Souris

Greffées d'un mélanome murin sous anesthésie, irradiées quatre minutes, puis reconstituées par injection de cellules immunitaires, 3 978 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit ensuite trois injections d'immunothérapie espacées de deux jours au moins. Le développement tumoral peut entraîner perte de poids, anémie, déshydratation et ulcération de la tumeur. Le porteur écrit que ces souris ne peuvent être "éthiquement" ni réutilisées, ni adoptées, du fait de l'injection de cellules cancéreuses, et prévoit de les tuer toutes.

Objectifs

Les lymphocytes T CD8 sont des cellules essentielles de notre système immunitaire, capables de reconnaître et d’éliminer spécifiquement les cellules cancéreuses ou infectées, assurant ainsi une protection durable contre les maladies. Leur activité est régulée par des protéines appelées checkpoints immunitaires, qui peuvent freiner ou limiter leur action. Ces checkpoints sont aujourd’hui au cœur des stratégies d’immunothérapie contre le cancer, permettant de stimuler le système immunitaire pour mieux attaquer les tumeurs. Cependant, les mécanismes précis par lesquels ces protéines modulent les réponses immunitaires restent encore mal connus. Pour mieux les comprendre, il est indispensable d’utiliser des modèles animaux qui prennent en compte la complexité des interactions entre les différentes cellules dans l’environnement tumoral. Notre projet se concentre sur l’étude de checkpoints immunitaires qui jouent un rôle clé dans la régulation des lymphocytes T CD8 humains et vise à identifier les modalités moléculaires et cellulaires par lesquelles ces molécules contrôlent l’activité anti-tumorale de ces cellules.

Bénéfices attendus

Notre étude pourrait révéler comment certaines tumeurs développent des résistances aux traitements et aider à élaborer de nouvelles stratégies pour renforcer l’efficacité des immunothérapies actuellement développées.

Procédures

Des cellules tumorales de mélanome murin seront implantées de façon unique à des souris anesthésiées et analgésiées, sur une durée de 10 secondes. Les animaux seront ensuite soumis à une irradiation durant 4 minutes afin de permettre une reconstitution de leur système immunitaire par injection unique de cellules immunitaires spécifiques des cellules tumorales implantées, sous anesthésie, durant 10 secondes. Les souris vigiles pourront ensuite être traitées ou non par 3 injections d’immunothérapie par intervalles de temps espacés d’au moins 48 heures, chaque injection durant 10 secondes.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales est susceptible de causer ponctuellement une douleur modérée. Le développement tumoral peut engendrer des effets indésirables tels que perte de poids, anémie, déshydratation. Les tumeurs présentent également un risque d’ulcération. L’irradiation des souris engendre un stress de courte durée. L’injection de cellules immunitaires est susceptible de causer ponctuellement une douleur modérée.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort car elles ne peuvent pas être éthiquement réutilisées, remplacées ou adoptées, du fait de l’injection de cellules cancéreuses. Toutefois, une partie des souris mises à mort permettra d’effectuer des prélèvements d’organes post-mortem, et ainsi mener des expériences ex vivo en plus des données pré-cliniques qu’elles fourniront.

Remplacement

Bien que le projet inclue des expériences in vitro permettant d’étudier l’activité des cellules immunitaires sur des cellules tumorales, ces tests ne peuvent reproduire que partiellement la complexité des processus biologiques ayant lieu dans un organisme vivant entier. En effet, la réponse immunitaire contre une tumeur fait intervenir de nombreux mécanismes qui se déroulent selon une chronologie et dans des tissus variés, de l’activation des lymphocytes dans les organes lymphoïdes secondaires à leur déplacement vers la tumeur. Les modèles in vivo restent donc indispensables pour comprendre ces processus dans leur globalité et obtenir des résultats fiables afin de les transposer aux cancers chez l’être humain.

Réduction

Les effets biologiques présentent une variabilité statistique qui doit être impérativement limitée afin de pouvoir conclure de façon fiable à partir de résultats expérimentaux. Ainsi, à partir de valeurs extraites de la littérature scientifique, nous avons calculé à l’aide de tests statistiques le nombre minimal d’animaux nécessaires à la réalisation d’expériences robustes. Nous avons obtenu une taille d’échantillon de 26 animaux par groupe. Ce nombre pourra être réduit au cours du projet, sur la base de la réévaluation de la variabilité des effets biologiques mesurés.

Raffinement

Les animaux sont manipulés à l’aide de leur abri, ou bien dans le creux de la main, de façon à limiter l’anxiété et le stress lors des manipulations, conformément aux recommandations du NC3R. L’analgésie locale préalable à l’injection des cellules tumorales et des cellules immunitaires permet de supprimer la douleur liée à la piqûre. La surveillance accrue lors de la phase de développement tumoral, avec évaluation du bien-être animal à l’aide d’une grille de scoring, permet de prévenir la souffrance des animaux. En cas d’effets indésirables modérés, des mesures de renutrition et réhydratation sont prévues. En cas d’effets indésirables graves, les souris sont euthanasiées. Le transport adapté ainsi que les différentes sources d’enrichissement contribuent à réduire le stress autour de l’irradiation. L’hébergement en conditions SOPF (exempt de pathogène spécifique ou opportuniste) ainsi que les mesures d’asepsie (utilisation d’équipements de protection individuels, portoirs ventilés individuellement) permettent de réduire le risque infectieux transitoire des animaux, le temps que leur système immunitaire se reconstitue. L’irradiation des souris engendre un stress de courte durée, pris en charge par un transport adapté et un enrichissement de l’hébergement, ainsi que des mesures de protection et d’asepsie le temps de la reconstitution du système immunitaire. L’injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse est susceptible de causer ponctuellement une douleur modérée, qui est prévenue par l’administration d’un analgésique.

Choix des espèces

Le modèle d’étude choisi est le modèle murin, dont la physiologie, notamment du point de vue du système immunitaire, permet la transposabilité des résultats pré-cliniques à la médecine humaine. Les souris seront incluses en procédure à partir de l’âge de 7 semaines, à partir duquel leur système immunitaire est considéré comme mature.

Pour savoir si les crèmes solaires favorisent le mélanome, 150 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes et de sang. Un mélanome leur est induit par application cutanée répétée de tamoxifène, puis les composés à tester sont appliqués sur la peau pendant deux à vingt-quatre semaines, chaque application précédée d'une tonte sous anesthésie. Les souris portent une collerette et passent des périodes en cage individuelle. Le porteur décrit des papules pigmentées apparaissant en trois à quatre semaines, puis des tumeurs de grande taille et des métastases pulmonaires et ganglionnaires, la mise à mort survenant entre le quarantième et le soixante-quinzième jour pour charge tumorale ou ulcération de la peau.

Objectifs

Le mélanome cutané se situe au 8ème rang des cancers chez l'homme et au 6ème rang chez la femme. C'est une tumeur potentiellement agressive surtout lorsqu'elle est prise à un stade tardif et qui peut donner des métastases mettant en jeu le pronostic vital. L'incidence et la mortalité du mélanome ont augmenté régulièrement au cours des dernières décennies. L'induction du stress oxydatif (SO) par les rayons ultraviolets (UV), en particulier les UVA, par divers mécanismes, est un phénomène bien documenté. Des résultats préliminaires révèlent que les filtres solaires, conçus pour bloquer les rayons UV, peuvent induire indépendamment le SO, in vitro et in vivo. De plus, des données démontrent que les crèmes solaires peuvent induire la réticulation de l'ADN génomique et mitochondrial dans la peau de personnes saines. Il est donc crucial de déterminer si les crèmes solaires sont effectivement capables de générer un SO délétère et de favoriser les lésions de l'ADN, et d'étudier si ces lésions entraînent ensuite une augmentation de l'incidence du mélanome primaire et/ou métastatique dans le modèle murin in vivo. Cette étude pourrait faire progresser significativement nos connaissances et redéfinir les paradigmes entourant la formulation des crèmes solaires et leurs implications biologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’explorer les effets de l’application d’une crème solaire sur le développement de mélanomes cutanés. Ce projet permettra de déterminer si les filtres solaires sont capables de générer le stress oxydatif et favoriser les lésions de l’ADN et par conséquent augmenter l’incidence du mélanome primaire et/ou métastatique dans le modèle murin in vivo. Un total de 6 études environ sera réalisé sur la totalité du projet

Procédures

Le mélanome sera induit chez une partie des souris par application quotidienne (5 minutes) de tamoxifène, (sous anesthésie générale, inférieur à 15 min), pendant au maximum 3 jours. Le nombre de lésions sera enregistré 2 fois par semaine et mesurée 3 fois par semaine à partir de leur apparition (5 min). Les molécules test seront administrées par voie topique aux souris pendant 2 à 24 semaines à une fréquence variable. Les animaux seront pesés un minimum de 2 fois par semaine (< 2 minutes). Les applications topiques seront précédées par une tonte réalisée sous anesthésie pour assurer la reproductibilité (acte d’environ 15 minutes). Les animaux porteront des collerettes et seront hébergés individuellement. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie).

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, des lésions sont attendues aux sites induits chez les animaux recevant un anti-estrogène. Les lésions apparaissent généralement d'abord sous la forme de multiples papules fortement pigmentées avec une latence de 21-28 jours. Ces lésions se développent ensuite en tumeurs de grande taille, de sorte que les animaux porteurs de tumeurs sont généralement euthanasiés entre le jour 40 et le jour 75 après l'induction tumorale, en raison de la charge tumorale ou de l'ulcération de la peau sus-jacente. En plus des lésions mélanocytaires étroitement adjacentes qui sont devenues confluentes avec la progression de la maladie, nous pouvons nous attendre à observer une excroissance de tumeur non pigmentée s'étendant sous les parties superficielles pigmentées. Une telle perte de production de pigment a été décrite pour de nombreux autres modèles de mélanome murin et est en effet souvent observée dans les mélanomes et les naevus humains. Des métastases ganglionnaires et pulmonaires peuvent être détectées à partir de 6 semaines après l'induction tumorale. Chez les souris non traitées par l'anti-estrogène, nous pouvons nous attendre à l’apparition de tumeurs cutanées de manière plus tardive, entre 3 et 6 mois d’âge. Le port de la collerette et l’hébergement individuel pendant une heure peuvent induire un stress de désorientation, transitoire.

Devenir

Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des molécules sur la maladie d’intérêt.

Remplacement

Des résultats préliminaires révèlent que les crèmes solaires, conçues pour bloquer les rayons UV, peuvent induire indépendamment le stress oxydatif, in vitro. De plus, des données démontrent que les crèmes solaires peuvent induire la réticulation de l'ADN génomique et mitochondrial dans la peau de personnes saines. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’effet des filtres solaires sur l'incidence du mélanome primaire et/ou métastatique, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types de cellules et/ou tissus sont impliqués. L’impact réel des filtres solaires devra donc être vérifié in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’Homme. De plus, pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’études sur animaux.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon leur poids. Le nombre de groupes dépendra du nombre de conditions à comparer. Le nombre d’animaux par groupe sera adapté à la question scientifique et variera entre 6 et 8 10 par groupe. Le nombre d’animaux par groupe est choisi de sorte qu’il soit possible à l’issu de l’étude de faire des conclusions statistiquement significatives.

Raffinement

L’apparition de lésions cutanées sera enregistrée au moins deux fois par semaine et chaque lésion sera mesurée trois fois par semaine dès son apparition. Pour les études de tolérance, les animaux seront pesés quotidiennement pendant 7 jours puis au minimum 2 fois par semaine voire quotidiennement si nécessaire. Pour toute autre étude, les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine voire quotidiennement si nécessaire. Le poids constituant un point limite sera adapté au modèle. Un gel nutritif et de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de toutes les cages dès un seuil de perte de poids défini sur certains animaux. Les administrations topiques seront réalisées sous anesthésie. Le port d’une collerette avec hébergement individuel sera nécessaire. Une période d’acclimatation au port de la collerette sera réalisée et un enrichissement supplémentaire sera fourni (deuxième élément de nidification et aliment humidifié). Si nécessaire, un nettoyage quotidien des yeux avec une compresse imbibée de sérum physiologique stérile palliera le manque de toilettage imposé par le port de la collerette. Les produits tests seront administrés par voie topique sur la peau du dos des animaux, préalablement tondus sur une surface ne devant pas excéder les limites autorisées. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle et de la procédure sont prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction de la maladie et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). De plus, les modèles de mélanome sont bien documentés chez la souris. Des souris de 4-8 semaines seront utilisées, le modèle de mélanome induit étant bien décrit chez des animaux de cet âge pour observer l’apparition spontanée des lésions cutanées.

Les souris utilisées portent une ostéogenèse imparfaite, la maladie des os de verre, et s'exposent donc à des fractures spontanées accompagnées de douleurs modérées. 800 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant onze injections et deux radiographies sous anesthésie. Le médicament testé vise à corriger la petite taille associée à la maladie, que les bisphosphonates prescrits aux patients ne traitent pas. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" d'étudier la croissance dans un "organisme entier", et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever leurs organes.

Objectifs

L'ostéogenèse imparfaite, ou « maladie des os de verre », est une maladie génétique rare caractérisée par une fragilité osseuse. Les personnes atteintes se fracturent des os facilement tout au long de leur vie. Cette fragilité osseuse est due à l'anomalie d'une protéine essentielle à la structure des os. Quand cette protéine est défectueuse, les os deviennent plus fragiles et moins résistants aux chocs. Les personnes atteintes sont souvent de plus petite taille que la moyenne, et mesurent entre 92 et 108 cm à l'âge adulte. Les causes de cette petite taille ne sont toutefois pas encore comprises. Pour traiter cette maladie, la plupart des patients reçoivent des médicaments appelés bisphosphonates. Ces médicaments aident à limiter les fractures en réduisant la perte osseuse. Cependant, ils ne favorisent pas la croissance des os ni leur bonne qualité. De plus, environ 20 % des patients ne réagissent pas à ce traitement. Il est donc important de trouver de nouveaux traitements qui favorisent la croissance et la solidité des os. Ce projet vise à tester un nouveau médicament sur des souris atteintes d’ostéogenèse imparfaite, afin de déterminer s’il améliore la croissance des os, en particulier dans la zone responsable de l’allongement des os longs. Parallèlement, l’étude portera sur l’évolution du cartilage dans cette zone afin de mieux comprendre les mécanismes responsables de la petite taille observée chez les personnes atteintes.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont au nombre de deux : - mettre en évidence un traitement permettant de corriger la petite taille observée chez les patients atteints d'ostéogénèse imparfaite - comprendre comment la plaque de croissance est altérée suite à une anomalie de la protéine

Procédures

Contention et injection : 5 secondes, 11 fois/souris. Radiographie : 5 minutes, 2 fois/souris.

Impact sur les animaux

- La contention peut causer un stress léger de courte durée - Injections causent un stress léger et une douleur légère de courte durée - Risque de fractures spontanées avec douleurs modérés dû à la pathologie.

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de prélever leurs organes et de les étudier.

Remplacement

La croissance est un phénomène dynamique impliquant plusieurs types cellulaires. Or, à ce jour, aucun modèle in vitro ne permet d'étudier la croissance dans son ensemble. Il est donc impératif d'étudier ce processus au sein d'un organisme entier afin d'étudier les communications entre ces différentes cellules, plutôt que de se limiter à l’étude d’un seul type cellulaire.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats seront analysés avec des tests statistiques.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les radiographies et les injections seront effectuées sous anesthésie générale afin d'éviter tout stress supplémentaire pour l'animal. Des points limites spécifiques ont été définis. Toutefois, tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.

Choix des espèces

La croissance chez la souris est très similaire de celle chez l'homme. Le mécanisme de croissance est un processus dynamique faisant intervenir plusieurs types cellulaires et donc il est indispensable de pouvoir l'étudier dans un organisme entier. Les analyses seront réalisées à deux âges clés : à 5 semaines, correspondant à la fin de l’enfance chez l’être humain, à 11 semaines, correspondant à la fin de l’adolescence et donc à la fin de la croissance. Certaines souris seront étudiées à différents moments de la formation de la plaque de croissance, afin de mieux comprendre son développement et son rôle dans la croissance osseuse.

Soumises à un régime riche en graisses et en sucre pendant huit à vingt-quatre semaines, injectées avec des particules pour modifier l'expression d'un gène, puis placées jusqu'à onze jours en cage individuelle ou en enceinte à 30 degrés, 784 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. En fin de parcours s'ajoutent des injections de lipoprotéines tous les deux jours pendant deux semaines, avant que toutes soient tuées pour prélever le sang et les organes. Le projet vise à décrire le dialogue entre le foie, le cœur et les vaisseaux dans la stéatose hépatique et l'athérosclérose, et le porteur affirme que ce dialogue ne s'étudie qu'à l'échelle de l'"organisme entier". La composition et la durée exacte du régime restent indéterminées, renvoyées aux résultats d'une étude pilote encore en cours.

Objectifs

Les maladies métaboliques telles que la stéatose hépatique associée à un dysfonctionnement métabolique sont caractérisées par des désordres touchant le métabolisme énergétique, et notamment des lipides. Elles sont fréquemment associées à des complications cardiaques et vasculaires. L’accumulation de lipides dans la paroi des artères est une conséquence fréquente qui peut conduire à des accidents vasculaires comme la crise cardiaque. Elle est associée à d’autres troubles comme l’obésité, le diabète et les dyslipidémies. Ces maladies touchent plusieurs organes et doivent être étudiées de façon globale afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués. Toutefois les mécanismes impliqués dans la communication foie - cœur et contribuant au développement de l’athérosclérose sont peu connus. L’objectif principal de ce projet est de valider la contribution majeure de la voie d’un transporteur et des lipoprotéines dans cette communication et de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement des maladies cardiovasculaires chez les patients atteints de stéatose hépatique associée à un dysfonctionnement métabolique.

Bénéfices attendus

La prévalence mondiale des maladies du foie telle que la stéatose hépatique associée à un dysfonctionnement métabolique (Metabolic dysfunction–Associated Liver Disease, MASLD) associée à l’athérosclérose ne cesse de croitre (38 pourcents) et celle-ci est associée à une augmentation de la mortalité. Ainsi, 65 pourcents des patients diabétiques de type 2 sont atteints de MASLD. Ce projet permettra de mettre en évidence les mécanismes associés au développement de MASLD et de l’athérosclérose et aux troubles métaboliques qui en découlent tels que l’insulino-résistance, et plus particulièrement d’identifier un lipide clé des hépatocytes dans ce processus. Cette étude nous permettra de comprendre l’importance de la dérégulation de l’homéostasie lipidique des hépatocytes dans le développement des maladies cardiométaboliques et d’explorer les dialogues inter-cellulaire et inter-organes. L’ensemble de ces données permettra d’envisager notre transporteur d’intérêt comme une potentielle cible thérapeutique dans le traitement des patients ayant une MASLD et un risque cardiovasculaire élevé.

Procédures

Les animaux impliqués dans ce projet seront injectés avec des particules (moins de 5 minutes) pour exprimer le gène cible. Un maximum de 6 actes est prévu par animal. Seuls 6 actes au total sont réalisés sur animaux anesthésiés (injection des particules, prélèvements sanguins, échographie cardiaque, électrocardiogramme, activité d’enzyme et injection de lipoprotéines), les autres actes étant réalisés sur des animaux vigiles. Après 2 semaines, les souris seront mises en présence d’un régime riche en graisses et en sucre pour une durée de 8-24 semaines. Avant et après régime, sur les souris vigiles nous évaluerons la masse grasse ce qui nécessite une courte contention (moins de 5 min), et elles seront testées par un faible prélèvement de sang sous anesthésie (moins de 5 minutes). A la suite du régime riche en sucres ou en lipides, les souris seront mises à jeun (entre 2 et 15h) et rapidement évaluées sur le plan métabolique. Les conséquences de l’ingestion de sucres ou de lipides seront alors évaluées grâce à de très faibles prélèvements (5 et 6 prélèvements) de sang sur de courtes périodes (respectivement 5 et 6 prélèvements à 2h et 6h par intervention). De même, la sensibilité des souris à l’insuline, afin d’estimer un potentiel diabète, sera réalisé selon la même procédure (2h) et une procédure complémentaire (5 minutes). Afin que les évaluations soient fiables, les animaux seront vigiles et libres de leurs mouvements. De même, les évaluations seront réparties dans le temps afin d’éviter toute fatigue. Le comportement des animaux sera mesuré sur quatre jours grâce à des cages munies de divers capteurs. L’impact de la température sur la prise de poids sera mesuré dans des cages de thermoneutralité à 30 degrés Celsius. Une partie des animaux sera évaluée sur le fonctionnement du cœur par une échographie (15 minutes) et un électrocardiogramme (15 minutes). Ceci sera réalisé sous anesthésie afin de garantir l’immobilité des souris et la qualité des images sans stresser l’animal. Enfin, des lipoprotéines seront injectées tous les 2 jours pendant les 2 dernières semaines (moins de 5 minutes) pour tester leur effet thérapeutique. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet. Les organes seront prélevés post-mortem.

Impact sur les animaux

Les souris seront exposées à des régimes riches en lipides et en sucre pendant plusieurs semaines (24 maximum) pour induire une MASLD et de l’athérosclérose afin de provoquer les désordres métaboliques qui lui sont associée : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, troubles du rythme, troubles du rythme cardiaque…. Ces régimes pourraient induire un inconfort et une difficulté de déplacement dus à la prise de poids développée. L’injection de particule pourrait induire une douleur de courte durée et un risque d’hématome ou d’hémorragie. De plus, les souris seront soumises à un phénotypage métabolique qui inclus un jeûne non-strict de quelques heures ce qui peut engendrer une sensation de faim chez l’animal. Les injections pour le test de sensibilité à l’insuline et l'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose et un le suivi de glycémie (ou lipides) associé avec des prélèvements sanguins de faible volume pourront induire un stress et une douleur légère de courte durée. L'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose ou de lipide pour le test de tolérance aux lipides pourrait induire des microlésions et des irritations. De plus, les sites d’injections et prélèvements peuvent également s’infecter. L’analyse corporelle ainsi que l’hébergement dans les cages métaboliques ou en thermoneutralité peuvent engendrer un stress de courte durée. Le placement de certaines souris en cage individuelle pendant une période de 11 jours pourra causer un stress social. Les anesthésies gazeuses peuvent provoquer un risque léger de dépression respiratoire et de température corporelle. Enfin, la manipulation des animaux peut induire un stress

Devenir

Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins pour répondre à la question (ou aux objectifs) scientifique de ce projet.

Remplacement

Le dialogue inter-organes (coeur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (hépatocytes et macrophages) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires. Ainsi l’impact induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, l’altération du métabolisme lipidique dans un organe peut avoir un écho profond dans des organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués.

Réduction

Le projet impliquera 784 animaux au total. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre d’évaluations à réaliser, et donc le nombre d’animaux requis. La composition et la durée du régime riche en lipides et en sucres utilisé ici sera déterminée par les résultats d’une étude pilote en cours. Cette méthode nous permet ainsi d’assurer avec un faible nombre d’animaux le succès de ce projet et une utilisation rationnée et réduite au strict nécessaire.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel ou à 30 degrés Celsius (thermoneutralité) est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les greffes et les explorations cardiaques seront réalisées sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux. Les animaux seront vérifiés quotidiennement et un suivi régulier du poids sera effectué afin de s'assurer du bien-être des animaux. Pour faciliter l'alimentation, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage en cas de nécessité. Conformément à la réglementation, les actes techniques seront réalisés par du personnel formé et compétent pour respecter le bien-être animal et diminuer leur stress. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris constitue le modèle privilégié pour l’étude des mécanismes impliqués dans la pathophysiologie des maladies métaboliques : la souris est le mammifère le moins évolué qui développe rapidement des maladies métaboliques similaires à l’Homme. L’analyse de l’athérosclérose requiert une modification du métabolisme lipidique et une altération de la communication inter-organes. Nous utiliserons une lignée de souris qui présente un métabolisme lipidique plus proche de ce que l’on peut observer chez l’Homme. Des souris âgées de 8 à 10 semaines, un âge auquel elles sont suffisamment matures pour être injectées avec les particules, seront utilisées. Les régimes riches en lipides et en sucres seront mis en place à l'âge de 10 à 12 semaines, afin que l’expression du transporteur dans les hépatocytes suite à l’injection des particules soit optimale.

Opérées trois fois sous anesthésie, une à deux heures par intervention, puis maintenues la tête contenue pendant environ deux heures pour une tâche perceptuelle, 946 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent douze injections sous-cutanées et une séance de trente minutes évaluant leurs capacités pré-attentionnelles. Les animaux utilisés appartiennent à une lignée à haut risque de schizophrénie, retenue pour observer comment les neurones des régions auditives échangent des informations. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Percevoir avec précision la réalité extérieure est essentiel à notre survie. En particulier, les modifications de la perception sont une des caractéristiques majeures de la plupart des troubles neuropsychiatriques et neurodéveloppementaux, eux-mêmes source de souffrance et d’exclusion sociale. Bien qu'elles soient fondamentales, les bases biologiques d'une perception précise ou altérée sont très peu comprises. Dans cette étude, nous allons étudier d'une part chez des souris comment les neurones des régions cérébrales clés de la perception échangent des informations. Nous évaluerons les mécanismes qui conduisent au fonctionnement et au dysfonctionnement des neurones, grâce à l'utilisation d'un modèle de souris à haut risque de schizophrénie. Cette recherche fera progresser nos connaissances limitées sur la façon dont les troubles neurodéveloppementaux modifient les circuits neuronaux sensoriels et affectent ainsi la perception. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de comprendre les fonctions de régions cérébrales clés de la perception auditive chez la souris, modèle bien adapté pour mimer la physiologie et certains aspects de la pathologie humaine. L’utilisation de modèles souris transgéniques appropriés apportera des données au niveau cellulaire, anatomique et fonctionnel en identifiant les structures cérébrales fonctionnellement mises en jeu. Mieux comprendre ces structures permettra d’appréhender les processus de perception et de prédiction, mais aussi une meilleure compréhension des maladies psychiatriques dans lesquelles ces processus sont altérés. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.

Procédures

Chirurgie : 3 fois, 1h à 2h. Etude des capacités pré-attentionnelles : 1 fois, 30min. Contention pendant tâche perceptuelle : 1 fois, environ 2h. Injection sous-cutanée : 1 injection, durée 5 secondes, 12 fois. Injection intra-péritonéale : 1 injection, durée 5 secondes, 1 fois.

Impact sur les animaux

L’anesthésie peut entraîner du stress léger de courte durée. Les injections d’anesthésiques et d’analgésiques peuvent entraîner un stress et une douleur légère de courte durée. Une douleur modérée peut être associée à l’acte chirurgical. L’étude du comportement et la contention par la tête peuvent entraîner un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau en vue d'études physio-histologiques sur les souris expérimentales.

Remplacement

Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles complexes et comportementales sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Des analyses a priori de puissance statistique permettent de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. D'autres tests statistiques a posteriori choisis en fonction des distributions des populations nous permettre de comparer les moyennes et identifier des différences deux à deux entre groupes expérimentaux et génotypes. Les tests statistiques permettent également de trouver des corrélations entre les variables étudiées.

Raffinement

L’état de santé des animaux et leur accès à l’eau et nourriture sont surveillés quotidiennement. La chirurgie et le post-opératoire se déroulent dans des conditions qui protègent la santé de l'animal, en lui protégeant de l’hypothermie grâce à un tapis chauffant et de la déshydratation avec une solution de sérum physiologique. La chirurgie se déroule sous anesthésie générale et des analgésiques sont utilisés avant et après la chirurgie, et sur les jours suivants. A la fin de la chirurgie, après le réveil complet, l'animal est replacé dans sa cage collective avec de la nourriture et de l'eau ad libitum. Les animaux sont habitués à leur manipulation afin de réduire leur stress.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour l'exploration des mécanismes de la perception car les régulations cellulaires mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies cellulaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Pour les expériences, nous utiliserons des souris adolescentes et adultes entre 7 et 17 semaines car c'est au cours du jeune âge adulte que la plupart des altérations de la perception sensorielle apparaissent dans les troubles neurodéveloppementaux.

Créées in utero par électroporation d'embryons au douzième jour de gestation, les tumeurs sont ensuite greffées par stéréotaxie dans le cerveau de souris adultes. 2 775 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour conserver et analyser les tissus tumoraux. Les femelles gestantes subissent une ouverture de la paroi abdominale de trente minutes, et le porteur décrit chez les porteuses de tumeur une ataxie, une perte d'appétit, une prostration et un gonflement possible de la boîte crânienne par hausse de la pression intracrânienne. Au titre de la réduction, il indique réutiliser les mêmes femelles pour les chirurgies et la reproduction jusqu'à leurs huit mois.

Objectifs

Ce projet vise à développer de nouveaux modèles de souris génétiquement modifiées pour l'étude du Gliome Diffus de la Ligne Médiane, une tumeur cérébrale pédiatrique rare et incurable. En améliorant nos modèles précédents pour qu'ils possèdent des défenses naturelles (système immunitaire) réalistes, nous pourrons évaluer des stratégies innovantes basées sur l'immunothérapie. L'objectif final est de reproduire fidèlement cette maladie dévastatrice afin de comprendre les étapes précoces de la formation du cancer et de tester des traitements qui renforcent la réponse du corps pour enfin éradiquer la tumeur.

Bénéfices attendus

Obtenir un modèle murin génétiquement modifié de Gliome Diffus de la Ligne Médiane permettra de mieux comprendre les étapes précoces du développement de ces tumeurs, pour le moment encore inconnu. Cette compréhension permettra d’identifier les modifications précoces menant à l’apparition de cellules tumorales. L’induction de modification menant à des tumeurs dans des animaux ayant un système immunitaire compétant permettra l’exploration de nouvelles approches thérapeutiques, en prenant en compte l’environnement immunitaire de tumeurs, et tester ainsi des approches immuno-oncologiques (immunothérapie, médicaments immuno-modulateurs, stratégies vaccinales…).

Procédures

Les femelles gestantes seront soumises à une intervention chirurgicale telle qu’une ouverture de la paroi abdominale (pour une durée de 30 minutes), précédés d’injections d’analgésiques et anesthésiques. Les embryons quant à eux auront 1 injections ainsi que l’utilisation d’électrodes induisant un faible champ électrique (de moins d’une minute). Ces futures tumeurs seront par la suite greffées dans des souris adultes, par stéréotaxie (sous anesthésie générale, avec une injection unique dans le cerveau d’une durée de 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées aux symptômes tumoraux et à la chirurgie. On pourra observer des symptômes neurologiques modérés qui sont fréquemment observés en présence d’un volume tumoral conséquent (ataxie). On pourra également observer une perte d'appétit et donc perte de poids modérée, légère prostration des animaux, légère perte d’équilibre. L’augmentation de la pression intracrânienne peut également entraîner un gonflement modéré de la boite crânienne. Ces symptômes peuvent apparaître très progressivement et durer au maximum 1 semaine.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour conservation et analyse de tissus tumoraux post-mortem.

Remplacement

Ces tumeurs du cerveau central sont uniques car elles s'infiltrent partout. Pour trouver un traitement, il faut travailler sur des modèles animaux vivants afin de comprendre leur progression dans un environnement complexe et réaliste. Ces modèles sont vitaux, car le cerveau est protégé par une barrière naturelle, appelé la barrière hématoencéphalique, qui bloque la majorité des médicaments. Tester des traitements sur ces modèles nous permet de vérifier s'ils peuvent franchir cette barrière. Avant cela, nous affinons les doses en laboratoire, sur des traitements de cellule pour garantir leur sécurité. Enfin, ces modèles vivants sont notre seule façon d'étudier pleinement comment les défenses immunitaires peuvent être mobilisées contre la maladie.

Réduction

Le projet utilise une technique d'imagerie appelée bioluminescence pour suivre l'évolution des tumeurs chez les souris sans avoir besoin de les euthanasier. Cette méthode est cruciale car elle permet de diminuer grandement le nombre d'animaux utilisés pour la recherche et de mieux anticiper et gérer la souffrance des souris. De plus, pour réduire davantage le nombre de souris, l'équipe réutilise les femelles pour les chirurgies et la reproduction jusqu'à ce qu’à 8 mois de vie.

Raffinement

Nous appliquons des protocoles rigoureux pour garantir le confort des souris. Cela comprend l'anesthésie générale pour toute procédure, l'administration systématique d'anti-douleur avant, pendant et après la chirurgie, le maintien de leur température et de leur hydratation, et des mesures d'hygiène strictes. Pour les souris malades, nous assurons une surveillance quotidienne (poids et observation) et appliquons des règles très strictes (appelées points limites) pour arrêter immédiatement l'étude si une souffrance est détectée, afin de la minimiser au maximum.

Choix des espèces

L'utilisation de souris ayant un système immunitaire est ici essentielle pour la poursuite de ce projet. De plus, ce modèle, déjà établi, a été réalisé chez la souris. Des femelles âgés de minimum 7 semaines seront mises en accouplement, ce qui correspond à l’âge du jeune adulte possédant les meilleures capacités de reproduction et ceci jusqu’à la limite de leurs capacités de reproduction, à partir de 8 mois. Les embryons seront injectés au jour embryonnaire 12.5-13.5, ce qui représente la fenêtre de développement durant laquelle les potentielles cellules progénitrices de ces tumeurs se développent. Lors de la greffe, les souris seront agées de 6 semaines au minimum.