatigue, une baisse de l’appétit, une perte de poids ou une diminution de l’activité. Dans les cas plus avancés, une faiblesse ou une paralysie peuvent apparaître. Les animaux seront observés chaque jour afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de détresse. Si nécessaire, un traitement adapté sera administré ou l’animal sera retiré de l’étude pour éviter toute souffrance prolongée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélements d'organes (poumons, intestins, foie, rate), du sang et du liquide broncho-alvéolaire et permettre des analyses immunologiques afin d'étudier l'efficacité des cellules thérapeutiques. Des analyses microbiologiques seront également effectuées par l'analyse de la composition des microbiotes dans le poumons et l'intestin.
Remplacement
Notre approche expérimentale a inclus une première analyse in vitro avec des co-cultures entre les cellules de lymphomes, les cellules genetiquement modifiées pour reconnaitre directement la tumeur mais elle reste largement insuffisante pour analyser l’efficacité du traitement par ce type d'immunothérapie, car elle n’englobe que très partiellement la complexité de l’in vivo. Le modèle murin utilisé permettra de reproduire fidèlement dans un organisme complexe le protocole d’immunothérapie par cellules modifiées qui est proposé aux patients atteints de lymphome et ainsi comprendre l’impact sur les microbiotes pulmonaire et intestinal dans ce modèle en caractérisant les effets directes (perte d’efficacité du traitement, resistance au traitement,…) mais également les effets indirectes (modification des microbiotes pulmonaire et intestinal, émergence de pathobiontes, inflammation…)
Réduction
Des tests in vitro préalables (co-cultures lymphome/cellules génétiquement modifiées pour reconnaitre la tumeur) ont permis de limiter le recours aux animaux. Le nombre d’animaux in vivo a été calculé à partir d’analyses statistiques afin d’obtenir des résultats significatifs avec des lots de taille minimale (8 souris/lot, 3 répétitions). Chaque animal sera exploité au maximum (prélèvements multiples d’organes et fluides) afin d’optimiser l’information obtenue et réduire le nombre total nécessaire.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages enrichies avec un enrichissement de milieu varié (rouleaux en carton, coton pour nidification, matériaux à ronger) permettant l’expression des comportements naturels et la réduction du stress.En fonction de l’état clinique des animaux et de la progression tumorale, l’enrichissement sera adapté individuellement : raccourcissement ou retrait partiel des tubes en carton pour faciliter les déplacements en cas de mobilité réduite ;déplacement de la nourriture et de l’eau vers la zone la plus accessible ;utilisation de nourriture humidifiée ou émiettée et de gels hydratants pour maintenir la prise alimentaire et limiter la déshydratation ;ajout de matériaux de confort (nids de coton compactés) pour réduire la fatigue. Une surveillance quotidienne sera assurée (pesée, l’évaluation de l’activité, du comportement, de la posture, du pelage et de la respiration). Ces observations seront consignées dans une grille de scoring clinique spécifique au modèle de lymphome. Tout signe de souffrance ou de douleur déclenchera l’administration d’un traitement antalgique .En cas de non-amélioration, l’animal sera immédiatement euthanasié afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les transports entre EU1 et EU2 sont de très courte durée (5 minutes). Les animaux sont déplacés dans des cages dédiées, enrichies et placées dans des cartons opaques. Ces mesures minimisent les stimuli stressants. Les trajets sont limités au strict nécessaire, réalisés par du personnel formé, avec surveillance clinique avant et après déplacement et établissement d’un certificat de transport. Les animaux regagnent leur hébergement immédiatement après chaque procédure.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront des souris mâles de 6 semaines, pesant environ 20 g. À cet âge, le système immunitaire est pleinement mature et fonctionnel, avec des populations lymphocytaires diversifiées et un microbiote intestinal stabilisé. Cette espèce est adaptée à l’étude des lymphomes car des lignées de cellules B tumorales y sont disponibles, et des protocoles établis permettent la modification génétique des lymphocytes T pour générer les cellules thérapeutiques in vitro. Le choix du sexe mâle est motivé par deux raisons principales : Comparabilité avec nos travaux antérieurs, déjà réalisés chez des mâles, ce qui garantit la cohérence et la continuité des données. Prépondérance masculine décrite dans les lymphomes, ce qui confère une pertinence scientifique et permet de limiter le nombre d’animaux en évitant la duplication des expériences sur les deux sexes (principe de réduction).
Étude de la modulation du métabolisme des monocytes sur la récupération post-infarctus chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Ouvertes au niveau du thorax pour qu'un infarctus leur soit provoqué, jusqu'à 140 minutes sous anesthésie profonde, 356 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, huit autres d'un niveau léger. Le porteur reconnaît une douleur modérée à sévère pendant et après l'opération. Viennent ensuite une échographie de vingt à trente minutes et cinq prélèvements sanguins échelonnés, avant le développement attendu d'une insuffisance cardiaque, que le RNT décrit comme sans conséquence clinique visible en raison du court délai avant la mise à mort. Les 364 souris sont tuées pour prélever leur cœur et leurs poumons et y mesurer l'infiltration des cellules immunitaires.
Objectifs
Après une crise cardiaque, le corps réagit par une inflammation qui peut parfois persister et fragiliser davantage le cœur. Ce projet vise à mieux comprendre cette réaction inflammatoire pour la maîtriser, tout en préservant les défenses naturelles de l’organisme. Nous nous intéressons à des cellules immunitaires appelées monocytes, qui jouent un rôle central dans l’inflammation et la réparation du tissu cardiaque. En étudiant leur comportement chez l’humain et chez la souris, nous cherchons à repérer les signes précoces d’une inflammation excessive et à explorer de nouvelles pistes pour la réguler. Notre objectif : développer des traitements innovants pour mieux protéger le cœur après un infarctus, anticiper les complications, et améliorer le suivi des patients les plus à risque.
Bénéfices attendus
Nous pensons que ce projet introduira une nouvelle approche thérapeutique post-infarctus du myocarde en limitant l’inflammation, réduisant ainsi le développement de l’insuffisance cardiaque. Ce projet pourra également ouvrir la voie à de nombreuses études d’intervention post-infarctus du myocarde à fort impact, notamment en collaboration les centres de recherche clinique proches. Il générera des connaissances nouvelles de haute qualité, disponibles en accès libre. De plus, les techniques et expertises développées dans le cadre de ce projet pourront être appliquées à d’autres pathologies cardiovasculaires impliquant une dérégulation de l’inflammation, comme la myocardite. À plus long terme, l’objectif est de transposer ces avancées en stratégies thérapeutiques disponibles en clinique. Impacts économiques et technologiques attendus : L’insuffisance cardiaque représente un coût économique considérable, lié aux traitements à vie et aux hospitalisations fréquentes (estimé à 991 millions d’euros par an en France). Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir ou ralentir la progression de cette maladie pourrait réduire significativement cette charge économique. À court terme, ce projet permettra d’explorer une nouvelle voie thérapeutique dans le traitement de l’insuffisance cardiaque. À long terme, il pourrait ouvrir des perspectives vers le développement de solutions thérapeutiques ciblées. Au-delà de l’impact économique, l’insuffisance cardiaque altère fortement la qualité de vie des patients (environ 160 000 hospitalisations chaque année en France). En améliorant les approches thérapeutiques et les stratégies de prévention, notamment par la nutrition et l’exercice physique, nous pourrions atténuer les conséquences de l’infarctus du myocarde sur la vie des patients. L’impact à long terme de ce projet pourrait bénéficier à plusieurs milliers de patients chaque année
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale thoracique visant à induire un infarctus du myocarde, réalisée sous anesthésie générale profonde avec une couverture analgésique adaptée (140 minutes maximum). Le suivi des animaux implique un examen échographique (20 à 30 minutes) et cinq prélèvements sanguins par animal (moins d’1 minute chacun), réalisés sous sédation ou anesthésie générale, répartis tout au long de l’expérimentation. .
Impact sur les animaux
La chirurgie thoracique provoque une douleur modérée à sévère, per- et post-opératoire, de durée moyenne. Aucune nuisance n’est attendue pendant les examens échographiques (non invasif). Les prélèvements sanguins engendrent une douleur légère de très courte durée. L’induction de l’anesthésie (ou la sédation selon l’examen) associée à ces interventions, de même que le réveil, induisent un léger stress ou inconfort de courte durée. Pour les groupes d’animaux ayant subi un infarctus, le développement d’une insuffisance cardiaque est attendu, mais sans conséquence clinique visible ou invalidante associée dans les conditions expérimentales prévues (délais court entre l’infarctus et l’euthanasie de l’animal).
Devenir
Les animaux devront être mis à mort en fin d’expérimentation, avec prélèvement de différents organes (cœur, poumons…), pour effectuer des analyses tissulaires et des analyses d’infiltration des cellules immunitaires.
Remplacement
Ce projet s’appuie sur des données in vitro et in vivo déjà publiée montrant le rôle clef du métabolisme dans la réponse inflammatoire post infarctus. Dans le présent projet nous cherchons à identifier le rôle clefs de la réponse inflammatoire post infarctus, qui est un phénomène multi organe nécessitant une approche sur organisme vivant. En effet, les monocytes infiltrant le tissu myocardique sont produits à distance dans la moelle osseuse, puis circulent dans le sang et infiltrent le cœur.
Réduction
L’utilisation du même animal pour un prélèvement sanguin a différent temps permet d’augmenter la puissance statistique tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Le calcul des nombres d’animaux nécessaires a été réalisé avec l’appui du biostatisticien.
Raffinement
La chirurgie et les examens d’imagerie seront entièrement réalisés sous anesthésie profonde avec une couverture analgésique adaptée. Grâce au recul de l’équipe sur ce modèle chirurgicale, nous appliquerons tous les raffinements mis en place jusqu’ici (abord chirurgical sans résection de côte, soin post-opératoire,…) Des points limites sont établis en conséquence, afin de permettre l’interruption de l’expérimentation en cas d’apparition de douleur, stress, angoisse ou dommage durable que nous ne serions pas en mesure de supprimer ou de soulager.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté et largement utilisé dans la littérature pour les études mécanistiques ou précliniques portant sur les maladies cardiovasculaires. Malgré certaines différences physiologiques, telles qu’un rythme cardiaque plus rapide, la souris s’est révélée être un modèle pertinent pour l’étude des mécanismes de la pathologie de l’infarctus du myocarde et de l’inflammation. La disponibilité de modèles génétiquement modifiés permet également une compréhension plus détaillée des mécanismes sous-jacents. La procédure chirurgicale d’infarctus du myocarde, nécessaire pour induire une insuffisance cardiaque, est par ailleurs maîtrisée au laboratoire, ce qui nous permet de bénéficier d’un excellent retour d’expérience. Les animaux seront âgés de 10 à 16 semaines au début de chaque procédure. Ce stade de développement est le plus couramment utilisé, permettant une réalisation maîtrisée et homogène de la chirurgie. Il permet également de s’affranchir de la variabilité interindividuelle apparaissant avec le vieillissement des animaux.
Rôle des peptides antimicrobiens dans un modèle de maladie auto-immune chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris utilisées appartiennent à une lignée qui développe spontanément une maladie auto-immune détruisant les glandes salivaires et lacrymales, et sont réparties par âge, à 4, 12 et 20 semaines, pour couvrir les stades de la maladie. 960 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse. Chacune subit une biopsie du bout de la queue, un tatouage d'identification, un prélèvement de sang à la veine faciale que le porteur décrit lui-même comme modérément douloureux, et jusqu'à six injections. La contrepartie annoncée tient en une phrase, de nouveaux outils thérapeutiques pour une maladie sans remède, et le dimensionnement des groupes en une autre, une "étude statistique adaptée" dont rien n'est précisé.
Objectifs
Nous étudions une maladie auto-immune chronique caractérisée par la destruction des glandes exocrines. Environ 0,5% de la population totale est atteinte et souffre de sécheresse buccale et oculaire et jusqu'à présent, il n'y a pas de remède pour celle maladie. Cela amène à la nécessité d'explorer d'autres domaines dans la compréhension de la maladie. Le rôle des molécules antimicrobiennes émerge dans le domaine de l'auto-immunité. Ces molécules constituent un groupe de petites molécules largement exprimés pour la défense contre les micro-organismes. Des études récentes révèlent que ces molécules régulent également les réponses immunitaires. Les molécules anti-microbiennes sont très exprimées dans les glandes salivaires. Notre objectif général est de déterminer le rôle de molécules anti-microbiennes dans les glandes exocrines lors du développement de l'auto-immunité dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Notre projet fournira de nouveaux outils thérapeutiques pour prévenir ou guérir un syndrome auto-immun.
Procédures
* Biopsie extrême pointe de la queue : 1 fois par animal, 2-3 secondes. * Prélèvement de sang : une fois par animal,, 2-3 secondes. * Injection : entre 1 et 6 injections, 2-3 secondes.
Impact sur les animaux
- Biopsie pointe de la queue (douleur légère de quelques secondes), -Tatouage d'identification (douleur légère de quelques secondes), -Injections (douleur légère de quelques secondes), Prélèvement sang à la veine faciale (douleur modérée de quelques secondes).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyse.
Remplacement
Pour étudier la physiopathologie des maladies auto-immunes, seuls les modèles in vivo sont capables de refléter la complexité de ces maladies et notamment les interactions entre le microbiote intestinal, le système immunitaire et le tissu cible. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques.
Réduction
Les groupes ont été dimensionnés par une étude statistique adaptée.
Raffinement
-nombre d’individus par cage : un nombre suffisant sera défini pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons); Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Selon le plan d’action défini, par les expérimentateurs : Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique.Tout animal qui aura une valeur totale comprise entre 1 et 3 dans les différents points limites recevra un analgésique (Ketoprofen, dose 5mg/kg, volume 0,012ml/g; SC).
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. De plus il existe des modèles bien établis de maladies auto-immunes. Les souris NOR seront de 3 âges différents (4, 12, 20 semaines) correspondant aux différents stades de développement de la maladie. Les souris C57BL/6 Tcfcp2L1-Cre-ERT X Slpi-flox seront utilisées à l'âge adulte >8 semaines.
Implication de l’enzyme EZH2 dans un modèle murin de développement de maladie valvulaire cardiaque (rétrécissement aortique calcifié)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une souris qui ne réagit plus à un stimulus, ou qui reste inactive dans sa cage plus de six heures, est mise à mort. 630 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Génétiquement modifiées pour le métabolisme des lipides et soumises à un régime riche en graisses prolongé, elles développent une dysfonction de la valve aortique, subissent une biopsie du cartilage de l'oreille au sevrage, trois jours d'injections et une anesthésie gazeuse à chaque échocardiographie. Le porteur écrit que le modèle qu'il cherche à mettre au point a déjà été décrit par d'autres équipes, et repousse le calcul de puissance statistique à l'après-mise au point, sans justifier l'effectif de départ.
Objectifs
L’objectif du projet est de mettre au point un modèle murin de maladie valvulaire cardiaque appelée rétrécissement aortique calcifié. Cette pathologie se caractérise par un épaississement puis une calcification progressive de la valve aortique, limitant son ouverture et compromettant son étanchéité. Ce modèle permettra de mieux comprendre les mécanismes de développement de la maladie et d’évaluer l’efficacité de traitements pharmacologiques, actuellement inexistants.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra, dans un premier temps, de mettre au point chez la souris un modèle de rétrécissement aortique calcifié (RAC), déjà décrit par d’autres équipes, qui pourra ensuite être utilisé pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement du RAC, ainsi que pour évaluer le bénéfice potentiel de traitements pharmacologiques de cette pathologie in vivo. Dans un second temps, nous étudierons l’implication de l’activité de d'une enzyme dans différents types cellulaires (cellules endothéliales valvulaires, cellules inflammatoires, etc...), grâce à l’utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées (OGM) au cours du développement du RAC. Nous espérons ainsi, si les résultats obtenus sont encourageants, proposer une nouvelle stratégie de ciblage pharmacologique de l’enzyme, spécifique aux cellules inflammatoires, pouvant constituer une approche innovante pour limiter la progression du RAC chez l’Homme.
Procédures
Biopsie du cartilage auriculaire externe de 2mm au moment du sevrage. Injections quotidiennes durant 3 jours. Anesthésie gazeuse lors de chaque échocardiographie.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons, si notre modèle s’avère fonctionnel, à observer des signes de dysfonction cardiaque — notamment une augmentation du gradient transvalvulaire — et plus particulièrement de la valve aortique pendant plusieurs jours, évalués par échocardiographie. Cette dysfonction pourrait entraîner chez l’animal un état de fatigue, notamment à l’effort pendant plusieurs minutes. L’injection de la molécule induisant la délétion pourrait également provoquer des rougeurs, des douleurs ou une inflammation abdominale pendant quelques minutes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de cette étude.
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro, car l’objectif de cette étude est de mettre au point un modèle murin de rétrécissement aortique calcifié (RAC), inexistant à ce jour.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons de manière séquentielle des mesures non invasives de la fonction cardiaque (échocardiographie). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation et de mutualisation des prélèvements réalisés au moment de la mise à mort pour les analyses ex vivo. Ainsi, les tissus prélevés pour chaque animal seront congelés, broyés puis réduits à l’état de poudre, afin d’être répartis pour différentes analyses : lipidomiques, protéiques et moléculaires. De cette manière, un seul animal sera utilisé pour l’ensemble de ces analyses ex vivo, en lieu et place d’un animal dédié à chacune des méthodes. À l’issue de la phase de mise au point du modèle animal, nous ajusterons le nombre d’animaux nécessaires aux procédures suivantes à l’aide d'un calcul de puissance statistique, afin d’optimiser et réduire encore le nombre d’animaux requis. Enfin, des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos procédures, afin de s’affranchir d’un effet lié au sexe et de valoriser l’ensemble des animaux géntiquement modifiés produits dans notre animalerie.
Raffinement
Les animaux seront hébergés conformément aux normes en vigueur, avec un enrichissement environnemental adapté. Des points limites précis ont été définis (absence de réaction à un stimulus, inactivité prolongée dans la cage pendant plus de six heures, manifestation de signes de détresse), ainsi qu’une stratégie d’anesthésie et d’analgésie appropriée associée à un suivi quotidien des signes cliniques et à un suivi du poids hebdomadaire. Par ailleurs, les expérimentateurs auront des contacts pluri-hebdomadaires avec les animaux afin de favoriser leur habituation à la manipulation. L’identification des souris génétiquement modifiées par puçage sous-cutané et la biopsie du cartilage auriculaire externe nécessaire au génotypage seront réalisées de manière concomitante, au cours d’une procédure unique, sous anesthésie gazeuse. Cette organisation vise à limiter le stress et à réduire le nombre d’anesthésies.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage indéniable de permettre l’utilisation d’outils de biologie moléculaire qui ne sont pas toujours accessibles chez le rat (modèle également développé au sein de notre laboratoire), tels que l’invalidation ciblée d’un gène dans différents types cellulaires, comme c’est le cas dans cette étude. Ces modèles sont particulièrement pertinents pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de la dysfonction valvulaire aortique responsable de la maladie cardiaque dont cette demande fait l'objet. Nous utiliserons un modèle de souris génétiquement modifiée pour le métabolisme des lipides qui, associé à un régime alimentaire riche en graisses prolongé induit une dysfonction valvulaire aortique similaire à celle observé chez des patients. Des animaux adultes, âgés de 8 à 12 semaines et pesant 20 à 24 g, seront utilisés pour cette étude. À cet âge, la taille des souris permet de faciliter le suivi échocardiographique de la maladie.
Evaluation de traitements contre le phénotype épileptique dans le syndrome de Dravet
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Identifiées par une biopsie de l'oreille, traitées chaque jour pendant quatre à huit semaines, implantées d'électrodes intracérébrales pour 150 d'entre elles, 480 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et l'autre moitié un niveau sévère. Toutes seront tuées pour des prélèvements d'organes, et le porteur indique qu'environ 40 % au maximum meurent avant l'âge de 60 jours, des crises d'épilepsie que leur modification génétique provoque. Le projet évalue des traitements contre le syndrome de Dravet, une épilepsie rare de l'enfant, sur des souriceaux traités dès le septième jour de vie. Les tests comportementaux, annoncés jusqu'à trois fois par animal pour des sessions de huit à trente minutes, ne sont pas nommés, alors que les symptômes recherchés sont l'hyperactivité, le déficit social et le défaut d'apprentissage.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer l’impact de traitements sur les symptômes et la survie d’un modèle animal du syndrome de Dravet. Le syndrome de Dravet est une épilepsie rare de l’enfant qui a pour cause une mutation du gène SCN1A. Ce syndrome épileptique est caractérisé par des crises épileptiques pouvant diminuer la survie des patients (phénotype de SUDEP = mort subite et inattendue chez les patients épileptiques). Des modèles animaux du syndrome de Dravet ont été établis, ce qui mène au développement de crises épileptiques, provoquant dans environ 40% des cas une mort prématurée (SUDEP). Nous proposons d’utiliser un modèle du syndrome de Dravet, spécifiquement des souris jeunes afin de modéliser les phases précoces de ce syndrome. L’objectif est d’évaluer l’impact de traitements sur 1) la survie des animaux, 2) l’apparition des crises épileptiques, et 3) les symptômes associés : hyperactivité, déficit social ou défaut d’apprentissage.
Bénéfices attendus
Le syndrome de Dravet est un syndrome épileptique de l’enfant dont les traitements actuels ne permettent pas de soigner tous les patients. De plus, même si certaines crises sont atténuées par les traitements actuels, la survie ne semble pas être prolongée. Ce projet vise à tester de nouveaux traitements pour diminuer les crises d’épilepsie et augmenter la survie, ce qui permettra de proposer de nouveaux traitements chez l’Homme.
Procédures
Tous les nouveaux-nés modèle de Dravet et leurs contrôles (environ 480) seront identifiés à l’aide d’un prélèvement (biopsie) à l’oreille qui sera effectué une seule fois. Pour les traitements, les animaux seront administrés quotidiennement (une seule fois par jour) pendant la durée des expériences soit au maximum : 8 semaines pour 240 animaux, et au maximum : 4 semaines pour 150 autres animaux. Pour l’évaluation du comportement, les animaux seront testés au maximum 3 fois à l’aide de test allant de 8 min à 30 min/jour, le tout sur 2 semaines maximum. Cela concernera 240 animaux. Pour les enregistrements d’activité électrique cérébrale (EEG), environ 150 animaux subiront une procédure chirurgicale.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues (connues de la littérature) sont : 1) Le phénotype des souris transgéniques est dommageable, avec une survenue de crises épileptiques spontanées, qui peuvent entrainer une mort prématurée (environ 40% des animaux au maximum n’atteignent pas l’âge de 60 jours). 2) Un stress et une douleur associée à la biopsie d’oreille pour l’identification et le génotypage simultané 3) Un stress et une douleur dus à l’administration chronique des traitements proposés 4) Un stress dû aux tests comportementaux 5) Un stress dû à la chirurgie pour l’implantation d’électrodes intracérébrales 6) Un stress dû à l’isolement (maximum 24h) pendant les périodes d’enregistrement des crises spontanées. Les traitements seront effectués par du personnel expérimenté pour limiter le stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car le comportement (locomoteur, social, cognitif) ne peut être étudié au niveau cellulaire (in vitro) ou par modélisation (in silico). De plus, afin de mimer un syndrome d’origine génétique et ses conséquences sur un organisme en cours de développement, l’utilisation d’animaux transgéniques est indispensable.
Réduction
Afin de limiter l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype dommageable, les animaux seront générés par fécondation in vitro d’ovules de femelles non transgéniques et de sperme issu de males transgéniques. Suite à nos précédents travaux, nous pouvons estimer le nombre de femelles gestantes nécessaires afin d’obtenir le nombre d’animaux permettant d’atteindre une puissance statistique adéquate. Le calcul du nombre des animaux est fait selon les procédures standards de statistiques. De plus, les animaux pouvant présenter des crises épileptiques létales, il nous faut au minimum 12 animaux par groupe pour pouvoir évaluer le phénotype des animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées enrichies. La température est de 22°C +/-2°. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 7h/19h. Une surveillance attentive et quotidienne des animaux est réalisée. Environ 45 minutes avant chirurgie, une dose d’analgésique est administrée. Pendant la chirurgie, le dessèchement de la cornée est évité à l’aide d’un gel spécifique. Une injection d’anesthésique local est faite le long de la ligne d’incision pour limiter la douleur. De plus, l’animal est maintenu à une température de 37°C à l’aide d’un tapis chauffant. Puis, l’analgésique est administré 5 à 6h après l’injection pré-opératoire. Le lendemain, si un signe de mal-être/douleur est identifié, alors l’administration d’analgésique sera continuée. Une distribution d'aliment hydraté ou d’une bouillie produite par dispersion de croquettes dans l’eau pourra être effectuée pour faciliter l'alimentation. Les administrations seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté. Des points limites stricts et spécifiques du projet seront appliqués.
Choix des espèces
Afin de modéliser au mieux le syndrome de Dravet, qui est à plus de 80% dû à une mutation génétique, l’espèce souris dont la modification génétique du gène Scn1a déjà publié est la plus pertinente. Ce modèle récapitule bien le phénotype Dravet : crises fébriles, crises spontanées, SUDEP et symptômes psychiatriques. Pour la moitié, les animaux seront traités à partir du jour post-natal 7 (P7) au minimum afin d’avoir une exposition suffisante avant la diminution de la survie estimée à P20. Ces animaux seront évalués jusqu’à leur âge adulte (environ P45) où leurs comportements seront évalués. Pour l'autre moitié, les animaux seront utilisés après sevrage pour faire l’implantation d’électrodes et pouvoir mesurer les crises spontanées le plus tôt possible, les crises étant les plus visibles autour de P28.