Souris

3 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyses histologiques et moléculaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent 28 ou 56 jours en hypoxie intermittente, des baisses répétées d'oxygène reproduisant l'apnée du sommeil, dans le bruit de la machine et avec la fatigue d'un sommeil dégradé, puis reçoivent une lésion musculaire provoquée sous anesthésie. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, mieux comprendre comment ce manque d'oxygène perturbe le muscle chez des souris jeunes ou âgées, mâles ou femelles. Le porteur mène en parallèle des cultures de cellules souches musculaires, tout en écartant le remplacement total au motif que le in vitro ne rend pas compte des interactions dans un tissu entier, et fixe des groupes de huit à dix animaux sans dire combien de groupes composent les 3 360.

Objectifs

Le Syndrôme d’Apnées Obstructives du Sommeil (SAOS) est le trouble respiratoire du sommeil le plus courant, qui touche plus d’un milliard de personnes dans le monde. Cette maladie chronique se caractérise par des épisodes répétés de l'affaissement complet ou partiel des voies aériennes supérieures entraînant une diminution transitoire de la saturation en oxygène appelée hypoxie intermittente. Cette succession de phases hypoxiques et de réoxygénations crée un déséquilibre d’approvisionnement des organes en oxygène, responsable de nombreux effets délétères pour notre organisme tels que de l’inflammation, des anomalies vasculaires et de la mortalité cellulaire. Certains patients atteints de SAOS présentent des changements structurels et bioénergétiques dans les muscles squelettiques impliqués dans la respiration mais l’impact de l’hypoxie intermittente sur la biologie des muscles squelettiques périphériques et des cellules souches musculaires reste méconnu. Chez l’adulte, le muscle squelettique a une croissance prodigieuse et possède de grandes capacités régénératrices qui font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, les cellules satellites nommées ainsi du fait de leur localisation en périphérie des fibres musculaires. Elles sont présentes dans toutes les masses musculaires squelettiques, où elles résident dans un état de repos jusqu’à ce que des stimuli notamment environnementaux viennent les solliciter afin de participer à l’homéostasie et à la régénération musculaire. Notre hypothèse est que l’hypoxie intermittente joue un rôle délétère sur la fonction des cellules satellites en homéostasie ou au cours de la régénération musculaire. L’objectif principal de notre projet est d’étudier l’impact de l’hypoxie intermittente sur l’homéostasie du muscle squelettique et au cours de la régénération chez la souris saine, jeune ou âgée, mâle ou femelle.

Bénéfices attendus

Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels l’hypoxie intermittente liée au SAOS perturbe l’homéostasie du muscle sain ou en régénération, chez des sujets jeunes ou âgés, mâles ou femelles.

Procédures

Les procédures invasives sur animal anesthésié sont au nombre de trois : 1. Modèle de régénération musculaire sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min) 2. Mesure de la force musculaire sur animal anesthésié (1 fois, durée : 30min) 3. Prélèvement sanguin sur animal anesthésié (1 fois, durée : 2 min). Les procédures non ou peu invasives sur animal anesthésié ou vigile sont au nombre de trois : 1. Exposition à une hypoxie intermittente (28 ou 56 jours) 2. Mesure de la perfusion sanguine sur animal anesthésié (2 fois / souris, durée : 15 min) 3. Test d’agrippement sur animal vigile (2 fois, durée : 5 min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont principalement du stress lié à la contention et aux manipulations sur animal vigile (test d’agrippement). Les effets indésirables sont principalement ceux liés à l’exposition à l’hypoxie intermittente : à l'hypoxie au début de l'expérimentation et au bruit généré par la machine ainsi qu'une fatigue chez les souris due à une faible qualité de sommeil. Dans notre expérience, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal ayant subi une lésion musculaire passées les 24 premières heures post-lésionnelles suggérant que la période critique sera principalement celle de l’exposition des animaux à l’hypoxie intermittente.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des trois procédures afin de permettre les analyses histologiques et moléculaires nécessaires pour répondre à nos questions biologiques.

Remplacement

Afin de tester l’impact direct de l’hypoxie intermittente sur la biologie des cellules satellites, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment. Pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n'est pas envisageable. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un organisme ou d’un tissu entier. L'utilisation de modèles animaux, présentant des similitudes au niveau des systèmes de réparation du muscle squelettique humain, reste essentielle afin d’étudier les effets délétères de l'hypoxie intermittente sur le muscle squelettique. Par ailleurs, les souris âgées peuvent fournir des notions importantes sur l’impact de l’hypoxie intermittente sur le muscle squelettique dans les populations vulnérables, avec une grande pertinence pour la santé humaine.

Réduction

Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives (test d’agrippement) permettant de répéter les analyses sur le même animal mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés (*) et au fait d’utilisation de la patte controlatérale comme contrôle sans lésion. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=8-10 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle dans notre modèle de régénération musculaire et de la mortalité potentielle des animaux exposés à l’hypoxie intermittente. (*)Un test de Student (également appelé test T) sera utilisé pour comparer deux groupes (effet de l’exposition à l’hypoxie intermittente versus contrôle). Pour les comparaisons multiples (effet de l’exposition à l’hypoxie intermittente en fonction du sexe et/ou de l’âge), nous utiliserons des tests ANOVA à un ou deux facteurs. Une valeur p < 0,05 sera considérée comme statistiquement significative.

Raffinement

Les animaux importés de fournisseurs agréés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour le modèle de lésion musculaire, les souris seront anesthésiées et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examinés de façon quotidienne pendant les 2-3 premiers jours suivant le début de l’exposition à l’hypoxie intermittente et l’induction de la lésion musculaire afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car la physiologie du muscle squelettique est proche de celle de l’Homme. Par ailleurs, la souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées. Les souris Tg :Pax7-GFP et Tg :Pax7CT2mTmG permettent l’expression ciblée de protéines fluorescentes dans les cellules satellites afin de faciliter leur analyse spatiale en histologie et/ou leur tri en cytométrie en flux pour l’analyse ultérieure de leur potentiel myogénique en culture ou de leur expression génique différentielle. Le modèle de lésion musculaire utilisé n'entraine aucune mortalité post-opératoire. Enfin, nous utiliserons des outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles du muscle squelettique et des cellules satellites in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes de 4 mois. A ce stade, les muscles sont parfaitement formés et les cellules satellites résident en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos. Nous utiliserons également des souris âgées de 16 mois pour évaluer l’influence de l’âge un facteur de vulnérabilité majeure dans l’impact de l’hypoxie intermittente.

Des souris femelles reçoivent des lentivecteurs porteurs de mutations humaines pour développer un lymphœdème, cette accumulation de lymphe et de graisse dans un membre. 1 050 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, presque toutes des femelles parce que le lipœdème ne touche que les femmes. Elles subissent jusqu'à cinq injections quotidiennes d'affilée, une chirurgie de moins de vingt minutes et une mesure de composition corporelle, et le porteur écrit que la formation de l'œdème, la chirurgie et les injections engendrent des douleurs modérées. Une partie est transférée dans un second établissement pour y recevoir une anesthésie, une lymphographie et la mort, toutes finissant tuées pour prélèvement d'organes.

Objectifs

Le lymphœdème est une pathologie chronique résultant d’une accumulation massive de lymphe et de tissu adipeux dans un membre. Il existe deux sortes de lymphœdème : primaire et secondaire. Le lymphœdème primaire est d’origine héréditaire, lié à des mutations génétiques. Plus de 30 gènes ont été identifiés comme étant associés au lymphœdème primaire. Le lymphœdème secondaire survient à la suite d’une lésion du système lymphatique, souvent après une chirurgie, une radiothérapie ou une infection. Bien que cette maladie affecte 250 millions de patients, il n’y a à ce jour aucun traitement disponible. Notre équipe a développé une thérapie pour le traitement du lymphœdème secondaire qui passera en clinique en fin d’année. Notre objectif est maintenant d’évaluer son efficacité sur le lymphœdème primaire. Environ 30 mutations génétiques ont été identifiées comme responsables du lymphœdème primaire. Nous nous concentrerons sur les mutations les plus fréquentes. Dans un deuxième temps, nous allons étendre l’application de la thérapie au lipœdème. Le lymphœdème et le lipœdème sont des affections distinctes, mais partagent plusieurs caractéristiques cliniques communes. Tous deux se caractérisent par un gonflement persistant des membres, affectant généralement les membres inférieurs. Il est important de noter que le lipœdème ne touche que les femmes et qu’il n’existe à ce jour aucune thérapie curative. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

À ce jour, il n’existe aucune thérapie curative pour le lymphœdème primaire et le lipœdème. Cette étude permettra d’évaluer la possibilité d’étendre l’application de l’Apernavec au traitement de ces pathologies. Le lymphœdème primaire étant causé par différentes mutations, évaluer l’efficacité sur plusieurs d'entre elles permettra un champ d’application de la thérapie plus large.

Procédures

Dans l’EU 1/2, les animaux seront soumis à des injections en vigile ou sous anesthésie gazeuse qui auront une durée maximale de 2 minutes chacune. Les injections vigiles pourront être ponctuelles ou sur une semaine à raison de 1 injection par jour (soit 5 jours d’injections au total), chaque injection ne durera pas plus d’une minute. Les injections sous anesthésie seront au maximum de 2 tout au long du projet pour chaque animal. Ils pourront être aussi soumis à une intervention chirurgicale d'une durée inférieure à 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Une analyse de la composition corporelle serait faite par imagerie et aura une durée maximale de 6 minutes. Dans l’EU 2/2, les animaux recevront une injection intrapéritonéale d’anesthésie en vue d’une lymphographie ainsi que la mise à mort.

Impact sur les animaux

La formation d’œdème, la chirurgie, le minispec ainsi que les injections vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, certains animaux seront envoyés dans l’EU 2/2. Tous les animaux de la procédure seront mis à mort afin de prélever les organes nécessaires au projet.

Remplacement

Bien qu’il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico reproduisant fidèlement la réponse immunitaire et tissulaire à une injection intradermique de l’Apernavec ainsi que des lentivecteurs codant pour les mutations, une phase préliminaire a été conduite sur des cultures cellulaires (kératinocytes et fibroblastes murins) pour évaluer la transduction et la cytotoxicité, limitant ainsi le recours aux animaux. Le choix s’est orienté vers l’espèce animale car il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico reproduisant les paramètres physiologiques de la pathologie (réponse immunitaire, inflammation, formation d’œdème) nécessaires à la bonne évaluation de l’efficacité de l’Apernavec. Ces données permettront une étude plus fiable.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car ces pathologies touchent essentiellement les femmes. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre de souris a été calculé par une analyse statistique rigoureuse afin de garantir la significativité des résultats tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Les groupes expérimentaux sont restreints au strict nécessaire. Un lot contrôle (vecteur vide) est inclus afin d’évaluer l’effet de l’administration du vecteur indépendamment du gène muté qu’il contient. Toute mutation n'induisant pas d'effet pas d'effet pathologique ne sera pas retenue pour les tests d'efficacité de la thérapie afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. L’injection est réalisée sous anesthésie afin de réduire la douleur. Toute souffrance anormale entraînera une euthanasie immédiate. Les techniques d’injection et de manipulation sont assurées par du personnel expérimenté afin de limiter le stress. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les précédentes études menées sur l’Apernavec dans le lymphœdème secondaire ont été réalisées sur ces dernières. De plus, des lignées sur le même fond génétique précédemment établies dans l’équipe seront aussi utilisées pour les études sur le lipœdème en raison de leur pertinence scientifique. Le lymphœdème primaire et le lipœdème se caractérisent par une accumulation de tissus adipeux fibrotique dans les membres touchés. Ainsi, le modèle utilisé doit posséder un tissu adipeux suffisamment développé. Le choix s’est alors orienté vers des souris âgées de 10 à 12 semaines pour le lymphœdème primaire et de 5 à 12 semaines pour le lipœdème.

Des souris reçoivent du xylène sur les oreilles, de la carraghénine ou de la levure de boulanger dans la patte, puis passent sur plaque chauffante pour un test de seuil de douleur. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées d'un travail pratique à l'autre, puis proposées à d'autres projets ou tuées en fin d'année. Chaque animal enchaîne jusqu'à deux sections de l'extrémité de la queue avec sept prélèvements de sang par séance, cinq injections de diazépam ou de flumazénil et vingt tests de comportement, sous la main d'étudiants qui apprennent le geste. Le porteur reconnaît que ce sont ces manipulations par des débutants qui ont fait classer toutes les procédures en gravité modérée, et juge ce "minimum de notions d'expérimentation animale" "tout à fait essentiel" à la formation des pharmaciens, après entraînement préalable sur souris en caoutchouc.

Objectifs

Dans le cadre des études de pharmacie, nous organisons plusieurs séances de travaux pratiques (TP) sur souris permettant la validation pharmacologique de substances d’intérêt médicamenteux. Ces séances ont plusieurs objectifs : 1) Montrer aux étudiants la diversité des approches pharmacologiques possibles, en fonction de l’effet biologique de la molécule à tester. 2) Prévoir et réaliser les expériences en pratique, en tenant compte des contraintes pratiques, organisationnelles et éthiques : prévoir le nombre d’animaux nécessaire et suffisant, les doses de médicaments à tester, les protocoles expérimentaux, et l’analyse statistique des résultats. 3) Acquérir des bases en matière d’expérimentation animale : règles d’hébergement et de manipulation des animaux, règles éthiques. Ces enseignements permettent donc aux étudiants d’appréhender concrètement les tests pharmacologiques réalisables in vivo, tout en leur apportant les bases de l’éthique et de règles de manipulation des animaux. Ce minimum de notions d’expérimentation animale est tout à fait essentiel dans la formation de futurs pharmaciens, qui doivent être sensibilisés aux enjeux des étapes pré-cliniques de la conception des médicaments. L'ensemble de ces compétences permet de les préparer à leur futur métier de pharmacien. L'apprentissage des règles de bonne pratique en expérimentation animale, notamment la manipulation concrète des animaux est un des objectifs du TP, qui ne peut être acquis en travaillant en travaux dirigés (TD) ou en regardant des vidéos.

Bénéfices attendus

Les bénéfices pour les étudiants sont à la fois disciplinaires et transversaux. D'un point de vue disciplinaire, les étudiants mobilisent et concrétisent les notions vues en enseignement théorique sur les effets des médicaments ou la régulation de la glycémie in vivo, ce qui leur permet d'approfondir leurs connaissances. D'un point de vue transversal, ils acquièrent des compétences en gestion de projet scientifique, ils se préparent à maitriser toutes les étapes de la création d'un nouveau médicament, incluant notamment les étapes de recherche préclinique, aujourd'hui indispensables à la validation de médicaments et préalables aux essais cliniques. Ils se familarisent avec la notion de variabilité individuelle, au calcul d'effectif, à l'analyse statistique des résultats, à l'élaboration d'un design expérimental, et acquièrent des bases en matière d’expérimentation animale. Ces compétences sont essentielles pour former les futurs professionnels pharmaciens, en particulier pour tous ceux qui exerceront dans le domaine de l'industrie pharmaceutique ou dans la recherche clinique et préclinique.

Procédures

Les animaux subiront tous 1 à 2 fois la procédure 1, 5 fois la procédure 2, puis pour la plupart 1 fois une des procédures 3 à 6. Le transport des animaux de la zone d’hébergement aux salles de TP, qui sont dans le même bâtiment, dure moins de 5 minutes. Pour la procédure 1, et par séance de TP, l’animal vigile recevra une injection de substance (ce qui dure quelques minutes), et une goutte de sang sera prélevée à 7 temps successifs après avoir sectionné l’extrémité de la queue (1-2mm) pour le premier prélèvement : ceci afin de mesurer dans le temps l'évolution du taux de sucre dans le sang. Chaque prélèvement de sang dure 1 à 2 minutes. Au maximum il y aura 2 séances de TP par animal, soit 2 injections et 2 sections de la queue sur 1 semaine. Cette procédure concerne 30 animaux. La procédure 2 concerne les 30 animaux de la procédure 1, plus 30 nouveaux animaux, soit 60 animaux. Par séance de TP, il y a 1 injection sur animal vigile (quelques minutes) et 4 tests de comportement (5 minutes chacun). Il y a au maximum 5 séances de TP sur 4 semaines, soit 5 injections et 5x4 tests de comportement. Ensuite, les animaux seront soumis, à l’une des procédures expérimentales 3 à 6. Dans la procédure 3, chaque animal vigile subira 1 injection ou 1 gavage (quelques minutes) et 2 tests de comportement (moins de 2 minutes chacun). Dans la procédure 4, chaque animal recevra une anesthésie gazeuse légère puis 1 injection dans la patte (moins de 10 minutes) + 1 injection ou 1 gavage (quelques minutes). Pour la procédure 5, chaque animal vigile aura une application de xylène sur les oreilles (quelques minutes)+ 1 injection ou 1 gavage (quelques minutes). Pour la procédure 6, chaque animal recevra 2 injections (quelques minutes), et sera anesthésié légèrement pour prendre sa température (moins de 10 minutes, répété 4 fois).

Impact sur les animaux

Les animaux seront tous manipulés par un grand nombre d’étudiants, dans des salles de TP auxquelles ils ne sont pas habitués, ce qui induira un stress pendant la durée des TP (quelques heures avant d’être remis dans la zone d’hébergement). De plus, ils recevront tous au moins trois injections : de glucose et/ou d'insuline (maximum deux injections) dans la procédure 1, de diazépam et/ou de flumazénil (maximum 5 injections) dans la procédure 2, d'ibuprofène ou de paracétamol (maximum 1 injection) dans les procédures 3 à 6. Ces injections induisent un stress lié à la contention et à l'introduction d'une aiguille par les étudiants (ou à défaut par l’enseignant). Dans les procédures 3 à 6, certains animaux pourront être gavés (ibuprofène ou paracétamol), avoir une injection de carraghénine ou de levure de boulangerie, ou être irrités à l’oreille avec du xylène (une fois par animal). Ils seront de plus soumis à des prises de sang à la queue dans la procédure 1 (au maximum deux séances de 7 prélèvements (7x1 goutte de sang par animal), à des tests de comportement non douloureux dans la procédure 2 qui correspondent à un stress léger. Dans les procédures 3 à 6, les animaux seront soumis à des tests d'évaluation de la douleur, type plaque chauffante ou réflexe de retrait de la queue lors d'une augmentation de température. L’effet des molécules dure en général quelques heures, le temps que ces dernières soient éliminées, et les effets des tests eux mêmes sont modérés et ne perdurent pas au delà de quelques heures après la séance de TP. Bien que les gestes effectués sur les animaux soient de gravité légère, en particulier pour les procédures 1 et 2 (injection IP, prise de sang à la queue), le contexte lié à la présence de nombreux étudiants peu habitués à manipuler les animaux, représentant une source de stress pour les animaux, a conduit à classer toutes les procédures en gravité modérée.

Devenir

A l'issue de la procédure 1, tous les animaux sont utilisés pour la procédure 2. A l'issue de la procédure 2, ils sont tous utilisés pour l'une des procédures 3 à 6. A l'issue de ce projet (mois de mai), tous les animaux sont proposés à la réutilisation dans d’autres projets ou mis à mort.

Remplacement

Des méthodes de remplacement sont prévues et inclues dans les séquences d'enseignement. Tout d’abord, les étudiants peuvent s’entraîner à la contention et aux injections sur modèle inerte (souris en caoutchouc). Puis certaines expériences sont réalisées sur modèles cellulaires (exemple : impact d'un médicament donné sur la sécrétion de molécules inflammatoires), ou ex vivo (exemple : contrôle qualité pour vérifier la présence de contaminants). Nous utilisons également, lorsque c'est possible, un organe isolé tel que de la peau de souris (exemple : vérification de la pénétration dans la peau d'un médicament). Notre demande d'autorisation ne conserve donc que les étapes non remplaçables, à réaliser sur animaux vivants, et ce afin d'intégrer des processus physiologiques (régulation du taux de sucre dans le sang nécessitant l'intégration de plusieurs organes, comportement animal).

Réduction

Les mêmes animaux sont utilisés pour les TP 1, 2 puis pour le TP3 correspondant à une des procédures 3 à 6. Ceux ci sont échelonnés dans le temps de façon à permettre l'utilisation continue des animaux : le TP1 a lieu en février, le TP2 en mars-avril et le TP3 en mai. De plus, pour un seul TP il y a plusieurs séances (les étudiants, au nombre d'une centaine par promotion, sont répartis en 6 à 10 groupes) : là aussi nous utilisons les animaux pour plusieurs séances de TP, tout en veillant à ce qu'ils disposent d'un délai suffisant (de 2 jours minimum) entre deux séances de façon à minimiser le stress et à leur permettre de retrouver pleinement leur état de bien-être, et d'éliminer totalement les substances injectées, dont la demi vie est courte. Ainsi, un seul lot de 60 souris nous permet de réaliser les 3 TPs, concernant près de 240 étudiants au total chaque année. Les doses à injecter sont affinées en amont par une étude bibliographique, de façon à éviter des études de dose-réponse qui ne seraient pas nécessaires et donc à réduire le nombre d’animaux. Enfin, pour certains TP les étudiants travaillent en équipe et chaque équipe ne dispose pas d'un lot complet d'animaux permettant de réaliser une vraie étude statistique, mais les résultats obtenus par chaque équipe sur un petit lot d'animaux (2 à 3 souris) sont mis en commun de façon à ce qu'ils obtiennent collectivement des résultats robustes et qu'ils puissent interpréter statistiquement. Ceci permet de réaliser l'analyse des résultats, tout en réduisant le nombre d'animaux.

Raffinement

Après livraison, les souris auront une période d’acclimatation d’au moins 7 jours avant le début des enseignements. Le personnel responsable du bien-être animal veillera à leurs conditions d’hébergement avec enrichissement, à leur adaptation à leur environnement et à la mise à disposition à volonté en nourriture et eau. Tout comportement anormal ou souffrance sera signalé au vétérinaire responsable des animaux pour mettre en place des soins adaptés. Les animaux seront pesés au début de chaque TP, ce qui permettra de détecter une éventuelle perte de poids. Les procédures 1 et 2 ne nécessitent pas d'analgésie et encore moins d'anesthésie. Les procédures 3 à 6 visent à déterminer l'effet analgésique ou anti-inflammatoire d'un médicament (paracétamol ou ibuprofène), le raffinement est donc intégré au design de l'expérience elle-même. Au cours des TP, nous veillerons à sensibiliser les étudiants aux effets du stress chez les animaux et à imposer l’ambiance de travail la plus calme possible. Nous surveillerons régulièrement les animaux dans les cages afin de détecter d’éventuels signes de stress (perte de poils, perte de poids, bagarres et blessures…). Les animaux seront marqués individuellement, et nous veillerons à perturber le moins possible les groupes qui sont constitués dans les cages, ainsi nous reconstituerons à la fin du TP les groupes d'animaux initiaux dans les cages. Les étudiants pourront d’abord s’entrainer à la contention et à l’injection sur souris en caoutchouc pour réduire leur stress et donc celui des animaux, et le risque de mauvaise manipulation. Les étudiants seront ensuite appelés à manipuler les animaux, et à leur faire réaliser les tests de comportement. Ils pourront également, mais seulement s’ils le souhaitent, réaliser les injections et les gavages. Dans tous les cas, les gestes seront d’abord montrés par les enseignants qui encadrent le TP, puis l’étudiant les réalisera sous supervision étroite d’un enseignant qui contrôlera chaque étape. En cas d’échec, d’hésitation ou de stress trop important de l’étudiant, l’enseignant reprendra l’animal et réalisera lui-même le geste, pour ne pas stresser trop l’animal et/ou de risquer de le blesser. Tous les enseignants ont le niveau concepteur, sont à jour de leur livret de compétences, et sont attachés à respecter la recommandation du CNEA du mai 2019.

Choix des espèces

La validation de substances d’intérêt médicamenteux passe nécessairement par des tests sur au moins une espèce de rongeurs, avant de pouvoir envisager des tests cliniques. L’utilisation de modèles cellulaires ne permet pas d’obtenir des données physiologiques reflétant les effets comportementaux des médicaments. Par ailleurs, la formation de futurs pharmaciens qu’ils soient à l’officine, en industrie ou en recherche académique, ne peut s’abstenir d’une découverte concrète de l’expérimentation animale utilisant l' espèce la plus fréquemment utilisée dans ce domaine d’activité. Nous utiliserons des souris jeunes adultes (8 semaines) pour le TP1. Puis nous les conservons jusqu'au mois de mai pour le TP3, les souris seront alors âgées d'environ 6 mois soit des souris adultes. Par homogénéité nous commençons dès le TP1 avec des souris adultes.

Une injection dans l'abdomen déclenche chez les souris une spondylarthrite qui gagne les poignets et les chevilles, avec des douleurs, une perte de poids et un rythme jour-nuit désorganisé. 218 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit les gestes en secondes, l'injection dure moins de dix secondes, les contentions hebdomadaires quelques minutes, quand la maladie installée, elle, dure des semaines. Il écrit lui-même que les symptômes avancés ne permettent pas une vie dans de bonnes conditions, ce qui justifie selon lui la mise à mort de tous les animaux, par ailleurs commandée par les examens post mortem.

Objectifs

Les spondylarthrites sont un groupe de maladies inflammatoires qui comprennent l’arthrite réactionnelle, rhumatisme déclenché à la suite d’infection bactérienne (Chlamydia …), la spondylarthrite ankylosante (rhumatisme caractérisé par une ankylose progressive du rachis), le rhumatisme psoriasique et d’autres. Les spondylarthrites touchent 0,5 à 2 % de la population mondiale et se manifestent par des inflammations rachidiennes, articulaires, et extraarticulaires : psoriasis, uvéite et maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Une inflammation intestinale infraclinique a été décrite chez près de 60% des patients avec une spondylarthrite ankylosante. Nos objectifs scientifiques à long terme sont de mieux caractériser les mécanismes de l'immunité mis en oeuvre lors de la progression de la maladie, de proposer et de valider de nouveaux moyens de traitement. A plus court terme, nous étudions l'effet du microbiote et de l’immunité intestinale sur la progression de la maladie.

Bénéfices attendus

Le mécanisme des spondylarthrites humaines implique une interaction entre des prédispositions génétiques et des facteurs déclencheurs durant la vie comme des infections. Les bactéries de l'intestin produisent des substances qui modifient les cellules de l'immunité impliquées dans la spondylarthrites. Afin d’explorer les relations de cause à effet entre les bactéries du tube digestif, les prédispositions génétiques et la progression des spondylarthrites, nous utiliserons des aliment avec prébiotique. Nous explorerons l'immunité de nos souris. Cela permettra à long terme la recherche de nouveaux moyens de prévenir ou traiter les spondylarthrites.

Procédures

L’induction de la maladie se fait par une injection dans l’abdomen qui prend moins de 10 secondes lors d'une contention de moins d'une minute. Il pourra y avoir jusqu’à deux prises de sang la première semaine et une les semaines suivantes, avec la même durée que pour l'injection précédemment décrite. La pesée, le prélèvement de crottes, la mesure du diamètre des articulations demandent des contentions une fois par semaine de quelques minutes.

Impact sur les animaux

La progression des lésions d’arthrite, principalement au niveau des poignets et des chevilles entraine des douleurs et des contraintes de niveau modéré, accompagnés d’une perte de poids et d’une perturbation du rythme d’activité entre le jour et la nuit. L’induction de la maladie se fait par une injection sous cutanée ou dans l’abdomen. Il pourra y avoir jusqu’à deux prises de sang la première semaine et une les semaines suivantes, avec des douleurs et contraintes qui durent quelques minutes. La pesée, le prélèvement de crottes, la mesure du diamètre des articulations demandent des contentions une fois par semaines de quelques minutes. Les études sur le microbiote peuvent provoquer des désagréments digestifs.

Devenir

La très grande majorité de nos expériences comprennent des examens post mortem afin d'obtenir le maximum d'information des expériences. De plus les symptômes de la spondylarthrite avancée ne permettent pas une vie dans de bonnes conditions. Donc la mise à mort concerne tous les animaux de ce projet.

Remplacement

Comme remplacement partiel, les effets de la prédisposition génétique sont étudiés ex vivo sur des prélèvements post-mortem de souris issues de notre élevage et auxquelles nous n’avons induit la maladie. Une partie des effets des produits des bactéries est étudié in vitro, avec un fermenteur de bactéries et des cellules de l'immunité en culture. Enfin, la mise au point des tests enzymatiques et bactériens pour l’analyse des échantillons se fait in vitro. Sinon, les spondylarthrites sont des maladies complexes qui font intervenir des facteurs génétiques, un déclencheur, et un emballement immunitaire qui s’attaque aux organes ciblés dont les articulations. Ce processus ne peut pas pour l’instant être modélisé en dehors d’un animal.

Réduction

Dans nos expériences avec un suivi clinique, grâce à des calculs basés sur nos données statistiques passées, nous incluons le nombre minimal d’animaux qui permette de détecter avec des chances raisonnables l’effet d’un traitement par nos tests. Le geste technique de mesure des diamètres des articulations est toujours réalisé par la même personne afin de réduire la variabilité de cette mesure. Pour nos expériences courtes qui explorent des mécanismes avec des effets de type tout-ou-rien, le nombre de répétition est réduit entre 4 et 6, en accord avec le type de test statistique utilisé pour valider.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions sanitaires contrôlées qui font que leur déficit immunitaire n’est pas un handicap. Seuls les prélèvements, injections et tests en rapport avec la question scientifique seront faits durant une expérience, et ils seront couplés de façon à ne manipuler les souris qu'un nombre minimal de fois par semaine. Les prises de sang seront faites sous anesthésie générale volatile ou après administration d’un antalgique. La manipulation de nos animaux avant l’induction de la maladie nous permet de les habituer à la pièce d'animalerie, à notre passage et aux manipulations. Cela permet d’avoir des données de références, de diminuer le stress de nos animaux lors des contentions et aux animaux de s’adapter à leurs nouveaux locaux. Les souris sont ramenées dans leur litière et groupe d'origine après chaque intervention. Le geste technique de mesure des diamètres est toujours réalisé par la même personne afin que les souris soient habituées à cette manipulation contraignante et afin de réduire cette durée de contention. Des points limites sont mis en place et des mesures de raffinements sont mises en place selon des critères intermédiaires de cette grille. Notamment, selon ces critères, une alimentation riche et humide leur sera donnée dans la cage en plus des croquettes sèches habituelles.

Choix des espèces

Notre modèle de souris est celui est qui reproduit le mieux les symptômes de l’arthrite réactionnelle et de la spondylarthrite ankylosante de l’homme. L’âge des souris enrôlées dans cette étude est compris entre 5 et 15 semaines au moment de l’induction. Cet âge permet d’avoir une maturité immunitaire.

68 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus cérébraux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le régime riche en graisses court sur toute la durée de l'expérience, avec des manipulations quotidiennes de cinq minutes et des incisions de la queue pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, cinq prélèvements par test après six heures de jeûne. Le protocole couvre la gestation et la lactation, l'objectif déclaré étant de mieux comprendre l'anorexie et la boulimie chez l'être humain, sans qu'aucun mécanisme précis ne soit avancé. Sur le remplacement, le porteur se contente d'écrire que la souris est "l'espèce de choix" pour étudier le système nerveux des vertébrés et que le protocole "nécessite l'utilisation d'animaux", tandis que sa rubrique raffinement décrit des chirurgies sous anesthésie que le reste du résumé ne mentionne nulle part.

Objectifs

Ce projet cherche à mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire, comme l’anorexie ou la boulimie. À l’aide d’un modèle de souris, on souhaite étudier comment l’alimentation et le stress influencent le poids et le comportement durant la gestation et la lactation et ensuite à l'age adulte. L’objectif est de trouver de nouvelles pistes pour dépister plus tôt ces troubles et mieux accompagner les personnes à risque.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’acquérir de nouvelles connaissances sur les causes des troubles du comportement alimentaire (TCA) et leurs mécanismes sous-jacents. En offrant une meilleure compréhension de la manière dont ces troubles affectent les individus, ce projet ambitionne d'identifier de nouvelles cibles pour des diagnostics potentiels et éventuellement des interventions efficaces pour réduire les symptômes de la maladie et sa prévalence chez les personnes à risque.

Procédures

les régimes riches en graisses (« high fat diet ») pendant toute la durée de l'expérience. Manipulations quotidiennes (pesées, observations cliniques) 5min par animal tous les jours. Incisions de la queue pour collecter une goutte de sang et injection pour le test de tolérance au glucose et insuline: Mesurer la glycémie à 0, 15, 30, 60 et 120 minutes après injection grâce à un lecteur de glycémie, par prélèvement d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue 1–5 µL de sang suffisent (une goutte à chaque mesure). Jeûne de 6 h (début tôt le matin pour limiter le stress).

Impact sur les animaux

les régimes riches en graisses (« high fat diet ») modifient le poids, le métabolisme et même certains comportements. lStress de la mise à jeun 6h, La douleur au point de piqure pour prelever une goutte de sang

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure expérimentale. Cette étape est indispensable afin de pouvoir prélever les tissus cérébraux nécessaires aux analyses scientifiques prévues dans ce projet. Ces analyses biologiques ne peuvent pas être réalisées autrement et sont essentielles pour répondre aux objectifs de recherche

Remplacement

La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Afin de vérifier ce concept dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, plusieurs mesures concrètes ont été mises en place : Utilisation des deux sexes Tous les animaux produits, qu’ils soient mâles ou femelles, seront inclus dans les expériences. Cela permet d’éviter un gaspillage d’animaux et d’améliorer la représentativité biologique des résultats. Fondement expérimental solide Le projet s’appuie sur des données pilotes et sur l’expertise acquise au cours d’expériences précédentes. Ces éléments permettent de cibler précisément le nombre d’animaux nécessaires pour répondre à l’hypothèse, en évitant les répétitions inutiles. Calcul statistique rigoureux Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une estimation de la variance observée dans ce type de données, afin de garantir une puissance statistique suffisante tout en évitant la sur-utilisation. Analyses statistiques optimisées L’utilisation de tests statistiques appariés permettra de réduire la variabilité interindividuelle et donc de diminuer le nombre total d’animaux nécessaires pour atteindre une conclusion robuste.

Raffinement

À chaque étape du projet, le bien-être des animaux sera une priorité. Conditions d’hébergement Les animaux naîtront et seront hébergés dans une animalerie à haut statut sanitaire. Ils seront maintenus en cages collectives ventilées, avec litière adaptée favorisant le fouissage. Des enrichissements seront systématiquement fournis : nids végétaux, tubes en carton, matériaux manipulables, afin de permettre l’expression de comportements naturels (construction de nids, exploration, jeu, rongement). Soins et suivi quotidien L’entretien et la surveillance seront assurés par un personnel qualifié et expérimenté. Un suivi quotidien standard est assuré, renforcé lors des périodes sensibles (ex. récupération après intervention). Procédures et gestion de la douleur Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale adaptée, avec administration systématique d’analgésiques validés par le vétérinaire référent. Les expérimentateurs impliqués disposent d’une solide expérience, garantissant des procédures maîtrisées et rapides, réduisant ainsi le stress et la douleur. Points limites et mesures correctives Des critères d’arrêt précoces sont définis pour détecter toute souffrance non compatible avec le projet. Des mesures de soutien seront appliquées dès les premiers signes d’altération de l’état général : réhydratation, maintien au chaud, nourriture enrichie ou pâte molle. Si nécessaire, l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié de façon éthique, afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Pour atteintre l'ojectif du projet, il est nécessaire d’étudier l’évolution de l’animal de la naissance jusqu’à l’âge adulte : Période néonatale : le cerveau et le métabolisme sont en plein développement. Cette phase est critique pour comprendre l’influence précoce de l’environnement (nutrition, interactions maternelles) sur la vulnérabilité future aux TCA. Sevrage et adolescence : période de transition alimentaire et sociale, essentielle pour analyser comment les régimes (ex. high fat diet) et le stress social influencent la mise en place des circuits neuronaux de la récompense et de la régulation alimentaire. Âge adulte : permet d’évaluer la persistance des effets observés, la stabilisation des comportements alimentaires et l’installation éventuelle de phénotypes pathologiques durables.

309 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant par cinq séances de suivi glycémique. Une séance, c'est six heures de jeûne puis une incision au bout de la queue et un prélèvement de sang toutes les quinze minutes pendant deux heures. La moitié des souris reçoit dès dix semaines un régime riche en graisses qui les rend obèses et diabétiques jusqu'à la fin des expériences, avec une dégradation dentaire attendue, et le suivi métabolique impose l'isolement de chaque souris en cage individuelle. Le porteur fonde tout le projet sur le constat que l'hébergement réglementaire à 22 °C soumet les souris à un stress thermique chronique, et présente l'hébergement à 28-30 °C comme un raffinement pour des animaux qu'il rend par ailleurs malades.

Objectifs

Le changement climatique représente une menace croissante pour la santé humaine. Parmi ses conséquences les plus dangereuses figure la chaleur extrême, qui affecte particulièrement les patients atteints de maladies chroniques comme le diabète. Plusieurs études associent les vagues de chaleur à une augmentation des hospitalisations et de la mortalité chez les patients avec un diabète. Il reste néanmoins à déterminer si ces effets sont directement liés à la température et à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués. Pour cela, nous souhaitons développer un modèle pertinent qui permettra d'étudier l’impact de la chaleur sur la régulation de la glycémie. Chez la souris, mammifère endotherme, la zone de thermoneutralité se situe autour de 28-30°C. Or, en laboratoire, les souris sont hébergées à 22 ± 2°C, ce qui induit un stress thermique chronique pouvant modifier leur métabolisme. Cette situation soulève des questions quant à la validité des modèles expérimentaux et leur transposabilité à l’homme. La régulation de l'équilibre glycémique étant sensible au stress, il est contre-intuitif de l’étudier chez des animaux en stress thermique. Or, peu d'études ont évalué l'effet de la température ambiante sur la glycémie, et leurs résultats sont souvent contradictoires. De plus, la notion de thermoneutralité est rarement prise en compte, et les études se concentrent généralement sur les régulations périphériques, négligeant les mécanismes cérébraux. Notre projet vise à étudier l’impact de la thermoneutralité sur la régulation de la glycémie et à identifier les mécanismes impliqués, en particulier ceux d’origine cérébrale. Dans ce contexte, une région du cerveau, l’hypothalamus, est un important organe régulateur des fonctions corporelles, notamment de la température corporelle, du sommeil et de l’appétit. Il semble donc représenter un acteur crucial reliant la température et l'équilibre glycémique, qui est important à étudier.

Bénéfices attendus

Les études réalisées sur la régulation cérébrale de l’équilibre glycémique, en contextes sain et pathologique, sont souvent menées à des températures d’hébergement qui induisent un stress thermique chez les souris, ce qui peut affecter leur physiologie et, par conséquent, la fiabilité des résultats et leur impact translationnel. Le nombre d’études conduites sur les souris à thermoneutralité est très limité. Ainsi, la caractérisation de l’homéostasie du glucose ainsi que des circuits neuroanatomiques dans un contexte de thermoneutralité est nécessaire. Cette étude va donc nous permettre de déterminer l’impact de la thermoneutralité et l’enjeu de la thermorégulation sur l’homéostasie glucidique. En outre, le présent projet propose d’étudier, à différentes échelles, l’impact d'un hébergement à thermoneutralité sur les mécanismes impliqués dans la physio-pathologie d’obésité/diabète, chez le modèle murin. Ces recherches apparaissent cruciales dans la lutte contre la pandémie croissante de diabète que nous connaissons à l’heure actuelle. Notre compréhension des enjeux sanitaires prenant en compte les facteurs environnementaux tels que la température, ouvrira la voie à des solutions innovantes dans l’adaptation à notre environnement et le traitement de ces maladies.

Procédures

Les animaux seront soumis à divers types d'expérimentations et de prélèvements soit en condition vigile, soit sous anesthésie. - Afin d’évaluer la régulation de la glycémie chez des animaux soumis à une température environnementale correspondant à leur thermoneutralité, les souris seront placées en armoire ventilée et soumises à des cycles de température inclus dans la zone de thermoneutralité (27 à 31°C) et comparées aux animaux hébergés à la température règlementaire durant la période d’expérimentation. - Afin de comparer l'effet de la température environnementale chez des animaux sains et obèses diabétiques, les souris seront divisées en 2 lots, l’un soumis à un régime alimentaire standard et le second soumis à un régime riche en graisse (High Fat Diet) dès l’âge de 10 semaines jusqu’à la fin des expériences. -Afin de suivre la glycémie, les animaux seront mis à jeun pendant 6 heures de leur phase inactive, pour subir ensuite des prélèvements sanguins de 4μL à l'extrémité de la queue toutes les 15 minutes pendant 2 heures, soit un volume total de l'ordre de 40 μL par expérience ; Les expérimentations sont répétées 5 fois en respectant une semaine de repos minimum entre chacune d'entre elles. - Afin d'évaluer l'impact de la température d'hébergement sur le comportement anxieux chez la souris vigile, les animaux soumis aux différentes conditions d'hébergement, subiront un test permettant d'évaluer leur comportement exploratoire dans un environnement inconnu. Le test consiste à une heure d’habituation dans la pièce d’expérimentation et 5 minutes d’observation du comportement de la souris libre à explorer le nouvel environnement – chaque souris subira ce test une seule fois. - Afin de prélever des tissus à l'issue des tests physiologiques, les animaux seront profondément anesthésiés afin de réaliser une chirurgie sans réveil d'une durée de 15 minutes.

Impact sur les animaux

- Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chronique chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce régime riche en lipides, à température ambiante et à thermoneutralité peut entrainer une détérioration de la santé dentaire des souris, sévérité modérée. - La mise à jeun de 6 heures avant chaque test physiologique peut entrainer une perte de poids, sévérité légère. - Le prélèvement sanguin pour le suivi de la glycémie, par incision de l’extrémité de la queue peut entrainer une douleur légère et de courte durée à l’incision, ainsi qu'une légère perte de sang, sévérité légère. - Le suivi métabolique implique l’hébergement individuel des animaux à 1 animal/cage inhérent à ce suivi, sévérité modérée. - L’injection intra-péritonéale de diverses molécules pour la caractérisation du profil glycémique, durant les procédures peut entrainer une douleur légère et de courte durée à l’injection, sévérité légère. - Le test de comportement utilisé pour évaluer le comportement anxiogène chez la souris, peut entrainer un stress, et un risque de chute de la plateforme associé à une blessure, sévérité légère.

Devenir

A l'issue des procédures, les souris seront mises à mort dont la majorité sera utilisée pour des analyses post-mortems. Le prélèvement des organes post-mortem, notamment le cerveau, servira pour la caractérisation de l'anatomie cérébrale ou de pour des études moléculaires, ainsi que les mécanismes cellulaires d'intérêt.

Remplacement

Afin de mieux comprendre la relation complexe entre la température et le diabète, en particulier dans un contexte où les enjeux climatiques s’exacerbent, il est essentiel d’étudier cette interaction dans un cadre physiologique chez la souris. Cette approche permet d’explorer les mécanismes interconnectés de la thermorégulation et du maintien de l’homéostasie glucidique. Pour mieux élucider ces effets, un réseau de neurones de l’hypothalamus, connu pour réguler à la fois la température corporelle et la glycémie, est particulièrement interessant. La caractérisation des altérations neuroanatomiques et du fonctionnement des réseaux formés par ces neurones en réponse aux variations thermiques environnementales, nécessite l’utilisation d’un modèle in vivo intégré. Il est indispensable d’étudier la communication entre le système nerveux et les systèmes périphériques de l’organisme afin de comprendre l’influence du premier sur le second dans différents scenarii climatiques. La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, ce modèle animal constitue une étape clé pour la recherche translationnelle. Les innovations thérapeutiques pourront potentiellement être développées sur la base de ces nouvelles connaissances et applicables à l’Homme à l’avenir. À ce jour, il n’existe aucune alternative non-animale permettant d’étudier ces interactions de manière complète.

Réduction

Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons entrepris une planification expérimentale en amont et avons réalisé des estimations de puissance statistique, associées à une estimation pour chaque expérience du nombre d’animaux nécessaires par groupe. Ceci permet de réduire au plus le nombre d’animaux utilisés, tout en s’assurant d’avoir la puissance statistique nécessaire à nos tests. En outre, cela permet d’éviter le double emploi et la réplication d’expériences. Les tests statistiques envisagés seront adaptés en fonction du nombre de groupes et du design expérimental ainsi que des conditions de normalité et d’homoscédasticité des données. Le design de nos expérimentations prévoit, quand cela est possible (différents tests physiologiques par exemple), qu’une souris subisse successivement différents tests, réduisant de ce fait de façon significative le nombre de groupe d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. De fait, l’hébergement des souris à une température dans la zone de thermoneutralité est susceptible d’éliminer le stress thermique métabolique qu’elles subissent à température règlementaire. Les animaux seront maintenus à un minimum de trois par cage pour éviter tout isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. Pour éviter la dégradation des croquettes riches en lipides par la chaleur à thermoneutralité, les croquettes seront remplacées toutes les 48 heures. Pour éviter d'induire un stress par choc thermique en sortant les animaux de l'armoire chauffante, les souris seront placées dans des cages d'expérimentation chauffées, qui assurent une température stable dans la zone de thermoneutralité pendant les procédures experimentales. De plus, l’état général des animaux sera quotidiennement évalué et les signes de mal-être seront surveillés attentivement, selon les points limites préalablement définis selon les recommandations pour le bien-être animal. Si un signe de mal-être ou une combinaison de signes apparaît, le suivi de l'animal sera renforcé et les soins adéquats seront apportés. Si l'état de l'animal s'aggrave dans les heures qui suivent ou ne s'améliore pas dans les 24-48 heures, il sera considéré qu'un niveau de souffrance intolérable est atteint et la mise à mort sera réalisée par élongation cervicale après anesthésie. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie/analgésie (locale ou générale). Il sera prévu, pour les animaux devant subir plusieurs tests au cours d'une même procédure, une période de rétablissement minimum d’une semaine entre chaque test, leur permettant une stabilisation de leur poids corporel et la reconstitution initiale de leur volume sanguin après prélèvement. Pour les souris sous régime riche en graisse, le suivi du poids est réalisé toutes les 2 semaines pour la surveillance de leur bien-être et l’intervention en cas d’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Afin de caractériser les mécanismes de régulation centrale de la glycémie chez la souris à thermoneutralité, il est nécessaire d’adopter une approche intégrative permettant une compréhension globale d’un système physiologique complexe. Seule l’utilisation d’un modèle mammifère in vivo nous permettra d’étudier la physiopathologie de l’obésité et du diabète ainsi que leur interaction avec la thermorégulation et le maintien de la température corporelle. La souris constitue un modèle privilégié en raison de sa physiologie proche de celle de l’Homme, favorisant une recherche translationnelle dont les innovations thérapeutiques pourraient être appliquées en clinique humaine. La souris présente également de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : notamment taille et coût d’entretien réduits. Il s’agit d’un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris offre des possibilités uniques d’approches génétiques et phénotypiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude, la physiologie chez l’adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.