Souris
Effet d’une supplémentation en permeat marin sur les troubles de l’humeur dans un contexte d’entrainement physique intensif
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Huit semaines de tapis de course, cinq jours par semaine et jusqu'à une heure par jour : 360 souris subissent cet entraînement dans des procédures classées en souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leurs cerveaux. Elles développent le comportement anxieux ou de type dépressif que le porteur annonce comme attendu, puis passent jusqu'à six tests comportementaux, dont un précédé de sept heures sans nourriture et un autre imposant 72 heures en cage séparée. La société de compléments alimentaires qui cofinance le projet veut démontrer qu'un extrait d'algue réduit la fatigue cognitive liée à la pratique sportive intense. Deux de ces tests sont nommés, les autres non, et c'est bien l'ensemble des 360 souris qui relève de la gravité sévère.
Objectifs
L'exercice intense et répété est associé à une fatigue cognitive. Un des objectifs de la société qui cofinance ce projet est de développer des compléments alimentaires qui réduisent la fatigue cognitive associée à la pratique sportive intense et régulière. Ainsi, l'objectif de ce projet est de démontrer l’efficacité d’un extrait d’algue sur les performances cognitives et la fatigue après un entrainement physique intense chez la souris ainsi que les mécanismes d’action. Le milieu marin constitue la plus grande partie de la biosphère et contient les formes les plus anciennes et variées de la vie. Cette diversité de vie et d'environnements atypiques ouvrent des perspectives pour le développement de nouvelles molécules bio- actives. Les organismes marins, et notamment les algues marines possèdent un immense potentiel de molécules originales d'intérêt biologique. Ainsi, les extraits d’algues, qui contiennent des molécules bioactives anti-inflammatoires et anti-oxydantes, représentent une stratégie nouvelle. Nous avons identifié dans un projet précédent un extrait d'algue qui améliore les comportements anxieux ou la mémoire chez la souris. L'admissibilité et l'innocuité de cette fraction d'algues ont été vérifiées dans un projet précédent. Ainsi, l'objectif de ce nouveau projet sera de tester si une supplémentation en extrait d’algue incorporé dans les croquettes chez la souris permet de prévenir les troubles émotionnels et mnésiques associés au surentrainement sportif.
Bénéfices attendus
Nous anticipons que ce projet permette de mettre en évidence un effet protecteur d'un ou plusieurs extraits d'algue sur les troubles de la santé cérébrale associés au surentrainement physique.
Procédures
Les animaux seront entrainés à courir sur des tapis de course 5 jours par semaine (pendant une période de 15 min jusqu'à 1h par jour) pendant 8 semaines avant de réaliser des tests comportementaux ( maximum de 6 tests ) permettant d'étudier leur anxiété et mémoire. Les tests comportementaux pouvant provoquer du stress sont de l’ordre de 6 min maximum. La période de restriction alimentaire pour le test de supression à la nouveauté (NSF) est d’une durée de 7h. Durant le test de préférence au sucrose, le temps d’isolement des animaux en cage avec séparateurs sera de 72 heures. Un prelèvement mandibulaire sera réalisé une seule fois, d'une durée de moins de 10 sec.
Impact sur les animaux
L’entrainement physique pourra être cause de nuisance pour les souris (fatigue). Un comportement anxieux et/ou de type dépressif (modélisé ici) est attendu chez les souris soumises à l’entrainement physique intense. Les tests comportementaux induisent un stress modéré à sévère de courte durée (le temps du test) chez l’animal. Les prélèvements sanguins à la veine mandibulaire présentent un degré de sévérité modéré durant la période du prélèvement. Ce prélèvement va générer une légère douleur et un stress dus à la contention pendant une période de 10 à 15 secondes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les cerveaux pour des analyses biochimiques qui permettront d'étudier les mécanismes neurobiologiques des extraits d'algue.
Remplacement
Le modèle d’entrainement physique ne peut pas être développé in vitro. L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, des performances cognitives et de la fatigue ne peuvent être réalisées que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. L'étude de l'effet de régimes alimentaires ne peut pas non-plus être modélisé in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au mieux en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. La significativité de différence statistique entre plusieurs groupes sera déterminée en fonction des comparaisons souhaitées. D’après les études scientifiques sur l’analyse de marqueurs comportementaux et cérébraux, nous estimons que 18 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour atteindre une signification statistique.
Raffinement
Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique et sédation avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. Les tapis de course que nous avons acquis insufflent de l’air pour encourager les animaux à courir et n’induisent pas de choc électrique comme la majorité des tapis utilisés. L’hébergement se fera à 5 souris/cage et l’environnement sera enrichi : igloo et carré de coton. Les expérimentateurs et soigneurs sont titulaires de leur certificat d’expérimentation animale niveau concepteur et/ou opérateur. Les expérimentateurs travaillent avec des animaux depuis de nombreuses années et sont très fortement sensibilisés au sujet du bien- être animal de par leur thématique de recherche (stress, anxiété, bien-être cérébral) et de par le travail de la SBEA (structure du bien-être animal). La SBEA procède à des contrôles réguliers de respect des procédures et de bien-être des animaux. Des points limites précoces ont été définis afin de limiter au mieux la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. La souris est un mammifère comme l’Homme, avec des cycles de reproduction rapides. Il est largement utilisé dans le champ de la cognition et de l'entrainement physique, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec les études antérieures. C’est un animal sur lequel les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. Les souris mâles et femelles arriveront à l’animalerie à l’âge adulte (3 mois). L'industriel qui finance ce projet est intéressé par l'étude de la cognition chez le sportif adulte. C'est pour cette raison que les expérimentations seront réalisées sur des souris adultes.
Détermination de biomarqueurs IRM de désordres hépatiques dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 480
480 rats et 288 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois injections par semaine pendant sept semaines leur administrent une molécule qui abîme le foie, avec une absence de prise de poids, une déshydratation et, dans les formes avancées, une dégradation de l'état général que le porteur ne peut pas exclure. Chaque animal passe ensuite une à deux séances d'IRM par semaine sous anesthésie générale, avec injection d'un agent de contraste, pour caler des marqueurs d'imagerie de la fibrose hépatique transposables au diagnostic humain. Le porteur présente l'imagerie du petit animal vivant comme un "maillon indispensable" et affirme que ces marqueurs permettraient de remplacer les "nombreux sacrifices d'animaux" des études à venir.
Objectifs
Le syndrome métabolique est un ensemble de désordres incluant le diabète, l'obésité ou la stéatose hépatique, qui constituent un problème de santé majeur dans les pays occidentaux. Sa prévalence est estimée entre 25% et 30% de la population et pour les patient atteints du diabète du type 2, elle monte à 70%. Ce syndrome est un facteur de risque pour les maladies cardio-vasculaires, la cirrhose et le cancer. Ce syndrome se caractérise par un foie gras, inflammé avec présence de fibrose. La présence de fibrose est un marqueur de la gravité de la maladie et sert à la stratification des patients. La présence de surcharge en fer est un facteur aggravant de la maladie. Afin de limiter la progression de ces désordres métaboliques, l’industrie pharmaceutique tente de développer des molécules pour restaurer la fonction des tissus endommagés (pancréas, foie, tissus adipeux...). Des études histologiques ont déjà été réalisées pour valider les modèles ani-maux. Cependant, plusieurs problèmes persistent, notamment le nombre très important d’animaux utilisés (pour évaluer l’évolution de la pathologie à différents temps, pour évaluer la sévérité de la pathologie, évaluer l’efficacité d’un traitement, etc..). L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique incontournable pour le diagnostic médical, grâce à sa bonne résolution spatiale, son caractère non-traumatique et sa grande variété de contrastes. L’IRM devrait permettre de définir des bio-marqueurs IRM pour détecter la pathologie et la sévérité de la fibrose pour ensuite évaluer l’impact de médicaments sur la pathologie, sans avoir recours à une biopsie. Ces marqueurs ont pour objectifs d’être, à terme, utilisés en routine clinique chez l’homme. Ce projet est donc basé sur le développement de séquences IRM sur le petit animal pour obtenir des informations précises et fiables, en 3D et en des temps d’acquisition rapides.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de développer des méthodes IRM produisant des marqueurs fiables de désordres hépatiques. Ainsi, il n’y aura plus besoin d’utiliser un grand nombre d’animaux pour les futures études, développant des traitements contre les désordres métaboliques. De plus, ces méthodes IRM seront transférables à l’homme, et limiteront ainsi le recours à des biopsies régulières sur les patients.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à trois injections intrapéritonéales par semaine de sérum physiologique ou d’une molécule induisant un désordre hépatique, pendant 7 semaines. Ensuite, les animaux seront imagés par IRM sous anesthésie générale une à deux fois par semaine. Une fois par semaine (lors d’une session IRM), un agent de contraste sera injecté par voie intraveineuse. Suite à la session d’imagerie, les animaux recevront une injection intra-péritonéale d’un mélange d’antalgique et d’analgésique avant d’être euthanasiés.
Impact sur les animaux
Une absence de prise de poids et une deshydratation sont attendues dans ces modèles. De plus, dans les formes les plus avancées de la pathologie, une dégradation de l’état général n'est pas à exclure.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de corréler les biomarqueurs IRM aux analyses histologiques.
Remplacement
Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant le diagnostic et l’évaluation de la sévérité de désordres hépatiques chez l’homme. L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus. En effet, nous souhaitons détecter l’apparition d’une maladie (diagnostic précoce) et ensuite suivre son évolution (pronostic). Ceci permettrait de remplacer les nombreux sacrifices d’animaux en fournissant des biomarqueurs fiables et robustes grâce à l’obtention d’images avec des résolutions spatiales élevées, et des informations quantitatives. Tout cela, dans le but de suivre plus tard l’application de traitements contre les désordres métaboliques.
Réduction
Du fait de la non-invasivité de l’IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum d’une semaine entre chaque examen. Ainsi chaque animal sera son propre contrôle. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire. De plus, sur la base de publications scientifiques, il était estimé un écart-type standard d’environ 25% sur la plupart des expérimentations réalisées. Nous utiliserons les tests statistiques pour comparer les biomarqueurs entre des animaux pathologiques et des animaux sains, ainsi qu’entre animaux à différents stades de la pathologie.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages collectives, avec de l’enrichissement (bâtonnets de bois à ronger, matériaux de construction de nid, maisonnette pour le souris, tubes en carton pour les rats, litière) et de la nourriture et de l’eau à volonté. L'utilisation d'anesthésies gazeuses générales lors des procédures, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Il est à rappeler que l’expérience d’IRM en elle-même ne génère aucun signe de souffrance visible. Une surveillance régulière de la santé et du bien-être des animaux sera réalisée, comprenant des signes au niveau du comportement, de la mobilité, de la perte de poids, et de l’apparition de symptômes cliniques. Si des signes de mal-être apparaissent, les animaux seront pris en charge par un analgésique. Des points limites ont aussi été instaurés, induisant une euthanasie immédiate. L’état de santé des animaux sera suivie quotidiennement.
Choix des espèces
Les animaux sélectionnés sont largement utilisés et caractérisés par la communauté scientifique afin d'étudier la progression du diabète, de l’obésité et des désordres hépatiques. Ils ont une progression pathologique similaire à celles observés chez l'Homme. En particulier, les rats sont très bien caractérisés au niveau métabolique. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Ceci permet d'une part de reproduire ces modèles couramment utilisés par la communauté scientifique et d'autre part d'éviter de considérer les effets due à l'immaturité du tube digestif des animaux non-adultes qui pourront altérer nos conclusions.
Étude de l’organisation du génome et de son rôle dans la production des globules rouges en conditions normales ou pathologiques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Irradiées en une dose unique, injectées jusqu'à quatre fois dans l'abdomen, piquées à la veine faciale jusqu'à dix fois au cours de leur vie, 2 838 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart. Une partie, dépourvue de système immunitaire fonctionnel, reçoit des cellules prélevées sur des patients atteints de leucémie, ce qui suppose une préparation entraînant jusqu'à 8 % de perte de poids. Le porteur décrit une anémie provoquée par les procédures, qu'il présente comme transitoire et réversible, et écrit dans la même rubrique qu'aucun signe de souffrance n'est attendu. Toutes sont tuées, la grande majorité pour prélever leurs organes.
Objectifs
Ce projet s'intéresse à l’érythropoïèse, processus essentiel conduisant à la production des globules rouges. Au cours des dernières années, notre compréhension de l’érythropoïèse ainsi que des processus par lesquels des cellules normales du sang deviennent cancéreuses (transformation leucémique) a beaucoup progressé. Cependant, de nombreux facteurs régulateurs et gènes, impliqués ou non dans l’apparition des cancers, restent à identifier et à caractériser fonctionnellement. Nous savons désormais que certaines maladies ne sont pas seulement liées à des anomalies dans les gènes eux-mêmes, mais aussi dans les petites séquences d’ADN qui contrôlent leur activité. Cela montre à quel point ces éléments régulateurs sont importants pour un fonctionnement physiologique normal. En étudiant le mécanisme de formation des globules rouges, nous cherchons à mieux comprendre comment certains éléments du génome influencent l’activation ou l’inactivation des gènes chez les mammifères. Nous voulons aussi identifier les perturbations qui peuvent conduire à des pathologies graves, comme certaines formes rares et agressives de leucémie (cancer du sang). L’anémie, qui se caractérise par un manque de globules rouges fonctionnels, est un problème de santé majeur à l’échelle du globe. Pourtant, malgré les avancées scientifiques, de nombreux aspects liés aux gènes (et à leur fonctionnement) du contrôle de la production des globules rouges restent encore mal connus. Avec des technologies de pointe, ce projet vise à : • Découvrir comment les gènes sont régulés dans les cellules du sang, • Identifier de nouveaux acteurs impliqués dans ce contrôle, • Comprendre comment ces mécanismes fonctionnent normalement et ce qui se passe lorsqu’ils sont altérés dans certaines maladies. En explorant ces aspects, nous espérons mieux comprendre les causes génétiques des leucémies érythroïdes (un type particulier, rare et agressif de cancer touchant les globules rouges), et ouvrir la voie à de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent la production des globules rouges, aussi bien dans des conditions normales que pathologiques. Il comprend également l’étude de certaines mutations génétiques pouvant entraîner un cancer rare du sang, appelé leucémie érythroïde, afin de mieux comprendre comment ce type de maladie se développe. À long terme, ces travaux pourraient ouvrir la voie à de nouvelles pistes de traitement pour traiter ces leucémies en ciblant plus précisément les anomalies génétiques responsables de la maladie
Procédures
Les interventions sur animal vigile prévues dans cette étude sont des injections intrapéritonéales, des prélèvements sanguins et une irradiation. Les injections intrapéritonéales seront limitées à un maximum de 4 par animal, soit 2 injections sur 2 jours consécutifs, soit 4 injections espacées de 48 heures chacune. Sur la base de notre expérience, ce geste est rapide et maîtrisé et ne dure pas plus de 20 secondes, après quoi l’animal est immédiatement replacé dans sa cage. Pour les prélèvements sanguins, ils sont effectués au maximum 10 fois au cours de la vie de l’animal. Notre pratique régulière de ce geste nous montre que la piqûre à la veine faciale est unique et rapide, et la collecte du sang ne nécessite que 20 secondes. Concernant l’irradiation, les animaux seront exposés à une dose unique. Tous les prélèvements d’organes seront réalisés après anesthésie et euthanasie de l’animal.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales peuvent provoquer un stress et une gêne temporaire chez les animaux. Notre pratique régulière de ces injections nous permet de réduire au maximum le temps de contention et d’injection. Les cages restent sous surveillance rapprochée au moins 20 minutes après toute injection pour détecter le plus rapidement possible les signes de souffrance éventuelle chez les animaux (prostration). L’anémie induite par les procédures constitue un autre effet indésirable. Toutefois, elle est transitoire et réversible : en moins d’une semaine, le taux de globules rouges revient à environ 80 % du niveau normal. Un suivi hebdomadaire des paramètres sanguins permet de s’assurer du caractère temporaire de cette anémie. Enfin, la préparation des animaux en vue de la greffe de cellules issues de patients peut entraîner une perte de poids transitoire, limitée à un maximum de 8 % du poids initial.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés, la grande majorité en vue de prélèvement d'organes.
Remplacement
Nous avons dans un premier temps effectué des expériences in vitro sur des lignées cellulaires de souris et humaines. Cependant, comme ces cellules ont été modifiées pour se multiplier indéfiniment en laboratoire, il est difficile de savoir si elles se comportent comme des cellules normales dans le corps, et surtout ces modèles ne permettent pas de prendre en compte le contexte tissulaire. Il n’existe pas d’alternative autre que l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour évaluer avec précision et pertinence physiologique le rôle des nouveaux gènes de notre étude. Nous utiliserons le modèle souris, permettant l’inactivation des gènes d’intérêt. Concernant l’étude de certaines formes de cancers du sang (leucémies aigües érythroïdes), compte tenu du nombre restreint de cellules d’intérêt, une amplification des cellules tumorales via une greffe chez la souris est nécessaire pour pouvoir effectuer les analyses détaillées des mécanismes de la maladie au niveau des gènes et des molécules.
Réduction
Nous avons réalisé une étude préalable pour déterminer le nombre minimum de souris nécessaires dans chaque groupe, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux tout en obtenant des résultats fiables. Cette estimation repose sur des outils statistiques et sur nos expériences précédentes. Ainsi, nous avons montré qu’un nombre de 10 souris par groupe suffisent pour détecter des différences significatives entre les groupes, tout en tenant compte des variations possibles d’un animal ou d’une expérience à l’autre.
Raffinement
Les procédures expérimentales sont clairement définies et publiées. Toutes les manipulations susceptibles d’induire une gêne sont réalisées sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques appropriés, afin de prévenir toute douleur ou inconfort. Des critères stricts de surveillance sont mis en place pour garantir le bien-être des animaux. Aucun signe de souffrance n’est attendu. En cas d’anémie, bien que non douloureuse, un point limite est fixé : si le taux de globules rouges ne remonte pas à au moins 80 % de la valeur normale après une semaine, l’animal sera euthanasié à titre préventif pour éviter toute souffrance prolongée. Un suivi individuel est assuré tout au long de l’expérimentation. Les animaux immunodéprimés sont hébergés dans des conditions très strictes d’hygiène et de sécurité : matériel et eau stériles, manipulations en environnement protégé, afin de limiter les risques infectieux liés à leur fragilité.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris pour lesquelles le système de production de toutes les cellules du sang est très proche de celui de l’homme, et extrêmement bien connu. Le projet est basé sur l’utilisation d’une souche de souris présentant un système immunitaire fonctionnel et complet ainsi que de plusieurs souches dérivées dont les animaux ont été génétiquement modifiés. Une souche dont le système immunitaire est non fonctionnel sera également utilisée pour permettre les greffes de cellules primaires humaines issues de patients chez la souris. A noter que cette dernière souche nécessite un hébergement confiné afin d’éviter tout risque d’infection ou de contamination. Nous utiliserons à la fois : - des animaux en cours de développement (avant la naissance) afin de comprendre le rôle des gènes étudiés pendant une étape clé de la fabrication des globules rouges, qui se déroule dans le foie du fœtus. - des animaux âgés de 2 ou 3 mois. Nous analyserons le tissu responsable de la formation de toutes les cellules du sang afin de comprendre comment certaines modifications génétiques influencent son bon fonctionnement.
Rôle des œstrogènes dans la récupération musculaire chez la souris après une blessure induite par l’exercice.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Pour mesurer si les hormones sexuelles femelles accélèrent la réparation du muscle après une lésion provoquée par l'exercice, 2 877 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur tissu musculaire. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré pour 2 817 d'entre elles et léger pour 60. Chaque animal subit un changement de régime alimentaire, jusqu'à trois lavages vaginaux, une séance d'électrostimulation de quinze minutes sous anesthésie générale et jusqu'à quatre mesures de force musculaire, le porteur rattachant les nuisances attendues au "cumul d'actes" plutôt qu'à un geste en particulier. Les points limites qui déclenchent la mise à mort listent l'infection vaginale, le gonflement anormal de la patte, une perte de poids supérieure à 10 %, la prostration et la mobilité réduite.
Objectifs
Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Il a été montré que ce processus est plus efficace chez les souris femelles par rapport aux souris mâles. Cette différence pourrait être liée, au moins en partie, aux variations des hormones sexuelles femelles au cours du cycle ovarien. Le projet vise à i) mettre en évidence l’influence du sexe sur la réparation musculaire en nous appuyant sur un modèle préclinique standardisé de lésions musculaires physiologiques induites par l’exercice ; ii) identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’identifier i) l’influence du sexe sur la réparation musculaire en nous appuyant sur un modèle préclinique standardisé de lésions musculaires physiologiques induites par l’exercice ; ii) les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. A terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs situations physiopathologiques affectant la production/disponibilité des hormones sexuelles femelles (ménopause, cancer…).
Procédures
Les souris sont soumises à un changement de régime alimentaire, à des lavages vaginaux (3 au maximum, durée 1 minute maximum), un protocole d’exercice (sous anesthésie générale, durée 15 minutes maximum), une mesure de force musculaire sous anesthésie (4 maximum).
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (contention, lavages vaginaux, électrostimulation, anesthésies) qui peut engendrer un stress pour les animaux.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Le laboratoire a déjà démontré in vitro par la culture cellulaire le rôle des hormones sexuelles femelles sur la prolifération des cellules musculaires. Aussi, bien que l'analyse de la régénération musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, ce processus repose notamment sur l’interaction entre différentes cellules qui ne peut être étudiée qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale.
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectuées précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser un dommage musculaire induit par l’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. L’enchaînement des procédures est construit sur une stratégie de type GO/NO GO qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’exercice et de la mesure de la force musculaire. Notre expérience sur ce modèle de dommage musculaire et de lavages vaginaux montre que l'ensemble (100%) des animaux est inclus pour réaliser des analyses fonctionnelles et biologiques. Un lavage vaginal est effectué ce qui permet d’éviter la réalisation d’un prélèvement intravaginal (frottis). Le raffinement inclut également l’administration de tamoxifène dans la nourriture plutôt que par injections. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont appliqués (infection vaginale, gonflement anormal de la patte, perte de poids > 10%, non utilisation persistante de la patte, prostration de l'animal, démangeaison, mobilité réduite)
Choix des espèces
Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Les animaux utilisés sont âgés de 10-14 semaines.
Synergie immunothérapeutique pour l’amélioration des réponses antitumorales
- Recherche appliquée
- Cancers
Injectées de cellules tumorales sous anesthésie, traitées à six reprises et pesées trois fois par semaine, 1 836 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes, dont la rate, les ganglions drainants et la moelle osseuse. Le projet cherche à savoir si une protéine recombinante associée à des immunothérapies fait mieux régresser les tumeurs que chaque traitement seul, les essais cliniques restant renvoyés à un avenir non daté. Sur le régime anesthésique des injections de traitement, le RNT dit trois choses différentes : anesthésie générale dans la description des procédures, animal vigile dans celle des effets indésirables, anesthésie locale dans le raffinement.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer in vivo l'efficacité thérapeutique et les mécanismes immunologiques associés à l'administration combinée d'une protéine recombinante avec des immunothérapies dans des modèles murins de cancer. Les objectifs spécifiques sont de déterminer si la combinaison thérapeutique proposée améliore la régression tumorale, la survie globale, ainsi que la fréquence et la qualité des réponses immunitaires antitumorales comparativement aux traitements monothérapeutiques. Deuxième objectif : Caractériser l'infiltration immunitaire intratumorale induite par les traitements combinés en analysant la présence, la répartition et l'activation des sous-populations cellulaires. Troisième objectif : Étudier les effets systémiques des traitements sur les populations lymphocytaires dans les la rate et les ganglions drainants, ainsi que dans la moelle osseuse afin de déterminer l'impact global du traitement sur l'immunité adaptative. Ces objectifs permettront de clarifier le potentiel thérapeutique et les mécanismes immunologiques sous-jacents à l'utilisation combinée de ce traitement combiné, en vue d'optimiser les stratégies d'immunothérapie contre le cancer.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet incluent : 1.L'identification d'une nouvelle combinaison thérapeutique potentiellement supérieure aux traitements actuels en termes d’efficacité antitumorale, avec une amélioration notable des taux de régression tumorale et de la survie. 2.Une meilleure compréhension des mécanismes immunologiques impliqués, notamment concernant l’activation et l'infiltration des sous-populations lymphocytaires clés, ainsi que la formation de structures lymphoïdes tertiaires au sein des tumeurs, pouvant servir de biomarqueurs prédictifs d’efficacité thérapeutique. 3.La possibilité d'élargir ces résultats précliniques vers des essais cliniques futurs, en fournissant une base solide pour le développement de stratégies innovantes et plus efficaces d’immunothérapie en oncologie humaine. Ainsi, ce projet pourrait avoir un impact significatif sur l’amélioration des traitements du cancer des patients traités par immunothérapie .
Procédures
L'injection tumorale sera réalisée chez les animaux sous anesthésie générale (durée de 2 minutes, une fois par souris). Nous effectuerons également des injections chez les animaux sous anesthésie générale (durée de 2 minutes, 6 fois par souris). Des prélèvements sanguins seront également effectués sous anesthésie générale (durée de 2 minutes, un prélèvement par souris).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables dus à l'induction de la croissance tumorale sont une légère gène mécanique, et une possible diminution modérée de poids . Les injections (une par souris) de cellules tumorales seront effectuées sur animal anesthésié (une par souris, durée maximale 2 minutes). Les injections de traitements provoquent une douleur légère et transitoire et seront effectués sur l’animal vigile (6 par souris, durée 2 minutes). es manipulations des animaux pour les injections, le suivi de croissance tumorale ou les pesées 3 fois semaine pourront induire un stress.
Devenir
Afin de caractériser l'effet de nos traitements; notamment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les organes des animaux traités et non traités. Nous devons pour cela procéder a euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire et métabolique des organes , ainsi que celles des tissus est indispensable pour évaluer les effets anti tumoraux mais également la toxicité éventuelle des traitements testés.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, le microbiote, l’immunité anti-tumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse anti-tumorale dans un contexte tumoral, avec toutes les interactions nécessaires. Il est impossible de reproduire toutes ces intéractions in vitro ou ex vivo.
Réduction
Dans cette étude, nous allons faire en sorte d’utiliser le moins de souris possible. Pour cela, nous allons organiser les expériences par étapes, en avançant seulement si les résultats de l’étape précédente sont conformes aux attentes. Chaque expérience sera répétée indépendamment deux fois pour s'assurer que les résultats sont fiables. Si la première ne donne pas les résultats attendus, nous arrêterons là, ce qui évitera d’utiliser plus d’animaux. Nous avons aussi calculé à l’avance combien de souris sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables, en nous basant sur les expériences déjà faites dans notre laboratoire. Cela nous permet de ne pas en utiliser plus que nécessaire. Enfin, pour analyser ce que nous observons (comme l’évolution des tumeurs ou la durée de vie des souris), nous utiliserons des méthodes statistiques.
Raffinement
Une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant le début de l’expérimentation afin de réduire le stress des animaux et d'assurer leur adaptation à l'environnement de laboratoire. Une surveillance quotidienne permettra d’observer tout changement comportemental et, si nécessaire, de mettre en place des adaptations ou des traitements. Toutes les injections seront administrées sous anesthésie locale afin de minimiser la douleur. Les souris seront pesées régulièrement, au moins une fois par semaine. Les points limites précoces seront strictement respectés et des soins adaptés seront prodigués, en consultation avec le vétérinaire, pour garantir le meilleur bien-être possible des animaux tout au long de l'étude.
Choix des espèces
La génétique de la souris est proche de celle de l’Homme et bien décrite au niveau de la littérature scientifique, ce qui rend comparable les voies de signalisation immunologiques des tumeures entre l'Homme et la souris. Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Aussi, les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et l’immunité intestinale. Toutes ces raisons scientifiques, pratiques et éthiques font de la souris un animal indispensable dans la réalisation de ce projet. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines, ce qui correspond à leur maturité sexuelle et assure une stabilité hormonale. Cet âge est optimal pour garantir une réponse biologique cohérente et réduire les variations liées aux fluctuations hormonales. De plus, leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui est essentiel pour l’étude de la progression tumorale et des réponses aux traitements, tout en permettant des interventions expérimentales sur une période prolongée.
Influence d’un stress de faible intensité sur les crises d’épilepsie dans un modèle murin d’épilepsie chronique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une à deux chirurgies crâniennes sous anesthésie, puis des crises d'épilepsie généralisées avec perte de posture et mouvements incontrôlables : 66 souris subissent ces procédures, dont 60 relèvent d'un niveau de souffrance sévère. L'induction de l'épilepsie entraîne selon le porteur un stress métabolique et une perte de poids sur 24 à 48 heures, et jusqu'à six prélèvements sanguins par animal servent à doser la corticostérone. Le facteur de stress ajouté, lui, tient en trente secondes d'apparition d'une ombre, qualifié de "faible intensité", alors que les mêmes souris peuvent passer onze semaines séparées de leurs congénères par une paroi perforée. Toutes sont tuées puis perfusées pour prélever leurs cerveaux.
Objectifs
L’épilepsie touche environ 1% de la population mondiale et, dans 30% des cas, aucun médicament ne permet le contrôle des crises. Cette forme de la maladie dite pharmaco-résistante est souvent associée à de nombreuses comorbidités et complications (ex. troubles cognitifs). Son coût pour la société est estimé à 14 milliards d’Euros par an en Europe et, malgré l’accès à plus d’une quinzaine de nouveaux médicaments anti-crises, le taux d’épilepsie réfractaire n’a pas changé en 30 ans. Ce constat difficile est en partie due au fait que nous ne comprenons pas bien les mécanismes de déclenchement des crises épileptiques dans le cerveau. Parmi les facteurs favorisant leur apparition, les patients rapportent fréquemment le stress comme l’un des principaux déclencheurs. Afin de mieux comprendre comment le stress favorise la survenue de crises au niveau neurobiologique, nous proposons d’étudier spécifiquement les modalités de stress de faible intensité susceptibles d'influencer les crises d’épilepsie dans un modèle murin d’épilepsie chronique.
Bénéfices attendus
Afin de mieux comprendre le lien entre le stress et l’épilepsie, ce projet présente deux bénéfices principaux : d’une part, la mise en place d’un modèle fiable de stress capable d'influencer les crises d'epilepsie ; d’autre part, une meilleure compréhension du délai d’apparition des crises après l’exposition au facteur de stress. Mieux comprendre comment l’activité épileptiques se déclenche est de première importance pour pouvoir développer de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi qu'ameliorer les systemes de prédiction des crises.
Procédures
Les animaux subiront une à deux chirurgies sous anesthésie générale et avec analgésie (entre 30 min et 1h30). De plus, la plupart des animaux vont subir soit une ou plusieurs crises aigues généralisées (une crise dure quelques secondes à une minute) soit développer une épilepsie du lobe temporal. Une crise généralisée correspond à une perte de posture, et mouvements incontrôlables. Tous les animaux seront suivis de près après chirurgie et induction d’une crise, et le cas échéant traités avec des soins adaptés (ex : analgésique pour la douleur, anti-convulsant pour la crise). Les souris seront également soumises à un stress de courte durée par stimulation sensorielle (30 s ex : apparition d’une ombre) de faible intensité accompagnée d’un monitoring vidéo continu pour analyser les comportements et comprendre la place d’un évènement stressant dans l’influence des crises épileptiques. Durant le protocole de stress, des prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie légère pour mesurer les taux de corticostérone. Chaque prélèvement sanguin durera au maximum 2 minutes et sera répété jusqu’à 6 fois par animal, avec un délai minimal de 48 heures entre deux prélèvements consécutifs. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères si possible. Toutefois, si l’expérimentation le nécessite, un hébergement semi-individuel sera mis en place. La durée maximale en hébergement individuel sera de 11 semaines en semi-isolement puisque les animaux seront séparés par une paroi perforée qui maintient un contact visuel, olfactif, auditif et tactile (restreint).
Impact sur les animaux
La procédure implique une ou plusieurs chirurgies sous anesthésie générale. Cette intervention entraine une douleur modérée. De plus, cela entraine une déshydratation légère de courte durée. Crises épileptiques induites ou spontanées : les crises peuvent entrainer un stress de courte durée. De plus, l’induction de l’épilepsie entraine un stress métabolique/malnutrition chez beaucoup d’animaux avec une perte de poids durant les 24 à 48h post-induction que la plupart vont récupérer rapidement au cours de prochains jours. Prélèvements sanguin répétés entrainent une douleur légère de courte durée.
Devenir
À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés puis perfusés, afin de collecter leurs cerveaux pour des analyses histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative tangible pour ce projet. En effet, notre étude utilise des méthodologies impossibles à utiliser chez l’homme/patients. Des modèles de simulations informatiques complémenteront notre étude mais nous devons d’abord avoir une compréhension plus claire du role du stress sur les crises épileptiques.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux requis pour ce projet, nous mettrons en place des contrôles internes chaque fois que cela sera possible. Nos contrôles internes correspondent à des mesures répétées de nos observations sur le même animal. Chaque animal est ainsi observé avant et après le test de stress afin d’étudier la variation induite par le stress tout en s’affranchissant de la variabilité inter-individuelle. Cette approche permet de réduire le nombre de groupes expérimentaux nécessaires, tout en augmentant la puissance statistique de l’étude grâce à une meilleure maîtrise de la variabilité interindividuelle.
Raffinement
Pendant la phase d’étude, un suivi hebdomadaire renforcé sur l’états de chaque individu en termes de bien-être sera effectué. De plus, après validation de la méthode de surveillance vidéo et dès que possible, les animaux seront hébergés en groupe. Pendant l’hébergement individuel, les animaux seront séparés par une paroi perforée transparente afin de maintenir au maximum un contact visuel, olfactif, auditif et dans une moindre mesure tactile et leur milieu de vie enrichit. Pour le modèle d’épilepsie utilisé, un protocole de suivi de la crise épileptique a été optimisé. En effet, comme chez les patients (5 minutes pour les patients), si la crise dure moins de 2 minutes, l’animal n’est pas traité pour cette crise sauf être mis au calme. En revanche, si la crise dure plus de 2 minutes, l’animal se verra administrer un anticonvulsif. Pour toutes chirurgies, les animaux seront anesthésiés de manière générale avec l'administration d'analgésiques appropriés en amont, durant et après l'opération pendant plusieurs jours. De plus, tous les animaux seront suivis post-chirurgie, induction d'épilepsie pendant plusieurs jours de manière renforcée pour limiter au maximum stress et douleur à l'aide de grille d'évaluation. Enfin, les points limites stricts propres au projet seront appliqués afin d'apporter des soins adaptés le cas échéant.
Choix des espèces
Ce projet utilise des modèles de souris adultes épileptiques pour étudier au mieux les épilepsies du lobe temporal chez les patients adultes. En effet, l’étude proposée ainsi que les méthodologies utilisées ne sont pas applicables aux patients. De tous les modèles expérimentaux, le cerveau de souris offre un grand nombre d’avantage : Il est structurellement très proche du cerveau humain, et il est assez gros pour permettre l’utilisation de méthodes d’enregistrements précises. De plus, par rapport au rat ou au primate, la souris permet d’utiliser un éventail très large d’outils génétiques, développés dans cette espèce. Enfin, Il existe un très grand nombre de modèles d’épilepsie acquise et génétique qui reproduisent fidèlement différentes épilepsies qui pourrait être utilisé dans de futurs projets précliniques.
Validation de sondes optogénétiques génétiquement encodées chez la souris en comportement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à trois heures par jour sur une roue d'activité, six fois par semaine pendant huit semaines : 2 976 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue par une chirurgie terminale destinée à prélever des échantillons. Chacune subit d'abord une opération du crâne de moins de deux heures, puis, pour une partie d'entre elles, une injection de colorant sous anesthésie tous les six jours pendant trois à quatre semaines, avec un risque de lésion, de saignement et de dépression cardio-respiratoire. L'objet réel du projet reste la caractérisation de protéines fluorescentes servant à lire l'activité électrique des neurones, présélectionnées parmi plusieurs centaines de milliers de variants criblés en culture cellulaire. Le porteur affirme que la souris est le seul mammifère aisément modifiable génétiquement et retient l'espèce parce que la taille de son cortex correspond au champ du microscope et qu'elle est "assez résiliente" à ce type de chirurgie, avec "une appétence certaine pour courir sur une roue d'activité".
Objectifs
De nouvelles méthodes consistent a utiliser des protéines sensibles à la lumière pour « lire » ou « écrire » l’activité électrique grâce à des nouvelles méthodes dites optiques, c’est-à-dire basées sur la lumière. En utilisant l’imagerie de l’activité électrique des neurones, nous pouvons comprendre la communication entre différents types de neurones. Ceci est possible grâce à de nouvelles protéines fluorescentes Les stratégies utilisées pour obtenir une présence minimale de ces protéines sur le neurone se basent sur l’existence et la disponibilité de modèles transgéniques. Les souris constituent le seul mammifère aisément modifiable génétiquement et leur utilisation ne peut pas être remplacé par des systèmes in silico ou in vitro pour évaluer le potentiel de ces nouvelles protéines. L’objectif de ce projet est de caractériser in vivo ces nouvelles protéines dont la sensibilité est améliorée et peuvent être combinées grâce à la diversité de leur propriété, notamment la couleur qui les rende fluorescente. Afin de réduire l’utilisation d’animaux, le maximum de tests in vitro a été réalisé afin de présélectionner le plus petit nombre de protéines candidates à partir d’une base de plusieurs centaines de millier de protéines. Les expériences d’imagerie neuronale in-vivo permettent de tester plusieurs conditions et d’obtenir beaucoup d’information par animal afin de réduire le nombre d’animaux utilisés par protéine ou couple de protéines testé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de donner accès à de nouveaux outils qui serviront pour mieux comprendre les mécanismes de fonctionnement des neurones. Les méthodes optiques comportent divers avantages y compris le fait qu'a partir d'un animal une grande quantité de données sont obtenues. Et en même temps, cette méthode est peu invasive par rapport à des approches d’insertions d’électrodes. Par ailleurs, ces animaux serviront à la fois à la recherche et à la formation des étudiant.e.s pour la recherche. Enfin, l’émergence et la validation de ces nouveaux outils permettront à terme, grâce à cette nouvelle façon précise et directe de mesurer l’activité cérébrale, de raffiner la compréhension du développement de maladies et des mécanismes d’actions de candidats médicaments.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie sous analgésie et anesthésie qui durera moins de 2 heures et sera réalisée une seule fois par animal. Certains animaux seront positionnés sur une roue d’activité au maximum 6 fois par semaine pendant au maximum 3 heures sur 8 semaines (au maximum) pour les expériences d’imagerie. Certains de ces animaux subiront une fois tout les six jours une injection de colorant (moins de quelques secondes) sous anesthésie sur 3 ou 4 semaines. Tous les animaux subiront une chirurgie terminale sous analgésie et anesthésie pour récupérer des échantillons.
Impact sur les animaux
Lors des injections d’analgésiques et anesthésiques, les animaux pourront subir un stress lors de la contention et de l’induction de l’anesthésie. Pour ces injections d’analgésiques et anesthésiques, l’animal pourrait ressentir une douleur lors du franchissement de la peau par l’aiguille. Lors du réveil post-chirurgical, les animaux pourront subir une hypothermie transitoire ainsi que des douleurs post opératoires. Un risque de lésion et de saignement est possible à la suite de l’injection du colorant ainsi qu'une dépression cardio-respiratoire de moins de 10 secondes. Lors de l’expérimentation d’imagerie intravitale, le maintien de l’animal sur la roue d’activité pourra durant les premières dizaines de secondes conduire à un stress.
Devenir
Tous les animaux seront donc euthanasiés par une méthode réglementaire pour prélèvement afin de répondre à une question scientifique.
Remplacement
Des études préalables in vitro ont été réalisées pour limiter grandement le nombre d’expérimentations in vivo. Ainsi des centaines de milliers de variants ont été évalués lors de screening réalisés sur des cellules, dites immortalisées, en culture. Nous essayons également de développer des méthodes in silico afin de raffiner la prédictibilité de la fonctionnalité de ces protéines candidates en fonction de leur séquence et des résultats obtenus in vitro. Cependant pour évaluer le potentiel de ces sondes dans différents types cellulaires, à différentes profondeurs et dans le cerveau d’un animal en comportement, l’utilisation de souris en expérimentation in vivo ne peut pas être remplacé par des systèmes in vitro.
Réduction
Les effectifs ont été réduits au maximum grâce à un calcul de puissance. De plus, un faible nombre d'animaux (2-3 souris par condition) est suffisant pour fournir un nombre élevé de neurones. Par conséquent, nous utiliserons au maximum 2976 souris. Des tests statistiques adéquats seront utilisés pour l’analyse des résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. La température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées, le cycle jour nuit est automatique. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à l’eau et la nourriture. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères. Le milieu est enrichi (nidification, rongement). Une période d'acclimatation de 7 jours sera systématiquement pour les animaux provenant du fournisseur agrée défini ou pour les animaux provenant de notre animalerie centrale et transférés dans la pièce de stabulation. Toute chirurgie sera précédée d’une analgésie et anesthésie adéquat. Le maintien de la température est assuré. Un suivi post opératoire est effectué quotidiennement et toutes les mesures sont prises pour veiller au bien-être animal. Des points limites ont été défini et seront appliqués afin de garantir la minimisation de risque de souffrance des souris les atteignant. La mise en place systématique d’une période de manipulation préalable à l’expérimentation ainsi qu’une habituation progressive du dispositif expérimentale permet de réduire le stress de l’animal.
Choix des espèces
La souris est choisie pour plusieurs raisons dont les plus importantes sont la disponibilité de modèles transgéniques et de manipulations génétiques multiples, la taille des circuits neuronaux et domaines fonctionnels du cortex, de l’hippocampe et du cervelet est en adéquation avec la taille de l'image accessible par le microscope et la validation d’outils optogénétiques sera comparative vis-à-vis des outils antérieurs précédemment validé chez la souris. Par ailleurs, la souris est assez résiliente à ce type de chirurgie et à une appétence certaine pour courir sur une roue d’activité. Des animaux adultes seront utilisés. Leur âge sera supérieur ou égale à 6 semaines car à cet age les conditions pour faire de la microscopie sont réunies et que nous souhaitons comprendre le fonctionnement des neurones dans le cerveau adulte.
Rôle des acides gras polyinsaturés dans le développement cérébral
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Carencées en oméga-3 depuis le développement embryonnaire et jusqu'à leur mise à mort, soit jusqu'à 200 jours de régime, 840 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Quarante femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale de trente minutes pour une injection dans le cerveau de leurs embryons, quarante nouveau-nés reçoivent une injection cérébrale sous anesthésie locale. Le porteur signale des avortements spontanés possibles après la chirurgie, une prise alimentaire augmentée toute la vie chez les animaux carencés, des défauts de mémorisation et une altération des tâches liées à l'effort, qu'il qualifie de légers alors que la procédure est classée modérée. Il annonce quatre interventions et n'en décrit que trois.
Objectifs
Dans ce projet nous cherchons donc à comprendre l’impact d’un régime carencé en oméga-3 sur le développement des astrocytes et des vaisseaux sanguins cérébraux.
Bénéfices attendus
Notre projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle des acides gras omega-3 dans le développement et la maturation d'un type de cellules du cerveau, les astrocytes, et des vaisseaux sanguins cérébraux. Cela pourrait permettre d’apporter de nouvelles pistes de compréhension de l’impact des changements alimentaires sur l’apparition de troubles comme les troubles du spectre autistique, la schizophrénie ou encore les troubles d’attention et d’hyperactivité chez les jeunes enfants.
Procédures
4 interventions sont utilisées dans ce projet. 1)Régime alimentaire : les animaux sont soumis depuis leur premier jours de développement jusqu’à leur mise à mort à un régime soit suffisant soit dépleté en omega-3. Nombre d’animaux concernés : l’ensemble des animaux de l’étude. Les animaux auront au maximum ce régime pendant 200 jours. 2)Injection dans le cerveau d’embryon (in utero) suite à une chirurgie abdominale des femelles gestantes. Nombre de femelles concernées : 40. Cette chirurgie n’est réalisée qu’une seule fois (durée: 30 min maximum pour la totalité de la chirurgie par femelle). 3)Injection cérébrale chez des nouveau-nés. Cette injection se fait une seule fois, sous anesthésie locale. Nombre d’animaux : 40 (durée 15min).
Impact sur les animaux
Certains animaux recevront une injection qui peut entrainer une gêne au site d’injection (nuisance légère et de courte durée, 2jours maximum). Un lot de femelles subira une chirurgie in utero abdominale qui peut entrainer des avortements spontanés avec un stress modéré et de courte durée (dans le 3 jours qui suivent la chirurgie) . Des animaux seront carencés en lipides oméga-3 depuis le développement embryonnaire. Il a été montré que cela pouvait induire une légère augmentation de la prise alimentaire tout au long de leur vie. Au niveau du comportement, une légère altération dans les taches liées à l’effort a été observée ainsi que des défauts de mémorisation donc de légères nuisances sur la durée de l’expérience.
Devenir
La mise à mort des animaux est nécessaire pour récupérer les cerveaux afin d’étudier les propriétés des astrocytes et des vaisseaux sanguins
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. D’après nos précédentes études sur le cerveau en développement et mature, il faut obtenir les observations sur au minimum 5 réplicas biologiques pour chaque condition afin de pouvoir obtenir des résultats statistiquement interprétables.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Par ailleurs, pour les interventions pouvant induire une nuisance éventuelle, des mesures seront adoptées, selon une procédure avec des points limites gradés. En particulier, des points limites intermédiaires permettant la mise en place de soin aux animaux sera mise en place évitant la mise à mort des animaux. 1) Pour les nouveau-nés subissant une injection, ils feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure et les jours suivants. 2) Pour le lot de femelles subissant une chirurgie in utero : de l’analgésique est injectée avant et après la chirurgie. Un suivi très régulier dans les 48h qui suivent l’opération est mis en place, permettant d’initier des interventions éventuelles, allant de l’ajout d’analgésique à la mise à mort. 3) Pour l’ensemble des animaux soumis aux régimes, un suivi pondéral est assuré au cours du développement pour vérifier leur bon développement.
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Nous prévoyons 4 stades à étudier : 5, 15, 60 et 200 jours après la naissance. Ces stades ont été choisis sur la base d'études préalables qui montrent que l’Unité Gliovasculaire se met largement en place entre le 5ème et le 15ème jour après la naissance. Il est par ailleurs important de déterminer si ce sont des phénomènes uniquement développementaux (5 et 15 jours après la naissance) ou maintenus chez l’adulte (2 mois et environs 6 mois après la naissance).
Obésité maternelle et pathologies cardiaques congénitales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Mises au régime enrichi en graisses dès l'âge de cinq semaines, accouplées huit semaines plus tard, les femelles restent sous ce régime jusqu'à leur mise à mort. 343 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, avec une pesée hebdomadaire et trois mesures de glycémie obtenues en coupant le bout de la queue. Le porteur affirme n'avoir observé, lors d'études précédentes, ni souffrance ni perte de poids continue, et ajoute des bâtonnets de bois dans les cages pour entretenir "le besoin de grignotage". Les femelles sont tuées à 8,5 jours de gestation pour que leurs embryons soient prélevés, l'objet étant de comprendre comment l'obésité maternelle perturbe la formation du cœur.
Objectifs
L'obésité est un problème de santé publique majeur associée à de nombreuses comorbidités et dont l'incidence ne cesse d'augmenter. Les comorbidités associées aux maladies cardiovasculaires sont largement représentées et une augmentation significative de la prévalence des malformations cardiaques congénitales est observée dans les cas d’obésité maternelle. Les cellules progénitrices cardiaques sont présentes très tôt chez l’embryon et nous avons démontré que l'obésité maternelle induite par une alimentation enrichie en graisse affecte la contribution de ces cellules au développement du cœur embryonnaire offrant alors un terrain favorable au développement de malformations cardiaques. Une nette augmentation de la prévalence de ces malformations et de mort prématurée des embryons obtenus de mères obèses est observée. Les études chez la souris ont permis de définir l'impact de l'obésité maternelle sur le développement cardiaque embryonnaire précoce. Nous nous intéressons à présent au processus biologiques par lesquels l’embryon transforme la matière et l’énergie obtenu de la mère normale et obèse pour son développement normal ou défectueux. Nos résultats sont encourageants et prometteurs. Il apparaît que le statut métabolique et bioénergétique des cellules progénitrices cardiaques joue un rôle important pour le développement normal du cœur. Jusqu'alors l'impact de l’obésité maternelle sur le développement cardiaque embryonnaire n'avait jamais été exploré. L'objectif de notre étude à long terme est d’identifier des cibles pertinentes pour le diagnostic et la prévention précoce des pathologies cardiaques congénitales dans un contexte d’obésité maternelle chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Jusqu’à présent les recherches fondamentales sur les pathologies secondaires à l’obésité ne rendaient pas compte de l’impact de l’obésité maternelle sur le développement de l’enfant en devenir. Les connaissances relatives au développement cardiaque embryonnaire ne permettent pas de déterminer quels sont les évènements biologiques défaillants. Ce projet à pour objectif d’exploiter les connaissances acquises et de développer de nouvelles connaissances relatives au métabolisme énergétique et aux voies de signalisation requises pour le développement normal du cœur. Ces recherches ont pour objectif de mettre à mal le spectre des pathologies cardiaques congénitales dans le cas d’obésité maternelle. Nous envisageons que l’identification des molécules et des réseaux altérés permettront d'envisager des cibles thérapeutiques afin de prévenir le développement des pathologies cardiaques congénitales chez l’Homme.
Procédures
L'obésité maternelle est obtenue par une alimentation enrichie en graisse en amont de l'accouplement et tout au long de la gestation. Les femelles âgées de 5 semaines seront soumises à un apport nutritionnel riche en acides gras qui sera maintenu pendant 8 semaines avant accouplement et jusqu'à l’euthanasie de l’animal. Pour chaque individu, un contrôle hebdomadaire de la prise de poids sera réalisé. Un contrôle de glycémie sera effectué lors du changement de régime alimentaire puis toutes les 4 semaines, trois prélèvements seront donc réalisés. Les mesures seront réalisés en moins d'une minute à l'aide d'un glucomètre.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont les suivants : 1- La modification du régime alimentaire des jeunes femelles. Les souris seront soumises à une alimentation enrichie en graisse au stade de 5 semaines pendant 8 semaines puis jusqu’au moment du sacrifice. Il n’y a pas de procédure invasive au changement d’alimentation. Les mâles reproducteurs seront eux soumis à une modification du régime alimentaire sur une fenêtre temporelle limitée à la période d’accouplement. Dans nos études précédentes nous n’avons pas observé de souffrances des animaux par une sous-alimentation qui puisse amener à une perte de poids continue ou un comportement inattendu. Lors de la modification du régime alimentaire les cages sont enrichies en batônnets de bois afin d’entretenir le besoin de grignotage des animaux. Besoin observé lors de notre précédente étude. 2- La mesure de la glycémie sera réalisée au moment du changement de régime alimentaire puis à 4 et 8 semaines après cette modification. Le dosage de la glycémie sera réalisé à l'aide d'un glucomètre. Une goutte de sang sera prélevée au niveau de la queue. La coupure très limitée du bout de la queue est couramment appliquée, en raison de la simplicité de la technique et de la riche vascularisation de la queue du rongeur. Le prélèvement sera réalisé au moment de la pesée hebdomadaire.
Devenir
Notre intérêt porte sur le développement embryonnaire. Les femelles seront donc mises à mort pour le prélèvement aux différents stades embryonnaires étudiés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise car il n’existe pas de méthode alternative. Les évènements qui nous intéressent se manifestent au cours du développement embryonnaire qui sont propres à l’organisme entier et vivant. In situ l’existence de nombreux facteurs produits par les tissus situés à proximité des cellules progénitrices ne permet pas la réalisation de cette étude en culture de cellules. Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico car elles ne sont pas adaptées aux objectifs de cette étude. En effet, les organes-on-chips, les organoïdes ou les gastruloïdes ne permettent pas de reconstituer le développement du cœur embryonnaire. Pour cela il faudrait maîtriser parfaitement l'apport maternel à l'embryon au cours de la gestation dont les modifications de la composition du liquide amniotique dans lequel baigne l’embryon et de l'apport nutritionnel via le placenta.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit de façon à obtenir suffisamment de données statistiquement significatives pour atteindre l’objectif scientifique fixé en respect du principe de réduction et de raffinement. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux en expérimentation nous effectuerons à l’issu de chaque génotypage, lorsque celui-ci est requis chez les embryons obtenus des parents transgéniques, un tri sélectif des génotypes des embryons afin de les utiliser pour les différentes approches expérimentales envisagées.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet sont élevées en groupes sociaux dans des environnements enrichis par des dômes en cartons ou des lanières de papier kraft ainsi que des batônnets de bois. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé, 3 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. Tout au long de l’expérimentation nous nous attacherons à reconnaître la douleur, la quantifier et agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis s'avèrent être atteints.
Choix des espèces
Nos recherches sont réalisées chez la souris, un modèle d'étude pour lequel les connaissances acquises sur le développement embryonnaire sont importantes et approfondies. Ce projet vise à étudier le développement des embryons obtenus de mères obèses induites. Nous nous intéressons aux cellules progénitrices cardiaques présentes aux stades précoces du développement à 8,5 jours de gestation, la gestation est de 21 jours chez la souris. Nous utiliserons des souris sauvages et génétiquement modifiées. Les animaux transgéniques sont des modèles requis pour l'identification, le suivi et l'étude des cellules progénitrices et de leurs dérivés cardiaques aux différents stades du développement embryonnaire. Ce projet permettra d’évaluer l'impact de l'obésité maternelle sur les évènements fondamentaux du développement cardiaques, les processus cellulaires et moléculaires, le métabolisme, etc. Les résultats doivent permettre des avancées majeures pour la prévention et le traitement de ces pathologies chez l’Homme.
Etude de l’impact de l’absence d’un récepteur à lipoprotéines sur le développement de l’athérosclérose – Modifications
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris de ce projet sont privées d'un récepteur aux lipoprotéines par cinq injections dans l'abdomen, puis nourries vingt semaines avec un régime riche en graisses et en cholestérol pour développer des plaques d'athérome. 112 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, l'autre d'un niveau modéré. Elles subissent onze prises de sang à la queue, un jeûne de seize heures, un gavage à l'huile d'olive dont le porteur reconnaît le risque de fausse route, cinq prises de sang supplémentaires et deux échographies cardiaques sous anesthésie. Toutes sont tuées à la fin, pour le prélèvement des artères et du sang.
Objectifs
L’accumulation de plaques riches en gras au niveau des artères (plaques d’athérome) et l’inflammation chronique accélèrent le vieillissement cardiovasculaire et contribuent à la mortalité et à la morbidité en France. Nous avons récemment observé que l’inflammation modifie la quantité d'un récepteur au gras dans les cellules immunitaires des vaisseaux. Notre objectif est d’induire la formation des plaques d’athérome chez la souris dépourvue de ce récepteur afin de mieux comprendre le rôle de ce dernier dans les mécanismes de la maladie qui sera induite par un régime riche en graisse de 20 semaines.
Bénéfices attendus
La réussite de cette étude permettra de déterminer l’implication du récepteur des lipides dans le processus d'inflammation et le développement de maladies cardiovasculaires.
Procédures
Les 5 injections au niveau ventral de 5 secondes de la molécule permettant de supprimer le récepteur ou du contrôle. Les 11 prises de sang à la veine de la queue de 10 secondes pour le contrôle de l’évolution de la santé de l’animal (1 toutes les 2 semaines). Le gavage (avec de l'huile d'olive) de 15 secondes, suivi de 5 prises de sang au niveau de la veine de la queue de 10 secondes. Les 2 imageries cardiaques (imagerie non invasive) sous anesthésie en début et en fin de régime d’environ 30 minutes.
Impact sur les animaux
Douleur comme une piqure d’aiguille, répétées lors des administrations intrapéritonéales sur l'animal vigile, qui peuvent induire une petite inflammation sur le site d'injection. Stress liés aux prises de sang à la veine caudale. Faim liée à la mise à jeun pendant 16h. Gavage à l’huile d’olive peut provoquer une gêne et un stress, malgré l’expérience des utilisateurs il existe toujours un risque de fausse route sur le geste qui sera réalisé avec précaution sur chaque animal. Diminution de la fréquence cardiaque lors des échographies sous anesthésie. MODIFICATION – Stress liés à la mise en contention.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l’étude puisque différents organes seront récupérés, notamment les artères afin d'étudier le développement de plaques d'athérome et le sang pour des études de la santé de l’animal. L'animal est inconscient lors de sa mise à mort.
Remplacement
De précédentes études sur le rôle du récepteur ont déjà été réalisées in vitro au laboratoire sur des modèles cellulaires de cellules immunitaires notamment une observation des caractéristiques et du fonctionnement des cellules de ces derniers. Cependant, pour étudier l'effet de la formation de dépôts lipidiques, de plaques d’athérome au niveau de l’aorte et l’inflammation associée sur le système cardiovasculaire lorsque le récepteur des lipides est diminué, nous sommes obligés de passer par un modèle in vivo. Le remplacement dans ce cas n'est pas possible.
Réduction
Toutes les mesures seront réalisées sur chaque animal, ce qui en réduit le nombre. De plus le nombre de souris nécessaires a été calculé pour permettre les analyses statistiques à postériori. Par expérience, le développement des plaques d'athérome dépend du type animalerie et du sexe (plus rapide chez les femelles). Ces analyses statistiques seront donc faites sur les groupes mâles et sur les groupes femelles séparément. Au total 112 animaux seront utilisés sur ce projet.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe avec de l’enrichissement. Les souris sont surveillées très régulièrement (prise de poids, zone d'injection). Une anesthésie gazeuse sera pratiquée pendant l’échographie des vaisseaux et du cœur et du gel ophtalmique est déposé sur les yeux pour éviter le dessèchement. Un anesthésique local est appliqué avant chaque prise de sang à la queue. La mise en place de points limites est adaptée à chaque étape de la procédure.
Choix des espèces
Les souris qui seront utilisées et mises sur régime riche en graisse développeront une obésité proche de celle de l’homme. Des souris adultes mâles et femelles de 8 semaines seront utilisées pour la réalisation de ce projet, âge où elles seront injectées avec une molécule permettant la suppression du récepteur solubilisée dans de l’huile ou d’huile seule (contrôle), puis ces mêmes souris seront soumises à l'âge de 12 semaines, âge où l'appareil vasculaire à atteint sa pleine maturité, à un régime riche en lipides et en cholestérol pendant 20 semaines.
Etude moléculaire des troubles du neurodéveloppement chez la souris-Modification1
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des sons à 110 décibels et des chocs électriques sur les pattes, des souriceaux isolés deux fois cinq minutes pour enregistrer leurs cris, des femelles gestantes soumises à un stress par contention trois fois 45 minutes pendant six jours : 3872 souris vont être utilisées, 2064 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 1808 d'un niveau modéré. D'autres gestantes subissent une ouverture de l'abdomen sous anesthésie profonde de 45 minutes pour une électroporation in utero, suivie de trois jours d'injections analgésiques. Le porteur écrit qu'aucun phénotype dommageable n'a été observé ni décrit pour les génotypes concernés, et qualifie de modérées les réactions de freezing que ces tests provoquent. Sur les 3872 souris, 1680 sont tuées après avoir achevé leur "rôle de reproduction", les autres pour des analyses histologiques, épigénétiques, électrophysiologiques ou comportementales.
Objectifs
Notre étudions une molécule sécrétée dans le milieu extracellulaire qui contrôle des étapes cruciales du développement du cerveau. En effet, des altérations de niveaux de cette protéine d’intérêt sont observés dans de nombreuses pathologies psychiatriques dont l’autisme, la schizophrénie et la dépression mais aussi la lissencéphalie et l'épilepsie. Or plusieurs populations cellulaires sécrètent cette protéine lors d'étapes successives du développement du cerveau. L'objectif du projet est d’identifier les rôles respectifs de ces populations sources de notre potéine d'intérêt dans le développement du cerveau et l’étiologie des troubles du neuro-développement en combinant des approches moléculaires, histologiques, électrophysiologiques et comportementales.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ces travaux nous permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’étiologie des troubles du neurodéveloppement, pour envisager de nouvelles approches diagnostiques ou thérapeutiques.
Procédures
Tous les souriceaux de plus de 7 jours subiront un stress léger lié à la contention et au tatouage (1 min) ainsi qu’une douleur légère liée au prélèvement à la queue (10 sec) entre P7 et P10. Cette intervention n’aura lieu qu’une fois, sauf cas exceptionnel de prélèvement dégradé. Lot1: Tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec); Lot 2: Tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec) en juvénile puis perfusion intracardiaque à P25 (2 injections de 10 sec); Lot 3 : Tatouage (1min), isolation pour vocalisations (2x5min) et prélèvement (10sec) en juvénile, puis OF (20 min), EPM (7 min), 3-chambers (30 min), NOR (30 min), tests d'inhibition du réflexe de sursaut (32 min) et de conditionnement par la peur (8min/jour x 4 jours). Lot 4a: perfusion intracardiaque à P4 ou P7 (2injX10 sec); Lot 4b: Eléctroporation in utero (1injX10sec, chirurgie sous anesthésie générale profonde 35min, suture 10min, 2 injX10secX3 jours), tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec) puis perfusion intracardiaque (2injX10sec); Lot 5: stress prénatal (3X45minX6jrs). Modification : Les animaux du lot 3 subiront en plus un test d’hyperlocomotion induite par la d-amphétamine (1h30 dont 2 inj x 10 sec). Les animaux du lot Lot 5 subiront soit un stress prénatal par inflammation maternelle (1 x 10sec, ip), soit un stress prénatal dû aux injections d’antidépresseur fluoxetine ou de saline de la mère (1x 10 sec injection ip x 6jrs) soit un stress postnatal dû aux injections d’antidépresseur des nouveaux nés ( 1X 10 sec d’injection sous cutanéex 3jrs puis 1x 10sec d’injection ip x 3jrs) .
Impact sur les animaux
Les souriceaux subiront après la naissance une contention pour permettre un tatouage des coussinets des phalanges et un prélèvement à la queue qui peuvent entrainer un stress et une douleur légers. Les actes chirurgicaux peuvent entrainer une souffrance si elle est mal prise en charge par le traitement analgésique. A noter que l'étape d’anesthésie en elle-même peut également provoquer un stress chez l’animal. Pour réaliser l’enregistrement des vocalisations, certains souriceaux devront être isolés pendant 2 fois 5min , ce qui est une source de stress. De même, les tests comportementaux successifs adultes sont une source de stress, notemment les tests d’inhibition du réflexe de sursaut ou de conditionnement par la peurqui imposent aux animaux de subir des sons à très hauts décibels (110db) et des chocs électriques sur les pattes, qui même si modérés, induisent une réaction de stress notable (posture de freezing). Pour l'étude des conséquences du stress prénatal sur l'épigénétique, certaines femelles gestantes subiront un stress répété par contention. Afin de marquer les astrocytes, certaines autres gestantes subiront une analgésie (voie sous-cutanée) et une anesthésie générale profonde (par voie respiratoire) de 45 minutes, suivies d’un acte chirurgical comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures, puis des injections sous cutanées d’analgésique d'une durée de deux minutes 2 fois par jours pendant 3 jours. Aucun phénotype dommageable n’a été observé ou décrit dans la littérature pour les génotypes décrits.Modification : Les animaux réalisant les tests comportementaux subiront un stress additionnel à la fin pour étudier leur hyperlocomotion induite par l’exposition à la d-amphétamine. Pour l'étude des conséquences du stress prénatal sur l'épigénétique certaines femelles subiront soit un stress prénatal de contention maternelle (3x45min x6jrs) ou un stress dû aux injections répétées d’antidépresseurs. De même, pour l’étude des conséquences du stress postnatal, les souriceaux subiront un stress lié aux injections répétées d’antidépresseurs.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans le cadre de l'étude seront mis à mort, soit à des fins d'études histologiques (lot 2, 384 animaux; lot 4, 368 animaux), épigénétiques (lot 5, 224 animaux), électrophysiologiques (Lot 1b, 384 animaux) ou comportementales (lot 3, 384 animaux), soit après avoir achevé leur rôle de reproduction (lot 1a, 1680 animaux). Modification : le lot 5 comprend maintenant 675 animaux qui seront mis à mort à des fins d'études épigénétiques.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire in vitro la complexité du cortex en développement et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part, ce qui rend l’utilisation d’un modèle murin indispensable à la réalisation de ce projet. Notamment, les effets du stress périnatal impliquent des interactions précises, transitoires et adaptatives entre les hormones, les neurotransmetteurs et les neuro-modulateurs, mais aussi avec les systèmes inflammatoires, digestifs et sanguins qui sont encore mal connues et ne peuvent être reproduites in vitro.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous optimisons les croisements des lignées transgéniquespour obtenir un pourcentage maximal d’animaux d’intérêt et nous optimisons au maximum les échantillons obtenus en réalisant plusieurs séries de coupes par cerveau pour réaliser plusieurs marquages différents sur un même cerveau. Pour les études histologiques, un test de puissance G réalisé à partir de résultats antérieurs sur un autre modèle de souris nous préconise une taille de groupe de 6 individus par genre. Pour les études comportementales, nos résultats antérieurs préconisent une taille de groupe de 12 individus. Les analyses statistiques seront réalisés par un test adapté.
Raffinement
Des points limites strictes et spécifiques à chaque procédure sont appliqués. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton de nidification et bâtonnet de bois) et sont regroupés en groupes sociaux de 2 à 6 individus par cage. La mise à mort par perfusion de paraformaldéhyde est réalisée sous anesthésie générale profonde et après une injection sous-cutanée de l’analgésique buprénorphine. La chirurgie d’électroporation in utero est réalisée sous anesthésie profonde préalable par l’isoflurane (4% pour l’induction et 2% pour le maintien de l’anesthésie) et sur une plaque chauffante (37°C), et ce après une injection sous-cutanée de l’analgésique buprénorphine, la désinfection du site d’incision et l’ajout d’une gel ophtalmique pour la protection des yeux. Après l’opération, l’animal reçoit à 24 et 48h l’analgésique Meloxicame en sous-cutané.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le fonctionnement des circuits neuronaux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. En effet, seuls les Mammifères présentent un néocortex organisé en couches inversées, grâce à la présence précoce des cellules sécrétant notre protéine d’intérêt à la surface du cortex. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés sont disponibles chez la souris. Le génotypage et les prélèvements seront réalisés sur les souriceaux entre 4 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges sans douleur. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Pour étudier les rôles des sous-populations cellulaires sources de Reln dans la formation des couches corticales nous allons étudier les stades embryonnaires E12.5, E14.5 et E16.5, puis les stades postnataux P0 et P25. En effet, les neurones corticaux sont générés entre E12.5 et E16.5, atteignent majoritairement leur position à P0 mais continuent à migrer et à se différencier dans les couches corticales jusqu’à P25. Les effets des quantités de Reln sur la prolifération et la maturation des astrocytes seront analysés aux stades post-nataux P4 et P7 (avant et après la phase de prolifération) et P25 (pour pouvoir visualiser une arborescence mature). Les effets du stress prénatal sur l’expression de Reln seront évalués à P0, quand les deux sources principales de Reln corticale sont simultanément présentes. Enfin les rôles spécifiques des sous-populations sur le comportement seront analysés à P6 pour les vocalisations néonatales (âge du pic de vocalisation induite par l’isolation) et à l’âge adulte (P60-P120) pour les autres tests comportementaux qui nécessitent une maturation achevée des circuits. Modification : Afin de différencier les effets du stress postnatal de ceux du stress prénatal, nous analyserons aussi des animaux à P8, quand les deux sources sont encore simultanément présentes.
Etude des altérations du réseau de neurones hypothalamiques à 26RFa/orexines et de son fonctionnement dans la régulation centrale du métabolisme énergétique et de l’homéostasie glucidique, chez des souris obèses/diabétiques. MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Six sessions de deux heures, une prise de sang à l'extrémité de la queue toutes les quinze minutes, précédées d'un jeûne de 6 à 16 heures : 733 souris rendues obèses et diabétiques par leur alimentation vont être utilisées, 66 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 667 d'un niveau modéré. L'objectif déclaré est de savoir si un réseau de neurones hypothalamiques peut devenir une cible thérapeutique contre ce que le porteur nomme la "diabésité". Les souris passent aussi par un gavage et par un hébergement individuel en cage d'enregistrement métabolique, avant d'être tuées pour le prélèvement de leurs organes. Le porteur admet que cet isolement constitue une nuisance, qu'il dit minorer en raccourcissant le test et en tuant l'animal immédiatement après.
Objectifs
Depuis plus de vingt ans, il est clairement établi que des systèmes de régulation situés dans l’hypothalamus jouent un rôle central dans le contrôle de l’équilibre énergétique et glycémique de l’organisme. Un dysfonctionnement de l’un de ces systèmes pourrait ainsi contribuer au développement de maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type 2. Ces pathologies sont étroitement liées, donnant naissance au terme « diabésité ». Aujourd’hui elles touchent des centaines de millions de personnes dans le monde et constituent un enjeu majeur de santé publique. Ainsi, mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces maladies permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et de nouveaux traitements pour leur prévention et leur prise en charge. Néanmoins, notre connaissance des réseaux de neurones et systèmes moléculaires impliqués dans ces processus de régulation reste encore très limitée. Ce projet s’intéresse plus particulièrement à une population de neurones hypothalamiques impliqués dans la régulation de la balance énergétique et glucidique. Ces observations nous ont conduits à proposer le présent projet. Celui-ci vise à étudier chez des souris rendues obèses et diabétiques les altérations de ce réseau de neurones, ainsi que son fonctionnement. L’objectif est donc de déterminer si ce circuit neuronal peut représenter une cible thérapeutique pertinente pour améliorer le contrôle de la balance énergétique et glycémique dans un contexte d’obésité et de diabète de type 2.
Bénéfices attendus
De récentes études ont permis d’élucider le rôle et le fonctionnement d’une population neuronale dans la régulation de la balance énergétique et glucidique en condition physiologique. L’objectif de cette présente étude est donc d’étudier les potentielles altérations fonctionnelles et anatomiques de cette population de neurones en condition pathologique d’obésité/diabète. Ces recherches apparaissent cruciales non seulement pour la recherche fondamentale mais aussi dans la lutte contre la pandémie de « diabésité », afin de proposer des solutions innovantes dans la prévention, la prise en charge et le traitement de ces maladies.
Procédures
- Pour établir le profil glycémique des souris, leur glycémie sera suivie par un prélèvement sanguin à l’extrémité de la queue, pendant moins de 10 secondes toutes les 15 minutes, au cours de sessions expérimentales de deux heures. Chaque animal sera soumis à 6 expérimentations au maximum, chacune espacée d’une semaine de repos. Durant l'un de ces tests, les souris recevront une administration orale d'un composé avec l'aide d'une sonde de gavage : ce test s'ajoute aux autres tests de suivi de glycémie que les souris subiront. - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages d’enregistrement, permettant d'évaluer les paramètres métaboliques, avant d’être réunis avec leurs congénères préalablement connus.
Impact sur les animaux
Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chronique chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. - Afin de suivre la glycémie, les animaux subiront une mise à jeun de 6 à 16 heures avant chaque test physiologique. Nuisances prévues : perte de poids consécutive à la mise à jeun dont le retour à la normale sera surveillé après chaque test. Une semaine de repos minimum leur sera donnée entre chaque expérimentation. - Toujours pour suivre la glycémie, les animaux subiront une incision à l’extrémité de la queue. Nuisance prévue : douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique et potentielle infection prévenue par la désinfection systématique des plaies. Un test de suivi de glycémie supplémentaire sera ajouté, les nuisances prévues sont similaires aux autres tests. De plus, durant ce test, les souris recevront une administration orale d'un composé avec l'aide d'une sonde de gavage. Nuisance prévue : potentiel stress, diminué par habituation - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés dans des cages d’enregistrement permettant d'évaluer les paramètres métaboliques. Nuisance prévue : hébergement individuel inhérent à ce suivi, minoré par un temps de test le plus court possible et une mise à mort qui suit immédiatement le test.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèver les organes.
Remplacement
Afin de mieux comprendre la physiopathologie de l’obésité/diabète, de caractériser les altérations neuroanatomiques ainsi que du fonctionnement des réseaux de neurones hypothalamiques à 26RFa/orexines dans leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme, l’utilisation d’un modèle in vivo intégré est obligatoire. Il est nécessaire de pouvoir étudier la communication qu’il existe entre le système nerveux et les systèmes périphériques de l’organisme afin de comprendre l’influence du premier sur le second ; dans notre cas l’influence du réseau de neurones à 26RFa/orexines sur la régulation de la glycémie et du métabolisme énergétique (tel le comportement alimentaire ou l’activité physique). La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. Il n’existe alors à ce jour pas d’alternative non-animale.
Réduction
Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, une planification expérimentale a été réalisée en amont. De plus, pour chaque expérience, le nombre d’animaux nécessaire par groupe a été estimé afin d’obtenir des résultats fiables tout en réduisant au mieux le nombre d’animaux utilisés. Anticiper ainsi les effectifs adaptés permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, de diminuer le risque de devoir répliquer une expérience avec de plus gros effectifs ainsi que le double emploi. Ces estimations ont été réalisées avec un site en ligne qui calcule le nombre d’animaux requis en fonctions de plusieurs paramètres : la force de l’effet attendu, la variabilité entre individus, et les paramètres statistiques souhaités.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Ils seront maintenus à un minimum de trois par cage pour éviter l’isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. La taille des cages est réglementaire. L’état général des animaux sera quotidiennement évalué et les signes de mal-être seront surveillés attentivement. L’établissement de points limites nous permettra de veiller au bon suivi des animaux et de leur apporter au besoin les soins adéquats. Si les points limites sont dépassés, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et l’animal sera en fonction des cas, écarté des expérimentations ou mis à mort.
Choix des espèces
Seul un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre d’étudier la physiopathologie de l’obésité/diabète. Nous pourrons ainsi explorer dans un contexte d’obésité/diabète, les altérations des réseaux de neurones hypothalamiques, des systèmes moléculaires d’intérêts, et de leurs répercussions sur leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme. La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. La souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude la physiologie chez l’adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.