Souris

Soumises à six types de tests comportementaux, dont l'un répété treize fois sur plus de sept mois, 72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées après les tests pour prélever des échantillons. Le projet évalue un dérivé de la mémantine sur un modèle transgénique de la maladie d'Alzheimer, avant d'envisager une étude clinique. Aucun des six tests n'est nommé dans le résumé, qui se contente de les numéroter et d'indiquer leur durée, en signalant un stress modéré pour deux d'entre eux.

Objectifs

Les traitements disponibles aujourd’hui pour traiter la maladie d’Alzheimer (MA) sont essentiellement symptomatiques. La recherche de nouvelles molécules avec des cibles originales est cruciale. Plusieurs dérivés de la mémantine ont été testés en laboratoire sur un modèle pré-clinique de la maladie d’Alzheimer. L’intérêt de ces composés réside dans le fait que la mémantine est le principe actif de l’un des quatre médicaments utilisés pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. Une molécule a montré de effets neuroprotecteurs puissants, validé pour l’instant dans un modèle pharmacologique aigue de la MA chez la souris. La molécule à présenté une efficacité supérieure à celle de sa molécule parente, la mémantine, notamment sur des aspects anti-inflammatoires et cognitifs. Le but de ce projet est de d’évaluer les effets neuroprotecteurs de cette molécule sur deux mois à la suite d’un traitement chronique dans un modèle transgénique de la maladie, avant d’envisager une étude clinique.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est d’évaluer les effets neuroprotecteurs d’un analogue de la mémantine dans un modèle transgénique de la maladie, avant d’envisager une étude clinique.

Procédures

Les animaux seront soumis à 6 types de tests comportementaux pour évaluer les différents symptômes de la MA. Tout au long de l'étude: Test N°1: 13 fois durant 8 min sur plus de 7 mois d'études. En fin d'étude: Test N°2: une fois durant 10 min. Test N°3: une fois durant 30 min. Test N°4: 2 sessions de 10 min chacune et réalisé une seule fois. Test N°5: une session par jour sur 5 jours sera réalisée soit 4 min/session/jour soit 20 min sur 5 jours divisé en 5 sessions. Test N°6: une seule fois durant 6 min. Un prélèvement sera réalisé sous anesthésie générale des animaux (durée : moins de 15 min).

Impact sur les animaux

Le test comportemental N°5 engendrera un stress modéré lors 5 sessions de 4 min réparties sur 5 jours. Le test comportemental N°6 engendrera un stress modéré d'une durée de 6 min. La procédure d'anesthésie terminale implique un stress léger d'environ 3 min.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux après les tests comportementaux pour prélever des échantillons.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours «in vivo» pour mimer les symptômes pathologiques de la MA et rechercher des biomarqueurs associés. En effet pour mimer la MA de l'Homme et rechercher d’éventuel thérapies médicamenteuses, certains points comme les capacités cognitives et ne peuvent être effectué que sur des modèles "in vivo".

Réduction

Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux à 20 par groupe pour obtenir une puissance statistique suffisante. Tous les tests comportementaux sont effectués sur les mêmes lots de souris pour limiter le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 5 minutes par souris avant le début des expériences. Des points limites ont été définies. Si une altération de l'état est observée une grille de scoring est utilisée pour déterminer la conduite à tenir.

Choix des espèces

Afin de refléter les symptômes de la MA la souris reste à ce jour un des modèles se rapprochant au plus près de l'Homme et dont les capacités de mémoire peuvent être étudiées en laboratoire. Les expériences débuteront sur des animaux de 3 mois, âge adulte des souris et âge avant l'apparition des symptômes de la maladie d'Alzheimer (4 mois) afin d'étudier le comportement avant et après l'apparition des symptômes.

Trente-six souris mâles subissent l'ablation des testicules et trente-six autres une opération fictive, vingt-quatre d'entre elles enchaînant six à huit échographies sous anesthésie gazeuse avant d'être gardées jusqu'à dix-huit mois. Elles seront 72 en tout, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif est de mesurer l'effet de la testostérone sur le recrutement de macrophages dans un cancer de la corticosurrénale, la mise à mort servant à prélever les deux glandes surrénales et le sang. La lignée utilisée est une souris chez laquelle des gènes suppresseurs de tumeurs ont été invalidés, et le porteur indique que les lignées cellulaires disponibles ne répondent pas aux androgènes, ce qui le conduit à affirmer la "nécessité" de recourir à l'animal.

Objectifs

Le carcinome corticosurrénalien est un cancer rare et agressif, caractérisé par un pronostic défavorable. À son diagnostic, près de 50 % des patients présentent des métastases, ce qui explique un faible taux de survie à 5 ans. Actuellement, l’unique option curative pour les patients non métastatiques repose sur une exérèse complète de la tumeur primaire. Cependant, le risque de récidive est élevé (30 à 70 %), constituant la principale cause de décès. Pour les patients métastatiques, la chirurgie est inenvisageable, et les traitements existants, bien que lourds, n’améliorent pas la survie globale médiane, qui demeure autour de 15 mois. Les essais d’immunothérapie dans le carcinome corticosurrénalien ont donné des résultats décevants, probablement en raison de l’immunosuppression induite par l’hyperactivité endocrine observée dans environ 50 % des cas. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il a été récemment montré dans un modèle murin de carcinome corticosurrénalien, que la testostérone produite au moment de la puberté induit un recrutement de macrophages chez les souris mâles, ce qui conduit à une régression de la tumeur. De façon similaire, le traitement des souris femelles portant des carcinomes corticosurrénaliens avec de la testostérone conduit aussi à un recrutement de macrophages et à une diminution de la taille de la tumeur. Ces résultats suggèrent que la testostérone possède un fort potentiel en tant qu’agent antitumoral dans le contexte du carcinome corticosurrénalien. Dans cette étude, l’objectif est d’approfondir la compréhension du rôle antitumoral de la testostérone dans le carcinome corticosurrénalien en utilisant une approche complémentaire de celle déjà réalisée dans nos modèles murins : Confirmation du rôle de la testostérone dans un modèle murin de carcinome corticosurrénalien : Des castrations seront réalisées afin d’évaluer l’impact de la suppression de la testostérone sur la progression tumorale. Cette approche permettra de confirmer son effet protecteur et de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents. L’objectif global de ces expériences est de comprendre l’importance de la testostérone et de comprendre également comment la testostérone est capable d’avoir un puissant effet antitumoral. Finalement ce projet a pour but de développer de nouvelles approches thérapeutiques visant à améliorer le traitement et la survie des patients atteints de carcinome corticosurrénalien.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet nous permettra de confirmer l’importance de la testostérone dans le cancer de la cortico-surrénale. Cela permettra également de confirmer les données préliminaires obtenus concernant les mécanismes moléculaires antitumoraux sous-jacents. Cette étude a pour objectif de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients en utilisant la testostérone ou en ciblant les mécanismes moléculaires mis en évidence ici.

Procédures

Les 72 animaux soumis à l’intervention chirurgicale subiront une injection unique d’anesthésiant/analgésiant qui dure moins d’une minute. Une intervention chirurgicale permettant l'ablation des testicules chez 36 mâles sera pratiquée et 36 mâles subiront une opération fictive. Les interventions chirurgicales seront pratiquées 1 seule fois et durent environ 20 minutes chacune. Les animaux subiront une anesthésie gazeuse afin d’effectuer le suivi échographique. Chaque échographie dure environ 20 minutes. 48 animaux subiront 2 échographies sous anesthésie gazeuse et 24 animaux (opérés à 4 semaines et conservés jusqu’à 18 mois) subiront entre 6 et 8 échographies.

Impact sur les animaux

L’injection de l’anesthésiant/analgésiant peut engendrer une douleur locale, légère, de courte durée. L'opération chirurgicale peut entraîner une douleur post-opératoire qu'il est indispensable de prendre en compte et traiter. Les opérations chirurgicales peuvent également entraîner une perte de poids limitée et temporaire chez les animaux. L’échographie, effectuée sous anesthésie, ne provoque pas de douleur, mais peut induire un stress léger chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer le rôle de la testostérone et de ses mécanismes sous-jacents dans le développement du corticosurrénalome et ainsi pouvoir potentiellement identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des corticosurrénalomes

Remplacement

Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux mis à mort sans manipulation préalable. Cependant, l’ensemble des lignées cellulaires de corticosurrénalome disponibles ne répondent pas aux androgènes. De plus, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.

Réduction

Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour des analyses transcriptomiques et l’autre pour des analyses protéiques. De même, le sang des animaux mis à mort sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 12 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.

Raffinement

Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de coton dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Après l’opération de la nourriture et du gel d’hydratation seront placés au sol pour éviter l’inconfort de l’animal lorsqu’il essaiera de se nourrir ou de boire. La réalisation de la procédure sera effectuée par du personnel qualifié sensibilisé au travail de chirurgie en conditions aseptiques afin de réduire au maximum la durée de l’opération et le risque d’infection. En plus de l’analgésie peropératoire, un protocole d’analgésie post-opératoire a été mis en place, avec une injection sous-cutanée d’anti-inflammatoire à la fin de l’opération. Durant les premiers jours, les animaux seront placés en cage individuelle afin d’éviter d’éventuelles agressions. Cependant, les cages étants transparentes et fermées par une grille, cela permet de maintenir une interaction visuelle et olfactive avec les autres animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis seront établis et les expériences seront arrêtées en conséquence.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant le cancer de la cortico-surrénale. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Au cours de ce projet, une lignée de souris est utilisée. Cette lignée est un modèle préclinique murin de corticosurrénalome reposant sur l’invalidation de gènes suppresseurs de tumeurs mutés chez les patients. Nous réaliserons nos analyses aux 2 stades de développement tumoral identifiés chez les femelles dans le modèle murin. Un stade d’hyperplasie à 6 semaines, un stade de corticosurrénalome métastatique à 18 mois. Chez les mâles, nous avons montré que la régression tumorale s’installe à partir de 6 semaines et se maintient jusqu’à 18 mois sans dissémination métastatique. Afin d’évaluer le rôle de la testostérone dans ce processus, nous réaliserons une castration avant l’initiation de la régression, soit à 4 semaines. Une partie des animaux sera gardée jusqu’à 6 semaines pour vérifier si l’absence de testostérone conduit à une hyperplasie, et l’autre jusqu’à 18 mois afin de déterminer si une privation androgénique prolongée favorise l’émergence de métastases. Par ailleurs, nous réaliserons également une castration sur des animaux âgés de 16 mois, qui seront gardés jusqu’à 18 mois. Cette approche nous permettra de tester si le maintien de la régression tumorale reste dépendant de la testostérone à un âge avancé, ou si cette régression devient irréversible et indépendante des androgènes.

2 200 souris dépourvues de système immunitaire fonctionnel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une inoculation de cellules tumorales puis jusqu'à cent manipulations pour mesurer sa tumeur, la moitié des animaux subissant en plus une infection par un virus oncolytique et l'autre moitié jusqu'à cent injections de traitement, avec un risque de péritonite que le porteur signale. Il affirme que seul un "organisme entier", où les cellules circulent, permet d'étudier la complexité du système immunitaire et ses interactions avec l'infection virale. Les souris retenues pour cela sont immunodéficientes, et l'étude porte notamment sur les mécanismes immunomodulateurs de la virothérapie.

Objectifs

La virothérapie oncolytique est une nouvelle approche dans la thérapie anti-cancéreuse. Elle implique l’utilisation de virus non-pathogènes capables d’infecter, de se répliquer et de détruire spécifiquement les cellules tumorales sans affecter les tissus sains. Le but de ce projet consiste à évaluer l’efficacité de la virothérapie oncolytique associée à la chimiothérapie et à l’immuno-thérapie anti-cancéreuse.

Bénéfices attendus

Malgré les efforts de la recherche, qui ont permis des progrès notables en matière de prévention, de dépistage et de traitements, le cancer reste l’une des principales causes de mortalité dans le monde. Sa prévalence continue d’augmenter : en France, on estime à plus de 430 000 le nombre de nouveaux cas par an. L’utilisation des virus oncolytiques représente une approche thérapeutique innovante et prometteuse dans la lutte contre le cancer. Ce projet permettra de démontrer l’efficacité de ces virus à cibler sélectivement les cellules tumorales tout en préservant les cellules saines, réduisant ainsi les effets secondaires par rapport aux traitements conventionnels. L’étude contribuera à mieux comprendre les mécanismes d’action antiviraux et immunomodulateurs, ouvrant la voie à de nouvelles stratégies combinées avec l’immunothérapie ou la chimiothérapie. De plus, ce projet pourrait déboucher sur le développement de biomarqueurs prédictifs de réponse, facilitant la personnalisation des traitements et améliorant les chances de survie des patients.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis à une inoculation de cellules tumorales (1 injection sous anesthésie gazeuse, 1 minute par souris par injection) et à un suivi de la croissance tumoral incluant une mesure de la taille de la tumeur de manière non invasive (manipulation de l’animal vigile, pour moins d’une minute, tous les 2-3 jours, pour un maximum de 100 fois). La moitié des animaux du projet sera soumis à une infection virale (une injection sous anesthésie gazeuse, 1 minute par souris par injection). La moitié des animaux du projet recevra des traitements tous les 2 jours (une injection sur animal vigile, 1 minute par souris par injection pour un maximum de 100 fois). Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéficientes, à cause de leur patrimoine génétique, présentent une sensibilité accrue aux infections. Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent engendrer un stress. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et une détresse respiratoire. La croissance tumorale peut entrainer une baisse ou perte d’appétit qui peut causer une perte de poids des animaux. Les sites d’injections peuvent s’infecter. L’administration de virus pourrait induire une fièvre transitoire. Un risque de péritonite est associé aux administrations fréquentes.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité de l’association virothérapie oncolytique, immunothérapie et chimiothérapie. Nous avons au préalable testé in vitro la sensibilité des lignées cellulaires aux traitements qui seront appliqués dans les expériences in vivo. Cette étude peut être conduite seulement in vivo car il n’y a pas d’autres modèles pour étudier la complexité du système immunitaire et de ses mécanismes sous-jacents in vivo ainsi que les interactions avec les infections virales. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2200 souris. Pour sa réalisation, des groupes de 5 et de 10 souris (selon les procédures) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. Une veille bibliographique attentive et continue sera réalisée afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet présentent un phénotype considéré comme dommageable du fait de leur immuno-déficience. Elles seront hébergées donc, afin d’assurer leur protection, au sein de notre structure dans une zone d’expérimentation dédiée aux animaux immunodéprimés, sur portoirs ventilés et toute manipulation sera faite sous hotte pour ne pas perdre leur statut et éviter que le développement de maladies indésirables. Des tests de statut sanitaire réguliers montrant l’absence d’infection des animaux par des pathogènes opportunistes sont réalisés chaque mois dans l’animalerie, dans le cadre de l’hébergement de ces animaux. Les animaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger et tunnels en cartons). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, désinfection, ...). Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteint des points limites prédéfinis.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. Tout d’abord, la souris est un organisme complet et fonctionnel dont le système immunitaire peut être comparé à celui de l’homme, ce qui en fait un modèle pertinent. De plus, sa génétique est bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront utilisés au stade adulte (à partir de 6 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire complet.

Jusqu'à soixante-trois jours seules en cage, cinquante-six administrations orales quotidiennes, deux mises à jeun de douze heures et quatre prélèvements de sang à la queue : 80 souris subissent ces procédures, dont soixante âgées de 22 mois. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées pour prélever foie, tissu adipeux, muscle, cœur et cerveau. L'étude compare un composé en développement à un composé de référence sur l'inflammation intestinale liée à l'âge, pour le compte d'un client dont le porteur espère qu'il obtiendra une mise sur le marché. Ni l'un ni l'autre composé n'est nommé, et l'effectif est justifié par l'expérience du laboratoire "sur le modèle de souris obèse", quand les animaux utilisés ici sont des souris âgées.

Objectifs

Le vieillissement se caractérise par un état d'inflammation chronique de bas grade, contribuant au développement de troubles métaboliques, gastro-intestinaux et systémiques. Les stratégies visant à restaurer l'intégrité de la barrière intestinale et à réduire les déclencheurs pro-inflammatoires d'origine intestinale sont de plus en plus reconnues comme des approches prometteuses pour atténuer l'inflammation et favoriser un vieillissement en bonne santé. L'objectif du projet est de caractériser l'inflammation intestinale et systémique chez des souris âgées comparées à des souris jeunes, et évaluer l'efficacité d'un traitement chronique pendant 7 semaines d'un composé en développement versus un composé de référence afin d'atténuer l'inflammation intestinale liée à l'âge et restaurer l'intégrité de la barrière intestinale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à répondre à un enjeu de santé majeur lié au vieillissement : la présence d’une inflammation chronique de bas grade, qui contribue à la progression de nombreuses pathologies métaboliques, gastro-intestinales et systémiques. L’identification de stratégies nutritionnelles ou thérapeutiques capables de moduler l’inflammation intestinale représente une approche prometteuse pour favoriser un vieillissement en meilleure santé. Ce projet s'incrit dans le cadre du développement d'un composé en développement visant à atténuer l'inflammation intestinale chez l'Homme et ainsi de promouvoir un vieillisement sain. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de l'inflammation intestinale.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Hébergement individuel (max. 63 jours / état vigil) ; 2) Administration quotidienne de traitements ou véhicule (max. 56; durée : env. 1 minute / état vigil) ; 3) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (max. 17 mesures; durée : env. 1 minute / état vigil) ; 4) Mise à jeun en présence d'eau (2 fois, durée : 12h / état vigil) ; 5) Administration d'un marqueur fluorescent (2 fois, durée : env. 1minute / état vigil); 6) Prélèvements sanguin à la queue (max. 4 prélèvements, durée du prélèvement : 2 minutes / état vigil).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations et le placement en boîte de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de stress. La mise à jeun de 12h pourra induire une sensation de faim.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure afin de collecter des organes (foie, tissu adipeux, muscle gastrocnémien, coeur et cerveau) pour analyses biochimiques et histologiques ultérieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre d'inflammation intestinal. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que nous n'attendons pas d'effet sexe-dépendant du candidat médicament, l'étude sera menée sur les deux sexes.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cage individuelle pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts visuels, auditifs et olfactifs entre eux. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue avant les prélèvements sanguins. Une alimentation sous forme de gelée sera ajoutée dans chaque cages afin de prevenir les difficultées d'alimentation en raison de l'âge avancé de certaines souris. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé est l’un des plus couramment employés et les mieux caractérisés dans le cadre d’études précliniques portant sur l’inflammation intestinale. Le présent projet nécessitera l'utilisation de 20 souris âgées de 2 mois correspondant au stade de développement "jeune adulte", afin de constituer un groupe de référence. Il impliquera également 60 souris âgées de 22 mois représentant un stade "adulte avancé" chez la souris. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par le composé à tester, à savoir une population âgée.

Privées de défenses immunitaires par sélection génétique pour que les greffons humains prennent, 384 souris reçoivent par chirurgie des fragments de tumeurs de poumon et de vessie prélevées sur des patients. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et la tumeur peut gêner la locomotion, ulcérer voire nécroser la peau qui la recouvre. Pendant jusqu'à 180 jours, chaque animal est pesé deux fois par semaine et sa tumeur mesurée au pied à coulisse, avec une sensibilité que le porteur reconnaît au moment de la mesure. Toutes sont tuées, celles chez qui aucune tumeur n'a poussé au bout de six mois comme les autres, et le porteur écrit qu'il n'a pas été possible de justifier statistiquement l'effectif de 384.

Objectifs

Le cancer reste l’une des principales causes de mortalité dans le monde. En particulier, les cancers de la vessie et les cancers du poumon représentent un lourd fardeau pour les patients et les systèmes de santé. Malgré les progrès de l’immunothérapie, les taux de réponse restent faibles (20–30 %) et les coûts de traitement très élevés (30 000 à 200 000 € par patient). Une des principales limitations à l’efficacité de ces traitements est liée aux systèmes de délivrance peu efficaces de l’agent thérapeutique. Il est donc urgent de développer de nouveaux outils de délivrance ciblée permettant d’optimiser l’efficacité tout en limitant les effets indésirables. Les objectifs du projet sont de développer des modèles de tumeurs dérivées de patients de cancers de la vessie et du poumon, représentatifs de l’hétérogénéité des tumeurs humaines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra de développer de nouveaux modèles pertinents afin d'obtenir par la suite des informations sur l’efficacité d’un potentiel nouveau traitement anticancéreux plus efficace chez des patients atteints de cancer du poumon et de la vessie, étant peu ou non répondeurs aux traitements de référence.

Procédures

Implantation de morceaux de tumeurs par chirurgie (5 minutes). Mesures tumorales au pied à coulisse 1 à 2x/sem et pesées 2x/semaine (quelques secondes) jusqu’à 180 jours après implantation. Administration d’analgésique pendant quelques secondes pouvant être réalisée jusqu’à 4 fois.

Impact sur les animaux

Pousse tumorale : nuisance possible si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite, gêne. Une perte de poids peut être envisagée suite à la pousse tumorale. Les animaux vont subir une intervention chirurgicale sous anesthésie afin d’implanter les fragments de PDX en sous-cutané qui peut entrainer un stress. La tumeur peut à un certain volume gêner à la locomotion, et la peau au niveau de la tumeur peut potentiellement ulcérer voire nécroser. Aucune métastase n’est attendue dans ces modèles chez la souris avant atteinte d’un volume tumoral constitutif d’un point limite, mais les animaux seront surveillés de manière adéquate. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress pendant plusieurs semaines lors de la contention et éventuellement une gêne, sensibilité au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tumeurs pour les analyser et caractériser les modèles ou au bout de 180 jours si aucune tumeur n’a pris.

Remplacement

Plusieurs études préliminaires ont été menées in vitro pour s’assurer de l’efficacité prometteuse du traitement sur des lignées cancéreuses en culture ainsi que plusieurs étapes de vérification de caractéristiques valides pour un candidat médicament, cependant les interactions entre le métabolisme, les cellules du système immunitaire et le microenvironnement tumoral sont complexes et impactées par différents organes, ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Même si nous cherchons à développer nos modèles en impression 3D, tout ceci n’étant encore qu’à un stade très précoce et ne représentant pas le microenvironnement tumoral et sa complexité, l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur cette tumeur ne peut, pour le moment, se faire que sur organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de mener le but de la procédure à bien. Il n’a pas été possible de justifier statistiquement les effectifs au vu de la portée exploratoire de ce développement, cependant nous nous sommes appuyés sur une revue extensive de la littérature et notre expérience pour déterminer que nous aurions besoin de ce nombre d’animaux pour mener le projet à bien.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet qui les pèseront plusieurs fois afin de limiter leur stress. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements appropriés à la souche de souris (coton de nidation, tunnels pour jeux, maisonnette).

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec la souris car c’est une espèce sur laquelle de nombreux modèles de cancer ont été développés, et qui permet de manipuler facilement le système immunitaire : ici une déficience pour une meilleure prise de nos PDX. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Deux injections trois fois par semaine pendant quatre mois : c'est le traitement imposé à 280 des 1 058 souris de ce projet, toutes utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime riche en graisses et en sucres jusqu'à devenir obèses et résistantes à l'insuline, puis des prises de sang mensuelles, des tests de tolérance à l'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie et des mesures hebdomadaires de composition corporelle. L'objet est de savoir si une hormone greffée sur des vésicules prolonge l'effet d'un antidiabétique du marché après son arrêt, les essais chez l'humain restant conditionnés aux résultats. Chaque souris finit anesthésiée à l'isoflurane, saignée au niveau du sinus rétro-orbital, puis tuée par dislocation cervicale.

Objectifs

Le Diabète de Type 2 est une maladie chronique qui touche 463 millions d'adultes dans le monde, représentant 90% des cas de diabète. Ce chiffre pourrait atteindre 700 millions d'ici 2045. Le diabète cause environ 1,5 millions de décès par an. Un des facteurs de risque majeur est l’obésité. Les médicaments utilisés dans le traitement de l’obésité et dans le diabète de type 2, présentent des limites. Ils ne sont pas efficaces chez tous les patients, et entraînent souvent un regain de poids après arrêt du traitement, ce qui représente un traitement à vie. Il y a donc nécessité de développer de nouvelles solutions pour surmonter les insuffisances et problèmes associés à l'utilisation de cette classe de médicaments. Une hormone abondante dans le sang, a des effets anti-inflammatoires et bénéfiques sur nos organes. Chez les personnes atteintes de diabète de type 2 ou obèses, son taux est fortement diminué. Il faudrait donc donner à ces personnes un médicament constitué de cette hormone. Or, à ce jour, personne n’a réussi à la fabriquer. Ce défi a été relevé en greffant l'hormone sur des vésicules, sortes de transporteurs présents dans le corps et qui assurent la communication entre les organes. Notre projet vise à étudier les effets thérapeutiques de ces transporteurs d’hormone chez des souris sous régime gras et d’évaluer leur impact thérapeutique après arrêt du médicament du marché. Ainsi, nous saurons si la perte de poids induite par le médicament du marché est maintenue grâce à l'hormone. Nous évaluerons aussi l’effet thérapeutique de l’hormone, combinée ou pas au médicament du marché lorsqu’elle est administrée sous forme de virus thérapeutiques. Nous comparerons également l'efficacité du traitement entre les femelles et les mâles.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet nous permettra de mieux comprendre comment utiliser un nouveau traitement qu’il soit à base de virus thérapeutique ou à base de vésicule transportant l'hormone pour prolonger les effets bénéfiques d’un médicament anti-diabétique existant, même après son arrêt. Cela pourrait permettre à l’avenir de réduire les effets secondaires liés à un traitement à vie, notamment chez les jeunes patients. Nous étudierons aussi si les femelles et les mâles réagissent différemment au traitement, ce qui pourrait aider à adapter les futurs traitements selon le sexe des patients. À moyen terme, les résultats obtenus contribueront à valider notre traitement expérimental avant son test chez l’humain. Si les résultats sont positifs, ce traitement innovant pourra entrer dans une première phase d’essai clinique. À long terme, ce nouveau type de traitement, basé sur des vésicules naturelles transportant un médicament, pourrait offrir une alternative plus efficace et mieux tolérée que les médicaments actuels, avec des applications dans d’autres maladies comme les maladies du foie, les problèmes cardiovasculaires, certaines atteintes de la rétine ou encore des maladies inflammatoires.

Procédures

Les animaux vigiles seront pesés 1 fois avant le début des traitements puis 1 fois par semaine pendant la durée du protocole. Le traitement consiste à 2 injections 3 fois par semaine pendant 4 mois et concerne 280 souris. 2 prélèvements de sang (sur 15 jours d’acclimatation) avant la période de traitement seront faits sur animaux vigiles puis 1 fois par mois pour mesurer les transaminases. L’analyse corporelle est une approche non invasive, qui se fait sur animaux éveillés en moins de 2 minutes. Elle sera faite 1 fois par semaine ou 1 fois par mois, selon la procédure. Les tests de glycémie (sous insuline ou non) seront faits 1 fois par mois à 5 jours d’intervalle. Différentes combinaisons de traitements seront injectées (quelques secondes) à 674 souris vigiles par voie sous-cutané ou par voie intra-veineuse pendant 1 mois. 360 souris recevront 1 injection sous-cutanée d’un traitement 3 fois par semaine pendant 1 mois et 1 seule injection en intra-veineuse. 72 souris recevront 1 injection sous-cutanée d’un traitement trois fois par semaine pendant 1 mois. 242 souris recevront 1 seule injection en intra-veineuse pendant 1 mois. 648 souris seront pesées et subiront des tests d’analyse de la composition corporelle avant le début du traitement et 1 fois par semaine, au cours du traitement pendant 1 mois. Elles subiront également un test d’analyse du métabolisme de base avant le début des injections et en fin d’étude. 26 animaux seront prélevés (30 µL de sang), moins d’une minute, avant le début des injections et une fois par semaine pendant 1 mois. Enfin, tous les animaux (1058) seront anesthésiés à la fin de l’étude et du sang sera prélevé (quelques secondes) une fois l’animal endormi. Les animaux seront euthanasiées et des organes seront récoltés.

Impact sur les animaux

Les animaux sous régime gras présentent des caractéristiques comparables aux personnes souffrant d’obésité (diabète, résistance à l’insuline). Les manipulations répétées pour les injections du traitement et les prélèvements de gouttes de sang peuvent entrainer un stress transitoire. Nous prévoyons d’alterner le site d’injection pour limiter la douleur induite lors des injections hebdomadaires. L’injection d’insuline peut entrainer une hypoglycémie.

Devenir

Toutes les souris sont mises à mort afin de prélever du sang et différents organes permettant de répondre aux questions sur les effets métaboliques des vésicules, car ces organes seront analysés par la suite par des techniques de biochimie et d’histologie.

Remplacement

Des méthodes alternatives ont déjà été utilisées, notamment sur des cellules en culture in vitro au laboratoire. La procédure expérimentale a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude métabolique globale dans un contexte d’obésité, dépendant du métabolisme et de la communication entre différents organes ne peut se faire que sur animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint à son minimum, sans compromettre les objectifs du projet et l’interprétation statistique des résultats expérimentaux. Le nombre de souris par lot a été déterminé par un logiciel d’analyse statistique en tenant compte de la taille d’effet basé sur des données pilotes. Nous prévoyons d’utiliser un total de 1058 souris sur une durée de 5 ans, dans 6 procédures.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront réparties dans les cages en fonction de leur poids et de certains critères métaboliques afin d’avoir des groupes équilibrés. Elles resteront 10 jours sans manipulation pour s’habituer à leur nouvel environnement. Elles recevront une alimentation riche en graisses et en sucres, changée deux fois par semaine pour garantir sa fraîcheur. Les litières seront changées plus souvent que la normale, car les souris sont diabétiques. Les souris seront pesées une fois par semaine et surveillées quotidiennement pour détecter rapidement tout signe de douleur ou de stress lié aux injections. Plusieurs signes seront observés : poids, apparence, comportement, réactions aux stimuli. Des scores seront attribués selon une grille définie afin de determiner le besoin d'un suivi renforcé, un traitement antidouleur ou une euthanasie. Les sites d’injection seront changés régulièrement pour limiter la douleur. Lors du test de tolérance à l’insuline, une solution de sucre (dextrose) sera préparée à l’avance afin d’intervenir rapidement en cas de signes d’hypoglycémie. Le jour de la mise à mort, une anesthésie sera réalisée sous isoflurane afin de récupérer le sang au niveau du sinus rétro-orbital (après dépôt d’une goutte d’analgésique local). Chaque animal sera ensuite euthanasié par dislocation cervicale afin de confirmer la mort de l’animal.

Choix des espèces

Afin de tester l’effet métabolique des vésicules transportant l'hormone, combinées ou pas avec l'anti-diabétique du marché, nous travaillerons avec des modèles murins d’obésité pertinents à savoir des souris sous régime gras qui développent des insulino-résistances sévères et présentent des phénotypes métaboliques basaux différents pour mimer l’obésité. Dans ce projet, des mâles et des femelles obèses âgés de 5 mois seront utilisés, car c’est à stade que se mettent en place des altérations métaboliques conduisant au développement de complications métaboliques qui pourraient donc être prévenues par l’injection de l'hormone. Pour étudier le devenir après injections (stabilité dans le temps et dans les organes) des traitements à base de virus transportant l'hormone, nous utiliserons des souris plus jeunes (10 semaines) qui auront un régime alimentaire standard.

18 000 souris, 2 000 rats et 2 050 hamsters dorés vont recevoir pendant jusqu'à soixante semaines une nourriture riche en graisses et en sucres, et une eau sucrée, afin de développer obésité, diabète, dyslipidémie et stéatose hépatique. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à 240 piqûres de la veine caudale par animal pour mesurer la glycémie, et le porteur reconnaît que la maladie induite peut aller jusqu'à la fibrose, la cirrhose ou un cancer du foie. La majorité de ces 22 050 rongeurs part ensuite vers le laboratoire d'un client qui les utilisera dans son propre projet, les cinquante hamsters servant à entraîner le personnel au prélèvement sanguin étant, eux, tués. Rendre malades des rongeurs par lots pour les livrer comme modèles d'évaluation de médicaments : le porteur compte ce travail parmi les bénéfices pour l'animal, au titre de "l'amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée".

Objectifs

A l’échelle mondiale, les maladies liées au surpoids représentent une part non négligeable des décès estimé à plus de 1,2 million par an. En 2016, 650 millions d’adultes étaient obèses, soit 3 fois plus qu’en 1975. En 2021, le diabète affecte plus de 537 millions de personnes. La dyslipidémie et la NASH (stéatose hépatique non- alcoolique) sont provoqués par le diabète et l’obésité. La dyslipidémie touche quelques milliers de patients chaque année en France et la société nationale française de gastro-entérologie considère qu’un quart de la population française est touché par la NASH. Par l'alimentation de rongeurs avec un régime riche en lipides et glucides, il est possible d'induire ces phénotypes spécifiques : obésité, dyslipidémie, diabète et NASH. Ces rongeurs avec syndromes métaboliques seront utilisés chez nos clients pour évaluer les effets de médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet aura des bénéfices pour l’homme. Ce projet pourra amener à long terme des solutions thérapeutiques pour traiter les syndromes métaboliques du surpoids et du diabète. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux auront à disposition un aliment standard et/ou un aliment riche en gras et/ou en sucre et une eau standard et/ou une eau additionnée de sucre, pendant 60 semaines maximum. Des prélèvements sanguins pour mesurer la glycémie pourront être faits, et consisteront en un prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale, avec ou sans mise à jeun (mise à jeun de 4 à 6 heures maximum), sur les animaux en aigue (maximum 2 mesures par jour par animal, avec 3 jours de récupération entre 2 séries de mesures, ce qui fait 240 prélèvements sur toute la durée du protocole) ou en chronique (une mesure par animal par semaine, ce qui fait 60 prélèvements sur toute la durée du protocole). La durée du prélèvement ne dépassera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

Au fil de la prise alimentaire riche en gras et/ou sucres et d’un abreuvement standard ou riche en sucre, les animaux pourront exprimés des signes cliniques plus ou moins modérés. Les animaux vont développer une obésité et des syndromes métaboliques tels diabète, dyslipidémie, insulino-résistance, NASH pouvant aller jusqu’à une fibrose, une cirrhose ou un cancer du foie à long terme (après la phase préparatoire). Le prélèvement sanguin peut induire un léger stress transitoire et une légère douleur.

Devenir

La majorité des animaux sont expédiés à un laboratoire de recherche pour une utilisation dans son projet de recherche. Les animaux qui auront servi à l’entrainement au prélèvement sanguin seront mis à mort, ne pouvant être utilisés dans une autre procédure.

Remplacement

L’induction de modification métabolique chez l’animal fait intervenir plusieurs types cellulaires produisant des facteurs tendant à moduler ou amplifier la réponse. Toute cette cascade d’événement faisant intervenir des facteurs autocrines, paracrines ou exocrines aussi variés que complexes ne permet pas une étude significative et déterminante in vitro. Par ailleurs, l'objet de cette étude est d'évaluer l'impact sur une fonction vitale de l'organisme, ce qui ne peut être fait que sur un organisme vivant.

Réduction

Nous réalisons ce protocole alimentaire pour proposer un modèle animal pertinent avec un nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre l'objectif scientifique. Le nombre d’animaux pour chaque espèce est estimé selon un prévisionnel de demandes basé sur les années précédentes. Les animaux dédiés à l’entraînement ne concernent que les hamsters, car la maîtrise du prélèvement sur la veine saphène nécessite une phase d’apprentissage préalable avant toute manipulation sur les animaux du protocole.Un nombre de 5 hamsters pourra être utilisé pour l’entrainement des personnes au prélèvement à la veine saphène avant chaque lot. Avec 2 lots par an, il sera utilisé 50 hamsters sur les 5 ans.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long de cette phase préparatoire. En cas d'anomalie clinique observée sur un animal, une grille de scoring général sera utilisée afin de déterminer l'atteinte de points limites et de décider du devenir de l'animal. Enfin, les contentions et prélèvements seront réalisés par un personnel formé et expérimenté.

Choix des espèces

Les souris, rats et hamsters sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur les maladies métaboliques liés au surpoids car elles développent naturellement ce type de pathologie ayant une affinité à la nourriture grasse et sucrée similaire à l’Homme. Pour les hamsters syriens dorés, ils ont un métabolisme des lipoprotéines imitant la dyslipidémie humaine car il exprime la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP). Les animaux pourront commencer le régime alimentaire à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). À cet âge, le métabolisme est encore en développement, ce qui permet une meilleure induction de l’obésité par le régime enrichi en graisses et/ou en sucre. De plus, une mise en place précoce du régime permet une meilleure standardisation entre les individus et augmente la robustesse du modèle.

Tuées quatre heures après une injection de lipopolysaccharide qui les laisse fébriles, confuses et apathiques, 54 souris mâles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les quatre jours précédents, chacune reçoit par gavage un extrait de la plante Satureja nepeta, sous contention d'une à deux minutes, et se retrouve isolée une demi-heure pour que ses fèces soient recueillies. Le projet cherche à savoir si l'infusion, la décoction, le macérat ou l'huile essentielle de cette plante limitent l'inflammation du tissu adipeux, présentée comme une "alternative naturelle" aux traitements conventionnels. Sur la prise en charge de la douleur, le RNT est explicite : aucune analgésie n'est prévue pour ce protocole.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'étudier les effets préventifs de divers extraits de la plante médicinale aromatique Satureja nepeta (Infusion, décoction, macération hydroéthanolique à 60% et huile essentielle), dans un modèle murin d’inflammation aiguë induite par le lipopolysaccharide (LPS).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier les extraits de Satureja nepeta les plus efficaces pour prévenir l’inflammation aiguë induite par le lipopolysaccharide (LPS) dans le tissu adipeux, tout en explorant les modifications du microbiote intestinal. Il permettra ainsi de mieux comprendre les mécanismes d’action anti-inflammatoires de cette plante médicinale et de valoriser son potentiel en tant qu’alternative naturelle aux traitements conventionnels.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention quotidienne de gavage oral pendant 4 jours consécutifs, correspondant à l’administration des différents extraits de Satureja nepeta. Chaque gavage nécessitera une mise en contention de l’animal pendant environ 1 à 2 minutes. Une injection de LPS sera réalisée le 5ᵉ jour, également sous contention d’environ 1 à 2 minutes. Par ailleurs, des collectes de fèces seront effectuées avant et après induction de l’inflammation, nécessitant un isolement temporaire de l’animal (environ 30 minutes) pour permettre le recueil dans des conditions standardisées.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors du recueil de fèces (environ 30 minutes). Stress lié aux gavages (5 minutes). Douleurs possibles lors de l’administration des extraits et lors des injections du LPS (2 minutes). Suite à l'injection de LPS, les animaux seront fébriles (augmentation de la température corporelle), ils peuvent montrer des signes de confusions et d’apathie (durant 4 heures, jusqu'à la mise à mort). Jeune de 3 heures. Prise de température au niveau rectal (1 minute).

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet qui seront ensuite étudiés et de démontrer les effets anti-inflammatoires des différents extraits de la plantes Satureja nepeta

Remplacement

L’étude de l’effet des différents extraits de la plante médicinale Satureja nepeta sur la santé métabolique et le microbiote ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Il n'existe pas de modèle alternatif à l'heure actuelle permettant d'étudier ces paramètres in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux (9 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test statistique, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arret. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle largement utilisé et reconnu pour les études portant sur l’inflammation et le métabolisme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

Nourries pendant quatre mois d'un régime riche en sucres et en graisses jusqu'à devenir obèses, une partie des 664 souris de ce projet passe ensuite sur la table d'opération pour un arrêt puis une reprise de la circulation sanguine dans le foie, sous anesthésie, pendant quatre-vingt-dix minutes. Toutes subissent trois à quatre prélèvements sanguins, certaines reçoivent deux administrations de molécules agissant sur les lipides, et les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. L'enjeu déclaré est de rendre greffables des foies stéatosiques aujourd'hui écartés, et le projet sert aussi à la formation professionnelle. Toutes les souris sont tuées, le porteur précisant que les prélèvements d'organes prévus sont "incompatibles avec le maintien en vie des animaux".

Objectifs

La transplantation est aujourd’hui une solution reconnue pour soigner des patients lorsqu'un organe ne fonctionne plus. Mais il y a un manque d'organes de qualité à greffer. Les médecins doivent donc parfois utiliser des organes dits "marginaux", provenant de personnes âgées ou ayant eu certains problèmes de santé comme l’obésité ou le diabète. Ces organes sont plus fragiles et réagissent mal à un phénomène appelé ischémie-reperfusion, inévitable en transplantation. Il correspond à l’arrêt temporaire de la circulation du sang dans l’organe, puis à son retour. Cela provoque des lésions qui abîment fortement l’organe et peuvent compromettre la réussite de la greffe. Les organes dits marginaux, comme les foies avec stéatose, sont encore plus sensibles à ces lésions d’ischémie reperfusion, d’où la nécessité d’évaluer des molécules pour les protéger et pouvoir les utiliser en transplantation. Des recherches récentes ont montré une altération précoce du métabolisme des lipides après une ischémie dans le foie avec apparition de lipides toxiques. Le but de notre projet est de déterminer si l'ischémie du foie sain ou avec stéatose conduit aussi à l'apparition de lipides dits toxiques et s'il est possible de limiter les lésions du foie après ischémie reperfusion en utilisant des molécules qui agissent sur les lipides toxiques.

Bénéfices attendus

A court terme, cette étude permettra de mieux comprendre les modulations précoces du métabolisme lipidique après ischémie sur foies sains et stéatosiques et leurs implications dans la genèse des lésions hépatiques. A long terme, ce projet vise à réhabiliter des greffons stéatosiques aujourd’hui récusés pour la transplantation en mettant au point des stratégies thérapeutiques limitant la production d’espèces lipotoxiques, dont le nombre va croitre massivement dans les années à venir en raison de la pandémie d’obésité, et ainsi répondre à la pénurie de greffons que subit aujourd’hui la France.

Procédures

Certains animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 4 mois pour provoquer une stéatose hépatique. Tous les animaux subiront 3 à 4 prélèvements de sang (durée de moins de 5 minutes) faits sous anesthésie pour mesurer différents paramètres biologiques et une chirurgie pour réaliser l'ischémie-reperfusion du foie (durée de 90 minutes) sous anesthésie également. Les prélèvements de sang seront espacés d'un minimum de 20 heures. Parmi la totalité des souris, une partie n’aura aucune administration de molécules et d’autres souris auront 2 administrations de molécules agissant sur le métabolisme lipidique (durée de moins de 5 minutes). Les 2 administrations seront espacées au moins de 90 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 4 mois. Ce régime conduira à la prise de poids progressive des animaux tout au long du régime jusqu’à atteindre une obésité. Les prélèvements sanguin (acte

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements d’organes, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

A ce jour, il existe des modèles de foie in silico ou in vitro, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire la complexité cellulaire du foie, le métabolisme des lipides et les lésions d’ischémie reperfusion. De plus, les modèles de perfusion de foies ex vivo ne nous permettent pas non plus d’étudier le remodelage du lipidome hépatique et plasmatique.

Réduction

Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures, ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). La répartition sera de 3 à 5 souris par cage. Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape de la procédure en pré-, per- et post- opératoire. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie, sous anesthésie générale, avec un maintien de la température corporelle.

Choix des espèces

Le choix porté sur la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2) Le modèle de régime obésogène chez la souris, qui mime une obésité environnementale chez l’homme, est validé et adapté pour répondre aux objectifs du projet. 3) La disponibilité chez cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques déjà présents au laboratoire. 4) La souche de souris sélectionnée offre moins de variabilité dans la réponse au régime occidental que d'autres souches de souris et développe moins de shunt porto-systémique comme mis en évidence dans notre précédente saisine

Fournir des anticorps monoclonaux pour des tests de diagnostic rapide suppose ici d'immuniser 200 souris, toutes tuées pour prélever leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois à quatre injections d'antigènes, à raison d'une par mois, et subit trois prises de sang. Les effets annoncés vont de l'infection au point d'injection à l'abcès, avec fièvre, perte de poids et douleur modérée liée à l'inflammation. Le porteur indique avoir sorti l'animal de la production d'anticorps à grande échelle, et affirme que l'immunisation in vitro ne donne pas des affinités suffisantes, ce qui rend selon lui le recours à la souris "toujours nécessaire".

Objectifs

Les tests « rapides » de détection et de diagnostic de microorganismes pathogènes ou de toxines responsables de maladies infectieuses sont d’un intérêt croissant non seulement dans le domaine de la maitrise et de la détection des risques biologiques mais plus largement en santé publique. Ce type de tests est particulièrement adapté à un suivi précoce de l’émergence ou de la ré-émergence de certaines maladies infectieuses responsables de pandémies mondiales pouvant avoir des conséquences extrêmement graves en santé humaine ou d’un point de vue économique (ex : Ebola, ZIKA, Covid-19, Variole du singe, etc.). Ils sont basés sur l’utilisation d’anticorps monoclonaux, des protéines du vivant capables de reconnaitre de manière très spécifique des pathogènes ou toxines. Notre projet vise au développement d’anticorps monoclonaux dirigés contre différentes cibles notamment des antigènes de microorganismes pathogènes ou de toxines dans le cadre de multiples programmes de recherche, visant à suivre les émergences des maladies infectieuses responsables de différentes pathologies humaines ou animales. Le développement de nouveaux tests antigéniques nécessite donc la génération de nouvelles lignées cellulaires sécrétrices d’anticorps monoclonaux spécifiques pour répondre à ces besoins importants pour la santé publique. Bien que l’animal ne soit plus du tout utilisé dans notre laboratoire pour la production d’anticorps à grande échelle, il reste néanmoins encore indispensable pour la partie immunisation permettant in fine l’obtention des anticorps d’intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de générer des anticorps monoclonaux sur le territoire national pour garantir la souveraineté et la sécurité des approvisionnements dont nous avons pu mesurer l’importance lors de la pandémie de COVID19. Cela permettra la mise au point, la validation et la fourniture de moyens diagnostiques appropriés, performants et répondant aux préconisations des autorités de santé.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 ou 4 injections (durée totale de chaque injection d’environ 10 secondes) d’antigènes pour les immuniser à la fréquence d’une injection par mois : Trois prises de sang seront réalisées par animal (durée de l’intervention environ 30 à 40 secondes) à la fréquence maximale d’un prélèvement par mois.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévisibles sont : - une infection au point d’injection, abcédation, risque de fièvre - une perte de poids - une douleur modérée transitoire due à l’inflammation

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. L’obtention d’anticorps monoclonaux nécessite en effet de prélever la rate des animaux immunisés.

Remplacement

L’obtention d’anticorps monoclonaux à des fins diagnostiques ou de détection nécessite d’atteindre un niveau d’immunisation très élevé. Bien que la production d’anticorps monoclonaux ait connu de grands progrès depuis quelques années, démarche dans laquelle notre laboratoire est pleinement engagé (avec une forte réduction du nombre d’animaux à plusieurs étapes et notamment celle de la production), les technologies actuelles de remplacement pour l’étape d’immunisation ne sont pas complétement satisfaisantes notamment en termes d’affinité et de spécificité des anticorps obtenus. Ces méthodes d’immunisation in vitro ne permettent pas, en l’état actuel des connaissances, d’obtenir des réponses immunitaires suffisantes pour garantir la performance de tests de diagnostic et actuellement, le recours à l’immunisation d’animaux afin d’obtenir des anticorps monoclonaux spécifiques est toujours nécessaire.

Réduction

Les immunisations sont réalisées par lots de 4 souris, un lot correspondant à une condition d'immunisation. Il est communément admis de tester 2 conditions d’immunisation par antigène (concentration ou type de solution véhicule) soit 8 animaux. La réponse immunitaire est évaluée et les animaux ayant les meilleures réponses sont sélectionnés pour réaliser les fusions lymphocytaires. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous ne testerons qu’une condition à la fois (4 animaux) ; si cette dernière ne donne pas les résultats escomptés lors des tests d’affinité, nous en testerons une deuxième. Il est à noter que dans la plupart des cas, la première condition est suffisante. Il est prévu 200 souris maximum pour les immunisations pour l’ensemble de la saisine sur 5 ans. Ce chiffre est un maximum et le nombre de lots est étroitement corrélé au nombre de sujets de recherche que nous aurons à traiter et du niveau de réponse immunitaire des animaux vis-à-vis de chaque antigène. Tous les efforts seront faits pour diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les études statistiques ne sont pas adaptables. Les résultats sont évalués en nombre d’hybridomes développés.

Raffinement

Une analgésie continue sera pratiquée avant tout acte potentiellement douloureux. Les animaux seront observés quotidiennement et un ensemble d’indicateurs prédictifs de douleurs ou stress éventuels a été mis place. En cas d’atteinte d’un point limite établi (prostration, dépilation, refus de s’alimenter…), une évaluation précise de l’état général de l’animal, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Le choix de la souris est rendu inévitable pour l’obtention des hybridomes sécréteurs d’anticorps monoclonaux spécifiques. En effet, l’hybridome étant le résultat de la fusion cellulaire entre des lymphocytes issus des souris immunisées et des cellules de myélome de souris (lignée cellulaire établie et approvisionnée auprès de collections internationales de cellules), il est de ce fait techniquement impossible de réussir cette étape si les lymphocytes et le myélome ne sont pas issus de la même espèce (souris en l’occurrence). Toutes les souris que nous utiliserons seront de jeunes adultes (6 à 8 semaines). A cet âge, les animaux ont la maturité immunologique nécessaire pour obtenir de bonnes réponses immunitaires.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées pour collecter et analyser leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent neuf jours seules en cage, une nuit sans nourriture, et subissent une injection sous anesthésie générale ainsi que trois contentions dans un tube d'analyse de la composition corporelle. Le porteur indique avoir déjà reproduit l'état nourri et l'état à jeun sur des cellules de foie en culture, et retient malgré cela l'animal entier pour ses échanges entre organes. Le bénéfice annoncé tient en une phrase et reste suspendu au long terme, ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour les maladies du foie ou le diabète.

Objectifs

Le but de ce projet de comprendre le rôle d'une famille de protéine dans la fonction des cellules du foie. En effet, des résultats du laboratoire montrent que la quantité de ces protéines varient entre l’état de jeûne et l’état nourri et que diminuer leur expression modifie l'adaptation de l'organisme pour répondre à la modification d'apport nutrionel. D'autre part, nous avons montré que la quantité de ces protéines étaient modifiées dans le cas de pathologie du foie ou de diabète.

Bénéfices attendus

Comprendre le rôle de ces protéines permettrait à long terme d'ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour les pathologies du foie ou du diabète..

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une injection sous anesthésie générale (4 min maximum) - 9 jours d'hebergement individuel (1 fois) - 1 nuit sans accès à la nourriture mais accès à la boisson - 3 pesées sur animal vigile (

Impact sur les animaux

L’analyse du métabolisme énergétique recquiert que les animaux soient hébergés individuellement pour une durée maximum de 9 jours, la privation de congénères peut générer un stress modéré. Pour la détermination de la composition corporelle des animaux, les animaux sont placés pour une très courte durée (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour pouvoir collecter et analyser les tissus.

Remplacement

Dans notre laboratoire, nous avons mis au point des conditions de culture permettant de mimer l'état nourri / à jeun avec des cellules de foie. Cependant, afin de mieux comprendre le fonctionnement de ces cellules, nous avons besoin d'étudier des animaux entiers avec leur physiologie et les échanges inter-organes. Seules les protéines ayant montré un impact sur le métabolisme des cellules du foie en culture seront étudiés chez l'animal.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires. Nous optimiserons également la collecte de tissus post- mortem à l’issue de chaque procédure afin de créer une « bibliothèque d’échantillons » pouvant être utilisés pour de futures analyses.

Raffinement

Le stress subit par les animaux par l'hébergement individuel est atténué par le fait qu’ils conservent un contact visuel et olfactif et sonore avec leurs congénères. Ces cages d'analyse présentent une grande surface au sol et sont équipées (litière, mangeoire, biberon et maisonnette suspendus) de manière à offrir des occasions accrues d'interaction avec l'environnement, qui compensent les effets de l’hébergement individuel. Pour l’injection, les souris seront anesthésiées quelques minutes afin de réaliser le geste sans stress pour l'animal. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil complet et qu’ils redeviennent mobiles. Puis un suivi sera réalisé les jours suivant l’injection pour vérifier qu’aucune lésion n’est apparue. Nous avons mis en place des points limites adaptés avec une surveillance des animaux (comportement, poids, site d'injection) permettant de déceler tous signe de mal-être ou de souffrance de façon précoce.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence dans les études métaboliques, nous pouvons donc bénéficier d’un grand nombre de ressources et de données préliminaires existantes. Par ailleurs, ce sont des mammifères dont l'utilisation du sucre et du gras est proche de celui de l'Homme. Nous espérons ainsi pouvoir extrapoler les conclusions de notre étude à l’Homme. Les animaux utilisés auront entre 10 et 25 semaines. A cet âge, les souris auront un foie mature.