Souris

Les souris M83 sont modifiées génétiquement pour produire une forme humaine de l'alpha-synucléine et développent entre 8 et 22 mois une maladie qui évolue vers la paralysie du train postérieur. 150 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, maintenues jusqu'à l'atteinte des points limites, toutes tuées. La démarche saccadée et la perte d'équilibre servent de signal, leur confirmation déclenchant la mise à mort avant la paralysie, et le seul acte décrit est une ponction cardiaque de deux minutes sous anesthésie. Le porteur présente cette mise à mort comme compassionnelle, quand elle sert aussi à prélever le sang dans lequel chercher des vésicules extracellulaires neuronales.

Objectifs

Le projet vise à identifier des biomarqueurs sanguins dans un modèle de souris modifiées génétiquement pour développer une maladie associée à l’agrégation de l’alpha-synucléine, une protéine qui est le constituant principal des lésions cérébrales dans la maladie de Parkinson. Les vésicules extracellulaires sont des petites structures libérées par les neurones et qui sont retrouvées dans le sang. Leur présence dans le sang de souris offre une fenêtre non invasive sur l'état du cerveau. L'étude des vésicules extracellulaires neuronales dans le sang de ces souris M83 par des méthodes biochimiques permettrait d'identifier des biomarqueurs de maladie. Ces derniers sont des indicateurs biologiques de l'état pathologique du cerveau de la souris, et ils peuvent être utiles au diagnostic précoce de maladies neurodégénératives ou refléter l’existence de maladies différentes sur le plan lésionnel et clinique chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le projet vise à rechercher si de nouveaux marqueurs moléculaires de la maladie peuvent être identifiés dans ce modèle expérimental à partir d’un prélèvement de sang. Réalisable par simple prélèvement sanguin et au cours de l’incubation de la maladie, cette identification ouvrirait la voie à des recherches de marqueurs précoces de la maladie.

Procédures

Les animaux sont soumis à une anesthésie, ainsi qu'à une ponction cardiaque d'une durée de 2 minutes au maximum.

Impact sur les animaux

L’apparition des signes cliniques moteurs se manifeste par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort compassionnelle des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort, en fonction de points limites adaptés, afin de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet qui vise à rechercher des biomarqueurs dans le sang ne peut être réalisé que sur animal vivant. Il n'existe pas aujourd'hui de méthode alternative pour évaluer le potentiel de ce type d'approche.

Réduction

Le projet complet prévoit un total de 150 souris, maintenues jusqu’à l’atteinte des points limites définis. La quantité de prélèvements issus de ces souris est jugée suffisante pour permettre la réalisation d’extraction de vésicules extracellulaires neuronales, et mener à bien nos analyses.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un portoir ventilé par groupe de 5 souris de même sexe, et originaires de la même portée, et maintenus dans un environnement enrichi (dômes en plastique, buchettes en bois et éléments de nidification) pendant toute la durée de l’expérimentation. Ces enrichissements sont renouvelés chaque semaine, et la litière en rafle de maïs changée de façon bi-hedomadaire. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. Le test de suspension par la queue montre une dégradation de l’écartement des pattes postérieures. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés selon les critères et le scoring prévu en annexe et justifiant la mise à mort de l’animal. Lors de la ponction intracardiaque, une analgésie est réalisée 30 minutes avant l'anesthésie.

Choix des espèces

Les souris M83 sont des souris modifiées génétiquement et qui produisent une forme de la protéine alpha-synucléine humaine entraînant le développement d’une pathologie de cette protéine accompagnée d’une symptomatologie motrice. Elles développent une maladie qui se manifeste cliniquement par l’apparition d’une paralysie lors du vieillissement, entre 8 et 22 mois. Elles constituent un modèle pertinent de la maladie de Parkinson chez l'homme.

800 souris âgées de 18 à 22 mois vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune recevant jusqu'à 120 injections dans le ventre sur quatre mois. Elles développent spontanément des tumeurs internes, une perte de poids et une baisse d'activité, que le porteur range parmi les effets attendus du modèle de vieillissement. Les molécules testées visent à bloquer des filets libérés par les globules blancs, soupçonnés de favoriser fibrose et tumeurs avec l'âge. Les bénéfices annoncés pour la qualité de vie des personnes âgées sont renvoyés au long terme, quand les injections répétées et la mise à mort de toutes les souris pour analyse de leurs organes sont, elles, programmées.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre comment certaines cellules de défense de notre organisme, les globules blancs appelés neutrophiles, peuvent influencer le vieillissement. Ces cellules libèrent parfois des sortes de filets collants (appelés “NETs”) qui, au lieu de protéger, peuvent parfois causer des dommages. Ils pourraient favoriser la formation de cicatrices internes dans les organes et même contribuer à l’apparition de tumeurs avec l’âge. Pour étudier ce phénomène, nous suivrons des souris âgées (de 18 à 22 mois, ce qui correspond à un âge avancé chez l’humain) et nous testerons différents traitements capables de bloquer la formation ou l’action de ces “filets”. L’objectif final est de mieux comprendre comment ces cellules du système immunitaire participent au vieillissement et d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes âgées.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter des connaissances importantes sur le vieillissement et sur certaines maladies qui y sont associées. En comprenant mieux comment les “filets” libérés par les globules blancs (NETs) participent à la formation de cicatrices dans les tissus ou au développement de tumeurs, nous pourrions ouvrir de nouvelles pistes pour améliorer la santé des personnes âgées. À long terme, ces recherches pourraient aider à développer de nouveaux traitements capables de bloquer ces mécanismes et donc de limiter la perte de fonction des organes, de réduire certains risques liés à l’âge et d’améliorer la qualité de vie des personnes âgées. Ce projet contribuera aussi à une meilleure compréhension générale du vieillissement, ce qui est essentiel pour trouver des solutions contre plusieurs maladies chroniques qui touchent une population de plus en plus nombreuse.

Procédures

Dans ce projet, les souris âgées seront soumises à une seule catégorie d’intervention, réalisée par du personnel expérimenté afin de limiter au maximum leur stress et leur inconfort : • Injections de traitements : certaines souris recevront des médicaments expérimentaux par une petite piqûre dans le ventre. o Chaque injection dure moins de 30 secondes. o Selon le produit testé, ces injections seront effectuées : • quotidiennement pour les inhibiteurs, soit environ 120 fois sur la durée totale de 4 mois, ou • 2 à 3 fois par semaine pour les anticorps, soit environ 40 à 50 fois au total. o Les sites d’injection seront alternés pour éviter toute irritation locale. Ces interventions sont courtes, non chirurgicales, et n’entraînent qu’un inconfort léger et transitoire. Aucun autre geste invasif n’est prévu dans le cadre de ce projet.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, plusieurs effets indésirables sont susceptibles d’apparaître chez les souris : • Effets liés aux injections : De légères irritations locales peuvent survenir au point d’injection (rougeur, petit gonflement ou peau tannée). Ces réactions restent généralement transitoires. • Effets systémiques possibles : Certains traitements peuvent provoquer une fatigue passagère, une diminution de l’appétit ou une léger trouble de l’état général, sans gravité durable. • Effets liés au vieillissement naturel : Les souris âgées (18 à 22 mois) présentent spontanément des signes de vieillissement physiologique, tels qu’une activité locomotrice réduite, un pelage altéré, une perte modérée de poids ou l’apparition de tumeurs internes. Ces manifestations font partie des effets attendus du modèle de vieillissement et peuvent s’ajouter aux nuisances mineures liées aux injections répétées. Aucun autre effet indésirable spécifique n’est anticipé.

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre l’analyse complète de leurs organes et de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Cette étape est indispensable, car les effets du vieillissement, tels que les cicatrices dans les tissus (fibrose) ou l’apparition de tumeurs, ne peuvent être évalués qu’en observant directement les organes au microscope et en réalisant des analyses biologiques détaillées. Les prélèvements permettront d’étudier la sévérité des lésions, la présence de cellules immunitaires spécifiques et l’impact des différents traitements testés sur ces altérations.

Remplacement

Avant de travailler sur les animaux, nous avons utilisé des modèles en laboratoire, par exemple des cultures de cellules vieillies (“cellules sénescentes”) et d’autres types de cellules présentes dans les tissus et le système immunitaire. Ces expériences nous ont permis de montrer que les cellules vieillies peuvent stimuler la libération de “filets” protecteurs (appelés NETs), et que ces filets peuvent contribuer à la formation de cicatrices dans les tissus (fibrose) et au développement de tumeurs. Toutefois, ces modèles de laboratoire ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’un organisme entier — comme la circulation du sang, le vieillissement global ou les interactions entre organes. C’est pourquoi un modèle animal reste indispensable pour répondre aux questions posées par ce projet.

Réduction

Le nombre de souris a été soigneusement calculé à l’aide d’outils statistiques, afin d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le moins d’animaux possible. Les travaux déjà réalisés dans d’autres modèles nous ont permis de cibler précisément les analyses et la durée du suivi (18 à 22 mois). Seuls 20 animaux par lot sont nécessaires pour tester nos hypothèses, ce qui correspond au minimum requis pour assurer une solidité scientifique tout en respectant le principe de réduction.

Raffinement

Des mesures concrètes seront mises en place pour réduire au maximum la douleur et l’inconfort des animaux. Les souris seront hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement favorisant leur bien-être (abris, matériel de nidification). Les injections de traitement seront effectuées par du personnel qualifié, en alternant les points d’injection pour limiter les irritations locales. En cas de signe de souffrance importante (ex. grosse tumeur, perte de poids sévère, difficultés respiratoires), l’animal sera immédiatement retiré de l’expérience et mis à mort de manière éthique et indolore.

Choix des espèces

Ce projet cherche à comprendre le rôle de certaines cellules du système immunitaire, appelées neutrophiles, et des “filets” qu’elles libèrent, dans le développement de maladies liées au vieillissement, comme les cicatrices anormales dans les tissus ou l’apparition de tumeurs. La souris a été choisie comme modèle d’étude car elle présente de fortes similitudes avec l’être humain concernant le fonctionnement du système immunitaire et les mécanismes de vieillissement. Cela permet d’obtenir des résultats fiables et transposables à l’humain. Nous utilisons des souris âgées de 18 à 22 mois, ce qui correspond à un âge avancé chez l’humain. Ce choix est essentiel pour étudier les phénomènes associés au vieillissement, tels que l’accumulation de cellules vieillies, la formation de cicatrices dans les organes ou le développement spontané de tumeurs. Le recours à ce modèle permet donc d’étudier de façon rigoureuse le rôle des neutrophiles dans les maladies liées à l’âge et de tester des traitements susceptibles d’améliorer la santé et la qualité de vie au cours du vieillissement.

Isolées en cage individuelle jusqu'à 37 jours et privées de 40 % de leur ration pendant 21 jours, 102 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent en plus cinq injections dans le ventre, quatre sous la peau et deux à trois prises de sang. Le projet vise à mettre au point un modèle de chimiothérapie chez la souris, puis à tester si un probiotique limite les effets de cette chimiothérapie sur l'absorption intestinale. Le porteur écrit que ce projet ne devrait entraîner que des nuisances modérées, tout en listant la faim liée à la restriction calorique, le stress de l'isolement prolongé et celui de la chimiothérapie.

Objectifs

La dénutrition associée à une altération de l'absorption intestinale est un phenomène couramment observé après une chirurgies de l'intestin ou une chimiotherapie. Nous souhaitons développer un protocole expérimental chez la souris permettant de tester l'hypothèse selon laquelle un probiotique ou ses derivés peuvent améliorer l'absorption intestinale chez le sujet adulte dont la fonction intestinale est dégradée. Un probiotique se définit comme un micro-organisme vivant qui, lorsqu'il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels. Nous espérons ainsi, dans ce modèle murin, améliorer la fonction intestinale par cet apport de probiotique. Dans un premier temps nous mettrons en place et caractériserons un modèle de chimiothérapie chez la souris. Dans un second temps, nous étudierons comment un traitement par un probiotique ou ses dérivés peut limiter les effets de cette chimiothérapie. Cette étude permettera de mieux comprendre l'influence du microbiote sur les phénomènes de dénutrition chez l'adulte. Nous espèrons également pouvoir ainsi, par l'apport de probiotiques ou de leurs dérivés, améliorer l’absorption intestinale et ainsi limiter les effets secondaires d'une chimiothérapie. A terme, l'utilisation de ses probiotiques pourrait permettre d'améliorer l'efficacité d'une renutrition des patients adultes après une chirurgie intestinale ou lors d'une chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes physiologiques de la dénutrition et l'implication du microbiote dans ce phénomène. De plus, nous espérons à l’aide d’un probiotique ou de ses dérivés pouvoir, en ameliorant l’absorption intestinale, limiter les effets secondaires d'une chimiothérapie et améliorer l’effet d’une renutrition. Cela pourrait à terme, par exemple, permettre d’envisager un traitement probiotique des patients traités par chimiothérapie afin de limiter les éffets secondaires associés, mais aussi des patients ayant subit une intervention chirurgicale de l'intestin qui souffrent également d’une altération de la fonction intestinale.

Procédures

- Individualisation des animaux : 98 souris au maximum pendant une durée maximum de 37 jours. - Restriction alimentaire : 98 souris maximum pendant 21 jours - Prélèvement de sang sur l'animal anesthésié : 2 à 3 fois maximum pour 102 souris maximum,cela prend moins d'une minute. - 5 Injections dans le ventre sur l'animal vigile : 102 souris maximum, le geste prend moins d'une minute. 4 injections sous la peau sur animal vigile : 102 souris maximum, le geste prend moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Ce projet ne devrait entrainer que des nuisances modérées chez les animaux : - Le stress lié au traitement par chimiothérapie est limité à 4 jours ce qui ne devrait pas induire d'effet secondaire - La sensation de faim associée à une restriction calorique de 40% de leur prise alimentaire moyenne pendant un temps limité de 21 jours - Le stress associé à l'individualisation des animaux pendant la durée de l'expérience en cas de restriction calorique. Cette individualisation sera prolongée à la phase de renutrition à satiété. En effet, après individualisation la remise en groupe des animaux pendant la période de renutrition risquerait de provoquer des combats pouvant induire des blessures graves voire la mort des animaux. Pour éviter un biais expérimental sur les conditions d'hébergement, nous devrons également individualiser les animaux contrôles non soumis à une restriction calorique. - Le stress associé à la pesée des animaux qui ne prend que quelques secondes et ne necessite pas de contention de l’animal - Le stress associé aux prélèvements sanguins qui seront espacés d’au moins 7 jours. Ces prélèvements se feront sous anesthésie - Le traitement par un probiotique ou ses dérivés qui se fera par voie orale à la pipette en déposant délicatement dans le coin de la joue une petite quantité de solution qui sera alors volontairement déglutis par l'animal. Ce traitement qui se fera après avoir contentionné la souris dure moins d'une minute. le stress induit par une injection dans le ventre et la contention associée de moins d'une minute. le stress associé à une injection sous la peau et la contention associée de moins d'une minute.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de collecter différents organes en vue d'analyses ultérieures

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme et de son microbiote à une chimiothérapie éventuellement associée à une restriction calorique ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier et des interactions avec sa flore dans ce contexte de restriction. C'est pourquoi cette étude nécessite d’expérimenter sur l’animal. Des études précédentes, laissent supposer un effet potentiel des probiotiques utilisés dans le contexte étudié.

Réduction

Nous avons prévu des expériences pilotes afin d'utiliser un minimum d'animaux pour mettre en place le modèle. De plus, le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus. Nous avons prévu de réaliser ce projet de manière séquentielle et de ne réaliser les procédures que si les résultats précédents le justifie. Dans une optique de réduction, nous allons également prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, foie, tissu adipeux, par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas forcemment prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de ce projet expérimental, nous n'utiliserons que des animaux de plus de 20g au debut du projet. Les animaux seront pesés à minima toute les semaines afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement. Les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie suivis d’un point de compression jusqu’à l’arrêt complet du saignement. En cas de restriction calorique, les animaux seront individualisés dans des cages transparentes pour maintenir un contact visuel avec leurs congénères. Ils auront un environnement enrichi afin de pouvoir exprimer au mieux leur répertoire comportemental (abri, morceau de bois, matériel de nidification en quantité importante). Le traitement probiotique ou par ses dérivés se fera en déposant délicatement une petite quantité de solution dans le creux de la joue. Pour chaque procédure, des points limites adaptés ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix pour étudier la flore dans une étude nutritionnelle. Afin de pouvoir modéliser les effets d'une chimiothérapie chez l'adulte, il est nécessaire d’utiliser des animaux adultes. Nous utiliserons donc des souris mâles de 13 semaines au début de l'expérience (10 semaines à l'arrivée dans l'établissement).

526 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. 414 d'entre elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, puis jusqu'à six injections de peptides dans l'abdomen sur animal vigile, trois injections d'agent de contraste dans la veine de la queue et trois passages de dix minutes au micro-tomographe à rayons X. Les tumeurs sont implantées au flanc, alors que le projet porte sur le glioblastome, un cancer du cerveau. Sur le remplacement, le porteur affirme n'avoir pas d'autre choix que l'animal, la culture cellulaire ne représentant pas les mécanismes d'un "organisme entier".

Objectifs

Le glioblastome multiforme (GBM) est le cancer du cerveau le plus courant et le plus létal chez l’adulte avec une incidence de 2 à 5 cas par 100 000 personnes par an en Europe et aux Etats-Unis. Le pronostic des patients est très faible, avec une survie médiane à 15 mois malgré le suivi d'une thérapie composée d’une chirurgie puis d’une combinaison de radio- et chimiothérapie. C’est pourquoi il est primordial de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques qui permettront de limiter l’expansion et l’invasion tumorales. Dans ce contexte, nous nous intéressons à deux protéines de la matrice extracellulaire, fortement présentes dans le cancer du cerveau et connues pour favoriser la croissance tumorale. Au laboratoire, ont été développés deux peptides ciblant spécifiquement ces deux protéines. Individuellement et par des approches de culture cellulaire et de modèles murins, ces deux peptides ont montré des effets antitumoraux notamment en rétablissant l’immunité antitumorale et en diminuant la vascularisation de la tumeur. Ce projet comporte plusieurs objectifs. (1) Nous voulons analyser les effets du premier peptide de manière individuelle sur le développement de ce cancer, étude jamais réalisée jusqu’à présent. (2) Nous voulons évaluer si l’injection des deux peptides en concomitance peut entraîner un effet synergique sur l’inhibition du développement tumoral. La procédure 1 va permettre de répondre à ces différentes questions biologiques. Les procédures 2 et 3 ne seront réalisées que si et seulement si la procédure 1 présente des résultats convaincants et permettront d’évaluer (3) la toxicité aiguë et (4) à doses répétées de ces deux molécules. Enfin, la dernière procédure nous donnera (5) des indications sur la répartition de ces molécules seules ou co-administrées dans le corps des animaux et nous permettra de confirmer qu’elles sont bien recrutées au niveau de la tumeur.

Bénéfices attendus

Le cancer du cerveau résiste à tous les traitements actuellement disponibles, d’où la nécessité de trouver de nouvelles approches. Dans cette étude, nous allons tester l’efficacité de deux molécules capables de bloquer certaines fonctions favorisant la croissance des tumeurs. Chacune de ces molécules a déjà montré des effets antitumoraux, à la fois en laboratoire (sur cellules) et chez la souris dans différents cancers, mais jamais encore dans le cancer du cerveau. Le premier intérêt est donc de vérifier si elles sont efficaces aussi dans ce contexte. Le second est d’évaluer leur action lorsqu’elles sont administrées ensemble, ce qui n’a jamais été étudié. Si elles agissent en synergie, elles pourraient modifier l’environnement de la tumeur pour le rendre moins favorable à son développement et permettre au système immunitaire de mieux la combattre.

Procédures

- Injection de cellules tumorales de cancer du cerveau (1x) sous anesthésie gazeuse. Toutes les souris des procédures 1 et 4 sont concernées soit 414 souris (

Impact sur les animaux

Le développement d’une tumeur au niveau du flanc peut entraîner une gêne ou une diminution du bien-être de l’animal (nuisance modérée). Les injections répétées de peptides et les anesthésies peuvent induire un stress transitoire, une baisse de température corporelle ou une altération de l’état général (nuisance modérée). Si une perte de poids importante (>20%) est constatée ou si la tumeur atteint la taille limite autorisée, l’animal sera immédiatement retiré de l’étude afin d’éviter toute souffrance. Des analyses sanguines hebdomadaires permettront également de vérifier l’état de santé global. Ces prélèvements sanguins peuvent occasionner une gêne passagère et nécessitent une anesthésie pour assurer le confort de l’animal (nuisance modérée). Une dépilation unique sera réalisée pour certaines procédures, pouvant causer un inconfort local mais sans conséquence durable (nuisance légère). L’injection d’un agent de contraste dans la veine de la queue est un geste court, susceptible de provoquer une gêne temporaire, avec un risque limité d’hématome (nuisance légère). Enfin, les souris immunodéficientes, en raison de leur système immunitaire affaibli, présentent une plus grande sensibilité aux infections et au stress (nuisance inhérente au phénotype).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, l’ensemble des animaux sera mis à mort pour analyse approfondie des tissus et de la tumeur.

Remplacement

Une étude sur des cellules seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes biologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. En effet, il est notamment très difficile de recréer exactement, l’environnement tumoral très complexe. Ainsi, nous n’avons pas d’autres choix que d’utiliser le modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique des candidats médicaments.

Réduction

Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés, le projet est conçu selon un schéma expérimental séquentiel. La première phase (procédure 1) vise à identifier la dose maximale efficace (d1) parmi deux doses testées. La poursuite du protocole vers la procédure 2 sera conditionnée par l’observation d’un effet antitumoral significatif et l’absence de signes de toxicité majeurs. La procédure 3 ne sera mise en œuvre qu’avec les doses jugées non toxiques à l’issue de la procédure 2. Enfin, la procédure 4 sera exclusivement réalisée avec la dose présentant le meilleur index thérapeutique, déterminé à partir des résultats précédents. Ce déroulé progressif permet d’éviter l’exposition inutile d’animaux à des conditions expérimentales non pertinentes. Par ailleurs, dans la première procédure, le nombre d’animaux par groupe a été déterminé de manière à minimiser leur utilisation tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour l’interprétation des résultats. Pour les autres procédures, le nombre de souris par condition a été déterminé à minima afin d’obtenir des données qualitatives qui n’ont pas besoin d’être quantitatives.

Raffinement

À leur arrivée, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine avant le début des procédures. Le nombre de souris par cage sera limité à 3 pour les immunodéprimées et 5 pour les immunocompétentes. La litière des souris immunodéficientes sera en cellulose pour éviter tout risque de blessure, et chaque cage sera enrichie avec dômes et tubes en carton. Les animaux seront habitués à la manipulation pour réduire le stress. Toutes les interventions pouvant provoquer douleur ou gêne (implantation de tumeur, imagerie) seront réalisées sous anesthésie gazeuse. À leur réveil, les souris seront placées en cage de récupération avec lampe chauffante. Pendant toute l’expérimentation, elles seront surveillées quotidiennement et pesées trois fois par semaine, avec remplissage d’une grille de suivi au moins trois fois par semaine pour détecter les premiers signes de mal-être. Après les injections répétées de peptides, une surveillance accrue sera mise en place. La douleur éventuelle sera prévenue ou traitée par anesthésiques et analgésiques. En cas d’atteinte d’un point limite, l’animal sera euthanasié sous anesthésie profonde par une méthode rapide et validée. Seules des souris femelles seront utilisées, permettant l’hébergement de plusieurs animaux par cage. Afin de raffiner le recours à l’utilisation d’animaux, à chaque fin de procédure, des prélèvements (tumeurs et organes d’intérêts) seront réalisés après euthanasie pour analyses complémentaires approfondies.

Choix des espèces

Le recherche de nouvelles molécules antitumorales est primordial dans le contexte du cancer du cerveau au vu de la résistance des cellules tumorales aux traitements actuels et à la très faible survie des patients. Nous avons développé de nouveaux peptides qui, en culture cellulaire, montrent de réels effets antitumoraux. Il est donc primordial de tester ces nouveaux peptides dans un contexte largement plus complexe que la culture cellulaire et la souris est une espèce qui permet de récapituler assez fidèlement l’environnement tumoral (vascularisation, immunité) retrouvé chez l’humain. Les souris utilisées auront 10 semaines au début des procédures afin d’éviter toute influence du développement sur les résultats.

Une partie des souris utilisées est génétiquement modifiée pour que leurs adipocytes bruns soient détruits. 7 018 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles passent de sept à vingt jours à des températures dérogatoires et reçoivent jusqu'à quatre injections, l'inflammation provoquée par les adjuvants étant reconnue comme une source de douleur, alors que le porteur écrit que ces souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Leurs ganglions lymphatiques et leur tissu adipeux brun sont prélevés après la mise à mort.

Objectifs

Chez les mammifères, comme chez l’humain et la souris, la température du corps est très bien régulée. Quand il fait froid, le corps met en place différents mécanismes pour rester à une température stable, par exemple en resserrant les vaisseaux sanguins ou en produisant de la chaleur dans de la graisse spéciale qu’on appelle le tissu adipeux brun. Mais cette température peut aussi changer en cas de maladie ou après une vaccination. On peut avoir de la fièvre (hausse générale de la température) ou une chaleur localisée à l’endroit de l’inflammation. Cette élévation de la température n’est pas anodine et elle peut jouer un rôle important dans le bon fonctionnement du système immunitaire. Les ganglions lymphatiques, sortes de petits centres de contrôle du système immunitaire, sont entourés de graisse. Cette graisse pourrait, elle aussi, produire de la chaleur en cas d’inflammation, aidant à réguler la température locale autour des ganglions. Des signaux envoyés par le système immunitaire (comme des cellules ou des molécules solubles) pourraient contrôler cette fonction "chauffante", comme cela a déjà été observé en cas d’exposition au froid. Ce projet de recherche a pour but de mieux comprendre ces mécanismes, à travers trois grands objectifs : 1) voir comment la température ambiante influence la réponse immunitaire chez la souris, 2) tester si certains adjuvants (substances ajoutées à un vaccin pour renforcer la réponse du système immunitaire) peuvent activer cette graisse "chauffante" autour des ganglions, et 3) déterminer si cette production de chaleur locale par la graisse joue un rôle dans la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre comment la température, la production de chaleur par le corps et le système immunitaire interagissent pourrait aider à trouver de nouvelles façons d'agir sur nos défenses. Par exemple, cela pourrait permettre de renforcer la réponse du corps lors d'une vaccination pour qu'elle soit plus efficace, ou au contraire de la calmer dans certaines maladies où le système immunitaire s'emballe, comme les maladies auto-immunes.

Procédures

Les interventions réalisées seront les suivantes : 7 jours d’exposition à des températures expérimentales (64 animaux), 7 jours d’exposition à des températures expérimentales + 1 injection (30 secondes) + 1 prélèvement sanguin (1 minute) (800 animaux), 8 à 10 jours d’exposition à des températures expérimentales + 2 injections sous anesthésie (10 minutes) (954 animaux), 9 à 15 jours d’exposition à des températures expérimentales + 2 injections (30 secondes par injection) + 1 prélèvement sanguin (1 minute) (400 animaux), 12 à 20 jours d’exposition à des températures expérimentales + 4 injections (30 secondes par injection) + 1 prélèvement sanguin (1 minute) (4800 animaux).

Impact sur les animaux

Les injections entraînent une douleur légère. L'inflammation induite par les adjuvants est également une source de douleur potentielle. Les animaux sont hébergés dans des conditions de température dérogatoires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les ganglions lymphatiques et le tissu adipeux brun dans le but de les analyser.

Remplacement

Pour comprendre comment la température, la production de chaleur par le corps et le système immunitaire interagissent, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre un ganglion lymphatique et la graisse qui l’entoure et entre les différents types de cellules à l’intérieur du ganglion.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, les souris « sauvages » seront commandées chez un fournisseur agréé afin de ne pas générer d’animaux surnuméraires. Pour les élevages, nous utiliserons des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. De plus, nous utiliserons indifféremment les souris mâles et femelles dans certaines procédures. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.

Raffinement

Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Il est important de préciser que les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins trois fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’humain nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’humain. De plus, nous étudions le tissu adipeux brun et nous disposons déjà des modèles génétiques murins permettant la déplétion spécifique des adipocytes bruns. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire les différentes analyses biologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. L’ensemble des procédures se fera sur des souris adultes (âgées d’au moins 8 semaines).