Souris
Etude de la cardiotoxicité induite par les traitements anti-cancéreux. EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, puis des injections quotidiennes pendant quatre semaines et une échocardiographie sous anesthésie toutes les deux semaines, pour tester des molécules censées protéger le cœur de la doxorubicine sans réduire son effet antitumoral. Le porteur signale une nécrose possible au point d'injection, une intolérance à l'effort et une respiration accélérée, et transporte les souris à pied entre deux établissements, en cage placée dans un sac opaque. Toutes sont tuées en fin de protocole pour prélever le cœur, la tumeur, le foie et les reins, prélèvements qu'il qualifie d'"indispensables".
Objectifs
La cardio-oncologie connait actuellement un essor grandissant au regard du problème de santé publique. En effet, ceci est dû au vieillissement de la population, l’augmentation de cas de cancer et la mise sur le marché de nouvelles molécules anticancéreuses. La doxorubicine (dox) fait partie des agents de chimiothérapies les plus utilisés dans le traitement des tumeurs solides comme le cancer du sein. Cependant son utilisation clinique est limitée due à sa cardiotoxicité qui peut conduire à l’insuffisance cardiaque (IC). Actuellement il existe une seule molécule cardioprotectrice dont l’utilisation reste limitée pour cause d’effets secondaires importants. L’objectif général scientifique de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires liés à la cardiotoxicité afin de proposer une molécule à la fois cardioprotectrice, n’interférant pas avec le pouvoir antitumoral de la dox et idéalement l’amplifierait. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier de nouvelles molécules permettant de protéger le cœur lors d’une chimiothérapie anti-cancéreuse. L’effet de chaque molécule sera étudié à la fois sur le cœur et sur la tumeur, afin de s’assurer que l’efficacité antitumorale n’est pas altérée. L’ensemble du projet contribuera ainsi à proposer une nouvelle stratégie cardioprotectrice lors de l’utilisation de chimiothérapies couramment utilisées dans le traitement du cancer, améliorant ainsi la prise en charge du patient et ses chances de survie.
Procédures
Les animaux suivront plusieurs types d’interventions : une injection unique de cellules tumorales sous anesthésie (durée environ 1 minute) ; des injections journalières pendant 4 semaines (durée environ 10 secondes chacune, sur animal vigile). Une échocardiographie sous anesthésie sera réalisée une fois toute les deux semaines (10 minutes chacune). L'ensemble des interventions auront lieu dans l'établissement utilisateur 1. Seule l'isolation des cellules primaires en intervention terminale et la mise à mort réglementaire des animaux se fera dans l'établissement utilisateur 2.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter une gêne transitoire liée à l’injection tumorale (apparition d’une masse localisée), une légère perte de poids ou une baisse d’activité liées aux traitements, ainsi qu’un stress ponctuel lors des manipulations répétées. De rares effets cardiovasculaires (intolérance à l’effort, respiration plus rapide) pourront survenir avec la doxorubicine ainsi qu’une nécrose localisée au niveau du site d’injection. Les anesthésies nécessaires aux échocardiographies peuvent entraîner une récupération lente ou une hypothermie passagère.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de protocole car les prélèvements d’organes (cœur, tumeur, foie, reins) sont indispensables à l’évaluation de la toxicité cardiaque et de l’efficacité antitumorale.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour étudier l’interaction entre la chimiothérapie et la fonction cardiaque dans un organisme complet. Les modèles in vitro ou sur organoïdes ne permettent pas de reproduire la complexité des réponses métaboliques et circulatoires impliquées dans la cardiotoxicité et la croissance tumorale.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en respectant la variabilité biologique et sans compromettre les résultats scientifiques attendus. Les groupes expérimentaux ont été optimisés afin de partager les animaux pour plusieurs types d’analyses et d’éviter les répétitions inutiles.
Raffinement
Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé, afin de réduire la durée et le stress des interventions. Les injections de cellules tumorales sont effectuées sous anesthésie, les échocardiographies sous anesthésie légère avec maintien thermique, et les animaux font l’objet d’un suivi clinique quotidien. Les points limites (perte de poids, taille tumorale, détresse respiratoire) ont été clairement définis pour éviter toute souffrance prolongée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied (moins de 10 minutes), à l’écart du public, dans les cages de transport sécurisées. Les cages seront placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.
Choix des espèces
L’espèce souris a été choisie car elle représente le modèle mammifère le plus couramment utilisé et le mieux caractérisé pour l’étude du cancer du sein et de la cardiotoxicité induite par la doxorubicine. Sa physiologie cardiovasculaire et ses réponses tumorales sont bien décrites et transposables à l’humain. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), correspondant à un stade physiologique stable et adapté aux procédures de greffe et de traitement.
Rôle des macrophages tissulaires dans l’altération de la réparation des organes après un sepsis
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Neuf mesures de pression artérielle et trois échocardiographies par animal, plus la pose sous la peau du dos d'une pompe osmotique : 5 148 souris mâles vont être utilisées, 3 822 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 1 326 d'un niveau modéré, toutes tuées pour le prélèvement de la rate, du rein, du cœur, de la moelle osseuse et du sang. Des injections intrapéritonéales et sous-cutanées leur provoquent un sepsis, avec un état fébrile de plusieurs heures, une perte de poids et une baisse d'activité. Le porteur ne retient que des mâles, les femelles étant selon lui relativement protégées du sepsis par les œstrogènes. Il affirme avoir réduit les effectifs "à son minimum" grâce à des analyses statistiques, sans donner ni calcul ni taille de groupe pour ces 5 148 souris.
Objectifs
Le sepsis est défini comme une infection grave caractérisée par une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Touchant près de 50 millions de personnes chaque année dans le monde, le sepsis est un problème majeur de santé publique. Lors d’un sepsis, le système immunitaire est complètement déréglé, et conduit les patients à un état d’immunodépression, c’est-à-dire à une incapacité du corps à combattre une infection. Cet état d’immunodépression induit à long terme à de graves dysfonctions d’organes telles qu'une insuffisance cardiaque ou une insuffisance rénale. Notre projet a pour but d’évaluer le rôle des cellules immunitaires dans la réparation rénale et cardiaque après un sepsis. Notre hypothèse est qu’après un sepsis, les cellules immunitaires dans les organes tels que le coeur et les reins, se réorganisent dans le temps et l’espace contribuant à l’installation d'une insuffisance cardiaque et rénale. Moduler l’organisation de ces cellules dans les tissus pourrait alors permettre d’améliorer les défaillances cardiaques et rénales induites par un sepsis.
Bénéfices attendus
La plupart des avancées récentes dans le traitement des infections graves se sont focalisées sur le traitement de la source infectieuse plus que le contrôle de la réponse immunitaire. A l'heure actuelle, on observe un surrisque de maladies cardiovasculaires, d'insuffisance rénale et de cancer chez les patients qui survivent à une infection grave (pneumonie, infection urinaire, infection abdominale). Mieux comprendre le role du systeme immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'infection pourrait permettre, à court terme, un meilleur suivi de ces patients, et de dégager de nouvelles thérapeutiques à plus ou moins long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections (intra-péritonéales et sous-cutanées) pour générer l’état de sepsis et faire varier la réponse inflammatoire au cours des 14 premiers jours de la procédure. Ces injections sont peu douloureuses et sont réalisées en quelques minutes. Une chirurgie quelques jours plus tard permettra la pose sous cutanée d'une pompe osmotique sous anesthésie (durée 5 minutes). Ceci est combiné à une échocardiographie sous anesthésie en début de procédure, avant la chirurgie et au moment de la mise à mort de l’animal (3 fois 10 min) ainsi qu'à une mesure de la pression artérielle non invasive sur animal vigile chaque jour pendant 5 jours avant le début de la procédure pour habituer l’animal, puis au moment de la chirurgie et 7 jours, 14 jours et 28 jours après la chirurgie (9 fois 10 minutes). Pour les animaux élevés au sein de l'établissement, une biopsie de queue est réalisée dans les premiers jours de vie (10 à 15 jours) pour nous assurer de leur conformité génétique. Ces biopsies sont réalisées en moins d’une minute par un expérimentateur qualifié.
Impact sur les animaux
L’induction d’une infection septique induit un état fébrile qui perdure plusieurs heures. Un traitement antibiotique sera administré durant les premiers jours pour limiter la fièvre. La perte de poids et une diminution de l'activité sont des complications attendues, et reviennent à la normale en quelques jours. La mesure de la pression artérielle peut induire un stress pour l’animal du fait de la contention, ce stress sera atténué par une habituation des animaux à ce type de procédure. La pose de pompe sous la peau du dos est un acte chirurgical qui comporte peu de risques pour l’animal, mais peut occasionner une gêne pour celui-ci. Pour caractériser génétiquement les animaux du projet, une biopsie unique à la queue est effectuée 10 à 15 jours après la naissance. C’est un acte peu douloureux et qui ne met pas en jeu la survie de l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin de prelever les différents organes à analyser (rate, rein, coeur, moelle osseuse, sang).
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n’existe pour l’heure aucune autre technique que l’expérimentation in vivo pour réaliser les procédures expérimentales prévues dans ce projet. Les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permetent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction et leur effet sur le corps entier. Le modèle murin a été retenu pour sa proximité avec les situations cliniques humaines, il est régulièrement cité en référence dans les publications relatives à l’insuffisance rénale aigüe et maitrisé par les équipes scientifiques du laboratoire.
Réduction
Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux est opéré par du personnel qualifié. Les animaux sont élevés en groupe sociaux (4-5 par cage) avec enrichissement. Afin de limiter les nuisances subies par les animaux tout au long du projet, des points limites suffisamment précoces ont été établis. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel de l'animalerie et les membres de l'équipe de recherche. Afin de réduire les nuisances causées par l’induction du sepsis, une antibiothérapie sera mise en place les premiers jours. La chirurgie ser fera sur animal anesthésié et analgésié.
Choix des espèces
Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle de sepsis comporte de nombreuses similitudes par rapport à un sepsis polymicrobien abdominal chez l’Homme. L'utilisation du modèle murin pour l'étude de la réponse immunologique au sepsis est le modèle le plus couramment utilisé. Par ailleurs, les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront le fonds génétique le plus utilisé pour les modèles transgéniques. Nous utiliserons des souris mâles jeunes adultes de 4 à 8 semaines environ afin de permettre une récupération optimale. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme. Seuls des mâles seront utilisés dans ce protocole car les femelles présentent une protection relative au sepsis liée aux oestrogènes.
Etude du rôle de la microglie dans les effets anxiolytiques et neurogéniques de la fluoxétine chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
En cas de douleur manifeste ou de blessure persistant trois jours, les souris sont tuées par perfusion intracardiaque. 1 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont privées d'abri et de matériel de nidification pendant quatre à sept semaines pour induire un stress, mises à jeun dix-huit heures, aspergées de sucrose sur le dos pour déclencher une heure de toilettage intense, puis placées seules dans une cage inconnue fortement éclairée, avec deux gavages qui exposent à une blessure de l'œsophage et à une fausse route. Il s'agit de savoir si des récepteurs à la sérotonine portés par la microglie conditionnent les effets de la fluoxétine, un antidépresseur inefficace chez un tiers des patients pour des raisons que le porteur dit indéterminées.
Objectifs
La dépression et l’anxiété représentent les troubles psychiatriques les plus répandus à l’échelle mondiale, touchant environ 332 millions de personnes. Les traitements de première intention appartiennent à la famille des inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (ISRS), mais leur efficacité est très variable, et 1/3 des personnes traitées y sont insensibles pour des raisons encore indéterminées. Les ISRS, tels que la fluoxétine, augmentent les concentrations extracellulaires de sérotonine en bloquant sa recapture. Chez la souris, un traitement chronique de fluoxétine provoque à la fois une diminution de l’anxiété et des processus de plasticité dont une augmentation de la neurogenèse adulte dans l’hippocampe. Il a par ailleurs été montré que cette neurogenèse adulte est diminuée dans les modèles murins de dépression et qu’elle est nécessaire pour permettre les effets anxiolytiques de la fluoxétine. La microglie, c'est-à-dire les cellules immunitaires du cerveau, joue un rôle important dans la régulation de la neuroinflammation. En situation de stress, d’infection ou de lésion, elle adopte un phénotype pro-inflammatoire qui favorise la défense immunitaire. À l’inverse, lorsque la menace est résolue ou pour maintenir l’homéostasie, elle adopte un phénotype anti-inflammatoire qui soutient la réparation tissulaire, et favorise la neurogenèse adulte. Toutefois, une persistance de l’état pro-inflammatoire peut se produire, et un nombre croissant d’études suggère que cet état pourrait contribuer à la pathophysiologie de la dépression. Corrélativement, il a été montré que la fluoxétine peut réduire l’activation pro-inflammatoire de la microglie, suggérant une régulation de ces cellules par la sérotonine. Ce lien entre neuro-inflammation et dépression oriente la recherche vers des traitements ciblant la microglie et l’inflammation cérébrale, en particulier pour les patients résistants aux antidépresseurs classiques. La modulation de la microglie, sans supprimer son activité essentielle, pourrait représenter une stratégie pour améliorer les symptômes ou limiter les dégâts liés à la maladie. Dans ce cadre, nous nous intéresserons à des récepteurs à la sérotonine spécifiquement exprimés par la microglie. Notre projet a pour objectif de déterminer si l’expression de ces récepteurs par la microglie est nécessaire pour permettre les effets de la fluoxétine sur l’anxiété et la neurogenèse adulte.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre le rôle de la microglie, et de sa régulation par la sérotonine, dans les effets des antidépresseurs qui modulent les niveaux de sérotonine dans le cerveau. Cette étude permettra de mieux comprendre comment la sérotonine, un neurotransmetteur clé dans la régulation de l’humeur, influence la microglie, et donc d’apporter de nouvelles connaissances sur les interactions neurones - cellules immunitaires dans le cerveau. Elle pourrait également permettre d’identifier, de nouvelles cibles thérapeutiques dans la dépression, notamment pour les patients qui présentent des résistances aux traitements pharmacologiques classiques.
Procédures
Dans ce projet, des animaux âgés de 4 à 6 semaines vont recevoir par gavage oral un composé pharmacologique pour bloquer l’expression d’un récepteur dans un type cellulaire spécifique. 2 prises espacées de 48h sont nécessaires. L’acte est réalisé sur animal vigile et dure moins de 30 secondes. Les animaux seront hébergés sans enrichissement environnemental (absence d’abri et de matériel pour faire un nid) afin d’induire un stress basal modéré pour une durée totale de 4 à 7 semaines selon la procédure et seront répartis dans 4 lots différents. Dans le lot 1, ils recevront un traitement pharmacologique antidépresseur via l’eau de boisson pour une durée totale de 5-7 semaines. Au cours du traitement, ils seront soumis à 2 tests comportementaux : un qui mesure l’anhédonie (un marqueur de la dépression) sur une durée d’1 heure, et un qui mesure l’anxiété pendant une durée maximum de 10 minutes, avec 7 jours d’intervalle entre les 2 tests. Dans le lot 2, ils recevront un traitement anxiolytique par une injection unique sur animal vigile (geste durant moins de 20 secondes), et seront soumis à un test mesurant l’anxiété sur une période de 10 minutes maximum. - Dans le test d’anhédonie, les animaux sont aspergés sur le dos avec une solution de sucrose, ce qui déclenche une activité intense de toilettage pendant environ une heure, et la qualité du toilettage du pelage sera mesurée à l’aide d’un score dans l’heure qui suit, ainsi que 24h après. - Dans le test d’anxiété, les animaux préalablement soumis à un jeûne alimentaire la veille (durée du jeûne : 18 heures), sont placés individuellement dans une cage inconnue et fortement illuminée. La latence pour aller manger une croquette située au centre de la cage est mesurée sur une période de 10 min. - Dans les lots 3 et 4, les animaux seront hébergés sans enrichissement environnemental afin d’induire un stress basal pour une durée totale de 4 semaines, pendant laquelle ils recevront un traitement pharmacologique antidépresseur via l’eau de boisson, également pendant 4 semaines. Ils recevront soit une unique injection intrapéritonéale d’un marqueur de division cellulaire (geste durant moins de 20 secondes), soit 2 injections à 2h d’intervalle et réalisées de chaque côté de l’animal pour limiter les douleurs répétées au même site d’injection. Enfin, une chirurgie sans réveil sous anesthésie et analgésie sera réalisée à l’issue des 2 procédures. Ce geste dure moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’hébergement sans enrichissement environnemental, le jeûne alimentaire de 18h ainsi que le test comportemental associé à ce jeûne (test suppression de la prise alimentaire par la nouveauté) vont provoquer un stress modéré. Lors de l’administration d’un composé pharmacologique par gavage, il y a un stress lié à la contention de l’animal, un risque de blessure au niveau de l’œsophage lors de l’insertion de la sonde de gavage, et un risque mineur de “fausse route”. Le traitement pharmacologique dans l’eau de boisson peut entraîner une baisse de la consommation hydrique. L’injection IP peut générer une douleur légère et transitoire au point d’injection, avec un risque de péritonite si l’acte est répété. L'anesthésie peut induire dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire voire un arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Nous devons euthanasier les animaux à l’issue de la procédure pour pouvoir prélever leurs organes (ici, le cerveau) et réaliser des analyses qui sont nécessaires à la compréhension des mécanismes de plasticité cérébrale et du lien entre microglie et effets des antidépresseurs et anxiolytiques.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les modifications des cellules microgliales, induites par un traitement antidépresseur, sur la neurogenèse adulte et sur le comportement. De manière à réduire le nombre d’animaux utilisés, leur remplacement par une approche cellulaire est toujours privilégié, comme des cultures primaires de neurones lorsque la question scientifique posée le permet. Nous pourrions envisager de mettre en place des cultures in vitro composées de microglies (cellules immunitaires du cerveau), de neurones sérotoninergiques et de cellules souches neurales (cellules peuvent donner naissance à des nouveaux neurones), afin d’observer l’effet des antidépresseurs sur ces différents types cellulaires, mais cette méthode ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre cellules et des circuits impliqués dans les effets des antidépresseurs, surtout au stade adulte. Par ailleurs, l’anxiété est un état qui se mesure par le comportement d’un animal éveillé, qui doit pouvoir bouger ou rester immobile, et se servir de ses sens (odorat, toucher…). Au niveau cérébral, il s’agit d’un phénomène complexe faisant intervenir, via les hormones de stress, plusieurs types de cellules, dont neurones et microglie, mais on ne peut modéliser fidèlement les interactions ni in vitro ni in silico. Le travail sur l’animal éveillé est donc indispensable pour comprendre comment la microglie participe aux effets des antidépresseurs de type ISRS.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats reproductibles. Pour l’analyse des résultats, nous utiliserons des tests statistiques adéquats tels que des ANOVA pour des comparaisons multiples afin de comparer nos différents groupes de génotypes et de traitement, ou des t-test. Sur la base de résultats d’expériences et de publications utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes. Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet est de 1104 sur 5 ans.
Raffinement
Conditions d’hébergement : Dans nos expériences, les enrichissements seront retirés à l’âge de 10-12 semaines et ce pendant une durée de 4 à 7 semaines selon la procédure, pour générer un stress permettant d’obtenir un effet antidépresseur ou anxiolytique des composés pharmacologiques qui font l’objet de notre étude. Procédures : Les expérimentateurs sont sensibilisés à l’importance du bien-être animal, à la fois pour les animaux et pour la qualité des résultats. Les manipulations des animaux sont donc réalisées en limitant au maximum la douleur et/ou le stress en termes de durée et d’intensité. Avant chaque geste, l’état général de l’animal est vérifié afin de s’assurer qu’il est compatible avec la poursuite de l’expérimentation (cf points limites ci-dessous). Les administrations sont effectuées conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Concernant le traitement antidépresseur, nous avons pris l’initiative d’administrer notre traitement dans l’eau de boisson (prise hydrique volontaire de l’animal), au lieu de l’injecter par voie intra-péritonéale, ce qui diminue considérablement la manipulation des animaux et évite les actes douloureux. Concernant la perfusion intracardiaque, les animaux sont injectés avec l'anesthésique et l’analgésique dans une pièce séparée de la salle de perfusion, et apportés dans la salle juste pour la perfusion, après avoir vérifié leur état de sédation par pincement de la patte. Points limites : Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement conformément aux réglementations, et de manière rapprochée pendant le déroulement de la procédure. Des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. La détection d’une possible souffrance est basée sur un suivi quotidien (posture, aspect du pelage, poids corporel, avant/après intervention), de sorte à administrer un traitement adapté si besoin (nourriture plus appétante, injection de solution saline et/ou glucosée), et à sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites. Notamment, en cas de douleur manifeste ou blessure, persistant 3 jours, les animaux seront euthanasiés par perfusion intracardiaque pour être utilisés dans les mises au point.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent pour nos études car en tant que mammifère, son système nerveux présente des homologies importantes avec l’homme. En effet, l’organisation des structures cérébrales et des différentes voies qui les connectent sont similaires entre ces 2 espèces. Les voies sérotoninergiques ainsi que les récepteurs à la sérotonine, sont bien décrites chez la souris, et comparables avec ceux décrits chez l’homme. La souris adulte est le modèle standard pour l’évaluation des effets neurobiologiques des antidépresseurs de type ISRS et les paradigmes comportementaux sont validés. Utiliser la souris est essentiel pour garantir la comparabilité et la reproductibilité avec des études effectuées précédemment. De plus, il existe dans cette espèce des lignées modifiées génétiquement, qui permettent d’étudier le rôle de certains gènes et de certaines cellules de manière précise. On peut en effet invalider des gènes précis spécifiquement dans un type cellulaire donné et à un stade ou âge donné. Dans notre étude, les animaux auront un développement normal, puis nous induirons à l’âge de 4 semaines, l’invalidation d’un gène spécifiquement dans la microglie. Cela nous permet d’élever les animaux dans un état où les modifications génétiques sont silencieuses, sans effet, jusqu’au moment de l’expérience. Les animaux seront ensuite traités à partir de 10 semaines avec un antidépresseur, classiquement donné en médecine humaine pour soigner les troubles dépressifs et anxieux.
Formation aux gestes techniques spécifiques
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Aucune connaissance ne sort de ce projet : 600 souris sont utilisées pour entraîner du personnel aux gestes d'injection, de prélèvement sanguin et d'administration par voie orale, nasale ou trachéale. 450 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger et 150 un niveau modéré, chacune tuée dès le geste appris. Les prélèvements peuvent provoquer des hématomes, les injections une douleur locale que l'animal signale en se léchant ou en se mordant, et le porteur précise que les actes se font sous anesthésie générale sans analgésie prévue. Il affirme que les rongeurs en plastique existants ne suffisent pas, puisqu'il faut un animal vivant pour un prélèvement rétro-orbital et une souris qui respire pour qu'une instillation intra-nasale soit efficace.
Objectifs
L’objectif du projet est de former les personnes aux gestes techniques des différents types d’injections, de prélèvements et d’administration de substances par différentes voies afin d’assurer le bon déroulement des protocoles expérimentaux en termes scientifique et de bien-être animal. Il s’agit d’un renouvellement de projet. La formation sera dispensée par des personnels 'tuteurs' de l’unité bien formés à ces gestes et sensibilisés au bien-être animal.
Bénéfices attendus
La maîtrise des gestes est un prérequis pour le succès des futures procédures d’expérimentation animale du laboratoire, destinées à faire progresser les connaissances pour identifier des pistes thérapeutiques en santé humaine à moyen terme. La formation permettra aussi de faire en sorte que la manipulation des animaux soit effectuée selon les bonnes pratiques en termes de bien-être animal. Il s’agit du renouvellement d’un projet. Les bénéfices obtenus du précédent projet comprennent la formation de 3 nouveaux personnels sur contrat, 1 doctorant et de 2 personnels permanents.
Procédures
Il est prévu un prélèvement de sang (maximum 5 minutes/souris) ou une administration (maximum 5 minutes/souris) sur animaux anesthésiés ou vigiles selon le cas et les bonnes pratiques vétérinaires.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus concernent principalement les prélèvements sanguins pouvant générer des hématomes. Les injections peuvent occasionner une douleur localisée au point d’injection qui pourra être détectée si l'animal a tendance à se lécher ou se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les administrations, intra-nasale ou intratrachéales, réalisées sous anesthésie, et le gavage ne devraient causer qu’une gêne passagère. Si l’animal est en souffrance au cours de la procédure, il sera mis à mort. Il s’agit d’un projet renouvelé, sans nuisances relevées lors du précédent projet, la majorité des actes étant réalisés sous anesthésie et de gravité légère.
Devenir
Dans cette DAP ‘Formation aux gestes techniques spécifiques’ nous limitons le nombre de geste par animal, l’animal est donc mis à mort une fois la formation au geste réalisée.
Remplacement
Ce projet est à visée de formation du personnel aux bons gestes techniques expérimentaux sur la souris afin de réaliser les protocoles de recherche avec compétence. Même si des rongeurs en plastique ont été développés pour permettre certains aspects de la formation à l’expérimentation animale, leur utilisation est limitée pour apprendre la maîtrise des gestes techniques de prélèvements sanguins, d’injections ou d’administration par voie orale, intra-nasale ou intra-trachéale. En effet, l’utilisation de rongeurs en plastique n’est pas possible puisqu’il est nécessaire d’avoir un animal vivant pour réaliser un prélèvement sanguin rétro-orbital ou sub-mandibulaire, il faut que la souris respire pour que l’instillation intra-nasale soit efficace, et il faut ouvrir la bouche de la souris pour effectuer l’administration par gavage ou intra-trachéale. De plus il n’est pas possible de vérifier que le volume injecté est allé directement dans les poumons par coloration avec le bleu Evans sur un rongeur en plastique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour acquérir la maîtrise du geste. Ainsi il est estimé qu’une répétition, soit 2 fois 5 animaux par groupe, sera nécessaire. Les animaux utilisés seront issus de l’élevage ne pouvant pas être utilisés pour les projets de recherche.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être et suivis avant et pendant l’expérimentation afin d’éviter au maximum la douleur et le stress au moment de l’expérimentation. Les dommages attendus pour l’animal sont limités, les gestes se faisant sous anesthésie générale, sans analgésie prévue, et les animaux étant mis à mort juste après le geste technique ou dès l’atteinte des points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
La souris permettra l’apprentissage des gestes techniques - Les souris (consanguines ou génétiquement modifiées) âgées de 2 à 10 mois seront utilisées dans ces études. - L’établissement utilisateur où se situe notre laboratoire, utilise principalement des souris, ce qui nous donne de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, selon les références bibliographiques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (entre 2 mois et 10 mois) qui correspond à l’âge des animaux étudiés dans les protocoles de recherche.
Étude du rôle d’une protéine impliquée dans l’agressivité tumorale dans le développement du cancer de la prostate et la résistance à la castration chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
À six à dix jours de vie, les souriceaux sont séparés de leur mère pour un prélèvement de tissu de queue sur animal vigile. Ceux dont le génotype ne sert à rien sont tués aussitôt, les autres reçoivent pendant cinq jours une molécule qui inactive les gènes visés et déclenche des tumeurs de la prostate, puis une partie est castrée chirurgicalement en quinze minutes sous anesthésie. 3 656 souris vont être utilisées au total, 2 148 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 1 508 d'un niveau modéré. Elles sont tuées au plus tard un mois après la castration, avant le délai au-delà duquel le porteur reconnaît qu'une tumeur grossissante peut gêner la miction, et leur prostate est collectée.
Objectifs
Le cancer de la prostate est le cancer le plus diagnostiqué chez l’homme dans le monde et la seconde cause de mortalité par cancer. Il s’agit d’un cancer dépendant des androgènes, une hormone, qui, en se fixant à son récepteur favorisent la prolifération des cellules cancéreuses prostatiques. Ainsi, les cancers de la prostate localement avancés et métastatiques sont traités par déprivation androgénique afin de bloquer toute activation de la voie de signalisation des androgènes. Cependant, bien que ce traitement soit efficace durant les premiers mois, la majorité des patients rechutent et progressent vers un cancer résistant à la castration. A l’heure actuelle, l’efficacité des thérapies disponibles pour ces patients reste limitée. C’est pourquoi, il est urgent de rechercher de nouveaux mécanismes impliqués dans la carcingénèse prostatique et la résistance à la castration. Dans ce projet, nous proposons d’étudier le rôle d’un nouveau candidat dans un modèle murin de cancer de la prostate et dont le potentiel thérapeutique a déjà été démontré dans le cancer du sein et le glioblastome. Cette étude nous permettra de déterminer si ce candidat pourrait être une cible thérapeutique pour les patients ayant un cancer de la prostate.
Bénéfices attendus
Les thérapies actuellement disponibles pour les patients atteints d’un cancer de la prostate ont un bénéfice clinique limité. Parmi ces traitements, les inhibiteurs de protéines impliqués dans la réparation des cassures de l’ADN ont démontré une efficacité limitée en raison de la faible proportion de patients éligibles à ces thérapies et l’apparition de résistances. Mieux comprendre le mode d’action de ces protéines permettrait d’optimiser les thérapies actuelles. Dans cette étude nous souhaitons donc évaluer la contribution de l’une de ces protéines dans le cancer de la prostate.
Procédures
Procédure Expérimentale 1 : Prélèvement de tissu pour génotypage sur animal vigile de 6 à 10 jours d'une durée de 10 minutes environ, réalisé une seule fois par animal. Procédure Expérimentale 2 : Les souris adultes seront injectées avec une molécule permettant d’inactiver les gènes d’intérêt pendant 5 jours (3 minutes par souris). Si besoin, ces souris seront nourries avec de la nourriture contenant cette molécule. L’utilisation de cette molécule a pour but d’induire le développement de tumeurs prostatiques. Les souris seront mises à mort à différent temps, et la prostate sera prélévée pour des analyses au laboratoire. Procédure Expérimentale 3 : Les souris seront injectées avec une molécule permettant d’inactiver les gènes d’intérêt pendant 5 jours (3 minutes par souris). Si besoin, ces souris seront nourries avec de la nourriture contenant cette molécule, puis castrées chirurgicalement à un temps précoce ou tardif de la maladie. La chirurgie sera faite sous anesthésie et analgésie. Cette intervention dure environ 15 minutes pour chaque souris. Les souris seront mises à mort au plus tard 1 mois après castration.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue des souriceaux induit une douleur légère de courte durée au point de biopsie et peut induire un stress lié à la séparation des souriceaux de leur mère pendant les quelques minutes de manipulation. Les souris peuvent être sujettes à un stress physique lors de la contention. Le grossissement de la tumeur peut dans de rares cas générer un inconfort (notamment une gêne urinaire) à des temps tardifs (au-delà de 12 mois). Des nuisances liées à l’anesthésie à l’isoflurane pour la castration peuvent être attendues tels qu’un stress passager, l’hypothermie ou troubles de la récupération. Des effets indésirables peuvent également être observés lors des différentes manipulations : les injections peuvent entraîner une infection et la castration peut induire une infection post-opératoire. De plus, la molécule utilisée pour induire un cancer de la prostate peut conduire à un relâchement du canal inguinal, une vérification du scrotum (présence d’œdème, asymétrie, tension) sera donc réalisée pour détecter ces éventuels effets indésirables.
Devenir
A l’issue du génotypage, les animaux de génotype désiré seront dédiés au maintien des lignées, ou serviront à des expériences. Les animaux de génotype inutile seront mis à mort immédiatement après le génotypage en fin de procédure. Après induction d'un cancer de la prostate, les souris seront mises à mort selon une cinétique définie d'après notre expertise et l’étude pilote réalisée dans ce projet. La prostate sera alors collectée pour y effectuer l’ensemble des analyses nécessaires à la bonne mise en oeuvre du projet de recherche.
Remplacement
Notre projet de recherche vise à comprendre le rôle d'un nouveau candidat dans le développement du cancer de la prostate et la résistance à la castration. Une alternative pourrait être l’utilisation de modèles de culture 3D. Cependant, il est clairement défini que les communications entre le microenvironnement tumoral (cellules immunitaires diverses, fibroblastes associés au cancer…) et les cellules cancéreuses prostatiques jouent un rôle crucial dans la progression tumorale et la résistance au traitement. Cette complexité ne peut pas être atteinte même à l’aide de culture 3D puisque l’ensemble des paramètres ne pourront pas tous être réunis. C’est pourquoi, notre projet nécessite d’utiliser un modèle in vivo afin que l’ensemble de ces facteurs soient pris en compte.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires pour nos expériences a été déterminé de façon à obtenir des résultats publiables et significatifs en fonction des expériences à réaliser. Deux études pilotes seront réalisées afin d’éviter d’utiliser un protocole d’induction du cancer de la prostate non adapté et de déterminer au mieux la cinétique d’évolution des tumeurs. Une étude pilote « cinétique » nous permettra de déterminer les temps les plus intéressants à utiliser pour les analyses plus approfondies, et ainsi réduire le nombre d’animaux étudiés par lignée. Certains modèles de souris proposés dans cette étude servent de contrôles, le nombre de ces souris contrôles pourrait être revu à la baisse après plusieurs étapes de validation.
Raffinement
Durant toute la vie des animaux, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Des points limites ont été déterminés afin de soustraire les animaux à toute souffrance inutile. Une habituation des animaux sera mise en place quelques jours avant les différentes procédures expérimentales afin de limiter leur stress. Dans un souci de raffinement et dans la mesure du possible, des procédures alternatives moins invasives pourront être mises au point lors de nos expérimentations.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris est justifié par le fait que les questions scientifiques posées ne peuvent pas être étudiées dans des organismes invertébrés et que nous pouvons utiliser chez la souris des animaux génétiquement modifiés pour répondre aux objectifs scientifiques. La souris présente également une composition prostatique, un système immunitaire et des gènes similaires à l’homme. Selon les procédures, les animaux sont des nouveaux nés âgés entre 6 et 10 jours ou seront des adultes. Ils seront mis à mort selon une cinétique définie selon notre expertise. Pour la procédure de génotypage, les animaux sont des nouveaux nés agés entre 6 et 10 jours. Pour le reste, les animaux utilisés seront adultes et seront mis à mort selon une cinétique définie selon notre expertise.
Apport de la thérapie génique pour soigner le syndrome d’Usher de type 2A
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Des souriceaux âgés d'un jour reçoivent une injection dans l'oreille interne, d'autres une injection sous la rétine à trente jours, puis passent sous anesthésie des tests auditifs répétés à un, deux et trois mois, des tests d'équilibre dont un dure trente et une minutes, et seize heures d'obscurité avant l'enregistrement de leurs réponses à des flashes lumineux. 2 310 souris vont être utilisées, 60 opérées sans réveil, 210 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 2 040 d'un niveau modéré. Le porteur écrit qu'aucune dégradation de leur état n'est attendue hormis un risque limité de cataracte, alors qu'il annonce pour les deux lignées créées une surdité et des troubles visuels modérés. Toutes sont tuées entre six jours et onze mois après l'injection, pour des prélèvements post-mortem.
Objectifs
Le syndrome d’Usher est l’une des principales causes de surdicécité héréditaire chez l’enfant. Il n’existe à ce jour aucun traitement pour prévenir et/ou corriger les déficits sensoriels responsables de ces atteintes auditives et visuelles. Depuis peu, la thérapie génique est l’une des pistes explorées pour soigner ces déficits. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une telle approche dans des modèles murins du syndrome d’Usher de type 2 (USH2). Nous testerons trois stratégies de thérapie génique dans des souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables des pertes visuelles et auditives décrites dans le syndrome d’Usher de type 2A et de développer des stratégies thérapeutiques capables de prévenir et/ou retarder la maladie. A court terme : - L’utilisation d’une souris porteuse de la mutation humaine nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables de la maladie dans les cellules sensorielles de la rétine et de l’oreille interne. - Nous identifierons les méthodes les plus efficaces pour exprimer la protéine non mutée ou réparer la protéine mutée et déterminerons l’efficacité de ces stratégies pour corriger les troubles sensoriels chez nos souris déficientes. A long terme : Nous espérons avec ce travail développer des outils utilisables dans des essais pré-cliniques et cliniques afin de prévenir ou retarder la cécité et la surdité chez les patients atteints du syndrome d’Usher de type 2A. Ceci inclut : - la mise en évidence d’approches nouvelles pour le transfert de gène, - la mise en évidence de l’efficacité in vivo de l’édition de gène pour la correction de mutations spécifiques.
Procédures
Chirurgie : Les animaux seront soumis à des injections sous anesthésie et analgésie, elles seront uniques et ne dureront pas plus de 10 minutes à 30 minutes en fonction du type d’injections. Tests auditifs : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront soumises à des tests auditifs dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à 1, 2 et 3 mois. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Tests d’équilibre : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront également soumises à des tests comportementaux. Leurs déplacements seront analysés à l’aide d’un système vidéo (2 minutes). Leur capacité d’équilibre sera quantifiée par 2 tests (l’un durant 31 minutes, l’autre 2 minutes). Leur capacité d’orientation dans l’espace sera évaluée grâce à deux autre tests (10 à 60 secondes chacun). Un test de nage sera finalement réalisé (10 secondes) avant le retour en cage d’hébergement. Tests Visuels : Les souris injectées au niveau de la rétine seront soumises à des tests entre 2 et 11 mois post-injection. Elles seront placées à l’obscurité 16 heures avant leur anesthésie, puis exposées à de brefs flashes lumineux d’intensité croissante. Les réponses électriques générées seront enregistrées à l’aide d’électrodes placées sous les paupières. Des mesures seront également réalisées entre 0 et 60 minutes après désensibilisation à la lumière (exposition lumineuse intense de 3 minutes).
Impact sur les animaux
Les souris déficientes en la protéine étudiée fonctionnelle présentent des déficits visuels et auditifs modérés. Les deux nouvelles lignées de souris que nous souhaitons créer pourraient présenter des phénotypes similaires. Aucune aggravation de phénotype n’est attendue pour ces lignées. Les injections dans l’oreille interne et dans la rétine seront réalisées sous anesthésie et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en pré- et post-opératoire. Aucune dégradation de l’état des animaux n’est attendue, hormis un risque limité de cataracte. Bien au contraire, nous espérons que le remplacement ou la correction du gène muté contribuera à rétablir les fonctions sensorielles des souris injectées. En découle la liste ci-dessous des interventions après raffinement, et de leurs éventuels effets indésirables supérieurs ou égal à une piqûre d’aiguille : 1) Pour la création de deux lignées de souris transgéniques déficientes en la molécule étudiée, élevées dans un milieu fortement enrichi -> surdité et troubles visuels modérés 2) Pour les injections dans l’oreille ou sous-rétiniennes sous anesthésie et analgésie, avec soins pré- et post-opératoires -> pas de nuisance attendue du fait des injections réalisées sous contrôle stricte pré et post-opératoire.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements post-mortem à des fins d’analyses.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de la rétine ou de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus visuel ou mécanique par certains récepteurs ou cellules sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique à la rétine ou à certains neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous aurons recours à la souris dans notre projet pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la cécité ou la surdité et pour tester l’efficacité thérapeutique de traitements préventifs ou curatifs.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons retraité les données issues de souris normales et mutantes avec un outil statistique. Nous avons déterminé qu’il nous faudrait un minimum de 5 individus par groupe. Afin d’éviter un éventuel « effet cage », les souris d’une même cage seront subdivisées pour recevoir au moins 2 traitements différents. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons.
Raffinement
A) Grille d’évaluation d’un phénotype dommageable : Notre projet prévoit la création de deux nouvelles lignées de souris transgéniques. Dans la mesure où toute création d’une nouvelle lignée de souris implique de surveiller la survenue d’un phénotype dommageable, nous suivrons la « fiche d'évaluation de phénotype suite à une création de lignée » proposée par notre SBEA. Ainsi, sur un minimum de 14 mâles et de 14 femelles (issues de 4 portées distinctes), pour chacune de nos deux lignées, nous examinerons un panel de critères physiques et comportementaux à trois stades : 1) à la naissance : taille des portées, soins apportés par les mères, présence d’une poche de lait stomacale, poids, apparence, réactivité, 2) au sevrage : âge du sevrage, nombre de souris sevrées, proportion mâles/femelles, poids, apparence, réactivité, 3) à 2 ou 3 mois : poids, apparence, déplacement, posture. La survenue d’un signe clinique grave (souriceaux cyanosés, cachexie, poil hirsute, prostration, lésion cutanée ou malformation) et persistant (plus de 24h) entrainera la mise à mort de l’individu concerné. B) Enrichissement de l’environnement Chez la souris, les troubles sensoriels peuvent s’accompagner d’hyperactivité, de désorientation, de stress et de bagarres (chez les mâles). D’expérience, nous avons remarqué que pour limiter ces effets, il suffisait d’ajouter deux igloos par cage, des copeaux en carton (et non pas en coton propice aux garrots), des bâtonnets en bois à grignoter (1 par souris), et d’équilibrer le nombre d’animaux normaux et d’animaux déficients dans une même cage. Les cages doivent de plus être manipulées avec une très grande délicatesse et le moins souvent possible (moins d’une fois par jour). Les personnes amenées à intervenir sur nos cages de souris déficientes sont alertées sur les consignes à appliquer. C) Monitoring des souris en amont et en aval d’une anesthésie avec ou sans chirurgie L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des souriceaux. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront régulièrement inspectés pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans la grille d’évaluation fournie par notre SBEA.
Choix des espèces
Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’œil et de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Afin de nous rapprocher de la pathologie humaine, nous souhaitons nous focaliser sur une région du génome pour lequel un variant pathologique a été décrit. Il n’existe pas à ce jour de modèles murins impliquant précisément cette région, raison pour laquelle nous souhaitons créer deux nouveaux modèles de souris mutées pour cette région. Ces deux modèles vont nous permettre d’explorer les preuves de concept thérapeutique que nous pourrons transposer, du moins conceptuellement, chez l’homme. Les injections sous la rétine se feront sur des animaux âgés de 30 jours, soit à un stade où l’espace sous la rétine est bien formé. Les injections dans l’oreille se feront sur des souris âgées de 1 jour, soit à un stade immature où les cellules sensorielles ne sont pas encore trop affectées. La mise à mort se fera entre 6 jours et 11 mois post-injection pour évaluer les effets à court, moyen et long terme d’une correction génique.
Elevage d’un modèle de souris reproduisant la Myopathie de Duchenne
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Les souris reproductrices et les femelles non utilisées sont tuées, les mâles exportés vers un autre établissement pour y être tués et prélevés. 900 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, l'élevage d'une lignée qui développe une dystrophie musculaire proche de la myopathie de Duchenne. Aucun acte expérimental ne leur est infligé, la maladie s'installe seule : leur poids reste jusqu'à moitié plus faible que celui d'une souris saine et leur déplacement est altéré, les signes atteignant leur maximum entre huit et seize semaines. Le porteur retient la souris parce que la structure de son muscle ressemble à celle de l'humain, et précise que le laboratoire utilise aussi des cellules humaines, "très rares" et en quantité limitée.
Objectifs
Ce projet concerne l'élevage d'un modèle de souris qui développent une maladie musculaire qui mime la dystrophie musculaire de Duchenne au bout de quelques semaines. Le modèle de souris présente un muscle malade sans que des signes cliniques soient observables à la période étudiée.
Bénéfices attendus
L'utilisation des muscles de ces souris permet l'étude des mécanismes impliqués dans la pathologie.
Procédures
Aucune intervention n'est prévue, la pathologie se développe naturellement.
Impact sur les animaux
Les souris développent une maladie qui mime une dystrophie musculaire et comportent des signes physiques qui les différencient d'une souris saine. Leur poids est jusqu'à 50% plus faible mais possèdent un développement normal. Leur déplacement est normal, mais lorsqu'elles sont comparées à des souris saines, celui-ci est altéré. Les signes de dystrophie musculaire atteignent un niveau maximal entre 8 et 16 semaines et s'améliorent à partir du 8e mois. Les souris sont utilisées entre 8 et 12 semaines lorsque la maladie atteint une sévérité élevée dans la muscle. Les conditions d'élevage sont en accord avec les dernières recommandations de février 2025 concernant l'élevage de souris comportant des pathologies musculaires.
Devenir
Les animaux utilisés pour les accouplements seront mis à mort, ainsi que les femelles non utilisées. Les animaux non mis à mort seront en utilisation continue (les mâles utilisés pour les expérimentations seront exportés vers un autre établissement utilisateur en vue de leur mise à mort à des fins de prélèvement).
Remplacement
La compréhension des évènements biologiques liés à la progression de la myopathie de Duchenne nécessite des analyses ex vivo à partir d'animaux affectés par la pathologie. En effet, la pathologie n'est actuellement pas modélisable in vitro car elle implique de nombreux types cellulaires qui communiquent ensemble. Néanmoins, autant que faire se peut, le laboratoire utilise des cellules d'origine humaine, mais qui sont très rares et dont la quantité est limitée.
Réduction
Les souris sont uniquement utilisées pour prélèvements de tissus. Les prélèvements sont utilisés pour de multiples expériences jusqu'à épuisement de la ressource. La pathologie humaine touche les hommes et les analyses sont réalisées à partir des tissus provenant d'individus mâles. Cependant, toutes les mises au point expérimentales sont réalisées à partir de tissus prélevés chez les femelles
Raffinement
Les souris montrent un phénotype dommageable à partir de 12 mois et seront mises à mort à 6 mois au plus tard. Les animaux présentent un poids inférieur que les souris normales ou mdx et sont sujettes au stress. Il y aura un enrichissement de leur environnement pour limiter le stress, ainsi que des conditions de contentions spécifiques les premières semaines.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car la structure du muscle est très similaire à celle observée chez l'homme. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines, au pic de la pathologie musculaire observée au niveau du tissu musculaire.
Gestion de la production d’animaux expérimentaux de lignée NOD SCID
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Maintenir en animalerie la production d'une lignée de souris immunodéficientes, disponible pour d'autres projets : 545 souris NOD SCID vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun acte expérimental ne leur est infligé, la souffrance vient du phénotype lui-même. Leur système immunitaire génétiquement affaibli les rend vulnérables aux infections, elles peuvent développer un lymphome spontané qui limite leur vie à huit mois environ, un diabète chez certaines femelles, une perte progressive d'audition dès trois mois et des difficultés de cicatrisation. Une partie sera tuée dès qu'un point limite est atteint, les autres gardées vivantes pour la reproduction de la lignée ou versées à un projet déjà autorisé.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de maintenir la production d'une lignée immunodéficiente en animalerie avec un statut sanitaire stricte
Bénéfices attendus
Les animaux utilisés dans ce projet possèdent une particularité importante : ils ne réagissent pas contre certaines cellules étrangères qu’on leur greffe. Cela permet d’introduire des cellules provenant d’un autre animal, ou même de l’humain, sans provoquer de rejet. Cette caractéristique est essentielle pour pouvoir étudier dans de bonnes conditions le devenir de ces cellules dans le corps. Les animaux seront gardés en vie pendant une période limitée, jusqu’à un maximum de 5 mois, car au-delà, ils peuvent développer une maladie naturelle à leur état fragile. Cette précaution est prise pour garantir leur bien-être, aussi bien pour les souris utilisées à des fins de reproduction que pour celles destinées à d’autres projets expérimentaux. Ce projet permettra de maintenir cette lignée fragile dans notre animalerie, afin qu’elle soit disponible pour des recherches futures, dans un autre cadre déjà autorisé.
Procédures
Les animaux ne subiront aucune intervention directe autre que celle liée à leur phénotype particulier. En effet, cette lignée est porteuse d’un phénotype dommageable, ce qui signifie qu’elle peut développer, avec l’âge, des troubles graves comme un lymphome thymique spontané. Pour éviter cela, les animaux sont utilisés sur une période 6 mois, avant l’apparition de ces signes, et suivis cliniquement chaque jour.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans ce projet sont très fragiles. Leur système de défense est génétiquement affaibli, ce qui les rend très vulnérables aux infections. Ils peuvent aussi développer spontanément une forme de cancer du système lymphatique (lymphome) à partir d’un certain âge, ce qui limite leur durée de vie à environ 8 mois. Chez certaines femelles, du diabète peut aussi survenir, ce qui peut réduire leur capacité à se reproduire. Certaines souris peuvent développer un faible niveau de cellules immunitaires fonctionnelles, ce qui peut affecter les résultats des études si cela n’est pas surveillé. Enfin, une perte progressive de l’audition dès l’âge de 3 mois, ainsi que des difficultés de cicatrisation en cas de blessure peuvent survenir. Toutes ces fragilités sont bien identifiées et seront surveillées de près.
Devenir
Certains animaux seront mis à mort lorsqu’un point limite est attaint, afin d’éviter toute dégradation de leur état de santé. D’autres animaux seront gardés en vie, soit pour être utilisés dans un projet expérimental déjà autorisé ainsi que pour assurer la reproduction et le maintien de la lignée dans l’animalerie. Ces décisions seront prises en fonction de l’état des animaux, de leur âge, et des objectifs de suivi dans les projets associés.
Remplacement
La lignée immunodéficiente est indispensable dans ce projet car aucun autre modèle murin ni aucune méthode in vitro ne permet de reproduire ses propriétés immunologiques. Ces souris sont dépourvues de lymphocytes T et B fonctionnels, ce qui rend possible la greffe stable de cellules allogéniques ou xénogéniques (notamment humaines) sans rejet. Cette tolérance est une nous permettant l’étude des effets neurofonctionnels à moyen terme de cellules greffées dans notre région cérébrale d’intérêt. Le recours à un système in vitro ou à un autre modèle murin immunocompétent exigerait une immunosuppression pharmacologique, ce qui pourrait interférer avec les résultats que nous obtiendrons en affectant les fonctions neuronales, gliales et vasculaires. De plus, aucun modèle computationnel ou organoïde ne permettrait d’évaluer de manière fiable l’impact des cellules greffées sur l’organisme in vivo. Ainsi, la lignée immunodéficiente ne peut être remplacée dans ce projet, car elle est la seule à permettre une analyse intégrée, physiologiquement pertinente et immunologiquement stable des greffes cellulaires dans le cerveau vivant.
Réduction
La production est strictement adaptée aux besoins expérimentaux et à la fragilité de la lignée. Seuls les animaux nécessaires sont élevés, avec une planification par petites cohortes. Le nombre de reproducteurs est limité, et renouvelé régulièrement en raison de la courte durée de vie reproductive des femelles. Cette organisation permet d’éviter toute surproduction tout en assurant une disponibilité continue des animaux pour les projets autorisés.
Raffinement
Bien que le phénotype dommageable associé à cette lignée ne s’exprime pas durant la période expérimentale prévue, des mesures spécifiques de raffinement sont mises en œuvre pour anticiper toute expression subclinique et garantir le bien-être des animaux. Les souris sont hébergées en conditions barrière, dans des portoirs individuellement ventilés, sous un tatut sanitaire strict, afin de minimiser l’exposition à tout agent pathogène. Leur environnement est enrichi avec des matériaux de nidification, des cachettes et des objets à ronger, afin de réduire le stress chronique, facteur aggravant dans les lignées immunodéficientes. La densité d’animaux par cage est limitée : pour la reproduction, un maximum de deux femelles avec leur portée est autorisé. Ces conditions strictes sont indispensables pour garantir la survie, le bien-être et la validité scientifique des données obtenues chez ces animaux vulnérables. Une surveillance clinique quotidienne est effectuée, intégrant des grilles d’observation standardisées portant sur l’état du pelage, la respiration, le comportement spontané et le poids corporel. Des points limites sont définis a priori. Une euthanasie immédiate sans attendre de dégradation supplémentaire sera envisagée une fois un point limite atteint.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille, à développement rapide, modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Pour notre projet, l'utilisation d'un modèle murin est la seule approche permettant d’observer directement une corrélation entre les cellules qui nous intéresse et sa fonctionnalité. La souris est également est un modèle animal qui permet de disposer de lignées immunodéprimées, indispensables pour les séries d’expérimentation qui vont être effectuées. Celles-ci sont décrites dans une autre DAP Les souris seront mises en expérimentation après le sevrage, entre P21 et P25. La reproduction se fera entre 6 et 8 semaines d’âge, en restant attentif à l’éventuelle apparition de diabète chez les femelles, généralement observée entre 10 et 14 semaines.
Effets thérapeutiques d’une nouvelle formulation de la mémantine dans un modele murin de la maladie d’Alzheimer MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent pendant dix mois, de trois à douze mois d'âge, une eau contenant la mémantine associée à une seconde molécule, et passent trois fois deux tests de mémoire de dix minutes ainsi que trois fois un test de navigation spatiale étalé sur cinq jours. Le porteur indique isoler les souris, un stress qu'il justifie par le risque de blessures répétées voire de mort en cas d'agressivité après plusieurs mois d'hébergement en groupe. Il présente l'étude comme une preuve de concept "capitale" pour la mise sur le marché, et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'évaluer un effet sur la cognition, qui repose selon lui sur l'observation du comportement de l'animal vivant.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est la maladie neurodégénérative la plus fréquente après 65 ans, et représente un enjeu majeur en santé publique en raison du vieillissement de la population, de son impact sur les patients et leurs proches, ainsi que de son coût économique considérable. Malgré des avancées thérapeutiques, les traitements actuels restent peu efficaces, rendant nécessaire le développement de nouvelles approches plus performantes. Un nouveau traitement a été conçu en associant deux substances aux propriétés complémentaires : l’une, déjà utilisée en clinique, aide à ralentir la progression de la maladie, tandis que l’autre possède des effets protecteurs sur le système nerveux. Leur combinaison a montré un effet renforcé en laboratoire, en particulier sur la mort neuronale, et l’innovation repose sur un dosage optimisé pour en maximiser les bénéfices. Pour confirmer son efficacité, des études précliniques seront menées sur un modèle animal reproduisant les caractéristiques de la maladie, afin d’évaluer son impact sur la protection des cellules nerveuses et les capacités cognitives.
Bénéfices attendus
Cette étude constituera une première validation de l’efficacité pré-clinique de ce nouveau traitement dans un modèle animal de maladie d'Alzheimer. L’étude permettra en outre d’évaluer l’étendue de l’effet observé et la présence d’un effet dose potentiel, ainsi que des effets potentiels à contrecarrer la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer. Il s’agira d’une étude preuve de concept, capitale pour envisager le développement clinique de la molécule et aboutir in fine à la mise sur le marché de ce traitement pour l’amélioration du pronostic de la maladie.
Procédures
Tous les animaux seront exposés à deux tests de mémoire d’une durée de 10 minutes par test, trois fois pour chaque test sur toute la durée du projet. Un autre test (navigation et mémoire spatiale) nécessite plusieurs sessions de 5 minutes d’apprentissage par jour, pendant 5 jours. Ce test sera également répété 3 fois. Les traitements pharmacologiques seront administrés dans l'eau de boisson, quand les souris sont agées de 3 à 12 mois, soit pendant 10 mois. L'isolement des souris est un stress pour l'animal, mais permet d'eviter les blessures repetees voire la mort en cas d'aggressivite des souris entre elles, ce qui est tres previsible au bout de plusieurs mois d'hebergement en groupe.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux peuvent engendrer du stress lié à la manipulation des animaux et leur isolement ponctuel durant ces tests. Le traitement ne devrait pas entraîner d'effets secondaires notables, d'après les données existantes. À partir du 8e mois de vie, les souris transgéniques utilisées développent des caractéristiques pathologiques associées à la maladie d'Alzheimer. Cela inclut principalement la formation de plaques amyloïdes dans le cerveau, qui peuvent entraîner des troubles cognitifs et comportementaux. Ces troubles peuvent se manifester par des déficits de mémoire et des difficultés d'apprentissage.
Devenir
Afin d'etudier l'effet du traitement sur les marqueurs histopathologiques de la maladie d'Alzheimer,tous les animaux seront mis a mort a la suite de l'unique procedure du projet.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée, a savoir l’efficacite d’un traitement sur la cognition qui repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant.
Réduction
Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique en tenant compte de la variabilité interindividuelle. Le calcul de la taille d’échantillon indique qu’un total de 60 animaux est nécessaire, soit environ 12 animaux par groupe. Afin d’assurer la représentativité biologique et d’examiner d’éventuelles différences liées au sexe, les expériences seront faites sur une cohorte de souris males, et une cohorte de souris femelles, ainsi l’effectif sera doublé avec un total de 120 animaux soit environ 24 animaux par groupe.
Raffinement
Les conditions d’élevage seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (papier absorbant, cabanes, et/ou tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences pour l’acclimatation. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Un suivi du poids des souris et d’hydratation sera effectué de façon hebdomadaire, et une vigilance sera accrue sur la prise de boisson (pesee des biberons) pour s’assurer que le traitement ne perturbe pas la prise alimentaire et hydrique. Dans le cas peu probable ou la prise de boisson est pertubee par le traitement, un additif sucré sera ajouté à la preparation. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués pour éviter toute souffrance inutile des animaux.
Choix des espèces
L'étude utilisera l’un des modèles de souris transgeniques les plus utilisés dans la littérature pour l’évaluation de l’efficacité de traitements pour la maladie d'Alzheimer. Il est bien connue que le phénotype associé, ainsi que les lésions cérébrales typique de celle-ci, se manifestent aux alentours de 8 mois de vie et sont encore davantage prononcés à 12 mois de vie. Les animaux adultes seront testés selon une chronologie bien decrite dans la literature pour ce modele transgénique.
Évaluation d’un nouveau traitement pour protéger le foie des atteintes provoquées par des médicaments
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
624 souris mâles vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à trois injections intrapéritonéales, dont 600 microlitres de paracétamol pour une souris de 30 grammes. 96 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, 528 un niveau modéré, et toutes sont tuées pour le prélèvement du foie. Le porteur ne retient que des mâles, les femelles synthétisant le glutathion plus vite et supportant mieux le surdosage. Les bénéfices annoncés, de nouvelles pistes contre la première cause d'insuffisance hépatique d'origine médicamenteuse, sont renvoyés au long terme, alors que l'intoxication provoquée est immédiate et que le porteur qualifie le modèle animal d'"incontournable" après des essais in vitro qu'il dit déjà concluants sur hépatocytes.
Objectifs
Le paracétamol (appelé aussi acétaminophène, connu sous le nom de Doliprane) est l’un des médicaments les plus utilisés pour faire baisser la fièvre et soulager la douleur. Il est sûr lorsqu’il est pris aux doses recommandées, mais une prise trop importante peut provoquer de graves lésions du foie. Cette toxicité est liée à la formation, dans le foie, d’une substance nocive qui épuise les défenses naturelles de la cellule. Le seul traitement actuellement disponible est la N-acétylcystéine (NAC), efficace uniquement lorsqu’elle est administrée très rapidement après l’intoxication. Malgré ce traitement, le surdosage en paracétamol reste aujourd’hui la principale cause d’insuffisance hépatique aiguë. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont donc nécessaires, notamment pour agir à des stades plus avancés de la maladie. Des travaux récents ont montré que certains dérèglements des mitochondries (les «centrales énergétiques » des cellules) jouent un rôle clé dans les lésions du foie provoquées par le paracétamol. Notre équipe a développé une nouvelle molécule capable de bloquer ces dérèglements et de protéger les cellules du foie. Ce projet vise à évaluer, chez la souris, l’efficacité de ce composé comme traitement potentiel contre les atteintes hépatiques dues à un surdosage en paracétamol.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique d’un nouvel inhibiteur de cyclophilines (C105SR) dans l’intoxication au paracétamol, qui constitue la principale cause de défaillance hépatique d’origine médicamenteuse. Les résultats attendus permettront de : - déterminer l’efficacité du C105SR en termes de protection hépatique et mitochondriale, seul ou en association avec le traitement de référence (N-acétylcystéine) ; - mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la toxicité induite par le paracétamol et dans l’action protectrice du C105SR ; - identifier de nouvelles pistes thérapeutiques susceptibles d’améliorer la prise en charge de l’intoxication au paracétamol. À plus long terme, les connaissances générées pourraient également ouvrir la voie à l’exploration de stratégies innovantes de protection mitochondriale dans d’autres maladies hépatiques ou non hépatiques où le dysfonctionnement mitochondrial joue un rôle central.
Procédures
Les souris auront une administration par voie intrapéritonéale de paracétamol (ou son diluant), de C105SR (ou son diluant), et de NAC (ou son diluant), chacune d'une durée de 10 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Les souris recevront : 1) une injection intrapéritonéale de paracétamol (APAP) ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (600 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection). Le modèle d’intoxication au paracétamol utilisé dans ce projet repose sur l’administration d’une dose unique de paracétamol à des souris mâles adultes qui provoque une atteinte hépatique aiguë, caractérisée par une élévation des enzymes hépatiques plasmatiques reproduisant de manière fiable les lésions observées chez l’humain après un surdosage. La majorité des souris ne présentent que des signes transitoires et modérés (diminution d’activité, diminution de la prise alimentaire), mais une petite proportion peut montrer des signes plus marqués, comme une posture anormale ou une perte de poids. Une surveillance quotidienne sera assurée après l’administration du paracétamol par les zootechniciens et les expérimentateurs (voir grille de score) ; 2) une injection intrapéritonéale de NAC ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (360 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection) ; 3) une injection intrapéritonéale de C105SR ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (210 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie.
Remplacement
Nos travaux préliminaires ont permis de valider in vitro la capacité de l'inhibiteur de cyclophilines à protéger les hépatocytes en culture de la toxicité du paracétamol. Nous arrivons ainsi à un stade du projet où le recours à un modèle animal est devenu incontournable pour confirmer ces observations dans un organisme entier et dans un environnement physiologique complexe. En effet, à ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière fiable la complexité des mécanismes impliqués dans l’intoxication par le paracétamol, lesquels résultent d’interactions entre plusieurs types cellulaires (notamment hépatocytes et cellules immunitaires). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé comme celui permettant de démontrer une différence statistiquement significative de 30 % du paramètre étudié (aire de nécrose). Les résultats seront analysés grâce à un test statistique non paramétrique.
Raffinement
Le bien-être animal sera garanti par des conditions d’élevage appropriées, incluant le contrôle de la température et de l’hygrométrie. Les souris seront hébergées dans des locaux adaptés, avec un enrichissement systématique (papier kraft, carrés de coton pour la construction de nids, dômes en cellulose). Elles seront maintenues en groupes de 5 individus par cage, favorisant leur comportement social. Toutes les manipulations, y compris la mise à mort, seront réalisées par du personnel formé, dans le strict respect des règles éthiques et réglementaires. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les zootechniciens. Ce suivi permettra de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de stress (prostration, négligence de la toilette, blessure). Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée.
Choix des espèces
Le modèle murin d'hépatotoxicité du paracétamol reflète étroitement la physiopathologie humaine et est pertinent pour l'identification de cibles thérapeutiques potentielles. De plus, les sites actifs de CypA et CypD présentent une homologie de 100 % entre la souris et l'humain. Des souris mâles adultes (âgées de 8 à 12 semaines) seront utilisées, car les femelles sont moins sensibles au surdosage de paracétamol en raison d'un taux de synthèse du glutathion plus rapide, ce qui se traduit par une toxicité moindre de paracétamol par rapport aux mâles pour une dose donnée de paracétamol. Dans ce projet, l’objectif est d’évaluer les effets hépatoprotecteurs d’un nouvel inhibiteur de cyclophilines dans le contexte de l’intoxication par le paracétamol chez l’adulte. Pour cette raison, seules des souris adultes seront utilisées. L’âge choisi (8–12 semaines) correspond à une phase de maturité physiologique où le métabolisme hépatique est pleinement fonctionnel, ce qui permet de reproduire de manière pertinente la situation clinique observée chez l’adulte humain.
Etude d’une combinaison de transfert adoptif de lymphocytes TVd2 et de radiothérapie dans le traitement des gliomes de haut-grade chez la souris (EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Les souris utilisées sont immunodéficientes par construction, pour que des cellules tumorales humaines greffées dans leur cerveau ne soient pas rejetées. 2 676 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Selon les groupes, chaque souris subit une à trois implantations chirurgicales de trente minutes, tumeur puis lymphocytes T, et 1 341 d'entre elles reçoivent en plus jusqu'à vingt-cinq minutes de radiothérapie dans un second établissement. Toutes sont tuées à l'issue et leur cerveau prélevé pour des analyses histologiques, le porteur indiquant que le développement des tumeurs peut entraîner une perte de poids, de motricité et de sensibilité.
Objectifs
Les gliomes de haut grade, en particulier le glioblastome, sont des tumeurs cérébrales particulièrement agressives pour lesquelles les options thérapeutiques restent limitées et souvent inefficaces à long terme. De nouvelles approches sont nécessaires pour améliorer le pronostic des patients atteints de ces cancers. Ce projet de recherche vise à étudier une stratégie combinée innovante associant deux traitements : -le transfert adoptif de Lymphocytes T (LT), une immunothérapie qui consiste à utiliser des cellules immunitaires pour cibler spécifiquement les cellules tumorales. -la radiothérapie (RT), utilisée en clinique mais dont les effets peuvent modifier le comportement des cellules du système immunitaire de manière favorable. Nous souhaitons déterminer si l'association de ces deux traitements permet une réponse antitumorale plus efficace que chacun des traitements pris isolément. Pour cela, des expériences seront réalisées chez la souris dans un modèle expérimental de gliome. L’objectif est d’analyser l’évolution de la tumeur, la réponse immunitaire associée à la radiothérapie, ainsi que la tolérance des traitements combinés. Ce projet utilise un nombre minimal d’animaux pour générer des résultats robustes, et respecte les règles éthiques strictes en vigueur. Il vise à générer des données utiles pour le développement de futurs traitements combinés contre les tumeurs cérébrales. Ce projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs différents (EU1 et EU2)
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre l’hétérogénéité des gliomes de haut grade en étudiant la réponse des différentes sous-populations tumorales à une immunothérapie innovante combinée à la radiothérapie. Cette combinaison devrait améliorer l’efficacité du traitement en renforçant la destruction des cellules tumorales et en réduisant la récidive. Les lymphocytes T utilisés sont notamment connus pour avoir une efficacité accrue en présence de tumeurs irradiées. Ce projet favorisera également le développement de modèles précliniques de xénogreffes dérivés de patients plus représentatifs, essentiel à la validation de stratégies thérapeutiques personnalisées. Les résultats générés pourront guider la mise en place d’essais cliniques combinant ces traitements et contribuer à l’identification de biomarqueurs prédictifs d’efficacité, ouvrant la voie à une meilleure prise en charge des patients porteurs de gliomes de haut-grade. Enfin, notre approche permettra d’identifier les mécanismes de résistance et d’échappement tumoral, notamment dans les sous-populations les plus agressives souvent responsables des rechutes.
Procédures
66 animaux recevront une seule implantation tumorale (chirurgie + administrations sous-cutanés) (environ 30min, EU1). 936 animaux recevront une implantation tumorale (environ 30min, EU1), un protocole de radiothérapie (maximum 25min, EU2), puis une seconde implantation chirurgicale (LT, 30min, EU1). 864 aimaux recevront deux implantations tumorale (environ 30min, EU1). 405 animaux recevront une implantation tumorale (30 min, EU1), un protocole de radiothérapie (25min au maximum, EU2), puis enfin deux implantations de LT distantes (30 min x 2, EU1). 405 animaux recevront les mêmes procédures chirurgicales à l’exception de la RT, soit une implantation tumorale (environ 30min, EU1), suivie de deux implantations de LT distantes (30min, EU1).
Impact sur les animaux
Les interventions chirurgicales peuvent induire des nuisances modérées à sévères de durées moyennes (quelques jours). Les animaux, en fonction de la procédure, auront une, deux ou trois répétitions de cette nuisance. Les injections réalisées au cours de ces chirurgies entraînent une douleur légère de courte durée. La manipulation des animaux pour l’induction de l’anesthésie, mais également les déplacements éventuels, peuvent engendrer un stress léger de courte durée. Ces nuisances concernent tous les animaux et seront de courte durée. Le développement de tumeurs peut entraîner une dégradation de l’état des animaux (perte de poids, de motricité et de sensibilité).
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques post-mortem.
Remplacement
- Aucune alternative in vitro ne permet actuellement de reproduire le microenvironnement cérébral complexe des gliomes humains ni d’évaluer les effets combinés des traitements (radiothérapie + immunothérapie) sur la survie globale. - Toutes les phases de mise au point (culture cellulaire 3D et co-culture, tests de cytotoxicité) auront été préalablement réalisées in vitro pour optimiser les protocoles et limiter l’usage d’animaux vivants. Le recours à l’animal est limité aux étapes indispensables. - Exploitation de données préexistantes pour affiner les hypothèses expérimentales.
Réduction
Les approches statistiques utilisées en amont et les tests choisis en aval sont les suivants : en amont, des calculs de puissance statistique ont été réalisés, en tenant compte de la taille d’effet attendue, afin d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire par groupe pour obtenir des résultats scientifiquement robustes. Ces calculs ont été effectués pour garantir une puissance statistique de 80 % avec un seuil de significativité fixé à α = 0,05. En aval, les comparaisons de survie entre groupes seront analysées afin d’évaluer les différences significatives. Lorsque cela est possible, plusieurs paramètres seront combinés chez les mêmes animaux (ex : étude combinée radiothérapie + implantation des lymphocytes T modifiés), permettant ainsi de réduire le nombre global d’animaux utilisés tout en respectant les critères expérimentaux. Une fois l’implantation tumorale caractérisée, les effectifs des groupes contrôles seront réduits dans la mesure du possible (croissance tumorale homogène et reproductible). Les lignées tumorales humaines ont été sélectionnées de manière stratégique (hétérogénéité représentative) pour maximiser la pertinence biologique tout en limitant le nombre de modèles.
Raffinement
Maintien des animaux en conditions d’hébergement réglementaire (cages ventilées, hébergement en groupes sociaux, contrôle de la température et de l’hygrométrie, cycle jour/nuit contrôlé, nourriture et boisson à volonté, 2 éléments d’enrichissement à minima). Le transport des animaux se fera par transporteur et véhicule agréés. Le confort des animaux sera maintenu (pas de modifications des groupes sociaux, présence d’enrichissement, aliment et boisson à volonté). Les chirurgies et les irradiations seront réalisées avec les mesures les plus rigoureuses possibles pour minimiser la douleur, le stress et la souffrance : habituation à la manipulation, aseptie lors des chirurgies, analgésie systématique, anesthésie générale contrôlée, réhydratation, régulation de la température, accès facilité à l’alimentation en post-opératoire (croquettes humidifiées dans la litière). Surveillance clinique régulière (à minima 2 fois/semaine), avec un système de score pondéré permettant la détection de toute altération de l’état de santé avec prise en charge de la douleur si nécessaire (administration d'analgésiques par exemple).
Choix des espèces
Les modèles utilisés dans ce projet sont indispensables pour évaluer l’effet d’un traitement sur la progression de la tumeur car ils prennent en compte les composantes du microenvironnement cérébral qui peut altérer l’effet thérapeutique. Le développement de tumeurs humaines, permettant de conserver les caractéristiques génétiques, moléculaires et physiopathologiques et de reproduire l’hétérogénéité tumorale, nécessite l’utilisation d’individus immunodéficients afin d’éviter tout rejet de greffe ou d’immunité croisée dirigée contre les lymphocytes T. L’utilisation de tumeurs humaines est indispensable à l’évaluation des lymphocytes T modifiés qui n’existent pas chez les souris. Ces modèles déjà maitrisés dans le laboratoire permettent ainsi d’étudier l’efficacité des lymphocytes T modifiés dans un contexte reproduisant la complexité tumorale et son microenvironnement tumoral existant en clinique, tout en intégrant la radiothérapie et ainsi identifier des stratégies thérapeutiques optimales. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés d’au moins 6 semaines en début de protocole. A ce stade, le cerveau est mature ce qui facilite les gestes chirurgicaux et permet le développement de tumeurs plus reproductibles.
Entrainement et mise au point de procédures expérimentales d’échographie (EU1/2)
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Rats : 220
592 souris et 220 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 212 d'entre eux réutilisés ensuite, les autres tués. Les anesthésies gazeuses se répètent jusqu'à trois fois à un jour d'intervalle, durent jusqu'à une heure quand un cathéter veineux est posé, et atteignent dix séances quotidiennes de trente minutes chez les femelles gestantes suivies pendant les vingt et un jours de gestation. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère jusqu'à quinze minutes, ce qui peut provoquer son rejet ou son agressivité à la réintroduction dans la cage. Le porteur annonce un "catalogue de prestations techniques" destiné à former d'autres équipes, et conclut que malgré des fantômes d'agarose utilisables pour les mises au point préliminaires, le recours aux animaux reste "indispensable".
Objectifs
L’objectif de notre projet vise à prendre en charge la mise au point expérimentale de l’exploration de différents organes et phénomènes biologiques, physiologiques ou pathologiques, par échographie sur le rongeur. Une large partie de cette mise au point sera consacrée à l’exploration cardiaque où la reproductibilité des mesures est primordiale pour étudier les dysfonctions ou le vieillissement cardiaque. L’échographie sera également mise en œuvre pour la détection et le suivi du cancer (foie, pancréas, colon, sein, etc..), l’exploration du muscle (orientation, longueur de fibres, volume), l’étude de la perfusion cérébrale ou encore suivi du développement embryonnaire et du nouveau-né. Nous souhaitons également mettre au point des interventions guidées par échographie (administration et/ou prélèvement de substances dans des organes profonds) susceptibles de remplacer certaines interventions chirurgicales. La mise au point pourra aussi porter sur l’utilisation d’agents de contraste pour l’échographie (microbulles) pour mieux visualiser certaines structures ou étudier la perfusion sanguine dans de nombreuses situations. L’un des systèmes dont nous disposons permet de mesurer des différences de dureté tissulaire à l’intérieur d’un même organe et ainsi mettre en évidence de façon ultra précoce l’apparition de certaines lésions. Si cette application a été bien prise en main par les spécialistes du cancer du pancréas utilisant quotidiennement l’échographie dans le cadre de leurs recherches, nous devons la déployer sur d’autres thématiques pour la rendre accessible à des équipes non spécialistes en échographie. Notre ambition est de mettre en place un catalogue de prestations techniques aussi complet que possible et évolutif pour, in fine, pouvoir former les utilisateurs ou prendre en charge leur projet en tant qu’experts. Nous nous attacherons également à diffuser les méthodologies validées pour en faire un référentiel pour la recherche préclinique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Cette mise au point de procédures expérimentales robustes et reproductibles d’imagerie non invasive par échographie ou échocardiographie à destination de la communauté scientifique vise à faciliter l’accès au plus grand nombre à une modalité d’imagerie non invasive, peu stressante, ne nécessitant pas d’intervention lourde sur l’animal et permettant leur suivi longitudinal. Nous espérons que cette expertise apportée aux chercheurs permettra d’augmenter le recours à l’échographie en remplacement de méthodes invasives ou terminales (dissections). Ceci aura donc un impact positif sur deux critères de la règle de 3R : 1. Réduction : Suivi d’une même cohorte au cours du temps, détection plus précise (chaque animal étant son propre contrôle) afin de réduire la taille des lots d’animaux 2. Raffinement : Modalité atraumatique, générant un stress limité puisque l’animal est sous anesthésie, détection plus précoce des pathologies pour réduire la dégradation du bien être dans le cadre de modèle chronique. Raffinement de certaines procédures précédemment réalisées par chirurgie (injection de cellules tumorales dans des organes profonds comme le pancréas).
Procédures
Pour la mise au point d’exploration échographie non invasive, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse de 20 minutes maximum et cette anesthésie pourra être répétée 3 fois à 24h d’intervalle minimum. Pour la mise au point de procédures d’échographie avec injection d’agents de contraste, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum avec pose de cathéter veineux (5 minutes) avant début des acquisitions échographiques. Pour la mise au point d’interventions sous contrôle échographique, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum et, durant cette anesthésie, des injections ou des prélèvements seront réalisés (30 minutes). Pour l’optimisation du suivi du développement embryonnaire par échographie, les souris femelles non anesthésiées subiront deux injections d'hormones. Après fécondation, elles subiront une anesthésie générale gazeuse quotidienne de 30 minutes maximum, soit 10 anesthésies maximum sur les 21 jours de gestation. Toutes ces interventions pourront être réalisées alternativement ou successivement (à minimum 24h d'intervalle) dans les établissements utilisateurs (EU) 1 et 2. Les femelles gestantes pourront être transférées d'une EU à l'autre, par voie routière, sauf durant le dernier tiers de la gestation (à partir de 14 jours). Une échographie pourra être réalisée sans anesthésie sur les nouveaux nés (souris et rats) durant leurs premières heures de vie (moins de 48h) mais les nouveaux nés ne seront pas séparés de leur mère plus de 15 minutes. Le suivi pourra se poursuivre jusqu’au sevrage à raison d’une échographie par semaine maximum (soit 2 à 3 échographies par animal de 48 h à 21 jours de vie). Les explorations pourront se faire dans l'EU1 ou l'EU 2 mais aucun transfert ne sera autorisé avant sevrage.
Impact sur les animaux
L’exploration échographique du rongeur dans le cadre de mises au point techniques nécessite une anesthésie générale d’une durée relativement longue (20 minutes à 1h selon la procédure). La phase d’induction s’accompagne d’une phase d’excitation qui est un stress de faible niveau. La phase de réveil est également un moment critique. Selon la durée de l’anesthésie, l’animal peut voir sa température corporelle chuter. Il peut se déshydrater et perdre un peu de poids. Selon les modèles qui seront mis en œuvre, nous serons amenés à travailler sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) susceptibles d’entrainer stress, gêne respiratoire, difficulté de locomotion et / ou douleur. Les injections intraveineuses d’agents de contraste échographique (microbulles) pourront induire douleur locale et inflammation au niveau du site d’injection. Dans le cadre de suivis gestationnels, l’administration d’hormones (synchronisation de l’œstrus, facilitation de la mise bas) pourra se faire sur animal non anesthésié, sous contention, susceptible d’induire un stress. L’échographie néonatale, impose de séparer le nouveau-né de sa mère et du reste de la portée pour la durée de l’exploration échographique ce qui peut induire des comportements de rejet et / ou d’agressivité de la part de la mère à la réintroduction du nouveau-né dans la cage. L’anesthésie néonatale peut entrainer une dégradation des fonctions respiratoires et cardiaques, de l'hypothermie et une hypoglycémie.
Devenir
Tous les animaux adultes impliqués dans ce projet seront mis à mort à la fin de chaque projet de mise au point expérimentale échographique. Les animaux nés au cours des projets de suivi du développement embryonnaire et/ou mise au point d'injections et/ou prélèvements sous controle échographique et dont l'état général (santé et bien-être) le permettra seront proposés pour réutilisation aux chercheurs propriétaires des lignées en question et titulaires d'une autorisation de projet en cours de validité.
Remplacement
Pour certaines applications, mesure de dureté des tissus en particulier, nous pourrions avoir recours, pour les mises au point très préliminaires, à des objets mimant les tissus vivants (fantômes d’agarose) mais l’échographie est une modalité d’imagerie clinique et préclinique reposant sur les différences d’échogénicités entre les différents organes, fluides et tissus, in vivo, le recours aux animaux reste indispensable y compris dans notre démarche de mise au point expérimentale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre moyen nécessaire et suffisant pour être en mesure d’évaluer la reproductibilité de nos mesures. Ce nombre sera ré-évalué pour chaque nouvelle fonction étudiée, en fonction des spécificités de chaque projet et sur la base de recherches bibliographiques. Afin de réduire le nombre global d’animaux mis en œuvre, les animaux dont l’état de santé et de bien-être général le permet seront, autant que possible, réutilisés lorsque la procédure pratiquée ne remet pas en cause le bien-être et / ou la survie des animaux. Ce sont par ailleurs les mêmes animaux qui seront suivis au cours du temps pour mise au point d’un protocole expérimental donné. Tous les résultats obtenus seront mis à disposition des équipes de recherche pour servir d’études pilotes aux projets de recherches qui s’appuiront sur ces nouvelles méthodes. Ils leur permettront de déterminer la taille de leurs lots d’essais par une approche statistique.
Raffinement
L'imagerie échographique permet d’explorer et mesurer les organes, la circulation et la perfusion sanguine sans douleur avec un stress minimal lié à l’induction de l’anesthésie (isolement et perte de connaissance). Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (à l'aide de grilles d’évaluation et de points limites adaptés à chaque modèle) sera strictement respecté et effectué quotidiennement en concertation avec les équipes de zootechnie. Pour ceux qui devront être transférés d’un établissement utilisateur à un autre, le transfert se fera par voie routière (15 à 30 minutes) dans le respect de la charte de transport établie par notre structure. Pour limiter le stress dû au transport les animaux seront transportés dans leur cage d’origine afin qu’ils conservent leurs repères olfactifs. Lors des explorations échographiques, les animaux seront maintenus sur un support d’imagerie chauffant pendant toute la durée de l’anesthésie générale. Dans le cas des nouveaux-nés, une attention particulière sera portée au maintien de l’environnement olfactif : 1/ pendant la procédure pour réduire le stress du nouveau-né et 2/ pendant la phase de réveil pour qu’il ne soit pas rejeté par sa mère après réintroduction dans la cage. Nous travaillerons sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) mais dans le cadre de ce projet la phase la plus critique des mises au point expérimentales se situera dans les phases les plus précoces et ne devrait donc pas induire de nuisance particulière pour les animaux autres que celles en lien direct avec la méthode expérimentale. Si malgré tout nous devions voir apparaitre des signes de souffrances non soulagés par des traitements vétérinaires classiques (réhydratation parentérale, administration d’antidouleur de type morphiniques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens), les animaux seraient mis à mort rapidement. Nous veillerons à limiter autant que possible le stress subi par les animaux en employant des méthodes de manipulation les plus adaptées (préhension sans contention, maintien de l'environnement olfactif pour les nouveaux nés). Tout stress causé aux animaux serait par ailleurs rédhibitoire pour prétendre mesurer des paramètres physiologiques tels que ceux caractérisant la fonction cardiaque. Certaines injections pourront se faire sur animal non anesthésié (injection d'hormones) mais la plupart seront faites sous anesthésie générale, durant la procédure d'échographie.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de mettre au point et standardiser différentes procédures expérimentales d’échographie, d’échocardiographie et d’écho-élastographie ce qui ne peut se faire que chez l’animal vivant en l’absence de modèles in vitro appropriés. L'utilisation de rongeurs tels que la souris et le rat permet de reproduire les pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires, les cancers ou les maladies métaboliques ou encore le suivi du vieillissement. Le rat est plus particulièrement utilisé dans des applications de neurobiologie ou l’étude de la nécrose osseuse induite lors de radiothérapie du cerveau en particulier. Les rongeurs (souris et rats), grâce à leur courte durée de gestation (21 jours) sont également des modèles particulièrement adaptés pour mener des études de suivi de développement embryonnaire. L’échographie permet de détecter l’apparition de malformations éventuellement associées à certains génotypes et/ou observer le phénomène de résorption embryonnaire pouvant expliquer l’absence de certains génotypes à la mise bas (mortalité embryonnaire). Les animaux adultes seront âgés de 7 semaines minimum à réception dans nos zootechnies. Ils ne seront utilisés qu’après 5 à 7 jours de quarantaine. Les expériences seront majoritairement conduites chez de jeunes adultes de 8 à 12 semaines mais cet âge pourra varier en fonction de l’objet de l’étude (a minima après sevrage et jusqu’à 1 an). Une des procédures, qui nécessite la mise en œuvre de femelles gestantes. Ces femelles (souris et rates) seront mises en accouplement à partir de l’âge de 8 semaines. Les embryons pourront être objets de prélèvements et / ou injections guidées par échographie à tous les stades de développement donc y compris durant le dernier tiers de gestation. Les souriceaux et ratons issus de ces gestations pourront être imagés par échographie avant sevrage (de 1 à 21 jours).