Souris
Immunothérapie à base d’ARN pour cibler les cellules infectées par les bradyzoites de Toxoplasma gondii
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Inoculées dans le bas-ventre avec une souche de toxoplasme puis vaccinées par deux injections intramusculaires dans les pattes arrière, 60 souris femelles sont toutes tuées à l'issue, l'infection par un agent pathogène interdisant tout autre devenir. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré pour la totalité des animaux. Le projet teste une immunothérapie à ARN visant les cellules qui hébergent les kystes du parasite, transposée des vaccins contre le Covid-19 et des traitements anticancéreux. Le porteur écrit pourtant que la souche choisie ne provoque ni symptôme clinique ni souffrance notable et que les seules nuisances attendues tiennent aux deux piqûres, ce qui laisse la souffrance modérée déclarée pour les 60 souris sans description.
Objectifs
Validation in vivo d'une immunothérapie à ARN contre les parasites persistants à l'intérieur des cellules. Ce projet propose une approche innovante pour traiter le parasite appelé toxoplasme en ciblant non pas directement le parasite dormant, mais les cellules qui l’hébergent sous forme de kyste. En s’inspirant des stratégies d’immunothérapie développées contre les rechutes du cancer et la vaccination contre le Covid-19, notre objectif est de stimuler une réponse capable de détruire de façon ciblé les cellules infectées par les kystes, via une thérapie à ARN. Nous testons une immunothérapie à ARN dans un modèle murin infecté par le toxoplasme. En ciblant des protéines capables d’activer les cellules immunitaires cytotoxiques, nous espérons éliminer les cellules infectées par les kystes. Ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité, la sécurité et la réponse immunitaire de cette approche innovante.
Bénéfices attendus
L’approche que nous proposons, est une première étape de validation d’une nouvelle stratégie thérapeutique adapté à l’infection de la souris par le toxoplasme extrapolable à l'ensemble de ses hôtes mammifères . Cette méthodologie pourrait ensuite être étendue à d’autres infections parasitaire à formes dormantes.
Procédures
Les interventions qui peuvent causer des nuisances sont (1) l'inoculation dans le bas ventre de 100 µL d'une souche avirulente pour la souris (la durée de cette intervention est estimée à 15 secondes) et (2) l'inoculation de l’immunothérapie de 50 µL en intramusculaire dans chacune des 2 pattes postérieures soit 100 µL au total (la durée de cette intervention est estimée au maximum à 30 secondes par injections soit 2 x 30 s), qui peuvent entrainer une gêne sur un laps de temps très court. Ces interventions seront réalisées une seule fois pour chaque souris.
Impact sur les animaux
La souche de toxoplasme inoculée est sélectionnée pour sa non virulence pour la souris. Elles ne provoquent pas de symptômes cliniques ni de souffrance notable chez les animaux, ce qui garantit une charge parasitaire suffisante pour l’étude tout en préservant leur bien-être. Le protocole inclura un suivi rigoureux des animaux qui seront surveillés quotidiennement afin de détecter tout signe de détresse ou d'effet indésirable en lien avec le traitement. Les seules nuisances ou effets indésirables potentiellement attendus sont liés à l'injection vaccinale : 2 injections intramusculaires de 50 µL chacune, même si les traitements à ARNm (vaccins COVID-19 ou immunothérapies anticancéreuses) ont démontré une innocuité préclinique solide chez la souris.
Devenir
Les animaux ayant été infectés par un agent pathogène, les souris seront systématiquement mises à mort après avoir été au préalable endormis en fin de procédure.
Remplacement
Le remplacement n’est pas possible à ce stade du projet. L’objectif est de valider in vivo un traitement à base d’ARN visant à éliminer les formes dormantes de parasites intracellulaires. Les mécanismes immunitaires complexes ne peuvent être reproduits de manière fiable in vitro. Le modèle murin infecté par le toxoplasme est actuellement le seul disponible pour reproduire une infection chronique à formes dormantes.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été strictement limité. L’expérience sera conduite en duplicat sur trois groupes de 10 souris seulement, soit un total de 60 animaux, ce qui représente un compromis entre puissance statistique et minimisation du nombre de sujets. Ce design expérimental a été optimisé pour maximiser l’information obtenue par animal.
Raffinement
Un soin particulier sera apporté au bien-être des animaux tout au long de l’étude. Du fait du faible nombre de souris inclues dans l’étude les souris inoculées seront hébergées dans des cages pouvant contenir plus de souris d’après les normes en vigueur. Les souris font l’objet d’un enrichissement dès leur mise en cage et jusqu’à la fin de l’expérimentation. Les souris recevront un traitement antalgique en cas de symptôme afin d'éliminer toute douleur potentielle liée à la procédure. L’infection sera induite par une souche adaptée à l’établissement d’une infection chronique sans signes cliniques pour la souris, ce qui permet d’éviter toute souffrance chez ces dernières. Les animaux seront anesthésiés et sous antalgique pour minimiser tous risque de stress et souffrance au cours de l'injection du traitement en intramusculaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter précocement tout signe de détresse ou de dégradation de l’état général et la fréquence d’observation est accentuée (deux à trois fois par jour au lieu d’une seule) en cas de symtômes. Des critères d’arrêt (score clinique) seront mis en place pour garantir leur prise en charge immédiate si nécessaire.
Choix des espèces
Les souris (Mus musculus) sont l’animal de choix pour l'entretien du parasite. Mis à part le chat domestique, la souris représente l'espèce animale de laboratoire la plus adaptée pour l'isolement et l'entretien de souches de toxoplasmes (le modèle rat par exemple ne permet pas le maintien des souches). Elle est utilisée par l'ensemble des équipes de recherche internationale qui travaille sur la culture in vivo du toxoplasme. Des souris femelles (âgées de 4 à 8 semaines) seront utilisées pour la mise en place d'une infection chronique par le toxoplasme et tester la réponse au traitement ARN. L’âge des animaux utilisés dans nos procédures correspond à une taille et un poids de l’animal minimum pour lequel l’injection des volumes d’inoculum et de traitement envisagés sont bien tolérés.
Etude des mécanismes moléculaires de la lymphomagenèse dépendante de REL dans les lymphocytes B : rôle de la stimulation antigénique et des partenaires oncogéniques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 938 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 668 d'entre elles et modéré pour 3 270. Le protocole prévoit des gavages jusqu'à trois fois par semaine, des injections intrapéritonéales pouvant se répéter chaque mois pendant douze mois, des injections intraveineuses et sous-cutanées, des biopsies de queue et des prélèvements sanguins sous anesthésie. Leurs modifications génétiques les font développer des lymphomes B spontanés, avec perte de poids et affaiblissement général, la mise à mort intervenant au-delà de 20 % de poids perdu ou en fin de procédure pour analyser les tissus. Une partie des souris au génotype voulu échappe à cette issue immédiate pour devenir fondatrices des lignées suivantes, et le porteur affirme qu'il est "indispensable" de valider in vivo ce que les lignées cellulaires ont mis en évidence.
Objectifs
Nous nous intéressons aux mécanismes moléculaires de la cancérogenèse des lymphocytes B. Pour ce faire, nous développons des modèles de souris transgéniques de lymphomes B. Notre objectif global est de mieux comprendre les processus de transformation des lymphocytes B pour à terme permettre une meilleure prise en charge thérapeutique de ces cancers. L'étude des mécanismes de lymphomagenèse B est réalisée grâce à l'obtention de souris génétiquement modifiées, i.e. par addition ou élimination d'un gène à un locus donné). Le présent projet consiste en l'étude de l'effet d'une dérégulation de NF-kappaB sur le développement d'un lymphome B.
Bénéfices attendus
Aborder la problématique des lymphomes B, notamment l’étude des phases précoces de la cancérogenèse, est impossible au plan expérimental chez l’humain. Les modèles murins génétiquement modifiés de lymphomes B humains sont donc indispensables pour élucider les conséquences in vivo d’oncogènes, pour en disséquer les mécanismes moléculaires et pour tester de nouvelles modalités thérapeutiques. Nos résultats devraient aboutir à proposer de nouveaux biomarqueurs prédisant l’évolution de ces lymphomes et la réponse thérapeutique.
Procédures
Les animaux sont soumis à des gavages (durée =10 secondes ; 3 gavages par semaine au maximum ; ou 1 gavage par semaine pendant 3 semaines), des injections intrapéritonéales (durée =5 secondes ; 1 ou 2 injections par semaine pendant maximum 4 semaines ; ou 1 injection par mois pendant maximum 12 mois), intravéneuses (durée =60 secondes ; 2 injections au total à 4 semaines d'intervale) et sous-cutanées (durée =10 secondes sous anesthèsie ; une seule fois ou 1 fois par semaine pendant 2 semaines). Les prélèvements (biopsie caudale et sang) sont réalisés sur animaux anesthésiés exclusivement.
Impact sur les animaux
Les modifications génétiques réalisées sur les différents modèles animaux sont susceptibles d’entraîner le développement spontané de tumeurs de type lymphome B. L’apparition de ces tumeurs peut entraîner une perte de poids et un affaiblissement de l’état général de l’animal. La piqure d’aiguille pour l’injection de molécules thérapeutiques ou d’un agent immunisant (globules rouges de mouton ou NP-CGG) en intrapéritonéal/sous-cutanée/intraveineux entraîne une douleur légère de courte durée ainsi qu'un stress de courte durée. La biopsie caudale pour le génotypage entraîne une douleur légère de courte durée. Le prélèvement de sang en sous-mandibulaire entraine une douleur légère de courte durée et est limitée par une anesthésie vétérinaire (Isoflurane). Le gavage est réalisé sur animal vigile et entraîne un stress de courte durée.
Devenir
A l'issu de la procédure 1, les animaux avec un génotype d'intérêt sont engagés dans les procédures 2/3 ou sont mis à mort en vue d'analyse ex vivo ou seront les fondateurs. A l'issu des procédures 2/3/4, les animaux sont euthanasiés afin d'analyser les tissus et les cellules d'intérêts.
Remplacement
L'établissement de lignées cellulaires a largement permis d'améliorer nos connaissances de la biologie du cancer. Mais le cancer est une pathologie complexe avec des interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules normales environnantes (telles que les cellules du système immunitaire) qui participent à la prolifération et la survie des cellules tumorales, à l'angiogenèse et à la formation de métastases. Considérer l'organisme dans son ensemble est donc nécessaire en cancérologie. De ce fait, il est indispensable de valider ou d'invalider in vivo les mécanismes de transformation mis en évidence in vitro sur lignées cellulaires, ceci grâce à l'utilisation de modèles animaux. Ces modèles apportent ainsi la possibilité d'apprécier la dynamique du processus transformant au cours du développement de la cellule B et de tester in vivo de nouvelles molécules chimiothérapeutiques afin d'identifier celles avec un vrai potentiel thérapeutique chez l'homme. Les souris constituent le meilleur modèle d'étude de la cancérogenèse grâce à leur petite taille, leur capacité de reproduction (temps de gestation de 21 jours, nombre de bébés par portée intéressant), leurs similarités physiologiques et moléculaires avec l'homme et leur génome en totalité séquencé. Cela en fait d'ailleurs une espèce de référence reconnue dans le domaine de la recherche internationale.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, des expériences d'optimisation ont été réalisées ainsi plusieurs analyses (histologiques, cellulaires, moléculaires et génétiques) seront réalisées sur un même organe d’intérêt (sang, moelle osseuse, rate et ganglions lymphatiques à minima). Nous savons optimiser l’utilisation de chaque prélèvement afin de réduire au maximum le nombre animaux engagés dans une procédure expérimentale. Par exemple pour les analyses histologiques, un même organe est systématiquement inclus en paraffine et également, congelé. Les analyses cellulaires comprennent de la culture cellulaire ex vivo et de la cytométrie de flux. Le reste des cellules sera congelé en vue d’extraction d’ARN, d’ADN ou de protéines pour les analyses moléculaires. Les expériences sont organisées dans un ordre précis, avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Nous pourrons ainsi faire des analyses statistiques fiables pour l'ensemble des tissus d'intérêts et des approches techniques souhaitées. Le nombre d'animaux engagé dans chaque procédure est donc déterminé par une approche statistique afin de produire des résultats fiables.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. De plus, l’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux, notamment en ayant recours à l’anesthésie et à la prise d'un antalgique. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et qualifié. Lors de la manipulation quotidienne, une grille de score sera mise en place pour un meilleur suivi des animaux. Les prélèvements de sang et de queues seront tous réalisés sous anesthésie et par du personnel qualifié maitrisant ces gestes. Les animaux sont maintenus sous surveillance jusqu’à leur réveil. L'observation régulière des animaux et le suivi de leur comportement permettra d’avoir un contrôle sur leur état de santé. Un protocole de gestion de la douleur est établi et mis en place dès que le score de douleur établi lors des surveillances quotidiennes le prévoit. La prise d'un antalgique est prévu selon la grille de score.
Choix des espèces
Les souris constituent le meilleur modèle d'étude de la cancérogenèse grâce à leur petite taille, leur capacité de reproduction (temps de gestation de 21 jours, nombre de bébés par portée intéressant), leurs similarités physiologiques et moléculaires avec l'homme et leur génome en totalité séquencé. Cela en fait d'ailleurs une espèce de référence reconnue dans le domaine de la recherche internationale. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes, âgées au minimum de 7 à 8 semaines, âge où la lymphopoïèse est mature. Dans le cadre de toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés s’ils présentent des signes de souffrance repérés grâce à la surveillance quotidienne et la grille de score : perte de poids >20 %, aspect physique externe altéré (aspect du poil, selles, respiration) et anomalies du comportement (dynamisme, posture).
ÉTABLISSEMENT D’UN MODELE MURIN DE MYASTHENIE GRAVE (FORME MUSK) SUR FOND GENETIQUE C57BL/6 ET ADAPTATION A UN MODELE TRANSGENIQUE
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
60 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à douze injections d'une protéine musculaire accompagnée d'un adjuvant, en quatre points du corps et à trois reprises espacées de quatre semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer une nécrose ou un durcissement de la peau, et que les souris développent pendant douze semaines une faiblesse musculaire et une mobilité réduite. Un électromyogramme sous anesthésie et un prélèvement sanguin terminal closent l'étude, avant la mise à mort de tous les animaux pour collecte des organes. Le projet construit le modèle de myasthénie MuSK qui servira ensuite à sélectionner des médicaments, et le porteur présente comme un bénéfice pour les souris le fait d'améliorer les conditions de l'expérience qu'il leur impose.
Objectifs
La Myasthénie Gravis (MG) est une maladie auto-immune qui perturbe la communication entre les nerfs et les muscles, qui a pour conséquence une faiblesse musculaire et une fatigabilité impactant fortement la qualité de vie des patients pouvant aller jusqu’à l’isolement social. L’incidence de cette maladie est estimée entre 3 et 28 personnes sur 1 million avec plus de 700000 patients atteints dans le monde. Les traitements actuels sont essentiellement des immunosuppresseurs qui nécessitent des mois de traitements et qui sont souvent associés à des effets secondaires lourds. De plus, 10 à 15% des patients sont résistants à ces traitements. La MG est causée par la production d'auto-anticorps attaquant les molécules de la jonction neuromusculaire, perturbant la transmission des signaux entre nerfs et muscles. La plupart des patients produisent des auto-anticorps contre le récepteur de l’acétylcholine (AChR), mais certains présentent des auto-anticorps ciblant la kinase spécifique du muscle (MuSK), essentielle pour une bonne communication nerveuse et musculaire. Ce projet vise à développer un modèle de MG forme MuSK chez la souris, car aucun modèle in vitro ne récapitule la complexité biologique de cette pathologie. Le projet consiste à administrer aux souris tout ou une partie de la protéine MuSK pour que leur système immunitaire produise des anticorps contre cette protéine, perturbant ainsi la communication nerf/muscle et reproduisant la pathologie observée chez les patients. Pour induire une réaction immunitaire, un adjuvant est ajouté, optimisant la production de ces auto-anticorps. Les études réalisées dans le cadre de ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques (prélèvements sanguins pour notamment doser la présence des anticorps en cours d’étude et prélèvements d’organes en fin d’étude pour valider l’expression des cibles thérapeutiques). Ces études seront réalisées sur des souris génétiquement modifiées ou non pour un gène/cible d’intérêt impliqué dans la maladie. Nous prévoyons une étude de mise au point du modèle en comparant le protocole bibliographique à un protocole apportant des améliorations éthiques (adjuvant) (36 souris). Dans un second temps nous souhaiterions adapter ce protocole sur une souris génétiquement modifiée (sans phénotype dommageable) d’intérêt pour un de nos projets et tester l’intérêt d’immuniser avec tout ou partie du domaine extracellulaire de la protéine MuSK (24 souris) soit 60 souris au total pour ce projet.
Bénéfices attendus
Dans le processus de développement d’un nouveau médicament, ce type d’étude se fait après des tests en laboratoire sur des cellules et des simulations informatiques. L'objectif est de mettre au point un modèle murin de MG forme MuSk en apportant des améliorations éthiques au protocole de référence. Les bénéfices attendus sont les suivants : 1. Affiner le modèle de la pathologie MG forme Musk sur les souris, en réduisant au maximum leur souffrance et en améliorant les conditions des expériences. 2. Proposer un modèle permettant de sélectionner les médicaments qui ont un effet positif sur les mécanismes de la MG forme Musk, avant de passer aux essais cliniques, et offrir ainsi une nouvelle option de traitement.
Procédures
- Immunisation par l’agent inducteur (protéine + adjuvant) de la pathologie/du modèle : l’immunisation se fait 4 fois par jour (4 injections à 4 sites différents), 1 jour toutes les 4 semaines, et cela jusqu’à 3 fois, moins de 30 secondes pour chacune des 4 injections - Administration d’un anti-douleur au préalable des immunisations par l’adjuvant le nécessitant (30 secondes par administration) - Prélèvement de sang (faible volume, moins de 30 secondes) avec une fréquence en accord avec les recommandations de la structure de Bien-Etre Animal : jusqu’à 3 prélèvements sur les 13 semaines que dure l’étude - Electromyogramme (étude de la fonction des nerfs et des muscles) sous anesthésie générale avec utilisation d’électrodes musculaires réalisé une seule fois par souris (en fin d’étude) - Prélèvement de sang terminal sous anesthésie générale et analgésie (une seule fois, 30 secondes) - Pour la 2ème phase du projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées élevées et commercialisées par un éleveur : préalablement à leur expédition dans notre établissement utilisateur, elles auront eu un prélèvement de tissus (biopsie de l’extrémité de la queue) pour confirmer leur modification génétique.
Impact sur les animaux
Selon les données de la littérature, les nuisances estimées sont les suivantes : 1. Administration de peptide avec adjuvant (4 sites d’administration, jusqu’à 3 jours d’immunisation espacés de 4 semaines) : moins de 30 secondes par injection, 3 fois. Risque de nécrose ou durcissement de la peau (douleur modérée) dans les jours suivant les administrations et dépendant du type d’adjuvant (risque accru avec l’adjuvant de l’article de référence pondéré par l’administration préventive 5 minutes avant d’un antalgique). 2. Prélèvements de sang : 30 secondes maximum 3 fois. Stress et douleur ponctuels (douleur légère). 3. Développement de myasthénie gravis sur maximum 12 semaines : Faiblesse musculaire et réduction de la mobilité (souffrance modérée), sans atteindre des signes cliniques sévères 4. Electromyogramme : 5 électrodes sous anesthésie gazeuse en fin d’étude : Stress léger (une fois, 10 minutes) 5. Prélèvement de sang terminal sous anesthésie et analgésie : Sans réveil, donc sans douleur post-procédure.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour la collecte des organes et tissus nécessaires pour les analyses in vitro des échantillons (immunohistochimie, etc) nécessaires à la caractérisation complète du modèle.
Remplacement
La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. Néanmoins, l’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est pas possible de modéliser complètement in vitro, c’est pourquoi nous souhaitons établir ce modèle vivo.
Réduction
Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle, et un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe pour de futures études (sur une nouvelle DAP ultérieurement). La technique de micro-prélèvement décrite en 5.10.3 pour réaliser les prélèvements sanguins permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet.
Raffinement
Des prélèvements de sang répétés sont réalisés à différents temps afin de mesurer en cinétique les paramètres biologiques d’intérêt. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique de micro-prélèvements de la souris, réalisable plusieurs fois sur un même animal en respectant les bonnes pratiques, les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. L’adjuvant de référence (dont le but est d’activer le système immunitaire et le rendre plus sensible à l’agent qui va induire le modèle) sera associé à l’administration d’un antidouleur 5 minutes avant l’administration de l’adjuvant. Nous évaluerons cependant un second adjuvant, jamais utilisé dans ce modèle, mais connu pour être mieux toléré, dans l’optique de raffiner ce modèle. L’alternative d’immunisation en sous cutanée dans le mollet plutôt que dans la voute plantaire sera mise en place dès la première étude afin de diminuer le risque de douleur. Des points limites spécifiques à ce modèle ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
L’espèce murine est exclusivement utilisée dans la bibliographie pour reproduire ce type de pathologie de par sa transposition à l’homme et la possibilité d’utiliser des souris transgéniques permettant d’évaluer la cible humaine. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 6 semaines, tel que décrit dans la littérature de ce modèle (en comptant les premières étapes de pesées avant le début d’induction de la pathologie à 8 semaines).
Evaluation de l’activité anti-tumorale de composés chez la souris porteuse de tumeur murine orthotopique du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
Jusqu'à trois administrations par jour pendant deux mois, après une ouverture de l'abdomen pour greffer des cellules tumorales directement dans le pancréas : 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever le sang, la tumeur et d'autres organes. Elles portent une tumeur abdominale dont l'évolution provoque une douleur que le porteur qualifie de modérée, avec un risque de métastases. Le projet sert à affiner la présélection de candidats médicaments déjà testés sur des souris greffées sous la peau dans un autre projet. Le porteur décrit ce modèle comme plus invasif que le modèle sous-cutané, et le retient parce que la tumeur se développe dans son organe d'origine.
Objectifs
Le cancer du pancréas est l'un des cancers les plus graves, avec seulement 10-13% de chances de survie à 5 ans. La détection tardive, souvent à un stade avancé avec des métastases, est la principale raison de ce faible taux de survie. Les traitements disponibles incluent la chirurgie, possible pour seulement 10-20% des patients. La plupart reçoivent chimiothérapie et/ou radiothérapie, avec de nombreux effets secondaires et une survie prolongée de quelques mois. En raison de son microenvironnement tumoral très dense, qui agit comme une barrière physique face aux traitements, le cancer du pancréas reste l’un des cancers les plus difficile à traiter. Dans ce contexte, ce projet vise à tester de nouveaux candidats médicaments sur un modèle de cancer du pancréas chez la souris. Les modèles couramment utilisés impliquent l'implantation de cellules de cancer du pancréas sous la peau de la souris. Cependant, ces modèles ne reproduisent pas entièrement le microenvironnement qui entoure les tumeurs présentes chez les patients. Les études liées à ce projet utiliseront le modèle orthotopique, qui consiste à implanter des cellules de cancer du pancréas par voie chirurgicale directement dans le pancréas de la souris (greffe orthotopique). Ce modèle est plus invasif que le modèle sous-cutané mentionné ci-dessus, mais il est plus pertinent car la tumeur se développe dans son organe d'origine et permet de recréer un environnement similaire à celui observé chez l'homme. Les études réalisées dans le cadre de ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques : prélèvements sanguins pour notamment détecter la présence de biomarqueurs et prélèvements d’organes terminaux pour, entre autres, valider l’expression des cibles thérapeutiques. Les composés seront testés seuls ou en combinaison, ajustant doses, voies d'administration, fréquence des administrations, pour espérer une régression partielle ou totale de la tumeur. L'objectif est de proposer de nouvelles options thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des patients atteints de cancer du pancréas.
Bénéfices attendus
Dans le processus de développement d’un nouveau médicament, ce type d’étude se fait après des présélections in vitro sur des cellules et des simulations informatiques. L’objectif est ensuite de pouvoir tester et sélectionner les meilleurs candidats médicaments dans un premier temps dans le modèle de souris greffées par les tumeurs sous la peau, modèle le plus couramment utilisé (autre projet). Puis dans un second temps, la mise en œuvre de ce projet va permettre d’affiner cette pré-sélection sur ce modèle orthotopique qui requiert de la chirurgie. Les bénéfices attendus sont : 1-Poursuivre la sélection d’un ou plusieurs candidats médicaments dans un modèle plus prédictif de la pathologie humaine 2-Prédire l’efficacité de ces candidats médicaments seuls ou en combinaison de composés chez l’homme dans le but d’améliorer la qualité de vie des patients et offrir une nouvelle option de traitement dans le cancer du pancréas
Procédures
- Chirurgie pour l’implantation des cellules tumorales dans le pancréas : cette chirurgie durera 30 minutes maximum et sera réalisée une seule fois sur l’animal avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, protocole analgésique pré-post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée). - Prélèvements de sang à la veine de la patte : Faible volume, avec une fréquence tout au long de l’étude pour une durée maximale de 3 mois (environ 20 secondes/souris). - Administration d’un composé ou d’une association de composés au maximum 3 administrations par jour (environ 30 secondes par administration), durée de traitement de 2 mois maximum. - Prélèvement terminal de sang réalisé sous anesthésie générale profonde en fin d’étude (une seule fois, environ 30 secondes/souris).
Impact sur les animaux
- Douleur modérée liée à la chirurgie lors de la greffe orthotopique avec une petite ouverture de l’abdomen une seule fois sur l’animal et de douleur modérée. - Douleur modérée liée à la présence de tumeur abdominale et à son évolution (risque faible de métastases) - Douleurs légères liées à l’administration d’un ou d’une association de composés à tester au maximum 3 administrations par jour pendant 2 mois maximum à raison d’une ou plusieurs fois par semaine, avec une durée d’environ 30 secondes /souris/ administration. - Douleurs légères à modérés lié à la (les) molécule(s) administrée(s) pouvant entrainer une nuisance pour l’animal pouvant induire un effet clinique (ex : modifications de la prise de poids, de l’activité locomotrice) - Stress et douleur légers ponctuels lors des prélèvements sanguins d’environ 20 secondes /souris - Douleur légère liée à l’administration d’analgésiques et/ou de l’induction d’anesthésie pour le prélèvement terminal de sang (une seule fois, environ 30 secondes/souris)
Devenir
A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui seront utilisés pour des études complémentaires ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs.
Remplacement
Des méthodes alternatives comme des tests in silico ou in vitro seront préalablement mises en place en amont des études concernées dans ce projet pour évaluer la pertinence et l’efficacité des composés à tester. Ces méthodes sont essentielles pour présélectionner les composés les plus prometteurs qui seront ensuite testés sur des modèles animaux. Ce projet vise à tester de nouveaux candidats médicaments sur un modèle de greffe de cellules cancéreuses murines du pancréas directement dans le pancréas de la souris (greffe orthotopique). Cette méthode permet à la tumeur de se développer dans un environnement similaire à celui d'un cancer du pancréas chez l'homme. Actuellement, il est difficile de recréer en laboratoire (in vitro) les interactions complexes entre une tumeur et son environnement. Même si de nombreuses initiatives sont en cours d’évaluation afin de proposer des méthodes alternatives, les modèles in-vitro actuels ne rendent pas compte de la complexité de l’interaction entre la tumeur, l’hôte et les traitements. Ils ne se prêtent pas au modèle que nous utilisons qui se veut le plus proche possible de la clinique humaine.
Réduction
Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui seront utilisés pour des études exclusivement in vitro ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir les échantillons nécessaires à ces études complémentaires. La technique de micro-prélèvement pour réaliser les prélèvements sanguins permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet en limitant l’utilisation d’animaux dédiés pour le prélèvement sanguin. De par notre expérience sur le modèle orthotopique lors d’études efficacité, nous évaluons à 10 souris par groupe le nombre de souris suffisant pour évaluer l’effet des composés avec un groupe contrôle et 4 groupes où différents composés et doses seront testé montrant que nous avons la robustesse statistique voulue.
Raffinement
Des prélèvements de sang répétés chez la souris sont réalisés à différents temps afin de mesurer en cinétique les paramètres biologiques d’intérêt. Ils sont effectués selon la technique de micro-prélèvements, réalisable plusieurs fois sur un même animal en respectant les bonnes pratiques, les volémies et les conditions physiologiques de la souris. La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie, avec : - Des espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie - Une anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie - Un maintien de la température corporelle de l’animal dès l’anesthésie - Une asepsie maintenue pendant toute la chirurgie. L’analgésie post-opératoire pourra si besoin être adaptée en termes de traitement administré et de durée en fonction des signes de douleurs observés et en concertation avec le vétérinaire. De plus une grille de scoring post opératoire et un suivi clinique quotidien tout au long de l’étude seront mis en place. L’évolution de la pathologie est surveillée et des points limites prédéfinis permettent d’éviter d’impacter le bien-être animal afin d’euthanasier avant que la tumeur impacte le bien-être animal. - Toutes voies confondues, le nombre d’administration sera réduit au minimum en privilégiant la co-formulation lorsque cela est possible. - Le nombre de contentions sera réduit lui aussi au minimum (ex. privilégier la même contention pour une administration intra-péritonéale et une administration per os).
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique en raison de sa pertinence biologique, sa capacité à fournir des données fiables, et son rôle crucial dans le développement de nouveaux traitements. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie puisque ce modèle récapitule de nombreuses caractéristiques des tumeurs pancréatiques chez l’homme. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines soit environ 18g. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.
Induction d’un syndrome métabolique (obésité, diabète, stéatose hépatique non alcoolique, …) par un régime riche en graisse et/ou en sucre chez des rongeurs (souris, rats)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 1000
Nourris pendant soixante semaines au plus avec un aliment riche en graisses et en sucres, 1 000 souris et 1 000 rats subissent jusqu'à 240 prélèvements sanguins pour mesurer leur glycémie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils développent obésité, diabète, dyslipidémie, insulinorésistance et stéatose hépatique pouvant aller jusqu'à la fibrose, la cirrhose ou un cancer du foie, et sont tous tués à l'issue sans pouvoir être réutilisés. Le protocole vise à vérifier qu'un aliment gras et sucré stérilisé par irradiation induit toujours le même état pathologique et que le modèle reste valide. Sur le dimensionnement de l'effectif, le porteur indique s'appuyer sur son savoir-faire et ses données historiques, et écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.
Objectifs
A l’échelle mondiale, les maladies liées au surpoids représentent une part non négligeable des décès estimés à plus de 1,2 million par an. En 2016, 650 millions d’adultes étaient obèses, soit 3 fois plus qu’en 1975. En 2021, le diabète affecte plus de 537 millions de personnes. La dyslipidémie et la stéatose hépatique non- alcoolique sont provoquées par le diabète et l’obésité. La dyslipidémie touche quelques milliers de patients chaque année en France et la société nationale française de gastro-entérologie considère qu’un quart de la population française est touché par la stéatose hépatique non- alcoolique. Par l'alimentation de rongeurs avec un régime riche en lipides et glucides, il est possible d'induire ces phénotypes spécifiques : obésité, dyslipidémie, diabète. Ce protocole a pour objectif de tester un aliment riche en lipides et/ou en glucides stérilisé par irradiation à différentes doses. L’étude permettra d’évaluer si le taux d’irradiation a un impact sur le modèle, en suivant notamment la prise de poids, le maintien du phénotype attendu et l’état général des animaux. Les observations recueillies permettront ainsi de vérifier si le modèle reste valide.
Bénéfices attendus
Ce projet aura des bénéfices pour l’homme. Ce projet pourra amener à long terme des solutions thérapeutiques pour traiter les syndromes métaboliques du surpoids et du diabète. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Les animaux auront à disposition un aliment standard et/ou un aliment riche en gras et/ou en sucre et une eau standard et/ou une eau additionnée de sucre, pendant 60 semaines maximum. Des prélèvements sanguins pour mesure de glycémie pourront être faits avec ou sans mise à jeun (mise à jeun de 4 à 6 heures maximum) sur les animaux en aigue (maximum 2 mesures par jour par animal, avec 3 jours de récupération entre 2 séries de mesures, ce qui fait 240 prélèvements maximum sur toute la durée du protocole) ou en chronique (une mesure par animal par semaine, ce qui fait 60 prélèvements maximum sur toute la durée du protocole). Une goutte de sang sera prélevée pour mesure de la glycémie sur une bandelette de glucose. La durée de prélèvement sera d’1 minute maximum.
Impact sur les animaux
Au fil de la prise alimentaire riche en gras et/ou sucre et d’un abreuvement standard ou riche en sucre, les animaux pourront exprimés des signes cliniques plus ou moins modérés. Les animaux vont développer une obésité et des syndromes métaboliques tels diabète, dyslipidémie, insulino-résistance, NASH pouvant aller jusqu’à une fibrose, une cirrhose ou un cancer du foie à long terme (après la phase préparatoire). Le prélèvement sanguin peut induire un léger stress transitoire et une légère douleur.
Devenir
En fin de protocole, les animaux ne pourront pas être réutilisés dans un autre projet et seront donc mis à mort selon les procédures en vigueur.
Remplacement
L’induction de modification métabolique chez l’animal fait intervenir plusieurs types cellulaires produisant des facteurs tendant à moduler ou amplifier la réponse. Toute cette cascade d’événement faisant intervenir des facteurs autocrines, paracrines ou exocrines aussi variés que complexes ne permet pas une étude significative et déterminante in vitro. Par ailleurs, l'objet de cette étude est d'évaluer l'impact sur une fonction vitale de l'organisme, ce qui ne peut être fait que sur un organisme vivant.
Réduction
Nous réalisons ce protocole alimentaire pour proposer un modèle animal pertinent avec un nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre l'objectif scientifique. Notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long de cette phase préparatoire. En cas d'anomalie clinique observée sur un animal, une grille de scoring général sera utilisée afin de déterminer l'atteinte de points limites et de décider du devenir de l'animal. Enfin, les contentions et prélèvements seront réalisés par un personnel formé et expérimenté.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur les maladies métaboliques liés au surpoids car elles développent naturellement ce type de pathologie ayant une affinité à la nourriture grasse et sucrée similaire à l’Homme. Les animaux pourront commencer le régime alimentaire à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). À cet âge, le métabolisme est encore en développement, ce qui permet une meilleure induction de l’obésité par le régime enrichi en graisses et/ou en sucre. De plus, une mise en place précoce du régime permet une meilleure standardisation entre les individus et augmente la robustesse du modèle DIO.
Évaluation de la sécurité préclinique des candidats médicaments chez les rongeurs et les non rongeurs
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 3600
Chiens : 400
Cochons : 320
Macaques à longue queue : 960
4 320 souris, 3 600 rats, 960 macaques à longue queue, 400 chiens et 320 cochons vont être utilisés dans des études de toxicité de candidats médicaments, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 9 240 d'entre eux sont tués pour l'examen anatomo-pathologique de leurs organes, environ 300 non-rongeurs réutilisés après avis vétérinaire et 60 proposés à l'adoption. Chaque animal reçoit le composé une fois ou de façon répétée pendant deux mois au plus, avec par exemple quinze prélèvements sanguins en un mois, des ponctions de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal sous anesthésie, et parfois la pose chirurgicale d'un implant vasculaire ou de télémétrie sous deux heures d'anesthésie générale. Le porteur écrit réaliser une cinquantaine d'études par an pour identifier tôt les candidats les plus prometteurs et concentrer les investissements, et affirme que les études sur animal vivant demeurent "indispensables" car aucun modèle alternatif ne reproduit la complexité d'un "organisme entier".
Objectifs
Objectifs du projet Le développement d'un médicament nécessite plusieurs années de Recherche et Développement avant sa mise sur le marché. Les études précliniques de sécurité, réalisées en amont des essais cliniques, sont indispensables pour évaluer l'innocuité des candidats médicaments conformément à la réglementation exigeant une évaluation sur deux espèces mammifères : un rongeur et un non-rongeur (hormis cas particulier où une seule espèce est pertinente, par exemple pour certains anticorps). GLOBALEMENT, TOUTES ESPECES CONFONDUES, UN TOTAL D'ENVIRON 50 ETUDES EST REALISE CHAQUE ANNEE. Objectif principal : Réaliser des études de sécurité préclinique exploratoires pour évaluer les potentiels effets indésirables des candidats médicaments en amont des études réglementaires. Finalités : -Définir les effets toxiques potentiels des candidats médicaments -Identifier précocement les candidat médicament les plus prometteurs -Caractériser la toxicocinétique du candidat médicament -Soutenir la prise de décision en optimisant le design des études réglementaires (ex : choix d'espèces, doses, organes cibles, profil de risque) Méthodologie : Suivi clinique et biologique des animaux après administration unique ou répétée du candidat par voies d'administration cliniquement pertinentes, incluant : -des prélèvements de fluides biologiques (par exemple, sang, urines, liquide cérébro-spinal), -des évaluations fonctionnelles optionnelles (par exemple, cardiovasculaire, neurologique, immunitaire), -une approche intégrée permettant la réduction du nombre d'études.
Bénéfices attendus
L'un des bénéfices de ce projet est d'améliorer la protection des volontaires sains et patients et d'optimiser le développement pharmaceutique grâce à l'identification précoce des risques et la compréhension du profil toxicologique avant les études réglementaires et essais cliniques. Cette approche permet de concentrer les investissements sur les candidats les plus prometteurs, conduisant à une réduction significative des échecs dans les phases ultérieures de développement et une amélioration globale de l'efficacité du processus. Le second bénéfice est de fournir des informations critiques pour optimiser le protocole, la qualité et la pertinence des études réglementaires, permettant une sélection éclairée des espèces, des doses et des paramètres à surveiller. Cela se traduit par une estimation préliminaire des marges de sécurité, offrant une première évaluation du rapport entre doses efficaces et doses toxiques. L'identification précoce des organes cibles permet la détection des systèmes biologiques potentiellement sensibles, tandis que la définition de biomarqueurs permet d'identifier des indicateurs biologiques clés pour le suivi ultérieur. Ce projet apporte une valeur ajoutée scientifique et stratégique en permettant l'exploration des mécanismes de toxicité et la compréhension précoce des effets indésirables. Il facilite la prise de décision grâce à des données préliminaires qui orientent les choix de développement. L'approche éthique est renforcée par l'optimisation du nombre d'animaux utilisés dans les phases ultérieures. La flexibilité inhérente au projet permet d'ajuster rapidement les stratégies de développement, améliorant l'efficacité globale du processus et la réactivité face aux nouvelles données. Le projet intègre systématiquement plusieurs méthodes alternatives en amont dans notre stratégie d'évaluation, comme la modélisation informatique et les cultures cellulaires, permettant l'élaboration de protocoles complets pour déterminer le mode d'action des candidats médicaments, tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés. Le développement de nouvelles technologies comme l'analyse vidéo automatique et l'utilisation d'implants pour un monitoring continu ouvre de nouvelles perspectives (exemple : enregistrement et analyse en continu de paramètres cardiologiques sur animal vigile). Ces innovations permettront l'acquisition de nouveaux paramètres dans les études, alimentant des bases de données de référence comme celle des groupes contrôles.
Procédures
Les animaux vigiles seront concernés par l’administration unique ou répétée (quotidienne ou hebdomadaire) du candidat médicament, possibles par différentes voies (le plus souvent intra-veineuse ou orale), au cours de l’étude sur une durée maximale de 2 mois. Dans la majorité des études, les prélèvements réalisées sont des prélèvements de sang (ex : 15 prélèvements sur une durée d’un mois). Ils peuvent être complétés par des prélèvements d’autres fluides biologiques, associés à une contrainte légère de quelques minutes, qui seront nécessaires pour évaluer différents paramètres en début et fin d’étude ; leur fréquence et leur volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie (entre 15 et 30 minutes) quand ils sont invasifs (par exemple moëlle osseuse, liquide cérébrospinal). Des mesures comme par exemple, la température corporelle (avec puce électronique), le poids (2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. Plus rarement, une procédure chirurgicale pourra être pratiquée chez les non-rongeurs afin de mettre en place un implant vasculaire ou de télémétrie pour mesurer par exemple les ECG et la pression artérielle (durée d’intervention sous anesthésie générale-analgésie d’environ 2 heures).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables seront limités à une contrainte modérée. L’administration du composé lui-même peut provoquer une altération de l’état général se traduisant par exemple par une baisse d’activité, une perte de poids, des modifications de la température corporelle et du comportement. Les nuisances liées à la procédure (contention, administration, prélèvements de fluides ou tissus biologiques, etc.) se traduisent par un stress, une douleur de courte durée. Dans les rares cas où une chirurgie sera pratiquée, elle est susceptible d’entrainer dans les 48 heures post-opératoires une douleur légère, une baisse d’appétit et une légère baisse d’activité.
Devenir
Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus, la quantification de l’exposition tissulaire du candidat médicament et/ou l’analyse de l’impact sur la cible. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.
Remplacement
Les études sur animal vivant demeurent indispensables car aucun modèle alternatif ne reproduit actuellement la complexité d'un organisme entier. Seul l'animal permet d'observer les interactions entre systèmes physiologiques (cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, etc.) et les effets systémiques des candidats médicaments. Cette approche est essentielle pour détecter des toxicités résultant d'interactions complexes entre organes, de métabolisations successives ou d'effets cumulatifs impossibles à modéliser intégralement in vitro. Plusieurs méthodes alternatives sont systématiquement intégrées en amont dans notre stratégie d'évaluation : Modélisation in silico : algorithmes prédictifs anticipant les propriétés toxicologiques des molécules basées sur leur structure chimique et caractéristiques physico-chimiques. Cultures cellulaires avancées : cultures primaires ou lignées cellulaires spécifiques pour évaluer la cytotoxicité et les mécanismes d'action moléculaires. Organes sur puce (organ-on-chip) : dispositifs microfluidiques reproduisant partiellement la structure et fonction d'organes spécifiques (foie, cœur, rein, barrière hémato-encéphalique) pour étudier les effets organotypiques. Organoïdes : cultures tridimensionnelles mimant l'architecture tissulaire et certaines fonctions d'organes pour évaluer des toxicités spécifiques. Modèles ex vivo : tissus isolés pour étudier des effets localisés. Pour les produits biologiques (anticorps monoclonaux, protéines thérapeutiques, thérapies cellulaires et géniques), des défis supplémentaires existent : Spécificité d'espèce : nombreux produits biologiques présentant une spécificité d'espèce limitant le choix des modèles animaux pertinents. Tests de réactivité croisée : évaluation in vitro de la liaison croisée sur tissus humains et animaux pour sélectionner les espèces appropriées. Immunogénicité : réponses immunitaires indésirables difficilement modélisables in vitro. Modèles humanisés : animaux génétiquement modifiés exprimant les cibles humaines pour améliorer la prédictivité. Les approches alternatives sont systématiquement utilisées en amont pour : réaliser un premier criblage des candidats médicaments, éliminer précocement les composés présentant des signaux de toxicité évidents, orienter la conception des études in vivo en identifiant les organes potentiellement cibles, caractériser plus finement les mécanismes de toxicité observés in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (données bibliographiques et historiques, lignes directrices internationales et internes), et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les éventuels effets adverses. Les tests statistiques utilisables sont dépendants des paramètres étudiés, et peuvent être par exemple, une analyse de variance ou un test de tendance. La mise en place d’études combinant l’acquisition et l’analyse de paramètres de sécurité, pharmacodynamie et pharmacocinétique permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, l'utilisation d'animaux témoins n'est pas systématique et fait l'objet d'une réflexion approfondie en fonction des objectifs spécifiques de chaque étude. Par ailleurs, le recours à des bases de données contenant des données historiques d'animaux témoins se développe de plus en plus. Ces données constituent ce que l'on appelle des "groupes témoins virtuels" et permettent des comparaisons pertinentes sans nécessiter de nouveaux animaux témoins. Enfin, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le Vétérinaire clinicien, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés. La réduction est aussi renforcée par l’absence d’utilisation d’animaux contrôle, palliée avec les données virtuelles de groupe contrôle.
Raffinement
Pour certains gestes techniques ou l'utilisation de dispositifs de contention, une phase de désensibilisation/d'habituation est systématiquement mise en place en amont de l'étude. Cette approche vise à réduire significativement le stress de l'animal. Chaque manipulation est associée à un renforcement positif sous forme de récompenses physiques (caresses, encouragements vocaux) et/ou alimentaires, en fonction de la compatibilité avec le protocole d'étude. Les interventions chirurgicales sont réalisées en condition maximale d’asepsie avec la mise en place d'une analgésie multimodale pour assurer le confort de l'animal. Un suivi clinique quotidien permet une détection précoce de tout signe de douleur, d'inconfort ou de détresse. Des critères d'arrêt anticipés, su pervisés conjointement par le Directeur d'étude et le Vétérinaire clinicien, sont établis pour garantir que les animaux ne subissent pas de contrainte supérieure à un niveau modéré. Pour l’ensemble des espèces, l'environnement des animaux est enrichi par la diffusion d'un fond sonore adapté dans les zones d'hébergement et les aires de jeux (si applicable). Pour améliorer la surveillance, des systèmes de vidéosurveillance dédiés sont utilisés pour les chiens, les miniporcs ou les rongeurs (cages digitales). En complément de leur alimentation quotidienne, les primates non humains reçoivent des enrichissements alimentaires distribués individuellement à la main, dès leur arrivée afin de favoriser l'établissement d'une relation de confiance entre l'animal et l'expérimentateur. Pour certaines études, la surveillance des rongeurs est renforcée par l’utilisation de cages équipées de caméras. Afin de minimiser le stress lors des manipulations et à améliorer leur bien-être, les souris sont délicatement prises en coupe dans les mains. Pour les rats en particulier, des séances de « chatouilles » mimant le jeu social naturel des rongeurs sont régulièrement pratiquées avant et pendant l'étude.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est défini par : -Les lignes directrices internationales définissant que les études de Toxicologie Générale doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rat, souris, génétiquement modifiés ou non) et chez le non rongeur (chien, mini-porc ou primate non humain) -Les données scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le véhicule envisagé et les données disponibles (pharmacocinétique, métabolisme et de toxicologie). L’espèce utilisée doit être pertinente et est essentiellement fonction de la similitude du profil métabolique et des effets biologiques attendus chez l’Homme, afin de permettre l’extrapolation des données acquises à l’espèce humaine. Le choix de l’espèce non rongeur peut dépendre également de la modalité thérapeutique. Dans certain cas particulier (par exemple pour les anticorps), une seule espèce peut être pertinente. Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes, pour répondre aux exigences de la réglementation internationale et aux spécificités découlant des différents programmes de recherche.
Collecte de sang et les prélèvements tissulaires sur différentes espèces dans le but d’améliorer des méthodes analytiques et / ou pédagogique (MODIFICATION)
- Enseignement supérieur
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Tests réglementaires
Rats : 100
Cochons d'Inde : 100
Hamsters dorés : 100
Lapins : 100
Chats : 50
Chiens : 50
Furets : 25
Cochons : 100
Prélevés de leur sang et de leurs tissus pour alimenter des travaux pratiques, la mise au point de méthodes analytiques et le développement de méthodes substitutives, 775 individus de neuf espèces vont être utilisés. Ils comptent 150 souris, 100 rats, 100 cochons d'Inde, 100 hamsters dorés, 100 lapins, 100 cochons, 50 chiens, 50 chats et 25 furets, 500 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil, 205 à un niveau de souffrance léger et 70 à un niveau modéré. Les prises de sang durent moins de deux minutes, sur animal vigile ou sous anesthésie brève, et les biopsies de peau moins de dix minutes, le porteur précisant que les rongeurs sont tués pour obtenir un volume de sang plus important. 275 individus, lapins, chats, chiens et cochons, sont réutilisés après un temps de repos, les autres sont tués puis servent à former des étudiants aux autopsies et aux gestes invasifs sur cadavres, et le résumé évoque un programme d'adoption sans en chiffrer les bénéficiaires.
Objectifs
Le but de ce projet est de pouvoir fournir des échantillons biologiques provenant d’animaux afin de permettre : 1) La réalisation de travaux pratiques (immunologie, histologie, etc.) 2) Le développement, l'amélioration ou le fonctionnement de méthodes analytiques 3) Le développement de méthodes substitutives à l'expérimentation animale (in vitro, in silico). Ces échantillons sont utilisés en tant que tels, ou utilisés comme pool de référence pour comparaison avec des échantillons issus d'études pré-cliniques. Pour certaines études cliniques, il est nécessaire de réaliser des prélèvements sur animaux sains. Notre établissement peut fournir ces échantillons pour éviter le prélèvement sur animaux de propriétaires si cela est pertinent.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont multiples, notamment de permettre la réalisation de travaux pratiques, dans le domaine de l'immunologie ou l'histologie. Ce projet permettra également de développer, d'améliorer et de participer au fonctionnement de méthodes analytiques. Pour terminer, ce projet permettra le développement de méthodes substitutives à l'expérimentation animale (in vitro, in silico).
Procédures
Dans ce projet, il s’agit principalement de permettre la collecte de sang ou le prélèvement de tissus (biopsie de peau, d'organes). Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile, ou sous anesthésie brève en fonction de l'espèce animale. Cet acte technique est très rapide (moins de 2 minutes) et le nombre de prélèvement dépendra des demandes, mais un temps de repos suffisant sera mis en place en fonction du volume de sang prélevé si l'animal doit etre reutilisé. Concernant les biopsies cutanées, cet acte sera très bref (moins de 10 minutes en fonction du nombre de biopsies par animal). En fonction de l'acte technique à réaliser et en fonction de l'espèce animale, les animaux pouront être anesthésiés. Cela nécessitera une injection pour induire l'anesthésie (acte d'une durée de quelques secondes) et l'animal sera anesthésié pour une durée de 15 minutes maximum ou euthanasié si besoin.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles associées aux prélèvements biologiques : stress de la contention et de l’anesthésie (si applicable), hématome, douleur possible.
Devenir
Dans ce projet, la grande majorité des actes techniques à mettre en place sont peu invasifs. Ainsi, la plupart des animaux seront gardés en vie à l'issue de leur procédure, afin de pouvoir être réutilisés, après avis du vétérinaire sanitaire et de la structure chargée du bien-être animal, prenant en compte un temps de repos suffisant en fonction de la procédure qui a été effectuée sur l'animal, ainsi que leur état de santé et des possibilités de réutilisation. Les animaux qui devront être euthanasiés à l'issue de leur procédure (par exemple pour un prélèvement sanguin de volume important sous anesthésie et sans réveil) seront valorisés pour la formation initiale et continue : formation d'étudiants aux autopsies et à l'anatomie, formation de personnel technique ou d'étudiants vétérinaires à des gestes invasifs sur cadavres/pièces anatomiques. Ces animaux pourront également permettre l'obtention de prélèvements ou données nécessaires à des équipes de recherche. Le nombre d'animaux concernés dépendra des demandes et ce nombre ne peut pas être anticipé pour le moment. Enfin, certains animaux pourront entrer dans un programme d'adoption, en tenant compte de leur utilisation, de leur état de santé et de leur comportement. Il n'est pour le moment pas possible d'anticiper le nombre d'animaux qui seront adoptés.
Remplacement
La récupération de la matière biologique ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est basé sur la base de l'expérience de 5 ans précédents et sur les contraintes scientifiques (nombre suffisant d’animaux permettant le nombre de prélèvements nécessaire pour assurer la validation des méthodes analytiques). Les animaux pourront faire l'objet d'une réutilisation, dès lors que les prélèvements effectués n'impactent ni leur santé, ni leur bien-être (les prélèvements envisagés sont dans leur majorité peu invasifs). Cette réutilisation permet la réduction du nombre d'animaux utilisés. Par ailleurs, la réalisation de ces prélèvements peut permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans d'autres projets, ou permettre le développement de méthodes de substitution à l'expérimentation animale.
Raffinement
Période d’acclimatation systématique (durée selon l'espèce animale, mais toujours minimum 1 semaine). Animaux hébergés en groupe. Paramètres d’ambiance des salles surveillés avec possibilité de modifier la température, afin d’optimiser le bien-être des animaux. Les animaux ont accès à un enrichissement spécifique à leur espèce. Des points limites, suffisamment prédictifs, permettront de sortir un animal de l’étude afin de limiter la douleur à son minimum. Prélèvements biologiques réalisés dans un contexte de renforcement positif par personnel maitrisant ces actes techniques. Si des prélèvements avec volumes sanguins importants sont à réaliser, alors nous prendrons systématiquement en compte le poids des animaux, afin de respecter un certain volume sanguin total à prélever, prenant en compte le volume sanguin total circulant chez l’animal, et prenant en compte un temps de repos nécessaire ensuite. Pour la collecte de sang chez les rongeurs, afin d'avoir un volume plus important, les animaux seront euthanasiés à la fin de la procedure. Les biopsies cutanées sont sous anesthésie locale. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de la procédure (observation quotidienne et suivi clinique avec pesée minimum une fois par semaine. Quelles que soient les procédures, la douleur est, si nécessaire, rigoureusement contrôlée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (anesthésie/analgésie).
Choix des espèces
L'espèce choisie correspondra à la demande de tissu / fluide, en fonction des analyses à réaliser. Le choix d'espèce a été basé sur l'historique de notre établissement. Par exemple pour le réglage d'une méthode analytique destinée au chien, un pool de sang de chiens sains sera fourni. Le stade de développement sera choisi en fonction des besoins analytiques ou de formation : la plupart du temps des animaux adultes seront utilisés (valeurs physiologiques normales et stables, tissus pleinement développés), mais des animaux plus jeunes pourront être utilisés pour des besoins particuliers (investigations sur des paramètres d'animaux immatures par exemple).
Rôle des macrophages dans la cicatrisation cardiaque après un infarctus
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Une chirurgie d'une heure et demie sous anesthésie interrompt puis rétablit l'irrigation du cœur de chaque animal, suivie de six injections d'analgésique sur trois jours. 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour que leur cœur soit récupéré et analysé. Le projet cherche à préciser le rôle des macrophages dans la cicatrisation du muscle cardiaque après un infarctus, et notamment dans la résorption de la cicatrice. Le résumé décrit jusqu'à sept injections d'un "produit non douloureux" sans dire lequel, et justifie les effectifs par l'expérience antérieure de l'équipe sans donner de calcul ni de nombre d'animaux par groupe.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’étudier la phase de cicatrisation du muscle cardiaque à la suite d’un infarctus du myocarde en s’intéressant plus particulièrement au rôle des macrophages, une population de cellules immunitaires impliquée à la fois dans l’élimination des cellules lésées et dans les mécanismes de réparation tissulaire. Si la cicatrisation constitue, en principe, un processus bénéfique visant à restaurer l’intégrité tissulaire, elle peut également avoir des effets délétères sur l’organe concerné. Dans le contexte de l’infarctus du myocarde, la formation initiale de la cicatrice permet de contenir les dommages ; toutefois, à long terme, elle peut évoluer vers une fibrose pathologique, caractérisée par le remplacement progressif du tissu musculaire par un tissu fibreux non contractile. Ce remodelage fibrotique altère la fonction cardiaque et peut conduire à une insuffisance cardiaque. Plus l’étendue de la fibrose est importante, plus la perte de fonction myocardique est sévère. On sait que les macrophages jouent un rôle essentiel, généralement bénéfique, à la fois dans les premières étapes de la cicatrisation, mais aussi dans la phase de résorption du tissu cicatriciel et dans la limitation de la fibrose. Notre objectif est de mieux comprendre, dans le détail, le rôle exact de ces cellules et leur mécanisme d’action. + Quelle est l’importance réelle des macrophages dans la cicatrisation du myocarde à la suite d’un infarctus ? + Les macrophages ne formant pas une population parfaitement homogène, quelles sont les caractéristiques de ceux impliqués dans la résorption de la cicatrice ? + Quels sont les mécanismes cellulaires intervenant dans la résorption de la fibrose par les macrophages ? Ces connaissances fondamentales pourraient, à terme, être appliquées à des objectifs médicaux comme la mise au point de traitements des séquelles cicatricielles de l’infarctus du myocarde.
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet, nous approfondirons notre compréhension du rôle des macrophages dans la cicatrisation cardiaque post-infarctus. Nous nous attacherons notamment à distinguer les fonctions spécifiques des macrophages adultes par rapport à celles des macrophages résidents d’origine embryonnaire. Cette étude nous permettra de préciser leur implication non seulement dans le processus de cicatrisation initiale, mais également dans la résorption de la cicatrice, la revascularisation des tissus lésés, ainsi que dans la modulation de l’hypoxie cellulaire associée. Bien que ce projet relève, pour l’instant, principalement de la recherche fondamentale, il s’inscrit clairement dans une perspective médicale. Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans la guérison du cœur après un infarctus pourrait, à long terme, nourrir des approches plus appliquées en recherche clinique. Actuellement, l’intervention médicale post-infarctus repose essentiellement sur une prise en charge rapide, visant à limiter les lésions aiguës. Cependant, si la cicatrisation qui s’ensuit est indispensable à court terme, elle peut engendrer des effets délétères à long terme, notamment par l’excès de tissu fibreux non contractile. Notre étude pourrait ainsi contribuer, à terme, au développement de stratégies thérapeutiques destinées à contrôler l’extension du tissu cicatriciel et à favoriser la régénération d’un myocarde fonctionnel.
Procédures
1) Injection de produit non douloureux (quelques secondes par animal) entre une et 7 fois (sur une période de 10 jours) 2) Injection de produit non douloureux (une minute par animal) 2 injection 30 mn et 5 mn avant la mise à mort 3) Intervention chirurgicale sous anesthésie provoquant un infarctus cardiaque transitoire. Fréquence et durée :intervention unique, d’environ 1 heure 30 minutes par souris 4) Injections d’analgésie : 6 injections sur 3 jours (toutes les 12 heures) en post-opératoire sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les injections même lorsqu’elles sont répétées, n’entraînent qu’une gêne légère et de courte durée pour les animaux, les produits administrés n’étant pas douloureux. Concernant les interventions chirurgicales, l’ischémie induite au cours de l’intervention est transitoire, et les animaux récupèrent rapidement, généralement dans les 24 heures suivant la chirurgie, sans signes de pathologie ni de souffrance post-opératoire. En conclusion, l’ensemble des procédures envisagées n’induiront qu’un inconfort modéré et transitoire, maîtrisé par des mesures adaptées d’analgésie et de soins post-opératoires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer et analyser le cœur.
Remplacement
L’étude du fonctionnement du cœur et des mécanismes de cicatrisation après un infarctus ne peut être réalisée que sur l’animal vivant, aucun modèle in vitro ne permettant, à ce jour, de reproduire de façon fiable la complexité de ces processus. Il n’existe pas non plus de système artificiel capable de refléter fidèlement le fonctionnement global du système immunitaire d’un organisme adulte. Le recours à un modèle animal est donc indispensable pour cette recherche. Il permet de reproduire de manière réaliste l’interruption de l’irrigation cardiaque, le microenvironnement tissulaire post-lésionnel, ainsi que la réponse immunitaire, à la fois locale et systémique, impliquant le recrutement cellulaire via la circulation sanguine. Ce modèle offre également la possibilité d’étudier directement les interactions entre les macrophages et d‘autres cellules cardiaques.
Réduction
Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en s’appuyant sur notre expérience antérieure ; - en fonction de la nature des expériences et des paramètres à mesurer, - en tenant compte de la variabilité attendue de ces paramètres. En particulier, les résultats obtenus lors d’un précédent projet ont montré que les différences observées entre les lots contrôles et expérimentaux étaient importantes et permettaient l’utilisation d’un nombre relativement restreint d’animaux pour chaque lot. Ceci permettra de produire des résultats fiables et interprétables, avec une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Pour la chirurgie, outre l’anesthésie, une analgésie sera effectuée par injection juste avant l’opération et durant les 72 heures suivant l’opération pour limiter au maximum les douleurs post-opératoires. Le réveil se déroulera en cages individuelles, au calme. La cage sera munie d’un tapis chauffant pour lutter contre l’hypothermie post-opératoire. Du gel alimentaire sera ajouté dans la cage pour faciliter la prise alimentaire durant les premiers jours suivant la chirurgie. Les animaux seront suivi de manière régulière pour évaluer leur état de santé. Des points limites spécifiques et précoces seront estimés (apathie, perte de poids, aspect du pelage) pour permettre une intervention rapide afin d’éviter ou de minimiser la douleur, si nécessaire.
Choix des espèces
- Les souris sont des petits mammifères qui partagent de nombreuses similarités avec l’homme. - Elles constituent un modèle très maîtrisé par l’ensemble des équipes de recherche - Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux - On peut utiliser des individus de lignées consanguines, ce qui permet une meilleure homogénéité dans nos populations, et on peut trouver d’énormes bases de données (ex : génétiques) et utiliser de nombreux réactifs spécifiques de cette espèce (ex : anticorps). - De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées) pour étudier les macrophages. - Les procédures chirurgicales, y compris les médicaments les plus efficaces (anesthésiques et analgésiques) et les doses à injectées, sont parfaitement connus. L’étude des effets de l’infarctus dans les différentes conditions expérimentales se fera à l’âge adulte (après 6 semaines). Le but est de produire un modèle proche de la pathologie humaine qui est une maladie de l’individu adulte. Chez la souris, la maturité sexuelle est atteinte à environ 6 semaines, cet âge est donc considéré comme le début de l’âge adulte.
Evaluation du potentiel antithrombotique d’un candidat médicament Fab humanisé
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Modifiées génétiquement pour porter le récepteur plaquettaire humain, les souris de ce projet sont utilisées dès l'âge de trois à quatre semaines dans les modèles de thrombose, avant que la graisse ne s'accumule dans leurs vaisseaux et empêche le caillot de se former. 360 souris vont être utilisées, 180 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil, 120 à un niveau de souffrance modéré et 60 à un niveau sévère. Un AVC est provoqué chez certaines par une chirurgie de 45 minutes suivie d'un réveil, puis d'une seconde anesthésie et d'une nouvelle intervention, avec des troubles moteurs attendus au réveil, d'autres subissant six injections pour une inflammation cutanée ou deux pour une inflammation pulmonaire. Le porteur indique que la thrombose développée n'est pas compatible avec le maintien en vie des animaux, et renvoie à des points limites établis pour chaque procédure.
Objectifs
Les plaquettes sanguines ont un rôle primordial dans l’arrêt des saignements. Elles sont aussi impliquées dans les phénomènes de thrombose dans lesquels les plaquettes sont recrutées et forment un caillot, appelé thrombus. Un récepteur des plaquettes permet l’adhérence transitoire des plaquettes à la paroi du vaisseau lors d’une lésion vasculaire, conduisant à l’arrêt du saignement. Ce récepteur est une cible antithrombotique connue de par son rôle important dans l’adhérence des plaquettes et dans la croissance du thrombus. Nous avons précédemment généré deux molécules qui bloquent ce processus. Ils ont montré une inhibition de la formation de thrombi dans un modèle in vitro de perfusion de sang humain. Nous les avons évalués dans différents modèles de thrombose et de temps de saignement in vivo. Forts de ces résultats, nous avons modifié et maturé l’une de ces molécules afin de poursuivre son développement comme futur outil thérapeutique. L’objectif de ce projet est donc de tester cette nouvelle molécule afin de vérifier son efficacité et le risque de saignement associé à son utilisation. Les procédures seront réalisées chez des souris modifiées génétiquement présentant le récepteur humain puisque notre molécule cible le récepteur dans sa version humaine. Nous avons préalablement vérifié que cette modification du récepteur n’impactait pas les fonctions plaquettaires des souris.
Bénéfices attendus
Nous avons validé notre molécule comme étant un antithrombotique efficace avec un risque de saignement modéré, ce qui en fait un candidat pour une utilisation en clinique. Pour poursuive son développement, nous avons humanisé la molécule. Ce projet nous permettra de valider l’efficacité antithrombotique de cette version humanisée de l’agent, le risque de saignement associé et ainsi poursuivre son développement vers la clinique afin d’améliorer la prise en charge de patients atteints de thrombose artérielle.
Procédures
Pour les procédures de thromboses, les souris sont soumises à 1 injection sur souris vigile (anesthésie) puis 2 injections et une chirurgie (entre 35 min et 1h) sur souris anesthésiées. Pour la procédure d’AVC, les souris anesthésiées sont soumises à 2 injections, une chirurgie de 45min, puis réveillées. Une nouvelle anesthésie est effectuée afin de réaliser 1 injection et 1 chirurgie (15 min). Pour l’inflammation cutanée, les souris anesthésiées subissent 6 injections (20 min) puis sont réveillées . Pour l’inflammation pulmonaire, les souris anesthésiées subissent 2 injections (10 min).
Impact sur les animaux
Une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). On pourra également observer une douleur localisée après les injections ainsi que d’éventuels saignements dus à la nature des molécules injectées. D’éventuelles douleurs pourront être observées lors du réveil de l’animal et dans les heures suivantes pour les procédures avec réveil . L’induction d’un AVC induit des troubles moteurs chez la souris au réveil. L’inflammation pulmonaire peut induire d’éventuels troubles respiratoires.
Devenir
A l’issue des thromboses, les animaux sont mis à mort car le développement d’une thrombose n’est pas compatible avec le maintien en vie des animaux. Les modèles d’inflammation cérébrale, pulmonaire ou cutanée nécessite la mise à mort des animaux afin de récupérer les tissus et de réaliser des analyses post-mortem.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact de la molécule sur la thrombose artérielle et le risque de saignement. Ces processus étant particulièrement complexe et faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, globules blancs, cellules endothéliales) ainsi que les conditions de flux (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. L’efficacité de la version humanisée de notre agent a toutefois été préalablement validée dans un modèle in vitro de formation de thrombi. La poursuite du développement de l’agent nécessite de valider l’efficacité de la version humanisée in vivo.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est réduit au minimum pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les groupes seront comparés avec des analyses statistiques.
Raffinement
Une habituation à la manipulation est prévue 5 jours avant le début des expérimentations. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux au minimum 7 jours avant l’expérimentation. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux. • Par une anesthésie avant et pendant la durée des procédures, ainsi qu’une anesthésie locale. • Par l’injection sous cutanée d’analgésiant aux sites d’incisions lors des procédures. • Par l’application de gel ophtalmique afin de protéger les yeux • Contre la déshydratation, une injection de sérum physiologique est réalisée avant la procédure. • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures et son réveil dans une chambre thermostatée pour les procédures avec réveil • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles de thrombose et d’arrêt du saignement. Les techniques de mutation des gènes ont permis de générer des souris exprimant le récepteur plaquettaire dans sa version humaine, permettant d’étudier l’effet de notre molécule sur la thrombose artérielle et son potentiel effet sur l’hémostase. Dans les modèles de thrombose, les souris seront utilisées à un âge de 3-4 semaines. Les modèles de thrombose doivent être réalisés sur souris jeunes, avant l’accumulation de graisses au niveau des vaisseaux. La présence de graisse empêcherait le développement de la thrombose. Dans les autres procédures, les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Rôle d’une protéine de l’immunité innée dans l’immunité antitumorale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Les tumeurs greffées peuvent s'ulcérer et s'infecter, et l'irradiation de 210 secondes qui précède la greffe de moelle peut endommager l'intestin, les poumons ou le cerveau. 670 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyses post-mortem, sans qu'aucune soit maintenue en vie. Chaque souris reçoit une injection de cellules tumorales sur animal éveillé, puis un traitement tous les trois jours pendant dix-huit jours, une partie subissant une seconde greffe de tumeur huit à douze semaines après l'irradiation. Le porteur ne nomme pas la protéine étudiée et renvoie au long terme la possibilité d'explorer des molécules qui en modifieraient l'activité chez des patients.
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’une nouvelle protéine dans la réponse antitumorale. Le contrôle de la croissance des tumeurs chez les patients dépend de l’activation d’une réponse immune efficace contre les cellules cancéreuses. Cela passe par le déclenchement d’une réponse immunitaire. Les protéines responsables de cette activation ne sont pas totalement connues. Nous avons récemment identifié une nouvelle protéine centrale dans l’activation de l’immunité. Ce projet a pour but de comprendre son rôle dans le contrôle des tumeurs. A terme, il est possible que les résultats de cette étude permettent de mettre au point des thérapies d’activation de l’immunité chez les patients atteints de cancers solides tels le mélanome ou le cancer du poumon. L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle de cette protéine immunitaire dans le contrôle du cancer.
Bénéfices attendus
La réponse immune antitumorale n’est pas totalement comprise. Nous avons récemment découvert une protéine nécessaire aux premières étapes d’activation du système immunitaire. Ce projet propose d’analyser son rôle chez la souris. À long terme, ce projet pourrait apporter la preuve que notre protéine d’intérêt joue un rôle dans l’organisme dans la protection antitumorale, ouvrant la voie à l’étude de cette protéine chez les patients. Nous pourrons ensuite explorer des stratégies thérapeutiques utilisant des molécules modifiant l’activité de cette protéine pour activer la réponse immune antitumorale.
Procédures
Toutes les interventions se font sur animaux éveillés. Dans un premier lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées aux animaux (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 injection tous les 3 jours pendant 18 jours maximum (durée de chaque geste inf à 10 sec). Dans un second lot, les animaux seront irradiés (durée : 210 sec), puis injectés avec des cellules immunitaires (durée : 10 sec). 8 à 12 semaines après, ils seront injectés avec des cellules tumorales (durée 10 sec) puis recevront un traitement anticancer à raison d’1 injection (durée 10sec) tous les 3 jours pendant 18 jours maximum. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur certains de ces animaux. Dans un troisième lot, les animaux seront irradiés (durée : 210 sec), puis injectés avec des cellules immunitaires (durée : 10 sec). 8 à 12 semaines après, ils seront injectés avec des cellules tumorales (durée 10 sec) puis recevront un traitement anticancer à raison d’1 injection (durée 10sec) tous les 3 jours pendant 18 jours maximum. Une seconde injection de cellules tumorales sera réalisée sur ces animaux (durée : 10 sec). Un prélèvement sanguin sera réalisé sur certains de ces animaux.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales, ainsi que des traitements au moyen d’une aiguille entraîne une douleur transitoire due à la piqure. Les potentiels effets indésirables de la greffe de moelle seront estimés lors d’une expérience pilote avec un petit nombre d’animaux. Il s’agit cependant d’effets indésirables très rares. La greffe de moelle osseuse implique une irradiation préalable du receveur afin d’éliminer ses propres cellules de moelle osseuse. Cette étape, bien que nécessaire, induit une toxicité significative : elle peut endommager des tissus non ciblés comme l’intestin, les poumons ou le cerveau, et affaiblir considérablement le système immunitaire, rendant l’animal plus vulnérable aux infections opportunistes. Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Greffer une tumeur chez une souris peut avoir des effets négatifs sur sa santé. Avec le temps,l’animal peut parfois perdre du poids, manger moins et avoir du mal à se déplacer, si la tumeur est volumineuse ou mal placée. La tumeur peut dans certains cas s’ulcérer, s’infecter.
Devenir
Aucun animal maintenu en vie. Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Des expériences en laboratoire ont montré que notre protéine immunitaire joue un rôle clé dans l’activation des défenses immunes de l’organisme. Quand cette protéine est absente, les cellules ne réagissent plus aux signaux censés déclencher une réponse immune. Le projet cherche maintenant à comprendre comment cette protéine aide le corps à lutter contre les tumeurs, en utilisant des souris comme modèle vivant. Même si des méthodes alternatives comme la culture de cellules ont été utilisées, l’étude sur l’animal reste essentielle pour observer la réponse immunitaire dans son ensemble, telle qu’elle se produit dans un organisme complet et fonctionnel. Cette réponse n’est pas observable avec des méthodes impliquant de la culture cellulaire.
Réduction
Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet sera de 670 souris. Le nombre de souris a été réduit en effectuant une première expérience permettant de déterminer le modèle tumoral et le régime de traitement le plus adapté à notre étude. Le reste de l’étude sera effectuée uniquement avec ce modèle et ces conditions expérimentales. De plus, la dernière expérience ne sera réalisée que si le modèle tumoral choisi en dans la première expérience présente un rejet complet des tumeurs. Le nombre de souris utilisées dans chaque groupe a été réduit au strict minimum nécessaire. En utilisant 10 souris par groupe, les chercheurs peuvent détecter des différences significatives entre les groupes avec une grande fiabilité. Pour s’assurer que les résultats sont reproductibles, l’expérience sera refaite une seconde fois avec le même nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris sont manipulées sans stress par des personnels compétents. Le bien être des souris sera suivi quotidiennement. Les points limites conduisant à l’euthanasie des souris seront précoces et prédictifs pour l’apparition d’une douleur. Le suivi et la détermination des points limites est effectué en utilisant une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche antitumorale : souches murines parfaitement définies et modèles génétiquement modifiés, avec de grandes similarités entre les systèmes immunitaires humains et murins qui permet de transposer nos découvertes dans le modèle murin chez l’humain. De plus, nous avons documenté de manière robuste l’existence de notre protéine d’intérêt chez l’humain et chez la souris. Souris adultes ( >6 semaines) car leur réponse immune antitumorale est active.
Investigation du rôle de la pression dans la transition des monocytes en macrophages
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Opérées sous anesthésie générale pour recevoir une matrice de collagène, l'incision étant refermée par des agrafes, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La lignée décrite est invalidée pour un gène d'intérêt, et le porteur prévoit après la chirurgie une douleur "modérée et transitoire", avant une prise de sang sous anesthésie générale terminale. Le projet vise à établir chez la souris une fibrose qui reproduise la rigidité des tissus tumoraux, pour étudier l'effet de la pression mécanique sur la transformation des monocytes en macrophages, avec des perspectives thérapeutiques que le porteur renvoie au conditionnel. Toutes sont tuées à la fin de la procédure pour des prélèvements destinés à "trois grandes techniques" que le porteur dit "indispensables", sans les nommer.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de discerner, dans un modèle murin, l'impact de la pression mécanique sur la transition des monocytes en macrophages. Les macrophages constituent une population abondante de cellules immunitaires dans le cancer, associée à un mauvais pronostic pour les patients ; cependant, les facteurs précis qui régulent la fonction des macrophages dans le cancer sont mal compris. De nombreuses études ont identifié que le cancer induit une fibrose générale dans le microenvironnement tumoral, ce qui augmente la rigidité des tissus. L'impact de la rigidité tissulaire sur la fonction des macrophages est un aspect fondamental de la compréhension de l'immunologie tumorale. Pour mieux comprendre cet aspect, nous visons à : 1) établir un modèle murin de fibrose. 2) contourner la différenciation des macrophages pro-fibrotiques. 3) Appliquer nos observations obtenues sur les macrophages pro-fibrotiques et sur la fibrose associée au cancer. L’objectif 3 sera atteint en traduisant nos résultats en données générées précédemment à partir des modèles de cancer en laboratoire.
Bénéfices attendus
Les objectifs de ce projet sont de déterminer, dans un modèle murin, l’impact de la pression mécanique sur la transition des monocytes en macrophages. Les macrophages représentent une population abondante de cellules immunitaires au sein du microenvironnement tumoral et sont souvent associés à un pronostic défavorable chez les patients atteints de cancer. Cependant, les facteurs précis qui régulent leur fonction dans ce contexte restent mal compris. De nombreuses études ont mis en évidence que les tumeurs induisent une fibrose marquée dans leur microenvironnement, augmentant ainsi la rigidité des tissus. L’influence de cette rigidité tissulaire sur la fonction et la polarisation des macrophages constitue un aspect fondamental de la compréhension de l’immunologie tumorale. Afin d’explorer ce mécanisme, nous poursuivons les objectifs suivants : 1. Établir un modèle de fibrose afin de reproduire les conditions de rigidité mécanique observées dans les tissus tumoraux. 2. Identifier les voies de signalisation impliquées dans la différenciation des macrophages pro-fibrotiques et explorer les moyens de contourner cette polarisation. 3. Appliquer les observations obtenues sur la différenciation macrophagique et la fibrose à des modèles tumoraux déjà établis au laboratoire. L’objectif final est de mieux comprendre la diversité fonctionnelle (hétérogénéité) des macrophages et les mécanismes biomécaniques qui influencent leur phénotype et leur rôle dans des environnements rigides, tels que les tissus tumoraux. Ces connaissances pourraient, à terme, ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques, en ciblant la signalisation mécanique pour moduler la fonction macrophagique dans le cancer.
Procédures
Implantation chirurgicale d’une matrice de collagène sous anesthésie générale avec analgésie, durée 10 minutes, une fois. Prélèvement de sang sous anesthésie générale terminale, durée 5 minutes, une fois.
Impact sur les animaux
À la suite de la procédure chirurgicale, les souris pourront ressentir une douleur modérée et transitoire. Tout inconfort proviendra de la chirurgie elle-même et des agrafes utilisées pour refermer l’incision cutanée, et non du collagène injecté. Le collagène est de petite taille et très fin, et n’affectera pas la santé des souris.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en œuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.
Remplacement
Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans un microenvironnement rigide dans toute sa complexité. En particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le comportement des macrophages dans un microenvironnement rigide soumis à différentes conditions en interaction avec le microenvironnement. Enfin, notre projet offre des perspectives thérapeutiques qui justifient aussi la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme. Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables.
Réduction
Nous avons pris en compte de multiples facteurs qui nous permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour répondre aux questions scientifiques sous-jacentes. Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expérimentaux est maintenu aussi bas que possible afin de pouvoir tirer des conclusions valables et significatives des expériences proposées, il a été déterminé par calcul de puissance. En outre, pour répondre à nos questions scientifiques, nous utiliserons des méthodes qui maximisent les connaissances acquises à partir de chaque animal. En outre, nous planifierons et exécuterons les expériences de manière à de combiner le plus grand nombre possible de tissus d'intérêt et de groupes de contrôle. Grâce à ces stratégies, nous visons à réduire le nombre d'animaux au minimum, tout en garantissant des résultats scientifiquement pertinents.
Raffinement
Les animaux disposeront d’une période d’acclimatation suffisante avant le début des procédures, incluant une familiarisation avec les expérimentateurs. Afin de réduire le stress lié à la manipulation, des méthodes raffinées seront employées . Des examens cliniques quotidiens seront effectués par l'équipe de recherche, et la fréquence des observations sera augmentée en cas de signes d’inconfort. Les procédures seront réalisées dans un environnement propre ou stérile, avec des mesures adaptées pour prévenir les infections post-opératoires. Une anesthésie et/ou une analgésie appropriée sera administrée chaque fois que nécessaire afin de minimiser la douleur et la détresse. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de différentiation des cellules, le cancer et la fibrose. De plus, notre modèle murin (souris invalidées pour le gène d'intérêt) a déjà été validé dans des publications précédentes. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines du fait de la population de patients..
Étude de l’effet de psychotropes chez la souris dans le cadre de l’enseignement pratique de pharmacologie.
- Enseignement supérieur
Des souris rendues agressives par les amphétamines peuvent se mutiler entre elles, et celles que les substances endorment risquent l'hypothermie. 840 souris vont être utilisées dans ces travaux pratiques de pharmacologie, 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 360 un niveau modéré, avec des administrations orales sous contention et des injections dans l'abdomen ou sous la peau. Le porteur annonce des tests comportementaux sans les nommer, et range l'apprentissage du bien-être des animaux non-humains parmi les compétences acquises par les étudiants. Toutes les souris sont tuées à l'issue, 72 d'entre elles étant d'abord réutilisées une semaine plus tard dans une quatrième procédure, ce que le porteur compte comme une réduction de 30 % du nombre d'animaux.
Objectifs
Le but du projet est d’étudier les effets de diverses substances médicamenteuses agissant sur le fonctionnement du cerveau, l’humeur et le comportement. Les effets pharmacologiques de ces molécules seront évalués chez la souris vigile à l’aide de tests comportementaux réalisés lors de travaux pratiques. Ce projet permettra de former l’étudiant à la mise en œuvre d’une procédure expérimentale chez un animal vivant dans le strict respect de la réglementation relative à l’expérimentation animale. Enfin, l’étudiant sera formé à l’exploitation et interprétation des résultats obtenus.
Bénéfices attendus
Le projet se déroule dans un contexte pédagogique. Il prépare les étudiants au métier de technicien dans les laboratoires de recherches dans des secteurs dans lesquels l’animal est utilisé à des fins expérimentales. Les objectifs sont d’acquérir des bases théoriques et pratiques en pharmacologie (science du médicament) et d’apprendre les bonnes pratiques en expérimentation animale dans le respect de la réglementation. La maîtrise de l’approche expérimentale sur l’animal vivant permet de répondre aux attentes du milieu professionnel et facilite l’insertion de nos diplômés. Voici les compétences en lien avec l’expérimentation animale qui seront acquises par les étudiants à l’issue de ce projet : •Contention de la souris (tenir l’animal correctement sans douleur et stress) •Préparation des solutions de médicaments •Administrations de traitements par différentes voies (sous la peau, dans la cavité abdominale, orale) •Mise en pratique des notions vues en cours sur les interactions entre médicaments, les substances agissant sur le cerveau, l’humeur et le comportement et les tests comportementaux associés.
Procédures
24 souris : 1 administration par voie orale par animal avec contention, durée 15 sec 24 souris : 1 injection intrapéritonéale par animal, durée 15 sec 24 souris : 2 administrations par voie orale par animal avec contention, durée 15 24 souris : 1 administration par voie orale par animal avec contention, durée 15 sec + 1 administration par voie orale par animal à l’aide d’une micropipette sans contention (administration volontaire) durée 30 sec 12 souris : 1 injection intrapéritonéale par animal, durée 15 sec + 1 administration par voie orale par animal avec contention, durée 15 sec 12 souris : 1 injection intrapéritonéale par animal, durée 15 sec + 1 administration par voie orale par animal à l’aide d’une micropipette sans contention (administration volontaire) durée 30 sec 48 souris : 1 injection intrapéritonéale par animal, durée 15 sec + 1 injection sous cutanée par animal, durée 15 sec
Impact sur les animaux
Les souris traitées aux amphétamines, peuvent parfois être agressives entre elles et conduire à des mutilations. Les souris en sédation ou sommeil à la suite de l’administration des substances pharmacologiques étudiées peuvent présenter des signes d’hypothermie.
Devenir
A l’issue du projet, toutes les souris sont mises à mort. Certaines d’entre elles sont toutefois réutilisées dans la dernière procédure du projet avant d’être mises à mort.
Remplacement
L'utilisation d'animaux à des fins expérimentales demeure indispensable dans le cadre du BUT Génie Biologique conformément aux exigences définies dans le programme pédagogique national. En effet, les futurs diplômés doivent être en capacité de « participer à des activités mettant en œuvre de l’expérimentation sur animaux de laboratoire ». Cette compétence est essentielle car les diplômés travailleront souvent dans des secteurs comme la pharmacologie, la physiologie pharmaceutique ou la toxicologie où l’expérimentation animale est courante. Savoir utiliser cette méthode in vivo est donc indispensable pour répondre aux attentes du monde professionnel. De plus, l’étude des substances psychotropes et de leurs effets associés ne peuvent être réalisées que chez l’animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisé dans ce projet, 72 souris sur les 168 requises pour la réalisation des procédures 1, 2 et 3 sont gardées pour la procédure 4. Cette réduction (30%) est possible grâce à des conditions d’hébergement à la fin de chaque procédure qui respectent les traitements administrés (autant de cages que de conditions expérimentales) et le délai d’une semaine entre les deux séances de TP.
Raffinement
Pour raffiner la réalisation des procédures décrite dans ce projet plusieurs mesures sont mises en place. Un enseignement spécifique consacré au bien-être animal, au respect des règles d’éthique et à la réglementation relative à l’expérimentation animale est dispensé aux étudiants depuis la 1° année de leur formation. Deux séances de travaux dirigés de 2h précèdent chaque TP pour permettre le bon déroulement des procédures expérimentales (traitements et tests comportementaux) et assurer la bonne prise en charge de l’animal (réduction de l’inconfort) au cours des procédures (Raffinement). Chaque souris est placée en cage individuelle pendant toute la durée de chaque procédure afin d’éviter le mélange de souris sous l'effet de substances aux actions opposées (sédation / excitation). Les souris en sédation ou sommeil sont placées sur des tapis chauffants pour éviter l'hypothermie. Pour minimiser le stress des animaux, les tests comportementaux sont réalisés dans des pièces distinctes de celle utilisée pour les traitements, à l’abri de tous types de nuisances. Des séances d’apprentissage à la réalisation de certains tests comportementaux ont été réalisées. La mise en place de la technique d'administration guidée par micropipette a été précédée d'une phase d’apprentissage préalable au cours de laquelle les souris reçoivent du lait concentré pour faciliter l’administration des substances par cette méthode. A la fin des procédures expérimentales, les souris testées sont contrôlées puis regroupées dans des cages en fonction des traitements reçus. Une attention toute particulière est portée aux souris recevant les amphétamines, parfois agressives entre elles. Des points limites stricts et spécifiques à chacune des procédures ont été également clairement identifiés et appliqués.
Choix des espèces
La souris est l’une des espèces les plus couramment utilisées dans les laboratoires de recherche, secteurs dans lesquels nos étudiants sont amenés à exercer en tant que techniciens. De plus, le criblage des psychotropes est majoritairement réalisé chez la souris, notamment à l’aide de tests comportementaux. Les souris adultes ont une taille qui rend leur manipulation possible par les étudiants.