Souris
Evaluation de l’inhibition pharmacologique d’un canal calcique pour traiter l’insuffisance cardiaque gauche, induite par différentes causes
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Opérées du cœur sous anesthésie pour provoquer un infarctus, équipées d'un capteur de télémétrie et parfois d'un diffuseur de médicament sous la peau, gavées chaque jour pendant une à deux semaines, 460 souris passent ensuite trois à quatre échocardiographies sous anesthésie. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré à sévère, la moitié des animaux en sévère, et une partie d'entre eux porte une mutation qui les rend obèses et diabétiques. Le porteur indique que la chirurgie de l'infarctus cause une douleur importante pendant plusieurs jours, puis que l'insuffisance cardiaque provoque une accumulation de liquide dans les poumons, des difficultés respiratoires et une perte de poids. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leur cœur.
Objectifs
Dans ce projet nous voulons évaluer l’effet du blocage d’un canal au calcium particulier, au cours de l’insuffisance cardiaque gauche ; pour cela nous utiliserons deux modèles chez la souris car l’insuffisance cardiaque a plusieurs causes : un modèle de crise cardiaque (infarctus du myocarde) et un modèle mimant le diabète et l’hypertension. L’infarctus du myocarde (IM) est un problème de santé publique majeur : le nombre de cas est estimé à 120 000 par an en France. Environ une personne sur dix décède dans l’heure qui suit l’IM et une personne sur 7 de plus dans l’année suivante. C'est une maladie qui évolue et cause des anomalies dans le rythme des battements cardiaques et/ou une insuffisance cardiaque (IC) chronique ; cela est responsable à terme du décès des patients. L’IC correspond à l’incapacité du cœur à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins de l’organisme. Cela entraine des conséquences dramatiques non seulement pour le cœur mais également pour les autres organes notamment les poumons, les reins, le foie et les muscles. Dans les cellules cardiaques, le calcium est un élément essentiel à la régulation du rythme et de la fonction cardiaque. La régulation des canaux au calcium est donc une piste pour de nouveaux traitements. Il a déjà été montré que le blocage de notre cible donnait une protection contre le développement de l’IC dans un autre modèle. Mais l’IC peut avoir de nombreuses causes, il faut donc confirmer cet effet protecteur dans des modèles différents.
Bénéfices attendus
Alors que la qualité de vie des patients atteints d'IC s'est considérablement améliorée au cours des 25 dernières années, la mortalité reste élevée. Près de la moitié des patients décèdent dans les cinq ans qui suivent le diagnostic. Les traitements actuels pour l'IC sont essentiellement des anti-hypertenseurs qui agissent sur le système neurohormonal et/ou des diurétiques qui diminuent la congestion pulmonaire : ils ne traitent pas la cause, c’est-à-dire la diminution de la fonction du cœur. En conséquence, de nouveaux traitements sont nécessaires et donc de nouvelles avancées dans le traitement de l'IC doivent être réalisées. Notre canal d’intérêt apparaît comme une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour cette maladie encore incurable. Par une approche à différents niveaux, molécule-cellule-organe-animal, ce projet contribuera à la compréhension de la fonction de ce canal dans les maladies cardiaques. Ce projet a un fort potentiel pour traduire la recherche en une meilleure prise en charge des patients en identifiant une cible thérapeutique innovante. Des inhibiteurs de notre canal cible, qui sont déjà utilisés chez les patients pour les maladies inflammatoires, pourraient ainsi rapidement servir à traiter l’IC.
Procédures
Certains animaux subiront une chirurgie au niveau du cœur, sous anesthésie générale et analgésie, pour mimer un infarctus du myocarde ; cette opération dure environ 15 minutes. Tous les animaux auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie pour implanter un capteur de télémétrie : cette opération dure environ 20 minutes ; certains seront implantés en même temps avec un mini-dispositif qui diffuse un produit pharmaceutique ; cela n’allonge quasiment pas la durée de l’opération. Tous les animaux recevront le traitement bloqueur du canal cible ou le placebo par gavage par la bouche, pendant 7 à 14 jours, une fois par jour. Cet acte nécessite une contention et prend environ 30 secondes pour chaque animal. Tous les animaux seront suivis par échocardiographie sous anesthésie ; cette procédure est non invasive, dure environ 15 minutes, 3 à 4 échographies par animal. Ils seront également suivis par électrocardiogramme grâce aux capteurs de télémétrie, de façon non invasive également ; enregistrement pendant 24h de l’animal dans sa cage, 2 fois par animal.
Impact sur les animaux
La chirurgie pour l’infarctus du myocarde cause une douleur importante immédiatement après l’opération et pendant plusieurs jours. Ensuite, le développement de l’IC implique des symptômes de la maladie : une accumulation de liquide dans les poumons qui causent faiblesse, difficultés respiratoires et perte de poids. Ces symptômes apparaissent progressivement et à des degrés de gravité variables selon les animaux. L’administration par voie orale du traitement implique un stress passager car il faut maintenir les animaux fermement pendant quelques secondes chaque jour. La chirurgie pour l’implantation des capteurs et des dispositifs de diffusion induit une douleur légère à modérée pendant 12 à 24h après la chirurgie. Un inconfort peut exister à cause de la présence sous la peau de ces deux implants, qui restent implantés 4 semaines. Du fait d’une mutation, une partie des animaux utilisés développe une obésité et un diabète (taux anormaux de glucose et d’insuline dans le sang).
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue des procédures afin de prélever le cœur ainsi que d’autres organes, pour compléter les données physiologiques par des études de biologie moléculaire.
Remplacement
Notre bloqueur du canal cible a été testé et a prouvé son efficacité dans un autre modèle d’IC gauche. Néanmoins, l’insuffisance cardiaque chez l’humain est dépendante de nombreux facteurs et peut être la conséquence de nombreuses maladies ; il est donc important de tester ce nouveau traitement dans différentes conditions et c’est pourquoi nous voulons le faire dans deux modèles dans cette étude. Au vu du niveau de complexité et de la spécialisation des cellules cardiaques, aucun système d’étude in vitro ne permet actuellement d’analyser la fonction et le dysfonctionnement cardiaque. Ainsi le recours à des modèles animaux reste impératif. Le cœur est un organe complexe, composé anatomiquement de plusieurs compartiments et physiologiquement de plusieurs tissus spécialisés. De plus, notre étude porte sur l’effet d’un traitement sur le cœur en conditions pathologiques, il est donc indispensable d’étudier le cœur intégré à l’organisme ; les modélisations par ordinateur ne sont pas suffisantes pour mimer une telle complexité. Il est donc nécessaire pour l’évaluation de la fonction cardiaque d’utiliser un mammifère entier adulte afin de s’approcher le plus possible des mécanismes physiopathologiques humains. La souris est un bon modèle car les gènes étudiés sont conservés.
Réduction
Une planification à l’aide de logiciels de statistiques nous a permis de déterminer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables, pour chaque objectif du projet. De plus, au sein d'une procédure expérimentale, les lots de souris sont soumis à diverses techniques d’études afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et maximiser le recueil de données sur les mêmes animaux. En fin d’expérimentation, les animaux seront euthanasiés et des expériences de biologie moléculaire et des études sur tissus ou cellules isolés seront effectuées afin d’optimiser les ressources à notre disposition et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux élevés au sein de l’animalerie seront pris en charge et observés de leur naissance à leur euthanasie. Les cages des animaux seront enrichies et les animaux seront suivis par un personnel spécifiquement formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles, dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Les interventions chirurgicales se font sous anesthésie générale et les animaux reçoivent une analgésie pré- et post-opératoire. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne et de pesées régulières en fonction des procédures. Une grille de score a été définie, évaluant les paramètres suivants : apparence physique, poids et état du cœur (par échocardiographie). Des points limites, en fonction du score obtenu selon cette grille, ont été décidés, menant à l’administration d’analgésie supplémentaire ou à l’euthanasie.
Choix des espèces
La souris constitue un bon modèle cardiovasculaire car c’est un rongeur possédant un cœur à 4 cavités et une physiologie semblable à l’être humain. De ce fait, cette espèce est la plus couramment utilisée comme modèle d'étude de la fonction cardiovasculaire. De plus, il a été démontré que nos protéines d’intérêt retrouvées chez l’être humain ont des fonctions similaires chez la souris. Ainsi, ces animaux représentent un bon modèle sur le plan physiologique et génétique. Des souris adultes âgées d’environ 2 mois seront utilisées car c’est à cet âge que l’IC se développe le plus rapidement. Les souris mutantes sélectionnées développent un diabète et une obésité, qui constituent des facteurs de risque importants de l’insuffisance cardiaque ; de ce fait, c’est un bon modèle pour mimer l’insuffisance cardiaque multifactorielle chez la souris.
Développement d’hépatocytes humains fonctionnels via leur amplification initiale in vivo
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris dont l'état ne peut plus être rétabli pourront être tuées avant terme, sur la base d'une grille de mesure de l'inconfort. 430 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées au plus tard huit mois après la greffe. Une partie de leurs propres cellules de foie est détruite par injection, une fois ou une fois par semaine pendant neuf semaines, puis des hépatocytes humains leur sont greffés sous la membrane du rein ou dans la rate, avant des prélèvements sanguins répétés pendant huit mois. Le porteur écrit qu'aucune nuisance n'est décrite pour cette destruction partielle du foie, et présente le projet comme un moyen de diminuer à terme le nombre d'animaux utilisés dans les tests de toxicité.
Objectifs
Les atteintes du foie ou atteintes hépatiques sont une des raisons principales du retrait de médicaments du marché et de l’échec de nouvelles molécules en développement au cours des essais cliniques. Les études pré-cliniques de toxicité hépatique et de pharmacocinétique sont des éléments essentiels pour réduire ces retraits et échecs et les conséquences médicales graves parfois observées chez les patients ainsi que pour accélérer le développement de nouveaux médicaments. Le foie est principalement constitué de cellules appelées hépatocytes dont l’une des fonctions est la biotransformation et la détoxification des médicaments et toxines. Ainsi, la culture de cellules de foie humain constitue le modèle de référence pour prédire le métabolisme et la toxicité hépatique des médicaments en développement. Cependant, leur accès est limité et ils présentent l’inconvénient majeur d’une grande variabilité entre donneurs. Ainsi, les laboratoires se tournent vers des modèles animaux ou de lignées cellulaires modifiées éloignés de la physiologie humaine. L’objectif général du projet est de développer des lignées d’hépatocytes humains hautement fonctionnels à la manière de ce que nous avons précédemment réalisé avec des cellules du pancréas actuellement considérées comme un modèle in vitro de référence des cellules sécrétrices d'insuline humaines. Afin de parvenir à cet objectif, le projet nécessite tout d’abord de mettre au point un protocole de greffe d’hépatocytes humains dans la souris. En effet l’amplification et la sélection initiale des cellules dans l’animal a été un élément décisif de la génération des lignées de cellules béta humaines fonctionnelles. Puis dans un second temps le projet consistera à générer plusieurs lignées d’hépatocytes à partir de tissus issus de patients qui seront ensuite caractérisées in vitro afin de sélectionner les lignées d’hépatocytes fonctionnels adaptées aux études pré-cliniques.
Bénéfices attendus
Le développement d’hépatocytes, les cellules actives du foie, humains et fonctionnels, aurait des conséquences directes positives sur la santé humaine tout en diminuant l’utilisation de modèles animaux. Des hépatocytes humains, représentatifs des différences de métabolisme et de toxicité des médicaments entre individus, permettraient la caractérisation fiable et précoce des nouveaux médicaments en développement, réduisant les échecs et accélérant le développement de nouvelles thérapies. De plus cette caractérisation du métabolisme et de la toxicité des molécules en développement faite sur des cellules humaines, permettrait de rendre les médicaments plus sûrs en amont des essais cliniques, augmenterait la sécurité des médicaments mis sur le marché et diminuerait les risques de toxicité chez les patients. Enfin, l’accès à de tels hépatocytes humains prédictifs diminuerait l’utilisation d’animaux dans les études de métabolisme et de toxicité. En effet, alors même que les modèles animaux utilisés en recherche pharmaceutique sont seulement partiellement prédictifs, ils sont utilisés du fait de l’absence d’une alternative. La validation de la capacité de prédiction de la toxicité et du métabolisme des cellules que nous allons générer, qui est prévue comme un objectif principal du projet, aurait pour conséquence immédiate une diminution de l’utilisation d’animaux. Finalement, ces cellules humaines fonctionnelles accélèreraient la recherche sur la physiologie des cellules du foie et sur les mécanismes des maladies du foie. Elles faciliteraient ainsi grâce à leur reproductibilité et au fait que ce soit un modèle humain, l’identification de cibles thérapeutiques.
Procédures
Un groupe de 60 animaux maximum subira une élimination partielle de leurs hépatocytes nécessitant 1 injection (30 animaux) ou 1 injection par semaine pendant 9 semaines (30 animaux), réalisées à l’état vigile. Puis ces animaux subiront des prélèvements sanguins au rythme de 1 prélèvement par semaine pendant 2 semaines puis 2 prélèvements par mois pendant un maximum de 3 mois. Ces prélèvements seront réalisés à l'état vigile. La durée individuelle de ces actes d’injection et de prélèvement est de 30 secondes. Un second groupe de 370 animaux maximum subira l'élimination partielle de leurs hépatocytes nécessitant, selon les résultats des groupes pilotes, 1 injection ou 1 injection par semaine pendant 9 semaines, réalisées à l’état vigile. Les animaux subiront ensuite la greffe d’hépatocytes humains. Cette procédure de chirurgie sera effectuée sous anesthésie et dure environ 15 minutes. Puis les animaux subiront 3 injections d’analgésique post-chirurgie (30 secondes par acte). Ces injections seront réalisées à l'état vigile. Enfin, les animaux subiront des prélèvements sanguins. Le nombre de prélèvements sera de 1 prélèvement par semaine pendant 4 semaines puis 2 prélèvements par mois pendant un maximum de 8 mois. Ces prélèvements seront réalisés à l'état vigile. La durée individuelle de ces actes d’injection et de prélèvement est de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, les souris seront soumises à une élimination partielle de leurs hépatocytes, induite chimiquement, puis à une chirurgie pour greffe d’hépatocytes humains sous la membrane qui entoure un de leur rein ou par injection dans la rate et enfin à des prélèvements sanguins et échographies afin de mesurer la multiplication des hépatocytes humains. Plusieurs nuisances liées à la procédure de greffe des hépatocytes pourraient être subies par les animaux. Il s’agit de douleur et de stress liés à la chirurgie et de gêne et/ou douleur occasionnée par la plaie. Il pourrait s’agir également d’une hypothermie liée à l’anesthésie ou d’une infection suite à la chirurgie. Par ailleurs les animaux pourraient subir une gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections. Enfin les animaux pourraient subir une gêne et du stress lors des prélèvements de sang pour le suivi des cellules implantées. Enfin, il n’y a pas de nuisances décrites induites par l'élimination partielle des hépatocytes. Il n’y a pas non plus de nuisances attendues en conséquence de la multiplication des hépatocytes humains greffés étant donné que la taille du greffon restera très modeste d’après notre expérience sur les précédents types cellulaires générés.
Devenir
Les animaux utilisés pour les études pilotes de déplétion des hépatocytes endogènes seront euthanasiés au maximum 3 mois après la procédure afin de confirmer la déplétion des hépatocytes. Ils ne pourront pas être ré-utilisés pour les expériences de greffe d’hépatocytes humains car ces greffes doivent être effectuées quelques jours après l’induction de la déplétion. Les animaux utilisés pour la greffe d’hépatocytes humains seront euthanasiés au plus tard 8 mois après la greffe, ce qui est le temps nécessaire pour permettre la croissance d’une lignée d’hépatocytes.
Remplacement
Les travaux prévus dans ce projet ne peuvent pas être transposées dans des modèles in vitro par exemple en culture cellulaire. En effet, notre expérience de génération de précédentes cellules humaines fonctionnelles montre qu’une étape essentielle est la greffe des cellules humaines dans l’animal pour une multiplication sélective de cellules qui conservent leur fonction. Ainsi, lors du développement du modèle de cellules sécrétrices d'insuline, aucune stratégie in vitro n’a permis la sélection de cellules qui maintenaient leur fonction. De plus plusieurs travaux décrivant l’immortalisation in vitro de cellules du foie humain ont été publiés par d’autres équipes, mais aucune de ces lignées de cellules n’a abouti à des cellules avec des caractéristiques fonctionnelles proches des cellules du foie, principalement en ce qui concerne leur capacité à détoxifier les toxines, ce qui empêche leur utilisation dans les études de toxicologie et de pharmacologie. Pour ces raisons, la greffe initiale des hépatocytes humains à des souris apparait indispensable pour pouvoir assurer l’obtention de cellules similaires aux cellules présentes dans le foie.
Réduction
Le principe de réduction du nombre d’animaux est appliqué dans ce projet en premier lieu via l’estimation précise du nombre d’animaux permettant de garantir l’interprétabilité des résultats. Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé par une approche statistique. Une analyse précise des protocoles publiés a également été réalisée afin de sélectionner les conditions expérimentales favorables et ainsi réduire le nombre de conditions expérimentales à comparer ainsi que le risque d’échecs et par conséquence le nombre d’animaux qui seront utilisés. Par ailleurs, le projet est construit en incluant des étapes pilotes afin d’éliminer toute utilisation inutile d’animaux. Nous procéderons ainsi lors de l’étape 1 à la comparaison de 2 modèles d'élimination partielle des hépatocytes du foie de l'animal. Seul le modèle permettant l'élimination partielle la plus reproductible sera conservé pour les étapes suivantes. Lors de la seconde étape, deux protocoles de greffe des hépatocytes seront comparés. Seul le modèle permettant la greffe reproductible sera conservé pour la troisième étape de génération des cellules à partir de foie humain. De plus, nous veillons très attentivement à ce que toutes les personnes impliquées dans le projet, que ce soit la partie animale mais aussi les parties cellulaire et biochimique de préparation des cellules et d’analyse, soient parfaitement formées aux procédures employées, ceci de façon à réduire au maximum le risque d’échecs, mais aussi de nuisance pour les animaux en ce qui concerne le travail in vivo, et ainsi le nombre d’animaux qui seront utilisés. Enfin, nous procéderons dans toutes nos étapes à une surveillance des animaux pour les nuisances possibles, de façon à les minimiser et ainsi garantir une plus reproductibilité optimale de nos résultats et conséquemment une diminution du nombre de répétitions des expériences et ainsi du nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
La démarche de raffinement de ce projet implique notamment un personnel précisément formé aux procédures afin de limiter les nuisances ou la survenue de complications, ainsi que la surveillance des nuisances possibles à toutes les étapes afin de minimiser les effets néfastes et la souffrance. Un système de mesure objective du niveau d'inconfort, de stress ou de souffrance des animaux est mis en place pour évaluer le bien-être et prendre des actions au plus tôt. Par ailleurs, différentes actions de raffinement seront également menées. Afin de réduire le stress, les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation avant de les manipuler. Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets pour enrichir leur environnement. Lors de la chirurgie, avant la procédure, les animaux recevront un traitement analgésique, puis une anesthésie générale. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera utilisé et l’animal couvert. Dans la phase de réveil, celui-ci sera placé dans une cage séparée dans un environnement également chauffé par un tapis. Sa température corporelle, son hydratation et l'absence de douleur seront suivies. Et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, un traitement analgésique sera administré en préventif pendant 3 jours. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées autour de 10 jours après la chirurgie. Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les conditions classiques et surveillé tous les jours. L’apparition d'éventuels signes d’hypothermie, de douleur, stress, perte d’activité, déshydratation ou absence de prise de nourriture, perte de poids, infection ou ulcération de la plaie sera surveillée. Si une limite prévue par le système de mesure objective est atteinte, des actions de traitement seront prises en accord avec la structure chargée du bien-être des animaux et avec le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il n’est pas possible de rétablir ou de soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée.
Choix des espèces
Le choix d'utiliser des souris est lié à l’existence de protocoles de greffe d’hépatocytes humains chez cet animal, à la disponibilité de lignées de souris immuno-déprimées qui favorisent l’implantation des cellules humaines ainsi qu’à notre expérience passée de génération de lignées de cellules humaines hautement fonctionnelles via la greffe de cellules primaires immortalisées dans des souris. Les lignées cellulaires que nous avons précédemment générées (principalement cellules béta pancréatiques) ont depuis été adoptées par plusieurs centaines de laboratoires travaillant sur le diabète ou sur la physiologie du pancréas dans le monde. La même stratégie sera appliquée ici à l’amplification et à la maturation d’hépatocytes humains pour lesquels il n’existe pas de modèle cellulaire humain complet. La procédure expérimentale de dérivation de cellules fonctionnelles n’a été testée que sur la souris rendant nécessaire le choix de la souris pour mener le projet concernant les hépatocytes. Enfin, les souris qui seront utilisées auront entre 7 et 12 semaines au moment de l’implantation des cellules ou tissus humains transduits, ceci afin que l’animal ne soit pas trop petit et pour ainsi faciliter et garantir la réussite de la procédure de chirurgie.
Rôle de DLL4 dans la fonction endothéliale et la santé vasculaire et métabolique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Le retrait des ovaires sous anesthésie, l'implantation d'une capsule hormonale sous la peau et, pour 64 d'entre elles, une lésion chirurgicale de l'artère carotide attendent 928 souris, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs vaisseaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de savoir si un traitement à base d'œstrogènes protège encore les vaisseaux après la ménopause, que la souris ne connaît pas naturellement, d'où l'ablation des ovaires. Le porteur annonce cette ablation pour les 928 animaux du projet, tout en précisant que l'étude porte sur des souris mâles et femelles. Il attribue par ailleurs au prélèvement de sang à la queue "une douleur légère au niveau de l'œil".
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause mondiale de décès. Les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins placées entre le sang et les tissus sont en première ligne face aux altérations métaboliques associées aux facteurs de risque cardiovasculaire. L’incidence de ces maladies est modulée par le sexe et le statut hormonal. En particulier, les hommes, ainsi que les femmes ménopausées — en raison de la baisse des œstrogènes — présentent un risque plus élevé de développer des maladies cardiovasculaires que les femmes non ménopausées. Ce projet vise à déterminer l’interaction entre les hormones sexuelles et un gène impliqué dans le maintien de la fonction endothéliale afin d’évaluer si certains traitements à base d’oestrogènes peuvent continuer à protéger les vaisseaux sanguins après la ménopause. Pour cela, des souris mâles et femelles chez qui un gène impliqué dans la réparation des vaisseaux spécifiquement dans les cellules endothéliale a été désactivé seront étudiées. En parallèle, afin de reproduire la baisse hormonale observée chez les femmes (puisque la souris ne présente pas de ménopause naturelle), les ovaires seront retirés à un groupe de femelles chez qui l’effet d’un traitement hormonal sera évalué. Nous allons étudier comment les différences entre hommes et femmes, ainsi que la présence ou non d’œstrogènes, influencent la forme des vaisseaux sanguins, leur capacité à se réparer et leur rôle de protection et de régulation dans le corps.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux définir les acteurs moléculaires qui pourraient être une cible thérapeutique pour limiter le développement des maladies cardiovasculaires en prenant compte le dimorphisme sexuel existant dans le développement de ces pathologies et le risque accru chez la femme au moment de la ménopause.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1-Gavage (1min) 256 animaux 2-Chirurgie de retrait des ovaires (10-15min) 928 animaux 3-Incision de la peau pour placer une capsule d'hormone à libération prolongée (5min) 928 animaux 4-Injection de molécule permettant l’évaluation de la perméabilité endothéliale (5min) 480 animaux 5-Mise à jeun : maximum 1 fois pour 12 heures effectives (phase active) (2min) 384 animaux 6-Incision de la peau et lésion superficielle de l'artère carotide (20min) 64 animaux 7-Prélèvement sanguin à la veine caudale maximum 3 fois espacé de 24h (3min) 384 animaux
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées dans ce projet sont peu invasives et indolores (pesée, jeûne) ou de classe légère (gavage, prélèvement à la veine caudale) et modérée (chirurgie de retrait des ovaires, incision de la peau pour placer une capsule d'hormones à libération prolongée et chirurgie de lésion superficielle de l'artère carotide). Elles peuvent être associées aux nuisances suivantes : Le prélèvement de sang à la veine caudale peut engendrer une douleur légère au niveau de l'oeil et un stress de la manipulation. Les chirurgies modérée peuvent entrainer une douleur localisée aux sutures, une perte de poids et un stress lié à l'opération.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus prélevés (vaisseaux) afin de regarder leur capacité à se réparer en présence ou non d'hormones.
Remplacement
L’utilisation de souris comme modèle de recherche nous permettra d’observer et de mesurer, de façon précise, les changements qui touchent les cellules des vaisseaux sanguins selon le sexe et après un traitement hormonal. Les modèles en culture cellulaire ne permettent pas de reproduire ces variations hormonales, d’autant que les cellules endothéliales cultivées perdent rapidement le récepteur aux œstrogènes. Par ailleurs, les différences liées au sexe impliquent de nombreuses hormones, organes et types de cellules qui ne peuvent pas être simulés en laboratoire dans une simple boîte de culture. C’est pourquoi l’expérimentation animale est aujourd’hui la seule méthode qui permet de mener à bien ce projet.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux pour cette étude, nous avons réalisé une veille bibliographique, tenu compte de nos expériences passées et conçu les expériences afin d’obtenir un pouvoir statistique suffisant avec un nombre minimum d’individus. Les études statistiques antérieures et publiés ont montré que des groupes de 8-10 animaux étaient requis pour obtenir une distribution normale des mesures sur des paramètres physiologiques. En effet les chirurgies étant difficiles et minutieuses, une variabilité plus grande dans les résultats est attendue.
Raffinement
Afin de limiter le stress et d'assurer le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation, des mesures de raffinement spécifiques sont mises en place concernant les conditions de logement. Les souris seront hébergées en groupes compatibles dans des cages contenant du matériel de nidification (papier, coton). Les manipulations seront effectuées de manière douce et rapide, en privilégiant les techniques de contention peu stressantes. L’ensemble du personnel est formé aux pratiques de bien-être animal et à la reconnaissance des signes de douleur ou de mal-être, permettant une prise en charge rapide en cas de besoin. Les chirurgies sont réalisées dans une salle différente de celles où ont lieu l’euthanasie et l’hébergement, afin de réduire le stress. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie. Les animaux se verront donc administrés des analgésique (morphinique) après chaque chirurgie. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance : dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessous, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement par les expérimentateurs du projet. Ce suivi aura pour but de détecter de la douleur, d’évaluer la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, il sera anesthésié puis, après perte de conscience, l’animal sera euthanasié par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle permettant une modification génétique aboutissant à une délétion du gène DLL4 spécifiquement dans les cellules endothéliales. Les animaux seront utilisés à l’age adulte (après la puberté) à partir de 7 semaines d’âge pour l’étude des hormones sexuelles et de la ménopause.
Efficacité et rémanence de nouvelles molécules à usage rodonticide
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 1020
Les rongeurs ne recevront aucun analgésique, le porteur invoquant les interactions possibles avec le métabolisme des substances testées. 1 020 rats et 510 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue pour prélever leur foie et leurs reins. Les effets attendus incluent une prostration avancée et durable, des signes hémorragiques et un arrêt de la prise alimentaire, le porteur misant sur des points limites précoces. Il s'agit de tester de nouvelles molécules destinées à tuer des rats et des souris, sur des individus porteurs ou non d'une mutation qui les rend résistants aux poisons actuels, et les deux espèces sont retenues parce qu'elles sont celles que le produit devra tuer sur le terrain.
Objectifs
Les anticoagulants antivitamine K utilisés comme rodonticides sont confrontés à 2 limites : un manque d’efficacité vis-à-vis de certains rongeurs résistants responsable d’échec de traitement et d’une persistance importante dans les tissus de rongeurs responsable d’empoisonnements secondaires. Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules à agir en tant que rodonticide, sur rongeurs porteurs ou non de mutations sur le gène VKORC1 conférent une résistance aux rodonticides actuels, mais aussi d’évaluer leur rémanence pour éviter de sélectionner des molécules trop rémanentes dans le corps du rongeur.
Bénéfices attendus
L'amélioration de l'efficacité de l'arsenal rodonticide, avec un objectif de nouvelles molécules actives sur les rongeurs résistants aux rodonticides actuels. Une diminution de l'écotoxicité par le biais de résidus de rodonticides à un niveau le plus bas possible dans les restes du rongeur, dans le but de diminuer l'impact de la consommation de ces restes sur les espèces prédatrices.
Procédures
Le gavage est une des interventions envisagées mais sera fait sous anesthésie et son usage sera limité au strict minimum. Lors de son utilisation, l'intervention aura lieu une fois par jour pendant la durée d'administration prévue de la molécule (typiquement une semaine), et aura une durée maximale de 5 minutes par animal (contention + geste technique). L'administration de vitamine K sous-cutanée quotidienne est également envisagée hors anesthésie dans le cas de l'utilisation d'une molécule antivitamine K, et cette intervention aura une durée maximale de 30 secondes par animal (contention + geste technique).
Impact sur les animaux
L’apparition de possibles effets indésirables constitués d’un état de prostration avancée et durable, de signes hémorragiques, d’un arrêt de la prise alimentaire 2 jours consécutifs ou d’eau de boisson ou d'autres signes cliniques que nous pourrions définir au cours des études. Les nuisances possibles sont celles liées à l'utilisation du gavage, diminuée au minimum, et à l'injection sous-cutanée de vitamine K1 lors d'utilisation de molécule antivitamine K. Ces nuisances sont constituées de stress, par manipulation et insertion du matériel (sonde de gavage ou aiguille), ainsi que de dommages corporels légers (trou cutané dû à l'aiguille, et possibles lésions oesophagiennes lors de gavages répétés). Les effets indésirables et nuisances des molécules testées sont inconnus, mais seront notés lors de la procédure 1 et seront pris en compte pour la procédure 2.
Devenir
Des prélèvements d'organes entiers nécessaires à la survie de l'animal (foie, rein...) étant appliqués en fin de procédure, la mise à mort des animaux est obligatoire.
Remplacement
Les stades préliminaires des études seront effectués in vitro et in silico afin de limiter le nombre d'expérimentations sur des animaux. Ces études seront faites le plus en profondeur possible sur la cible d'action des molécules pour pouvoir sélectionner moins de molécules à tester et à une dose théorique initiale la plus proche possible de la dose efficace en pratique pour éviter au maximum les répétitions d'expérimentations. Cependant l’expérimentation sur des animaux est nécessaire pour confirmer les résultats obtenus in vitro, et pour répondre aux critères d’efficacité imposés par la législation auxquels les tests in vitro ne permettent pas de répondre.
Réduction
Une approche statistique a permis de déterminer que 4 animaux par groupe-paramètre auront besoin d’être systématiquement présents afin d’avoir une puissance statistique suffisante et ainsi de pouvoir exploiter au mieux les résultats. Ce nombre sera également un maximum pour les études de la procédure 2, et sera augmenté à 5 pour les tests d'efficacité de la procédure 1 car les effets étant inconnus, la puissance statistique nécessaire est plus grande. Ce nombre par groupe-paramètre est à multiplier par la nombre de paramètres à étudier, paramètres qui seront réduits aux plus significatifs (souvent le sexe, et d'autres paramètres comme l'âge si des études précédentes ont montré un impact important sur les effets de la molécule). Les résultats des études préliminaires seront également utilisés au mieux pour limiter le nombre de molécules à tester et donc d'expérimentations.
Raffinement
Lors des tests les animaux seront conservés dans des conditions conformes à leur bien-être, et bénéficieront d’un enrichissement suffisant (abri et feuille d’essuie-main ou coton pour leur permettre de nicher). Les animaux seront laissés en groupe, afin de respecter le caractère sociable des animaux. Le gavage ne sera utilisé qu'en dernier recours et sera fait sous anesthésie à l’isoflurane ; seront préférées l'administration orale liquide par micropipette avec prise spontanée, ou l'administration orale solide dans un aliment appétent, ne nécessitant pas d’anesthésie. L’analgésie ne sera pas utilisée en raison des interactions médicamenteuses potentielles sur le métabolisme des substances actives étudiées. L’accent a donc été mis sur la prévention de la douleur par la définition de points limites le plus précocement possible.
Choix des espèces
Le choix de ces espèces vient du fait qu’il s’agit des espèces cibles. En effet les expérimentations doivent être efficaces sur les mêmes animaux que ceux faisant l’objet du contrôle en condition naturelle. Les animaux doivent être utilisés à différents stades de développement. En effet les réponses en terme d’efficacité et de résidus peuvent varier en fonction du stade de développement, l’équipement métabolique évoluant en fonction de l’âge.
Etude de l’effet de nouvelles cibles thérapeutiques dans un modèle murin de lupus érythémateux systémique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Toutes tuées à la fin pour prélever leurs tissus, 1 728 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la grande majorité en sévère. Elles appartiennent à une lignée qui développe spontanément un lupus accéléré et agressif, avec des lésions des reins, de la peau, du cœur, des poumons, des articulations et du cerveau, et reçoivent jusqu'à 182 administrations de composés et douze prélèvements sanguins pratiqués sur animal vigile. Le porteur écrit qu'un antalgique "pourra être utilisé si nécessaire" et fixe l'arrêt de l'étude vers vingt semaines de vie, selon les scores de maladie. Il justifie l'espèce par un chiffre de "99 % de similitude" entre les génomes humain et murin.
Objectifs
Le lupus systémique est une maladie auto-immune (dysfonctionnement du système immunitaire qui conduit ce dernier à s’attaquer aux constituants normaux de l’organisme) qui touche moins d'une personne sur 2000 en Europe et 4 à 178 personnes pour 100 000 habitants au niveau mondial. Elle touche plus souvent les femmes jeunes (9 femmes pour 1 homme, entre 15 et 44 ans). Plus rarement, le lupus est diagnostiqué chez l’enfant ou le sujet âgé de plus de 50 ans. Les maladies auto-immunes systémiques affectent plusieurs systèmes ou organes, dans lesquels les symptômes sont multiples, variés et peuvent être différents d’un patient à l’autre: fatigue, douleurs, gonflements articulaires, lésions cutanées, atteinte des cellules sanguines, atteinte rénale... Aujourd’hui, on ne guérit pas définitivement d’un lupus, les traitements existants soignent poussées et complications, et préviennent leur apparition. L'objectif de notre projet est d'étudier de nouvelles molécules thérapeutiques à visée anti-inflammatoire permettant de diminuer ou d’inhiber le développement de la maladie par l'intermédiaire d'une lignée de souris génétiquement modifiée qui développe spontanément une maladie auto-immune semblable au lupus érythémateux systémique humain.
Bénéfices attendus
Il n'existe pas encore de traitement permettant une guérison du lupus érythémateux systémique. Le traitement des poussées du lupus systémique est adapté à chaque cas. Le choix des médicaments utilisés dépend de la localisation des atteintes d’organes et de leur gravité. Le traitement actuel a plusieurs objectifs : traiter les poussées du lupus et les éventuelles complications (dues à la maladie ou à un traitement prescrit pour une précédente poussée) ; prévenir les rechutes, en obtenant des rémissions parfois très longues ; préserver la qualité de vie. Ce projet a pour but de tester de nouveaux médicaments à visée anti-inflammatoire permettant de diminuer ou d’inhiber le développement de la maladie, qui pourront être proposés en essais cliniques à court terme. Au long terme, ce projet permettra de proposer de nouvelles thérapies et améliorer la qualité de vie des patients atteints.
Procédures
Prélèvements de sang : maximum 12 prélèvements (1 fois par semaine maximum, 30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/souris). Administrations de composés : maximum 182 administrations (30 secondes/souris ; dans le cas de 2 administrations/jour pendant 13 semaines cela représente 182 administrations maximum).
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie qui va débuter vers la 12ème semaine de vie des animaux. Les souris MRL/MpJ-Faslpr/J développent une maladie lupique accélérée et agressive, caractérisée par des lésions immunitaires des reins, de la peau, du coeur, des poumons, des articulations et du cerveau. La douleur pourra générer une perte de poids. Cette perte de poids sera quantifiée par des scores attribués quotidiennement (pesée quotidienne). L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire la maladie (douleurs inflammatoires). Le gonflement des ganglions durant le developpement de la maladie pourra induire une petite gêne au niveau de la mobilité. D’après la littérature, à 20 semaines 100% des femelles présentes une lymphadénopatie (hypertrophie ganglionnaire) contre 23 semaines pour les mâles. L'étude sera arrêtée en fonction des scores du développement de la maladie (à environ 20 semaines de vie des animaux).
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever des tissus biologiques permettant de réaliser des analyses pour vérifier l'efficacité des candidats médicament sur la maladie.
Remplacement
Dans ce projet nous mettons en place un modèle de lupus érythémateux systémique (LES) qui va se développer spontanément chez des souris génétiquement modifiées afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies dans le cadre d’une monothérapie/combinaison thérapeutique. Ces nouvelles thérapies sont en premier lieu testées et validées sur des lignées cellulaires afin de sélectionner les doses à appliquer in vivo pour l'étude d'efficacité. Cette approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Cependant, les méthodes substitutives à l’expérimentation animale ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament, test nécessaire avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est pour le moment à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires bien que des modélisations tridimensionnelles in vitro des systèmes nerveux et immunitaire de la peau notamment soient en cours de développement actuellement. Les évolutions futures de ces modèles permettront d’obtenir une vision aussi complète que possible des influences réciproques entre système immunitaire et système nerveux sensoriel.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Par conséquent, 12 animaux/groupe maximum seront necessaires.
Raffinement
Un suivi et scoring journalier quotidien sera effectué. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Des croquettes humides ou de l'hydrogel pourront être ajoutés en cas de surveillance renforcée (surveillance 2x/jour). Un antalgique pourra être utilisé si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. Les différences génétiques entre l'homme et la souris sont minces. Les deux espèces possèdent environ 30.000 gènes, dont seulement 300 sont spécifiques à l'un ou l'autre organisme. Il y a donc 99% de similitude génome Humain et celui de la souris. Seulement 1 % des gènes murins n’a aucun équivalent chez l’homme et il existe de grandes analogies entre les deux espèces dans les systèmes et leur fonctionnement ce qui montre que nous avons un ancêtre commun. C'est l’animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique suite à ces découvertes génétiques. De nombreuses études précliniques sont réalisées notamment sur le modèle de Lupus comme décrit dans la litterature Les animaux pourront rentrer dans une étude à partir du stade adulte (à partir de 8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les animaux sont intégrés à l’étude à partir de 8 semaines afin de se situer avant le développement spontané des signes cliniques, ce qui permettra d’avoir une vision sur toute la période d’évolution de la maladie, mais également de faire voyager les animaux avant le développement du phénotype dommageable (les animaux venant de l’étranger). L’étude commencera après minimum 6 jours d’acclimatation.
Evaluation de nouvelles molécules thérapeutiques dans des modèles expérimentaux de polyarthrite rhumatoïde chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections dans l'abdomen et sous la peau tous les trois à quatre jours pendant cinq semaines, puis des prélèvements sanguins sous anesthésie tous les quinze jours pendant trois mois, le temps qu'une arthrite se développe dans leurs articulations. Le bénéfice annoncé reste un modèle murin destiné à évaluer plus tard des traitements ciblés, aucun essai clinique n'étant en vue. Sur le remplacement, le porteur décrit des tests sur cellules isolées suivis d'un passage chez l'animal, et présente la souris comme le modèle approprié pour observer la coopération cellulaire dans un "organisme entier".
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune caractérisée par une inflammation au niveau des articulations aboutissant à la déformation des articulations et, à terme, une perte de qualité de vie des patients. Certaines personnes sont plus à risque de développer cette maladie, notamment celles qui possèdent un certain type d’anticorps. Ces anticorps apparaissent parfois avant les premiers symptômes et sont liés aux formes les plus sévères de la maladie. Les traitements actuels sont basés sur l’immunosuppression : ils freinent l’ensemble du système immunitaire pour limiter l’inflammation. Mais cela peut aussi affaiblir les défenses naturelles du corps, augmentant le risque d’infections graves. Notre équipe développe une nouvelle approche : cibler uniquement les cellules immunitaires responsables de la production de ces anticorps particuliers, sans toucher aux autres cellules immunitaires. Pour cela, il est essentiel de tester ces thérapies sur des modèles expérimentaux fiables. Notre projet consiste à développer un nouveau modèle murin reproduisant les caractéristiques de la PR, notamment la présence de ces anticorps. Ce modèle unique nous permettra ensuite de tester avec une plus grande fiabilité des traitements innovants qui ciblent uniquement les cellules malades, pour une approche plus précise, plus efficace et avec moins d’effets indésirables.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mettre en place un nouveau modèle murin d’arthrite, reproduisant la pathologie humaine, avec la présence des anticorps spécifiques à cette maladie. Ce modèle unique permettra d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cellules pathogènes spécifiquement pour limiter les effets secondaires des traitement actuels.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs injections intra-péritonéales (
Impact sur les animaux
Douleur légère due aux injections intrapéritonéales et sous-cutanées. Douleur modérée due au développement de l’arthrite ou à une réaction immunitaire exacerbée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures pour analyser les cellules immunitaires présentes et l’impact des molécules testées sur les cellules exprimant/sécrétant les anticorps spécifiques de la pathologie.
Remplacement
Nos recherches visent à trouver de nouveaux traitements pour la polyarthrite rhumatoïde, une maladie où le système immunitaire attaque les articulations. Nous cherchons à développer des thérapies capables de cibler et détruire uniquement les cellules du système immunitaire qui fabriquent les anticorps responsables de ces attaques. D’abord, nous testons ces approches en laboratoire sur des cellules isolées (in vitro). Les plus prometteuses seront ensuite testées sur des modèles vivants (in vivo) pour vérifier leur efficacité avant d’envisager des essais sur l’humain. Pour cela, nous devons créer des modèles expérimentaux qui reproduisent le système immunitaire humain, y compris les cellules qui provoquent la maladie. Ces modèles permettront ensuite d’évaluer concrètement les nouvelles molécules thérapeutiques que nous aurons sélectionnées.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé avec un logiciel adapté pour nous permettre d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Seules les molécules ayant démontré une activité in vitro seront évaluées in vivo, afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les animaux seront observés régulièrement selon de nombreux critères : paramètres comportementaux et perte de poids. Le développement de l’arthrite sera suivi 3 fois par semaine pour évaluer le bien-être animal et adopter les mesures de raffinement appropriées. Un enrichissement des cages sera réalisé en utilisant des copeaux de litière et des igloos, et de la nourriture humidifiée dans la cage.
Choix des espèces
La souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Ces modèles permettent d’évaluer l’effet des molécules développées, leur efficacité sur les pathologies mais également l’identification d’effets secondaires potentiels. Les souris doivent être utilisées à l’âge adulte pour avoir un système immunitaire mature.
Elucider le rôle des interactions neurogliales dans le remodelage du canal central en contexte neuro-inflammatoire chez la souris adulte
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
768 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir une toxine bactérienne sous la peau, cinq injections quotidiennes d'un composé, une chirurgie de trente minutes pour injecter un virus dans les ventricules du cerveau et quatre heures de test de la miction, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique que le lipopolysaccharide déclenche un état de maladie avec anorexie, somnolence et évitement social, qui culmine six à dix heures après l'injection, et classe la poutre d'équilibre et le tapis roulant parmi les tests les plus stressants. 624 souris sont tuées pour prélever leur moelle épinière, 144 autres partent vers d'autres projets ou vers la reproduction. Les retombées annoncées, des biomarqueurs dans le liquide céphalo-rachidien et des stratégies protégeant la barrière de la moelle épinière, sont renvoyées au moyen et au long terme.
Objectifs
Le canal central de la moelle épinière est bordé par une barrière qui régule les échanges entre le liquide céphalo-rachidien (LCR) et le tissu nerveux environnant. Cette interface est en contact étroit avec plusieurs types de cellules spécialisées. Lors d’épisodes neuro-inflammatoires, la structure et la perméabilité de la barrière peuvent être altérées, ce qui risque de modifier la composition du LCR, de perturber la communication entre les cellules nerveuses, et d’entraîner des troubles des fonctions sensorimotrices et autonomes, par exemple le contrôle de la vessie. Les mécanismes de plasticité de cette barrière restent encore largement méconnus, en particulier dans un contexte inflammatoire. Mieux comprendre comment cette interface se remodèle et interagit avec les cellules nerveuses est essentiel pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et mieux prendre en charge les patients présentant des troubles des fonctions autonomes (par ex contrôle de la vessie) liés à une inflammation de la moelle épinière. Notre projet a pour objectif de déterminer comment une inflammation induite par une toxine bactérienne, le lipopolysaccharide (LPS) modifie la morphologie et le fonctionnement de cette barrière. Nous chercherons à déterminer quels changements cellulaires et moléculaires surviennent au niveau de cette barrière et quelles sont les conséquences sur la dynamique du LCR et la régulation des fonctions sensorimotrices et autonomes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre la plasticité de la barrière qui régule les échanges entre le liquide céphalo-rachidien (LCR) et le tissu nerveux environnant en contexte neuro-inflammatoire. À court terme, les travaux permettront de caractériser les modifications cellulaires, moléculaires et fonctionnelles (miction (action d'uriner), locomotion) induites par une inflammation aiguë, grâce une combinaison d’approches techniques. À moyen terme, les résultats permettront d’identifier de nouvelles cibles susceptibles d’être mobilisées pour restaurer ou protéger l’intégrité de la barrière. L’étude des conséquences fonctionnelles, notamment urinaires et locomotrices, apportera des éléments déterminants pour comprendre la genèse de symptômes observés dans les pathologies inflammatoires de la moelle épinière, telles que la sclérose en plaques ou les myélites. À long terme, ce projet contribuera à la mise en évidence de biomarqueurs dans le LCR permettant de suivre l’évolution et la réponse aux traitements des affections inflammatoires de la moelle épinière. Les connaissances acquises ouvriront également la voie à des stratégies thérapeutiques visant à limiter les effets délétères de l’inflammation et à favoriser la régénération tissulaire.
Procédures
# Injection-sous cutanée d’une toxine bactérienne (LPS) : moins d’une minute. # Injections sous-cutanées d’un composé pharmacologique une fois par jour pendant 5 jours : moins d’une minute. # Injection d’un virus (non pathogène) dans les ventricules du cerveau sous anesthésie : chirurgie 30 minutes ; surveillance après l'opération : 1h ; l’animal est en dehors de la zone de stabulation pendant 2 à 4h. # Prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie (acte terminal) : 15 minutes. # Injection d’un traceur dans les ventricules du cerveau sous anesthésie (acte terminal) : 15 minutes. # Test comportementaux : - Etude la miction : 4h. - Activité locomotrice spontanée : 40 minutes. - Poutre d’équilibre : 3/5 x 5 minutes. - Tapis roulant : 30 minutes.
Impact sur les animaux
1\ L’injection aigue de lipopolysaccharide est classiquement utilisée pour induire une neuro-inflammation aiguë chez les animaux. Ce traitement engendre un état de maladie transitoire dont les symptômes (anorexie, hyper ou hypothermie, inactivité, somnolence, évitement social, …) culminent à 6-10h post injection et se résolvent en 24h. 2\ Les injections sous-cutanées quotidiennes d'une substance pharmacologique pendant cinq jours consécutifs peuvent provoquer du stress et de l’inconfort en raison des manipulations répétées. 3\ Les interventions chirurgicales (injections dans les ventricules du cerveau) menées sur les animaux sont susceptibles de générer des douleurs et du stress après l'opération. La chirurgie proprement dite durera environ 30 minutes et le suivi immédiat durera au minimum 1 heure. 4\ Les tests comportementaux peuvent également induire du stress lié à la nouveauté de l’environnement et à la manipulation des animaux. Chaque test induit un stress plus ou moins important selon sa nature (par exemple, l’étude la miction ou la mesure de l’activité locomotrice spontanée sont peu stressantes alors que la poutre d’équilibre et le tapis roulant sont plus stressants). 5\ Afin de mettre au point la caractérisation génétique des animaux transgéniques utilisés dans notre projet, nous allons réaliser des biopsies de queue ce qui engendrera un stress et une douleur au niveau de la queue des animaux.
Devenir
624 souris seront mises à mort pour prélèvement de la moelle épinière et analyses. La moitié des souris (ie 144 souris) qui auront été caractérisées génétiquement sont inclues dans les 624 souris qui seront mises à mort et l'autre moitié (ie 144 souris) sera ré-utilisée dans d'autres projets ou pour de la reproduction.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier la plasticité de la zone de la moelle épinière qui est à proximité du liquide céphalo-rachidien (LCR) en contexte neuro-inflammatoire et ses conséquences sur différentes fonctions de l’organisme telles que la fonction urinaire et la fonction locomotrice. Ces phénomènes impliquent des interactions complexes entre les différents types cellulaires et la circulation du LCR qui ne peuvent être reproduites ni in vitro, ni informatiquement. De plus, la fonction urinaire et la fonction locomotrice ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants. Ce projet ne peut pas être réalisé chez l’Humain puisque nous avons besoin d’extraire les moelles épinières pour nos analyses. L’utilisation de la souris, espèce pour laquelle il existe de nombreux outils génétiques adaptés à nos objectifs, est donc indispensable.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés soit à partir de notre expérience, soit à partir d’analyses de puissance statistique afin de limiter au maximum le nombre d’animaux. Les animaux engagés dans les tests comportementaux (miction et locomotion) seront ensuite utilisés pour des analyses post-mortem maximisant ainsi les données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages collectives (2-4 animaux par cage) et enrichies (maison, buchettes, tunnel, …). Nous leur fournirons une grande quantité de matériel de nidification quelques jours avant l’injection de la toxine bactérienne (LPS) afin qu’ils puissent avoir des zones de température différentes au sein de la cage. Après l’injection de LPS, ils auront accès à des friandises et/ou du gel nourrissant et/ou des croquettes mouillées en plus de leur nourriture habituelle. Toutes les injections (hormis les injections dans les ventricules du cerveau) se feront par voie sous-cutanée afin d’éviter la voie intrapéritonéale, plus douloureuse et moins reproductible. Toutes les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie appropriée avec analgésie systématique par du personnel expérimenté. Pour limiter le stress et l’inconfort liés aux injections sous-cutanées quotidiennes de composés pharmacologiques sur cinq jours, nous essaierons de mettre en place l’administration volontaire par micro-pipette (composé dilué dans une solution appétente). Pour les tests comportementaux, les animaux seront habitués à la pièce / cage d’expérimentation la semaine précédant les tests (3 séances de 30 min – 1h). Nous ferons attention à ce que les animaux soient toujours en présence d’odeurs familières (litière de leur cage d’origine).
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus pertinente pour notre étude car (1) ce modèle est largement maîtrisé au sein de notre équipe et au laboratoire, et (2) notre projet repose sur l’utilisation de lignées transgéniques spécifiques permettant le marquage ou la manipulation ciblée de différents types cellulaires. L’existence d’outils génétiques adaptés chez la souris permet d’atteindre nos objectifs expérimentaux avec précision tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires. Les animaux utilisés seront des souris adultes (60-90 jours) au démarrage de l’expérimentation. Le choix de ce stade de développement est guidé par la volonté de réaliser des expériences chez la souris adulte, post-pubertaire.
Caractérisation des barorécepteurs aortiques et implication dans l’hypertension induite par les maladie rénales chroniques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Choisies à six à dix semaines parce que la graisse et le tissu fibreux des animaux plus âgés gêneraient la visibilité sous échographie, 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un marqueur neuronal leur est injecté à la microseringue près de la crosse aortique sous anesthésie, geste dont le porteur reconnaît le risque de pneumothorax, puis un régime enrichi en adénine leur provoque pendant vingt-huit jours une maladie rénale accompagnée d'une altération de l'état général et d'une perte de poids. Cinq à six semaines après l'injection, elles sont tuées pour prélever leurs organes et mettre leurs neurones en culture. Sur le remplacement, le porteur affirme que les alternatives non animales n'existent pas pour étudier la communication entre le sang et le cerveau.
Objectifs
L'insuffisance rénale chronique touche près de 700 millions d'adultes dans le monde, avec des taux plus élevés dans les pays les plus développés. Les complications liées aux maladies rénales chroniques incluent notamment l’hypertension artérielle, qui est la cause principale des maladies cardiovasculaires et des décès prématurés dans le monde. Les patients atteints de la maladie rénale chronique souffrent également de nombreuses complications neurologiques, notamment d'anxiété, de dépression, d'anomalies motrices, de troubles du sommeil et de troubles cognitifs. Il a été montré que la maladie rénale chronique, à la fois chez les patients et dans les modèles murins de cette maladie, entraîne des dysfonctionnements des mécanismes de régulation de la pression artérielle. Ces mécanismes réflexes modulent le diamètre des veines et des artères, ainsi que le rythme et la contractilité cardiaque, afin de contrôler la pression sanguine. La détection de la pression artérielle est initiée par des neurones dont les terminaisons, sensibles à l’étirement des vaisseaux sanguins, se situent dans des structures particulières des grosses artères : les sinus carotidiens (au niveau du cou) et la crosse aortique (à la sortie du coeur). Cette sensibilité à l’étirement leur est conférée par l’expression de protéines similaires à celles qui sont impliquées dans le toucher et dont notre équipe est spécialiste. Notre projet vise donc à caractériser les spécificités fonctionnelles et moléculaires des neurones aortiques chez la souris en conditions physiologique, et leurs modifications dans le modèle de la maladie rénale chronique. Nous pourrons ainsi évaluer si ces modifications participent à l’hypertension observée dans la maladie.
Bénéfices attendus
Notre étude pourrait être à l'origine de l'identification de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la régulation de la pression artérielle. L’utilisation du modèle de maladie rénale chronique nous permettra de mieux comprendre comment les neurones à l’origine de la régulation de la pression artérielle sont affectés au cours de la maladie et de déterminer si ceux-ci peuvent être à l’origine de l’hypertension qui accompagne les maladies rénales chroniques. De là, pourra être envisagé le développement de nouvelles stratégies pharmacologiques.
Procédures
1) Injection guidée par échographie de marqueurs dans la crosse aortique. Les souris seront anesthésiées pour être positionnées sous l'échographe. Pour éviter toute douleur liée à l’injection, nous administrerons préalablement un analgésique par voie sous-cutanée. La zone d’injection sera épilée puis désinfectée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante permettant le suivi de paramètres cardiorespiratoires ainsi qu’un suivi de la température. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de la procédure. A l'aide d'une microseringue, nous injecterons aux environs de la crosse aortique 1 microlitre d'une solution contenant un marqueur neuronal. La procédure durera 15 à 20 minutes maximum. En fin de procédure l’animal sera réveillé, placé dans une pièce de surveillance post-examen, chauffé, avec eau et nourriture. 2) Visualisation du marquage de la crosse aortique. 4 à 5 jours après l’injection, les souris seront anesthésiées pour vérifier la présence d’un marquage au niveau de la crosse aortique grâce à un appareil d'imagerie in vivo. La manipulation durera 10 min maximum. 3) Les animaux seront soumis à un régime alimentaire spécifique induisant le modèle de maladie rénale (28j). 4) 5 à 6 semaines après l’injection, les souris seront mises à mort pour prélever les organes et procéder à des cultures de neurones et prélèvement d’organes.
Impact sur les animaux
Les risques sont liés à 1) l’anesthésie : stress de la manipulation, déshydratation, détresse respiratoire et perte de poids ; 2) à l'injection bien que celle-ci soit guidée par échographie : risque de pneumothorax (douleurs diffuses et intenses dans la région du thorax, difficultés à respirer, respiration très rapide, faiblesse générale) et risque d’infection au point d’injection. Il n'y a aucun effet indésirable lié aux molécules injectées. L’induction d’une maladie rénale par un régime spécifique provoque une altération de l’état général et un stress de l’animal qui peut se manifester par une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure. Les organes seront prélevés pour réaliser des analyses et des cultures neuronales.
Remplacement
Le marquage des neurones de la crosse aortique ne peut se faire que sur des animaux vivants. Les marqueurs neuronaux fonctionnent chez la souris. Les alternatives non animales n'existent pas. Nous étudions une communication entre organes : le système sanguin et le cerveau, qu'il est impossible de modéliser in vitro ou à l'aide de modèles informatiques. Cette étude ne peut pas être faite chez l'humain.
Réduction
Comme évalué dans des études préliminaires concernant l’injection guidée sous échographie et le modèle murin de maladie rénale chronique, des lots de 35 et de 20 animaux sont nécessaires afin d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats. Nous utiliserons des tests statistiques spécifiques pour comparer deux lots entre eux ou pour comparer plusieurs (>2) lots.
Raffinement
Les injections sous échographie se feront sous anesthésie. Pour éviter toute douleur liée à la procédure, nous administrerons deux analgésiques par voie sous cutanée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante permettant le suivi des paramètres cardiorespiratoires ainsi qu’un suivi de la température. Le gel d’échographie sera chauffé préalablement à son application sur l’animal. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de l'examen. En fin de procédure l’animal sera réveillé, placé dans une pièce post-examen, chauffé, avec eau et nourriture ad libitum. Suite à la chirurgie, nous utiliserons une grille d'évaluation du bien-être des animaux tous les jours pendant 3 jours puis 2 fois par semaine. L'évaluation sera dépendante de plusieurs critères dont chaque modification sera cotée. En fonction du score total, les animaux pourront être placés sous traitement analgésique et/ou il y aura arrêt de l’expérimentation par mise à mort de l’animal. L’environnement des animaux sera enrichi avec des dômes autoclavables, des morceaux de bois à ronger et des nids à base de coton.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle souris car le marquage des neurones de la crosse aortique par injection sous échographie est une méthode que nous avons validée au sein du notre laboratoire. De plus, nous maîtrisons le modèle de maladie rénale chronique par régime riche en adénine validé chez la souris. Enfin, cette espèce permet également le recours à des techniques validées de quantification moléculaire, permettant de répondre à nos hypothèses. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 6 à 10 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Les souris ne présentent pas encore d'accumulation de tissus graisseux et/ou fibreux qui pourraient nuire à la visibilité des structures sous échographie.
Accompagnement nutritionnel à la reprise d’activité sportive par une complémentation en protéines d’insectes et en vitamine D (SITE2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Soumises pendant six mois à des entraînements de course sur tapis de 45 minutes trois fois par semaine, plus force et équilibre, 108 souris de 50 semaines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever sang, muscle, foie et tissu adipeux. Elles passent sept séries de tests de performance qui les fatiguent, sept mesures de composition corporelle avec contention et jeûne allant jusqu'à quatorze heures, et un transport de 15,3 kilomètres entre deux établissements. Le protocole vise à démontrer que des protéines de ténébrion valent des protéines laitières pour accompagner la reprise du sport chez les personnes vieillissantes. Le porteur écrit d'emblée penser démontrer l'effet attendu, et destine les résultats au développement de nouveaux produits alimentaires.
Objectifs
Ce projet se fera sur 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Notre objectif est de tester l’impact d’une approche combinant une complémentation nutritionnelle en protéines d’insectes (Ténébrion) et en vitamine D avec un programme d’activité physique adaptée dans le but de limiter la perte de fonction musculaire au cours du vieillissement chez la souris en surpoids. Les critères principaux d'investigation sont les performances physiques, la composition corporelle, la synthèse protéique musculaire, l'inflammation et le métabolisme de la vitamine D. A l'issue du projet, plusieurs dosages biochimiques (protéines circulantes relarguées) seront effectués au niveau circulant et au niveau du muscle squelettique, du foie et du tissu adipeux. L’objectif final de ce projet est de démontrer que la qualité nutritionnelle des protéines d’insectes est compatible avec la pratique sportive dans un contexte de veillissement.
Bénéfices attendus
Nous pensons démontrer par ce protocole qu’une complémentation combinée de protéines et de vitamine D a un effet anabolique musculaire plus fort qu’une complémentation protéique simple ou qu’une situation sans complémentation. Nous nous attendons à ce que la vitamine D puisse potentialiser l’effet anabolique des protéines, et puisse favoriser la restauration de l’homéostasie glucidique et lipidique, limiter l’inflammation du tissu adipeux et l'infiltration lipidique dans les tissus. Nous attendons également que la complémentation en protéines de ténébrion ait des effets anaboliques comparables aux protéines laitières (protéines de référence) afin de démontrer que cette source de protéines présente une bonne digestibilité et est aussi efficace qu’une protéine laitière au cours de la récupération sportive. En perspective à long terme, ce projet apportera des données scientifiques pour le développement de nouveaux produits alimentaires destinés aux personnes (âgées) souhaitant un accompagnement nutritionnel lors de la reprise d'activité physique.
Procédures
Les animaux seront soumis à des entrainements d’endurance (45 min 3x/sem), de force (15 min 1x/sem) et d’équilibre (15 min, 1x/sem) ainsi que des tests de performances physiques (vitesse maximale de course, force d’agrippement, équilibre) chaque mois (15 min par tests) pendant 6 mois à l’EU1 pour suivre leurs capacités locomotrices. Les animaux seront soumis de manière non invasive à une estimation de leur masse maigre et grasse par résonnance magnétique 1x/mois et à une estimation de leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte (2x) pendant 6 mois à l’UE2 pour suivre l’évolution de leur composition corporelle et leur dépense énergétique.
Impact sur les animaux
Les animaux seront souris à un protocole d’activité physique modérée de 16 semaines (course sur tapis, entrainement en résistance et équilibre) qui entrainera la prise en main quotidienne des animaux. Le personnel impliqué dans les mesures est formé à la contention low stress. Les animaux seront soumis à des tests de performances physiques (vitesse de course, force, équilibre) répétés 7x sur la durée du protocole (24 semaines) qui entraineront de la fatigue suivie d’une période de récupération. Des mesures de composition corporelle (7x) nécessiteront une contention des animaux d’une durée inférieure à 2 min et une mise à jeun des animaux d’une durée inférieure à 14h. Pour la mesure de la synthèse protéique musculaire (mesure unique en fin de protocole), les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée. La piqure d’aiguille pour l’injection est réalisée sur animal vigile en contention et entrainera une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure afin de prélever les tissus nécessaires aux analyses biochimiques (sang, muscle, tissu adipeux, foie).
Remplacement
L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacée par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas de mesurer simultanément l’évolution de la fonctionnalité musculaire (masse et force), de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant. Il est difficile de suppléer l’activité physique par des systèmes in vitro même si des systèmes de stimulation électriques de cellules musculaires existent, ils ne remplacent pas les adaptations cardio-respiratoires à l’exercice. Ce projet requiert une analyse multi-tissus du métabolisme de la vitamine D afin de comprendre pourquoi la déficience en vitamine D est si importante chez l'homme. Pour effectuer une télle étude chez l'homme, il faudrait pratiquer des biopsies tissulaires du foie, du tissu adipeux et du muscle squelettqiue. Ces techniques restent trop invasives à mettre en place chez un même volontaire sain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires est calculé pour une différence attendue de 25% pour la synthèse protéique musculaire entre les souris nourris avec les régimes non supplémentés en protéines et les souris nourris avec les régimes supplémentés en protéines (protéines de lactosérum ou protéines d’insectes). Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à l'âge, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 108.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6 dans des cages de dimension conforme à la réglementation comportant à mimina une maison en carton à double entrée, des batonnets en bois, et des ficelles de carton pou la nidification . Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. Les points limites et l’arbre de décision adapté à cette étude sont présentés en annexes 1 et 2. Pour le transport des animaux à l'EU2, les animaux seront placés dans des cages de transport agrées opaques avec nourriture + eau gélifiée + enrichissement. Les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 15.3 km).
Choix des espèces
Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris car cette espèce a montré une très bonne compliance à la course sur tapis dans nos études antérueures. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Notre protocole vise à freiner une diminution de la fonction musculaire avec l’âge (sarcopénie). Nous utiliserons donc des souris de 50 semaines à l’entrée dans le protocole. A la fin du protocole, les souris seront âgées de 74 semaines ce qui est suffisant pour obersver une baisse de la force musculaire et des performances physiques dans les groupes non supplémentés et non entrainés.
Evaluation de l’effet radio-sensibilisant d’agents de contraste
- Recherche appliquée
- Cancers
294 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la mamelle, puis un agent de contraste directement dans la tumeur, avant trois séances d'irradiation localisée sous anesthésie générale, une par jour. Le porteur indique que le modèle est réputé produire des tumeurs qui nécrosent rapidement malgré leur petite taille, et que cette nécrose peut entraîner une douleur modérée. Il annonce un changement radical dans l'administration des radio-sensibilisants, bloquée depuis des décennies sur des dérivés du platine, quand l'étude compare des formulations d'émulsions sur des tumeurs greffées.
Objectifs
L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet radio-sensibilisant de différentes formulations d’émulsions d'agents de contraste sur la croissance tumorale ainsi que la caractérisation des modifications du microenvironnement tumoral associées aux traitements. Cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles combinaisons thérapeutiques et conduire à un changement radical dans l’administration concomitante de radio-sensibilisants, qui sont restés depuis des décennies bloqués sur des agents relativement anciens et parfois toxiques tels que les dérivés du platine, générant un gain thérapeutique relativement faible.
Bénéfices attendus
En adoptant cette approche, nous visons à minimiser les limitations des thérapies utilisées seules, à améliorer les résultats thérapeutiques et à augmenter la réponse globale des tumeurs en limitant les toxicités liées aux traitements. Cette stratégie de traitement à multiples facettes non seulement promet d'améliorer les résultats thérapeutiques actuels mais pourrait également nous conduire à développer de nouvelles stratégies de traitement antitumoral plus efficaces et moins toxiques. Ce projet espère fournir une base solide et des nouvelles perspectives pour optimiser les traitements cliniques futurs tout en réduisant les effets secondaires des thérapies en question.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de cellules tumorales sous anesthésie locale (une fois, durée environ 20 secondes) et à une injection du traitement (une fois, durée environ 20 secondes), sous anesthésie générale. Les animaux auront des irradiations localisées des tumeurs (une fois par jour pendant trois jours, un cycle d'irradiation dure environ 2 minutes), sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
En raison de la croissance des tumeurs ou des effets secondaires des traitements, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit et/ou une réduction de l'activité. Le modèle utilisé est réputé pour produire des tumeurs qui nécrosent rapidement, malgré leur petite taille. Cette nécrose peut entraîner une douleur modérée à court terme.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour examen post-mortem sur tissus et organes.
Remplacement
Ce projet a pour but d’évaluer l'effet thérapeutique des agents de contrast à base de lipiodol, combinés à la radiothérapie. Ceci exige donc un système biologique dynamique et complet en interaction direct avec le stroma tumoral. Ceci nécessite le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être modélisé in vitro ni in silico..
Réduction
Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique à priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. Le critère de jugement principal pour le calcul de puissance est la taille tumorale.
Raffinement
Une anesthésie générale sera faite lors des injections des cellules tumorales dans la mamelle de la souris mais aussi lors des injections de agents de contraste en intratumoral. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton afin de diminuer leur angoisse. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement, au minimum de façon hebdomadaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Un aliment appétent et énergétique sera proposé en cas de nécessité.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie l'étude de la croissance tumorale. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 7 à 9 semaines, âge auquel les souris sont adultes.
Études neurophysiologiques et cognitives chez les rongeurs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 960
Caractériser l'effet de molécules à visée thérapeutique sur la cognition : 960 souris et 960 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour contrôle histologique. Chacun subit une chirurgie d'implantation de deux à trois heures sous anesthésie générale, puis des tâches comportementales pouvant atteindre une séance quotidienne de 25 minutes pendant quatre semaines, avec hébergement individuel, tête restreinte et restriction hydrique ou alimentaire. Ni les molécules ni les tâches comportementales ne sont nommées. Le porteur annonce des soins postopératoires sans douleur tout en listant un risque de douleur aiguë après la chirurgie, et justifie l'effectif de 1 920 animaux par "la force de notre hypothèse" et des années d'expérience, sans calcul rapporté.
Objectifs
Le présent projet s’inscrit dans un contexte de recherche préclinique visant à caractériser l’effet de molécules à visée thérapeutique sur la cognition et le fonctionnement cérébral. Les techniques utilisées incluent l’enregistrement et la modulation de l’activité neuronale chez l’animal anesthésié ou vigile et libre de ses mouvements. Ces approches permettent d’évaluer en temps réel l’impact potentiel d’un traitement thérapeutique sur les fonctions neuronales, cognitives et comportementales. Le modèle animal est indispensable pour étudier le potentiel thérapeutique de composés pharmacologiques avant leur éventuel développement clinique. Les rongeurs (souris et rats) sont classiquement utilisés pour la recherche préclinique en santé humaine, notamment dans des études de molécules susceptibles de modifier l’activité neuronale, le comportement et/ou la cognition. Les procédures employées suivent des standards établis dans les laboratoires de recherche publique, garantissant la fiabilité et la reproductibilité des données expérimentales.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’accompagner des études précliniques combinant approches comportementales et neurophysiologiques afin de mieux comprendre les effets de composés pharmacologiques à visée thérapeutique. Ce projet permettra de caractériser de manière précise l’impact de ces composés sur la cognition, le comportement et le fonctionnement cérébral, en fournissant des données fiables et reproductibles sur leurs effets neuronaux et cognitifs. Ces informations contribueront à identifier les cibles thérapeutiques pertinentes et à orienter le développement de nouveaux traitements dans un contexte préclinique.
Procédures
Les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée approximative de 2 à 3 heures, permettant l’enregistrement de l’activité neuronale dans une région cérébrale d’intérêt. Selon les études, les animaux effectueront différentes tâches comportementales adaptées aux molécules et aux régions cérébrales étudiées. Un ensemble de tâches standardisées est utilisé, dont la récurrence et la durée peuvent varier d’une séance unique de 15 minutes jusqu’à une séance quotidienne de 25 minutes sur environ 4 semaines. Cette approche combinant mesures neurophysiologiques et évaluation comportementale permettra de mieux caractériser l’impact des composés pharmacologiques sur la fonction cérébrale et la cognition. L’hébergement individuel sera appliqué uniquement aux animaux porteurs d’implants ou soumis à un contrôle hydrique ou calorique,(de quelques jours à plusieurs semaines, maximum 1 mois), tandis que la restriction hydrique ou alimentaire sera mise en place sur la période expérimentale correspondante afin de mesurer individuellement les apports (de quelques jours à une semaine).
Impact sur les animaux
Nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/Un risque de perte de poids trop importante durant le contrôle calorique, en cas de perte de poids l'animal est nourri ad libitum pendant 48H. 3/ un risque de perte d’implant lié aux chirurgies implantatoire 4/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après les procédures comportementales, en vue de la réalisation de contrôles histologiques.
Remplacement
L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus cognitifs/comportementaux. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus l'espèce humaine. 3) De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que le sujet est éveillé et soumis à des tests comportementaux : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles.
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e. mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.
Raffinement
À chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de carton, leur permettent de construire des nids, de jouer et de ronger. Leur soin est confié à du personnel qualifié et expert. Il surveille quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suivent les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures chirurgicales. L’expérimentateur possède une solide expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter toute souffrance animale, avec la mise en place de mesures pour les soulager, comme la réhydratation, le réchauffement et une nourriture adaptée.
Choix des espèces
La souris et le rat : -sont des mammifères étroitement liés à l'espèce humaine sur le plan phylogénétique, et certains de leurs comportements peuvent être comparés à ceux de l'humain. Ces rongeurs sont fréquemment utilisés dans les études électrophysiologiques, utilisant la technique de fiber photométrie, ainsi que dans les manipulations optogénétiques. -permettent des approches in vivo pour étudier les effets de composés thérapeutiques sur le système nerveux central, ainsi que leurs corrélations avec les fonctions cognitives, à travers l'analyse comportementale. Les animaux seront utilisés au stade adule, soit à partir de 10 semaines, un âge qui correspond à la maturité des circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées. De plus, les rongeurs adultes sont plus résistantes et récupèrent plus rapidement après la chirurgie que les plus jeunes.
Humanisation du foie de souris et modélisation de pathologies hépatiques [MODIFICATION]
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Les souris de la souche employée sont immunodéficientes et portent une mutation qui tue leurs propres cellules du foie, ce qui permet d'y greffer des cellules hépatiques humaines, parfois avec des cellules souches qui leur donnent aussi un système immunitaire humain. 8800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments contre des infections virales, le cancer du foie, des maladies métaboliques ou l'insuffisance hépatique. Les procédures comprennent quatre à sept injections d'un composé qui détruit les cellules du foie et les cellules souches, la greffe de cellules humaines, notamment par la veine porte avec un risque hémorragique accru, l'induction de maladies, l'administration des candidats médicaments et des prises de sang. Le porteur estime que l'humanisation ne réussit que chez la moitié environ des souris, et dit avoir fixé l'effectif sans approche statistique, d'après les études des années antérieures et une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial". Il indique que des souris pourront passer dans d'autres projets de l'établissement, dont une formation interne aux gestes techniques, et que les autres seront tuées parce qu'elles "ne recouvreront pas leur état de santé". 200 souris sont déclarées réutilisées.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Dans certains cas, la présence d’un système immunitaire humain, en complément d’un foie humanisé, est indispensable pour étudier des processus physiopathologiques spécifiques, comme dans les maladies métaboliques (ex. : MASH) ou virales (ex. : dengue). Dans ces cas, une double humanisation, incluant à la fois le foie et le système immunitaire des souris, sera envisagée afin de répondre de manière optimale aux besoins scientifiques et aux questions posées. Les cellules hépatiques humaines (et immunitaires, le cas échéant) pourront ensuite, par exemple, être infectées par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable et plus acceptable sur le plan éthique que les primates non-humains.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. En cas de besoin, il sera également possible d’humaniser simultanément le compartiment immunitaire et hépatique. Cette double humanisation constitue un atout majeur, car elle permet de modéliser plus fidèlement les interactions entre le foie et le système immunitaire humain, particulièrement dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. De plus, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, éthiquement plus acceptable que les primates non-humains, et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée pourront également être exploitées pour l’étude des mécanismes d’insuffisance hépatique et des thérapies ciblant cette condition. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’évaluer les réponses immunitaires humaines face à des pathologies complexes, notamment dans le contexte de traitements antiviraux ou de maladies impliquant des dysfonctionnements immunitaires.
Procédures
[MODIFICATION] 4 à 7 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale, ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être induites par [MODIFICATION] l’identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection, la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.
Remplacement
Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.
Réduction
Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de [MODIFICATION] 4 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de la PE2, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences des prélèvements sanguins sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique induisant la mort sélective des hépatocytes murins, ce qui permet de greffer simultanément en plus des cellules souches des hépatocytes humains. Cette approche vise à humaniser à la fois le système immunitaire et le foie. Cette double humanisation offre la possibilité d’évaluer des solutions thérapeutiques pour des maladies métaboliques et virales impliquant le système immunitaire, ainsi que pour les cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.