Souris

Ligature de l'uretère, chirurgie de 30 à 60 minutes, administrations jusqu'à trois fois par jour pendant six mois, prises de sang hebdomadaires et 24 heures en cage métabolique : 5886 souris et 2736 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour la collecte des tissus. Le porteur décrit perte de poids et d'appétit, déshydratation, démangeaisons, prostration et tremblements dans les jours qui suivent l'induction de l'insuffisance rénale. Il prévoit environ 1710 animaux par an pour tester une trentaine de candidats médicaments, avec 15 animaux par groupe parce qu'il anticipe 30 % de pertes ou de non-réponses. Le projet est justifié par l'échec fréquent des essais cliniques, attribué à des modèles animaux peu représentatifs des pathologies humaines, auxquels le porteur répond par d'autres modèles animaux.

Objectifs

Environ 10 % de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique, pathologie progressive marquée par des lésions du tissu rénal entraînant une perte de sa fonction. Divers facteurs, notamment les maladies cardiovasculaires et métaboliques (comme l'hypertension et le diabète), ainsi que certains traitements médicamenteux, aggravent l'évolution vers l'insuffisance rénale chronique après des lésions aiguës. Toutefois, les mécanismes biologiques précis responsables de cette progression restent mal compris. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales. Les recherches pour développer de nouveaux médicaments se heurtent à un taux d’échec élevé en essais cliniques, en grande partie à cause de modèles expérimentaux peu représentatifs des pathologies humaines. En effet, les modèles utilisés couramment ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique notament par l'absence de pathologies associées comme l'obésité, le diabètes ou le vieillissement. Ainsi, ce projet vise à mettre en place de nouveaux modèles animaux (chez le rat et la souris) d’insuffisance rénale aiguë à chronique afin de mieux évaluer l’efficacité de candidats médicaments dans des contextes pathologiques spécifiques. Les modèles développés mimeront des maladies rénales humaines comme la néphropathie diabétique, la fibrose rénale, lésion rénale induite par l'hypertension artérielle ou médicamenteuse.

Bénéfices attendus

La mise en œuvre et la réussite de ce projet permettront de développer de nouveaux modèles expérimentaux chez l'animal, reproduisant plusieurs troubles physiologiques similaires à ceux observés chez l’être humain. Ce modèle servira à évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments contre les maladies rénales, dans des conditions plus proches de la réalité humaine. L’objectif est d’améliorer la pertinence des tests précliniques et de réduire le taux d’échec des candidats médicaments lors des essais cliniques.

Procédures

Le projet se déroulera en deux phases expérimentales : - Phase 1 : Validations des conditions expérimentales. Cette étape vise à optimiser les paramètres du modèle sur un nombre limité d’animaux (n=18 par procédure, 4 procédures, soit 72 animaux au total), en s’appuyant sur des protocoles établis dans la littérature. La durée dépendra de la procédure (3 jours à 6 mois). - Phase 2 : Evaluation pharmacologique. Elle consistera à tester environ 38 candidats médicaments par an, répartis en 3 groupes de 15 animaux par molécule, soit un total d’environ 1 710 animaux/an. Tous les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au moins 7 jours avant le début des expérimentations. Les interventions prévues incluent : 1) Administrations de traitements (0.5 - 1 min par administration) réalisées sur animaux vigiles, jusqu’à trois fois par jour selon le protocole, pendant une période variant de 3 jours à 6 mois ; 2) Prélèvements sanguins (3 - 5 min par prélèvement, effectués au moins deux fois (avant et après l’induction du modèle d’insuffisance rénale). Pour les études prolongées (>7 jours), des prélèvements hebdomadaires pouurront être réalisés ; 3) Collectes d’urine, réalisée au moins une fois (jusqu'à 3 fois sur un protocole supérieure à 1 mois) par cage métabolique sur 24 heures (2 - 5 min pour la mise en cage) ou directement depuis la vessie au moment du sacrifice (1 - 2 min par animal) ; 4) Procédures chirurgicales (30 - 60 min, réalisées une fois) : effectuées sous anesthésie générale et analgésie, suivies d’un monitoring biquotidien jusqu’à la fin du protocole (5 - 10 minutes par visite/animal) ; 5) Mesures fonctionnelles rénales : incluant la diurèse sur 24h et/ou la filtration glomérulaire sur 1h30 par capteur transdermique ; 6) Euthanasies (5 - 20 min par animal) : réalisées sous anesthésie profonde, suivies du prélèvement de tissus et fluides biologiques pour analyses histologiques, biochimiques et moléculaires. Ces procédures permettront une évaluation complète et rigoureuse des effets des traitements sur la fonction rénale dans un modèle expérimental validé.

Impact sur les animaux

Les animaux impliqués dans ce projet pourront présenter différents effets indésirables liés aux procédures expérimentales : 1) Stress lié à la contention lors des manipulations répétées ; 2) Altération de la fonction rénale, se traduisant par une modification du volume urinaire (augmentation ou diminution), une perte de poids, voire une altération de l’état général (diminution de la vigilance visuelle) ; 3) Douleurs transitoires associées aux interventions chirurgicales ou aux injections médicamenteuses répectées. Au cours des premiers jours suivant l’induction du modèle d’insuffisance rénale, les signes cliniques suivants pourront être observés : perte de poids et d’appétit, déshydratation, démangeaisons, réduction de l’activité locomotrice, prostration ou tremblements. Enfin, certains effets indésirables additionnels (modification du comportement, aspect anormal des fèces, prostration) pourront apparaître lors de l’administration et de l’évaluation toxicologique des candidats médicaments.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de permettre la collecte des fluides biologiques et des tissus nécessaires aux analyses complémentaires.

Remplacement

En parallèle des modèles expérimentaux utilisant des animaux (rats, souris), des modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines sont en cours de développement. Cependant, ces approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité physiologique et les réponses systémiques observées chez l’animal. Elles constituent donc un outil complémentaire, mais ne peuvent remplacer totalement les expérimentations in vivo, indispensables pour évaluer les effets globaux et la tolérance des candidats médicaments.

Réduction

Les procédures expérimentales seront établies sur la base de protocoles déjà décrits dans la littérature. Le nombre d’animaux par groupe sera limité au strict nécessaire, tout en permettant de prendre en compte la variabilité interindividuelle et de réaliser des analyses descriptives et quantitatives robustes. La première phase de ce projet, dédiée à la validation des modèles et la mise en place des conditions expérimentales, sera menée sur un nombre restreint d'animaux (n=18). Chaque modèle inclura trois groupes de 3 animaux (groupe contrôle, groupe groupe "induit" et groupe traité avec une molécule de référence), soit 18 animaux par espèce, pour un total de 72 animaux (2 espèces, rat et souris). Cette première phase permet également de s’assurer de la robustesse et la reproductibilité de la procédure, d'habituer les expérimentateurs aux gestes techniques (notamment chirurgicaux) et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires aux phases ultérieures. Lors de la seconde phase, dédiée aux tests des candidats médicaments, 15 animaux par groupe seront utilisés pour chaque composé testé. Ce nombre a été déterminé en tenant compte d’un taux de perte ou de non-réponse estimé à 30 %. Ainsi, il est prévu qu’en fin d’expérimentation, environ 9 animaux par groupe puissent être exploités pour les analyses, ce qui reste suffisant pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement pertinents. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes témoins traités par le solvant seul. Les animaux seront randomisés afin d’éviter les biais expérimentaux et les données obtenues feront l'objet de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, des mesures strictes seront mises en œuvre pour garantir le bien-être des animaux. Le personnel en charge assurera un contact régulier durant la période d’acclimatation afin de familiariser les animaux avec la présence humaine et les manipulations, réduisant ainsi leur stress. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables de 2 à 5 individus, selon l’espèce, dans le respect de la réglementation en vigueur. Certaines procédures pourront être réalisées sous anesthésie et analgésie appropriées afin de limiter toute douleur ou inconfort. Pendant les interventions chirurgicales, les paramètres physiologiques (température, fréquence cardiaque et respiratoire, coloration des muqueuses) seront surveillés en continu. Les animaux seront installés sur un tapis chauffant pendant et après la chirurgie afin de prévenir l’hypothermie. Un suivi clinique rapproché (2 à 3 fois par jour) sera effectué après l’induction du modèle. Un traitement analgésique pourra être administré par voie sous-cutanée ou via l’eau de boisson durant les jours suivant l’intervention pour atténuer la douleur. Afin de favoriser l’alimentation post-opératoire, des aliments facilement accessibles (croquettes humidifiées, gels nutritifs) seront disposés au fond des cages pour limiter les déplacements. Une réhydratation sous-cutanée sera également réalisée si nécessaire. Un système de scoring clinique et des points limites spécifiques à chaque procédure seront appliqués afin d’évaluer l’état des animaux et de déterminer les seuils de retrait. Les conditions d’hébergement respecteront les standards de bien-être animal : propreté des cages, accès permanent à l’eau, à la nourriture et à des éléments d’enrichissement (tubes, matériaux de nidification, papier absorbant, friandises). Pendant le traitement avec les candidats médicaments, une surveillance quotidienne de la masse corporelle et de l’état général (sutures, pelage, respiration, locomotion) sera assurée. Toutes les observations seront consignées et analysées. En cas de dégradation persistante de l’état général pendant trois jours consécutifs (isolement, apathie, altération du pelage, troubles respiratoires), l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié conformément aux règles éthiques et aux procédures validées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont couramment utilisés pour l’étude de la fonction rénale et le développement de modèles d’insuffisance rénale, en raison de leur excellente transposabilité aux pathologies humaines. Les lignées de souris sélectionnées répondent de manière fiable aux procédures d’induction, notamment la ligature de l’uretère, permettant de reproduire la fibrose rénale observée chez l’Homme. Leur statut immunitaire spécifique limite le risque d’infection post-opératoire. Certaines lignées génétiquement modifiées développent spontanément un phénotype d’insuffisance rénale, permettant d’évaluer l’efficacité des traitements sans recourir à des procédures invasives supplémentaires. Les animaux proviendront d’élevages agréés et seront utilisés à l’âge adulte (≥ 7 semaines pour les souris, ≥ 6 semaines pour les rats). Les souris diabétiques seront un peu plus âgées (environ 12 semaines) afin de présenter des atteintes rénales établies, nécessaires à l’évaluation des effets thérapeutiques.

320 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à sept semaines de régime alimentaire spécifique puis à quatre semaines de traitement dans l'eau de boisson pour détruire la myéline de son cerveau. S'y ajoutent une biopsie de la queue, une anesthésie générale de 45 minutes à 1 h 30, des injections intracérébrales et une chirurgie d'une heure et demie ouvrant une fenêtre d'imagerie. Le porteur affirme que la souris est "le seul modèle" permettant de suivre en temps réel l'effet de la perte de myéline sur des types précis de neurones. Une partie des animaux est tuée sans avoir servi, faute de porter le génotype recherché, les autres le sont pour que leur cerveau soit prélevé.

Objectifs

La myéline est une gaine protectrice qui entoure certaines cellules du cerveau et permet une bonne transmission des messages nerveux. Lorsqu’elle est abîmée, comme dans la sclérose en plaques, cela perturbe non seulement la transmission de l'information, mais aussi la communication entre les cellules du cerveau. Notre projet cherche à mieux comprendre ce lien encore peu exploré entre la myéline et le bon fonctionnement du cerveau. Nous nous intéressons particulièrement à un type de cellule clé dans le traitement de l'information, souvent touché dans ce type de maladie. Ces cellules sont aussi entourées d’une matrice de soutien qui se dégrade quand la myéline est atteinte. Nous pensons que cette double atteinte, à la fois la perte de la gaine protectrice et la dégradation de cette matrice, pourrait fortement perturber le fonctionnement du cerveau. Nous allons donc observer comment les cellules réagissent à la perte, puis à la réparation de la myéline, et comment leur environnement évolue. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements, visant à protéger à la fois la myéline et les connexions essentielles entre les cellules du cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet démontrera comment la perte de la myéline altère la communication des neurones et comment la matrice qui les entourent peut les protéger. Ces découvertes éclaireront le fonctionnement des connexions entre neurones dans des individus sains et malades. Elles pourraient mener à de nouvelles thérapies combinant protection de la myéline et de la communication entre neurones, particulièrement pertinentes pour la sclérose en plaques. En révélant ces mécanismes clés, cette recherche ouvre la voie à des traitements innovants préservant les fonctions cérébrales.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Réalisation de biopsies à la queue (une fois, durant quelques secondes); 2) un traitement alimentaire spécifique de 7 semaines; 3) un traitement spécifique dans l’eau de boisson de 4 semaines; 4) injections sous-cutanées pour les analgésiques; 5) anesthésie générale (durée : 45 minutes à 1h30); 6) injections intracérébrales (durée : 45 minutes); 7) chirurgie pour l’imagerie cérébrale (durée : 1h30); 8) séance d'habituation et d'imagerie (durée : 45 min à 1h); 8) prélèvement des cerveaux pour des analyses.

Impact sur les animaux

La biopsie peut provoquer un stress léger et l’anesthésie générale peut provoquer également un stress léger. Concernant la chirurgie, les nuisances comprennent douleur modérée post opératoire. Concernant les injections sous-cutanées, une douleur légère peut survenir. En ce qui concerne l’imagerie du cerveau, les nuisances peuvent inclure un stress léger de la manipulation.

Devenir

Certains animaux sont mis à mort car ils sont sans génotype d’intérêt pour le projet. Tous les autres animaux seront utilisés pour des expériences et seront mis à mort afin de pouvoir collecter leur cerveau.

Remplacement

Notre compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies telles que la sclérose en plaques sera toujours insuffisante si ces mécanismes ne sont pas induits et analysés dans leur milieu naturel complexe. En étudiant les différentes composantes de façon isolée, de nombreux effets émergents de l'activité neuronale et des interactions cellulaires seront obligatoirement négligées. L’utilisation de l’animal est donc primordiale pour obtenir des résultats qui puissent avoir un véritable impact dans le développement de nouvelles thérapies chez l’homme. Les souris sont le seul modèle permettant d'étudier l'effet des altérations de la myéline sur des types spécifiques de neurones par imagerie cellulaire en temps réel.

Réduction

La stratégie que nous avons utilisée pour maintenir la lignée de souris est calculée de manière à minimiser au maximum le nombre de souris. Le nombre de cages pour les élevages a été réduit afin d'obtenir la production minimale nécessaire pour nos expériences. Afin de réduire au strict minimum nécessaire le nombre d’animaux, nous utiliserons une analyse de puissance statistique pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires afin d’obtenir un résultat scientifiquement fiable. De plus, les données seront analysées avec des tests statistiques adaptés et si la significativité est atteinte avec un nombre d’animaux plus faible que prévu, les expériences seront arrêtées.

Raffinement

Lors des actes chirurgicaux, les animaux sont anesthésiés et reçoivent des analgésiques en pré- et post-opératoires par voie locale et sous-cutanée. Après l’opération, un apport de fluide est effectué pour réhydrater l’animal, puis celui-ci est placé dans une enceinte chauffée jusqu’à son réveil complet. De la nourriture est placée dans la cage d’hébergement afin de faciliter la récupération; la surveillance des animaux est renforcée afin d’éviter toute souffrance; les animaux sont observés régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites est utilisée. Tout signe de douleur est soulagé avec des analgésiques.

Choix des espèces

Les expériences seront réalisées chez des souris génétiquement modifiées. La souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Une autre raison pour utiliser la souris est la possibilité de manipuler de types précis de cellules chez des animaux transgéniques. Pour le génotypage et les biopsies, les souriceaux ont entre 5 et 10 jours. L'expérimentation est menée sur des animaux adultes entre 2 à 5 mois ce qui nous permet de faire nos protocoles et traitements.

Greffées sous la peau du flanc droit avec des cellules cancéreuses de pancréas, les souris reçoivent une chimiothérapie puis, pour 1280 d'entre elles, une immunothérapie injectée trois fois par semaine pendant trois semaines. 1920 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées, soit lorsqu'un point limite est atteint, soit pour le prélèvement de la tumeur. Le porteur indique que la tumeur peut gêner leurs mouvements et provoquer perte de poids, posture douloureuse, léthargie et arrêt du toilettage. Il affirme qu'aucun effet des traitements sur l'état général n'est attendu et annonce que l'apparition d'éventuels points limites sera recherchée, sans dire lesquels.

Objectifs

Le cancer du pancréas est l'un des cancers les plus courants et les plus mortels. Il est souvent traité par chimiothérapie, mais cette approche n’entraîne pas toujours une guérison complète, surtout dans les formes avancées. On sait que le système immunitaire joue un rôle clé dans l'efficacité de la chimiothérapie, c’est pourquoi on essaie parfois de combiner celle-ci avec de l’immunothérapie (anti-PD-1) pour améliorer les résultats. Cependant, cette combinaison ne fonctionne pas pour le cancer du pancréas, ce qui montre qu’il y a des résistances qu’il faut comprendre. Une molécule, l'IL-1β, est impliquée dans les réponses inflammatoires et peut influencer la façon dont les traitements contre le cancer fonctionnent. Son rôle dans la réponse aux traitements est complexe et n’est pas totalement compris. Le projet a pour but d'étudier l'impact de l’IL-1β sur l’efficacité des traitements combinés chimiothérapie et immunothérapie contre le cancer du pancréas chez la souris. En examinant les cellules immunitaires présentes dans les tumeurs, l’objectif est de voir comment la présence ou l'absence d’IL-1β affecte les résultats des traitements et de mieux comprendre les raisons pour lesquelles certains traitements ne fonctionnent pas.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est d’évaluer le rôle de la voie IL-1β/IL-1R1, sur l’efficacité anti-tumorale des chimio-immunothérapies, utilisées en clinique dans différents modèles de cancers murins. Ce projet permettra également de déterminer les cellules cibles et les cellules produisant cette cytokine. En invalidant l’expression de l’IL-1β soit dans les cellules cancéreuses, soit dans les cellules de l’hôte, nous déterminerons son origine. En invalidant l’expression de IL-1R1 soit dans les cellules cancéreuses, soit dans les cellules de l’hôte, nous déterminerons quelle est la cible cellulaire de l’IL-1β. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur présence et leur état d’activation au niveau des tumeurs, chez les souris traitées ou non par chimio-immunothérapie. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer.

Procédures

- Injection des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Nombre de souris : 1920. - Traitements par chimiothérapie ou PBS : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 1920 - Traitements par immunothérapie : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 1280

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite (perte de poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage ). Aucun effet des traitements utilisés sur l’état général de la souris n’est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Les souris utilisées pour les expériences de croissances tumorales seront mises à mort lorsqu’un point limite sera atteint. Les souris utilisées pour les expériences d’analyse du système immunitaire seront mises à mort afin de prélever la tumeur.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les groupes seront constitués de 10 animaux (suivis de croissance) ou de 5 animaux (immunomonitoring) afin de considérer les variabilités inter-individuelles. Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude tout en en conservant la puissance statistique nécessaire. Le test statistique utilisé sera celui de Kruskal-Wallis en raison de la présence de nombreux groupes. Les 2 modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, des mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sont différents et peuvent affecter la réponse aux traitements. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Si aucune différence entre les différents groupes n’est observée pour un ou plusieurs modèles, les expériences d’immunomonitoring ne seront pas réalisées sur ces mêmes modèles. Si certains groupes de traitements (par exemple FOLFIRIONOX ou Gem/N-PTX) n’ont aucun effet démontré dans la partie I, ces groupes ne seront pas utilisés dans la partie II.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (en groupes, dans un environnement enrichi avec mise à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids). Les animaux seront habitués aux techniques de préhension de contention et de pesées. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe et pour les traitements intra-tumoraux. Durant toute l’expérience, suivi du poids et évaluation de la NEC (Note d’Etat Corporel) au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée. Le volume tumoral sera déterminé trois fois par semaine, afin d’appréhender au plus tôt d’éventuels signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. De plus, l’existence des souris C57BL/6 génétiquement modifiées pour ne plus exprimer l’IL-1R1 ou l’IL-1β renforce le choix de cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

Des femelles gestantes sont opérées sous anesthésie générale pendant trente minutes pour qu'un produit soit injecté dans le cerveau de leurs embryons, à treize jours de gestation. Les souriceaux de zéro à trois jours reçoivent à leur tour une injection intracérébrale sous anesthésie. 450 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, l'objet déclaré étant de former de nouveaux chercheurs à ces gestes puis à l'imagerie des circuits synaptiques. Le porteur mentionne des douleurs abdominales après l'opération, un risque de fausse couche et des cas où la mère refuse de s'occuper des souriceaux injectés. Tous les animaux sont tués à la fin, leur cerveau prélevé.

Objectifs

Le système nerveux central est composé de différents types de neurones dont la morphologie et la physiologie varient considérablement. Cette diversité commence au cours du développement embryonnaire et est déjà observable dans les cellules immatures qui donneront naissance à des neurones. Pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires régissant la différenciation et la maturation des cellules à différents stades du développement, nous procéderons au transfert de gènes dans le cerveau embryonnaire ainsi que durant les trois premiers jours de vie. Nous proposons de former de nouveaux chercheurs aux méthodes, qui permettent d’étudier l’expression génétique pendant le développement. Une meilleure maîtrise de ces techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils réaliseront ce type d'expérimentations pour leurs besoins de recherche.

Bénéfices attendus

Nous proposons de former de nouveaux chercheurs à ces deux méthodes, qui permettent d’étudier l’expression génétique pendant le développement. Une meilleure maîtrise de ces techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils réaliseront ce type d'expérimentations pour leurs besoins de recherche. Le projet de cette formation est également de présenter des techniques d’imagerie à haute résolution, permettant d’observer et d’étudier la dynamique des circuits synaptiques dans des tranches du cerveau.

Procédures

Les femelles gestantes subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale, au cours de laquelle une injection sera réalisée chez les embryons (durée approximative : 30 minutes, intervention unique). Les nouveau-nés (âgés de 0 à 3 jours) recevront également une injection sous anesthésie (durée inférieure à 5 minutes, intervention unique).

Impact sur les animaux

Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur abdominale post opératoire, risque mineur d’infection de la cicatrice. Dans de très rares cas, les souris enceintes pourraient avoir des problèmes de mobilité après la chirurgie ou une fausse couche. Nuisances liées aux injections : stress liée à l’anesthésie. Dans de très rares cas, la mère des souriceaux n’accepte pas de s’occuper des nouveau-nés injectés.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé.

Remplacement

Plusieurs phases de ce projet ont été effectuées in vitro sur différentes lignées cellulaires. Actuellement, nous souhaitons étudier le développement embryonnaire de différents types de neurones et leur intégration dans les circuits neuronaux in vivo. Cela nous permettra de mieux comprendre la physiologie des circuits neuronaux du cortex cérébral. L'utilisation d'animaux est donc inévitable. Notre formation repose sur une approche pédagogique de type hands-on training, c’est-à-dire un apprentissage par la pratique. Les compétences techniques et analytiques visées dans cette formation ne peuvent être pleinement acquises qu’à travers une mise en pratique directe. Les étudiants doivent pouvoir effectuer les expériences afin de recueillir des échantillons biologiques viables, nécessaires pour les étapes ultérieures du programme de formation, notamment l’imagerie à haute résolution et les analyses de biologie moléculaire. Ces étapes requièrent des matériaux biologiques d’une qualité et d’une intégrité qui ne peuvent être obtenues à partir de modèles in silico, de cadavres ou de démonstrations filmées.

Réduction

Nous faisons un effort particulier pour faire intervenir, lors de ces formations, des spécialistes expérimentés dans les techniques enseignées. Leur haut niveau d’expertise garantit une démonstration précise et efficace, ce qui permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’apprentissage. Grâce à la transmission rigoureuse de leur savoir-faire, les étudiants acquièrent rapidement les compétences requises, réduisant ainsi le besoin de répétition inutile des procédures. Nous utilisons le nombre minimal de souris permettant à la fois de démontrer correctement les techniques et d’offrir aux étudiants une opportunité d’entraînement pratique suffisante pour atteindre les objectifs pédagogiques fixés. Cette approche assure un équilibre entre la qualité de la formation et le respect du principe de réduction dans l’utilisation d’animaux vivants.

Raffinement

Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et un suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie et une installation tout au long des procédures chirurgicales d’un contrôle de la température par tapis chauffant. Les animaux injectés et/ou opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 4 jours suivants. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, l'état du pelage, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Selon le score obtenu, les souris pourront recevoir une injection d’un antalgique, et de l’aliment hydraté pourra être ajouté au fond de la cage. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront définis et appliqués.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour cette formation car elle correspond à l’espèce la plus couramment utilisée dans les laboratoires de recherche en neurosciences, notamment pour les études portant sur le système nerveux central. Les techniques enseignées lors de cette formation sont directement applicables aux modèles murins utilisés dans la grande majorité des projets de recherche académique et préclinique. De plus, la souris présente des avantages pratiques et scientifiques importants : elle est bien caractérisée sur le plan neuroanatomique et génétique, de nombreux outils et lignées transgéniques sont disponibles, et son utilisation est conforme aux standards internationaux en recherche biomédicale. Ainsi, le recours à la souris permet d’assurer la pertinence, la reproductibilité et le transfert direct des compétences acquises par les étudiants vers leurs futures activités professionnelles Nous devons cibler les cellules progénitrices en une période embryonnaire précise, nous utiliserons des gestantes à 13 jours de gestation. Il s’agit d’un stade où les embryons sont facilement accessibles pour l'intervention. L’injection chez les souriceaux permet de moduler l’expression génétique des neurones et des autres types cellulaires dans toutes les régions cérébrales, grâce à une technique simple et rapide.

Rasées sur le dos, puis enduites chaque jour pendant cinq jours d'une crème qui provoque rougeurs, épaississement de la peau et desquamation, 100 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de la peau et des organes. Vingt d'entre elles sont gavées trois jours de suite, quarante reçoivent des injections quotidiennes d'un anticorps ciblant la molécule CD146 ou d'un placebo. Le projet cherche à savoir si cette molécule intervient dans le psoriasis et si la bloquer soulage la maladie, ainsi que l'athérosclérose qui l'accompagne souvent. Le porteur cite des études cliniques déjà menées sur des patients psoriasiques, les juge descriptives, et affirme qu'il n'existe "aucune alternative à l'animal" pour étudier cette maladie.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la physiopathologie du psoriasis et à évaluer cette molécule comme cible thérapeutique dans le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Bénéfices attendus

Plusieurs études cliniques portant sur des patients psoriasiques ont été menées antérieurement pour évaluer les niveaux d’expression de la molécule d'adhésion cellulaire CD146/MCAM sur des biopsies de peau, quantifier les concentrations de sa forme soluble dans le sang ou pour étudier les différentes sous-populations leucocytaires exprimant ce marqueur cellulaire dans le sang. Cependant, ces études restent descriptives et ne permettent pas d’évaluer le rôle du CD146 global, du CD146 endothélial ou du CD146 exprimé par certaines cellules du système immunitaire sécrétrices de la cytokine proinflammatoire interleukine 17 dans la pathogenèse du psoriasis. Contrairement à notre projet qui compare des souris mutées ou non pour CD146, ces études ne permettent pas d’étudier les voies de signalisation régulées par CD146. De plus, ces études cliniques n’ont pas évalué l’effet de thérapies ciblant CD146. Ainsi, ce projet permettra d'identifier des mécanismes moléculaires régulés par CD146 dans la pathogenèse du psoriasis. Il permettra aussi d'évaluer dans un modèle murin le bénéfice thérapeutique d'anticorps monoclonaux ciblant CD146 pour traiter le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Procédures

Tous les animaux du projet seront rasés une fois sur le dos (2 minutes par souris). Ils recevront un traitement sous la forme d'une application quotidienne de crème sur le dos pendant 5 jours (30 secondes par application). 20 souris seront gavées avec une solution diluée dans de l'huile de maïs une fois par jour pendant 3 jours (30 secondes par gavage). 40 souris recevront des injections quotidiennes d'un traitement ciblant CD146 ou un placebo pendant 5 jours (30 secondes par injection). Un prélèvement sanguin sera effectué sur toutes les souris (30 secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

20 souris seront gavées une fois par jour pendant 3 jours avec une solution à base d'huile de maïs. Bien que le gavage ne soit pas douloureux, cela pourrait tout de même causer une gêne à l'animal ou un stress du fait de sa répétition et de la contention. Les souris seront rasées sur le dos, ce qui pourrait générer un stress. L'application d'un traitement à base de crème sur la peau des souris pour induire le psoriasis devrait entraîner une inflammation associée à à l'apparition de rougeurs, un épaississement de la peau et une desquamation en plaques. Ce traitement peut entraîner une déshydratation et une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt.

Remplacement

Nous étudions l'implication de la molécule d'adhésion cellulaire CD146, également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la pathogenèse du psoriasis. Cette pathologie autoimmune implique différents types cellulaires (kératinocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, cellules du système immunitaire), avec de nombreuses interactions biochimiques et cellulaires. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle in vitro, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier cette maladie.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris nécessaires pour générer les effectifs de chaque groupe utilisé dans les procédures expérimentales, nous utiliserons des souris issues d'accouplements homozygotes et nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles, le psoriasis touchant chez l'humain autant les hommes que les femmes. En l'absence de toute étude antérieure sur le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 dans le psoriasis chez la souris, nous évaluerons son implication dans cette pathologie en comparant des groupes de 10 souris entre eux, effectif minimal déterminé par une approche statistique pour mettre en évidence de potentielles différences significatives.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée après l’arrivée des animaux issus des établissements d'élevage. Les souris seront observées avant d’initier le protocole et les animaux présentant des symptômes type infection seront écartés des protocoles. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait, si ses poils sont hérissés. Les animaux seront pesés une fois par jour et observés deux fois par jour pour prévenir tout risque de déshydratation liée à leur traitement. Les animaux seront hébergés en groupe avec un enrichissement. Les animaux disposeront de nestlets, nids à base de fibres courtes de coton, utilisés comme enrichissement de l ’environnement et matériaux de nidification, ainsi que de tunnels afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité et en procurant un sentiment de sécurité à l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de souris présente de nombreux avantages pour notre protocole expérimental. Outre sa petite taille et son coût avantageux, la souris permet de générer un grand nombre de descendants très rapidement. Par ailleurs, sa manipulabilité génétique permet d'analyser l'effet de mutations du gène cible sur la pathogenèse du psoriasis. La souris permet également d'évaluer l'effet d'un traitement thérapeutique ciblant une protéine d'adhésion cellulaire potentiellement impliquée dans le psoriasis et une comorbidité associée, l'athérosclérose. Les souris utilisées seront âgées entre 8 et 16 semaines. Un âge compris entre 8 et 16 semaines est couramment utilisé dans la littérature pour ce modèle induit de psoriasis car l'épaississement de l'épiderme, l'érythème et la desquamation sont clairement visibles à cet âge là. De plus, cette tranche d'âge a permis de mettre en évidence dans plusieurs études les effets thérapeutiques chez la souris de différents traitements utilisés pour soigner le psoriasis chez l'homme.

Une grille de score décide du sort de chaque souris : au score 2, elle est mise à mort. 148 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de moelle et de tissus. Elles reçoivent du carboplatine, faible dose une fois par semaine six fois ou dose forte toutes les trois semaines, puis six prises de sang à la queue sous anesthésie gazeuse, une mesure du temps de saignement de trente minutes et une chirurgie de l'aorte abdominale. Le porteur qualifie de légères les souffrances liées à la chute des plaquettes, qu'il juge non impactante pour des souris en élevage, et classe la procédure en modérée du seul fait des contentions répétées.

Objectifs

Le cancer reste un défi majeur en France, avec environ 370 000 personnes traitées par chimiothérapie chaque année. Bien qu'efficace, cette approche peut entraîner des thrombopénies (diminution du nombre de plaquettes) induites par chimiothérapie (CIT), une complication sérieuse pouvant retarder les traitements et affecter les chances de guérison. Le carboplatine, utilisé contre les tumeurs solides, est particulièrement connu pour sa toxicité sur la moelle osseuse, provoquant une baisse importante des plaquettes sanguines. L'enjeu principal est de déterminer le schéma thérapeutique optimal pour gérer cette toxicité médullaire. La production de plaquettes est assurée par les mégacaryocytes de la moelle osseuse. Cependant, on ignore encore l'impact précis du carboplatine sur les mégacaryocytes, en particulier dans les cas où la chimiothérapie entraîne de graves perturbations de la moelle osseuse. L'objectif de cette étude est d'analyser de manière qualitative et quantitative l'état fonctionnel des mégacaryocytes de la moelle après traitement au carboplatine. Pour cela, nous utiliserons un modèle préclinique murin mimant la CIT. Cette approche nous permettra de suivre en temps réel la dynamique de libération des plaquettes, tout en surveillant la numération plaquettaire pour corréler la gravité de l'hématotoxicité avec les thrombopénies dose-dépendantes. Nous comparerons également différents schémas d'administration : trois cycles de faibles doses hebdomadaires versus deux cycles de fortes doses toutes les trois semaines. Cette démarche nous aidera à adapter nos modèles précliniques aux réalités cliniques, tenant compte du fait que la fréquence et la gravité de la toxicité peuvent varier selon l'intensité du traitement antérieur. Enfin, le plasma sera prélevé à la fin de chaque cycle pour rechercher des biomarqueurs prédictifs qui pourraient servir à identifier les individus à risque de développer une thrombopénie sévère.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Cette étude permettra de mieux comprendre l’impact d’une chimiothérapie sur la moelle osseuse et donc sur la production de plaquettes. Une thrombopénie est un réel frein au traitement des cancers puisque la seule prise en charge actuelle est de décaler le traitement de chimiothérapie, nuisant ainsi à l'efficacité du traitement anti cancéreux.

Procédures

- injection en cinétique d'une molécule de chimiothérapie sur animaux vigiles, soit une dose faible 1 fois par semaine 6x ou une dose plus forte 1 fois toutes les 3 semaines 2x - prélèvement de sang à la queue sous anesthésie gaz 5minutes : 6 x - temps de saignement à la queue sous anesthésie gaz 1x 30 minutes - anesthésie profonde par injection 1x 20 minutes - chirurgie pour un prélèvement à l'aorte abdominale sous anesthésie profonde 1x 20minutes

Impact sur les animaux

- En ce qui concerne les traitements de perte de plaquettes induite par la chimiothérapie (CIT), les souffrances infligées aux animaux sont légères, la thrombopénie induite est certes notable mais non impactante pour des souris en élevage, nous anticipons malgré tous des risques de saignements potentiels en cas de bagarre par un enrichissement supplémentaire et un suivi rigoureux. - Nous prenons en compte le stress généré par les manipulations et contentions répétées et classons la procédure en modérée. - Risque de douleurs et infections sur les zones d'injections ainsi que la section de la queue pour la numération sanguine.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. Nous prélevons systématiquement des tissus post mortem en vue d'analyses d'imagerie de pointe pour compléter l'étude, et ce afin de limiter le nombre d'animaux utilisés.

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. En particulier, l’intravasation met en œuvre simultanément des interactions entre les mégacaryocytes (MKs), les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et demandent à être étudiés sur l’animal. Il s’agit d’étudier la capacité des mégacaryocytes à franchir une barrière vasculaire dans des conditions où le microenvironnement natif est fortement perturbé par une chimiothérapie. Des expériences préliminaires réalisées in vitro, sur des MKs cultivés dans des inserts, indiquent que ces cellules ne franchissent pas naturellement une membrane poreuse (même en présence de chimiokines).

Réduction

Pour le dosage plasmatique des marqueurs de prédiction de la thrombopénie peut être réalisé sur le sang d’une seule souris pour chaque point de cinétique, c’est-à-dire 26 points donc 26 souris (répété 3x = 7 selon nos calculs statistiques). Il est prévu une seule cinétique témoin avec le véhicule NaCl de 26 souris qu’il n’est pas nécessaire de reproduire statistiquement. Par ailleurs nous prélevons le maximum de tissus sur les animaux post mortem (imagerie) afin de limiter leur nombre.

Raffinement

Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Le milieu est enrichi avec de la frisure de papier, des carrés de cellulose et des bâtonnets de coton afin de permettre aux souris de confectionner leur nid et structurer leur environnement. Des croquettes sont déposées sur le fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage. Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage. A la fin de l’expérimentation, les animaux sont sacrifiés avant leur réveil. Une fiche de suivi avec les points limites définis sera mise en place afin de pouvoir contrôler l’état des animaux tout au long du protocole expérimental. Quand un score de 2 est observé, la souris est mise à mort. Quand un score de 1 est observé, une attention particulière est apportée à l’animal et une décision est prise : augmentation de l’enrichissement, soins. Concrètement, lors de la surveillance quotidienne des animaux, nous observerons attentivement l’aspect des souris pour s’assurer de l’absence de signes extérieurs d’infection tels que des lésions cutanées ou des écoulements nasaux ou oculaires. Une attention particulière sera apportée au niveau des sites d’injection des substances pour s’assurer qu’il n’y a pas d’infections. Pour limiter au maximum l'agressivité, les animaux restent entre individus issus de la même cage d'origine avec un enrichissement accru.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs les mégacaryocytes (ex : anticorps, souris génétiquement modifiées, suivi en imagerie intra vitale). La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptées à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Par ailleurs la souris est un mammifère qui, par expérience, supporte bien les traitements de CIT (limités à quelques jours et à des doses d’injections faibles basées sur la clinique), et présente une thrombopénie proche de celle des patients humains dans les conditions de chimiothérapies. C'est également un animal indiqué pour le suivi des traitements pharmacologiques en général. Les expériences ne demandent pas de stade de développement particulier, nous utiliserons des souris adultes entre 8-18 semaines.

Chaque souris subit une ouverture chirurgicale du crâne sous anesthésie pour recevoir dans le cerveau une dose unique de candidat médicament, avec jusqu'à six prélèvements sanguins en 24 heures. 4160 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, par groupes de trois animaux par dose et par molécule. Le porteur présente ce dispositif comme un moyen de réduire le nombre total d'animaux, en éliminant tôt les molécules les moins prometteuses. Toutes celles qui ont reçu un composé sont tuées après trois à huit semaines pour le prélèvement du sang, du liquide céphalorachidien et des organes, tandis que 400 souris déjà opérées mais non injectées seront réutilisées dans d'autres projets.

Objectifs

Le développement de nouveaux médicaments pour traiter les maladies du cerveau commence par des études de sécurité sur des animaux, notamment les souris. Ces études servent à vérifier si les médicaments n’induisent pas de toxicité avant de pouvoir les tester chez l’Homme. Les maladies du cerveau sont souvent très graves et peuvent être causées par un dérèglement dans la production de certaines protéines ou par l'accumulation de protéines anormales. Pour traiter ces maladies, des thérapies innovantes sont en cours de développement pour éliminer ces protéines. Avant de tester ces médicaments chez l'Homme, il est crucial de déterminer à la fois la dose qui pourrait être toxique et la dose efficace. La barrière hémato-encéphalique est une structure qui protège le cerveau en contrôlant les substances qui peuvent y entrer. Cette barrière rend difficile l'accès des médicaments au cerveau lorsqu'ils sont administrés par voie sanguine. Pour contourner ce problème, les médicaments sont injectés directement au niveau des lombaires entre les méninges chez l'Homme. Chez la souris, cette méthode n'est pas possible en raison de sa petite taille, et les médicaments sont administrés directement dans le cerveau. Les médicaments les plus prometteurs sont d’abord sélectionnés après des études in vitro en laboratoire, et sont ensuite testés in vivo sur des souris pour évaluer leur sécurité et leur efficacité. Ce projet consiste à évaluer la tolérabilité (c’est-à-dire une toxicité éventuelle aiguë et à court/moyen terme) et à mettre en place des évaluations neurocomportementales/fonctionnelles qui pourraient prédire l’apparition d’une toxicité retardée après l’administration unique des candidats médicaments directement dans le cerveau des souris. Ces études permettent de sélectionner les médicaments les plus prometteurs afin de réduire les risques avant de passer aux essais d’efficacité. En résumé, ce projet a pour but d'évaluer de nouveaux médicaments pour traiter les maladies du cerveau tout en respectant les normes éthiques et en minimisant l'utilisation d'animaux. Les études préliminaires chez les souris aident à identifier les doses sûres et à évaluer les risques potentiels, permettant ainsi de sélectionner les meilleurs candidats pour les études ultérieures chez l'Homme. Les données recueillies permettent de décider si le développement du médicament doit continuer ou s'arrêter.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer le développement de nouveaux médicaments pour traiter les maladies du cerveau en évaluant très tôt leur toxicité potentielle (immédiate ou retardée) et en ajustant les doses et les plans des études de toxicité et d'efficacité qui suivront. Dans un premier temps, des études in vivo de trois semaines permettent de recueillir suffisamment d'informations pour sélectionner les médicaments les plus prometteurs, qui seront ensuite testés pour leur efficacité dans des modèles de maladies neurologiques. Après les études précoces de toxicité et d’efficacité, les meilleurs médicaments seront soumis à une étude de toxicité de huit semaines pour affiner leur profil de sécurité, comme les doses et les effets sur les tissus. Ces étapes supplémentaires de sélection visent à éviter des études ultérieures plus longues et avec plus d'animaux, réduisant ainsi le nombre total d'animaux utilisés pour un projet thérapeutique donné. Grâce aux études de présélection in vitro et aux études in vivo de toxicité et de pharmacologie qui en découlent, nous pouvons sélectionner le meilleur candidat et éliminer très précocement les moins prometteurs pour assurer la sureté et l’efficacité des médicaments de demain au service du bien-être du patient. En effet, ces études accélèrent la mise à disposition de nouvelles thérapies pour traiter les maladies du cerveau. Plus d'un tiers de la population mondiale souffre de troubles neurologiques, comme la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, l'épilepsie, la sclérose en plaques et les accidents vasculaires cérébraux (AVC). Ces maladies sont la principale cause de maladie et d'invalidité dans le monde. La qualité de vie des patients atteints de ces maladies est gravement affectée et le taux de mortalité est élevé, même chez les enfants. Les options de traitement actuelles sont très limitées et souvent insuffisantes pour répondre aux besoins des patients. Ce projet vise donc à améliorer les traitements, et améliorer la vie des patients atteints par ces maladies neurologiques.

Procédures

Dans le cadre de ce projet et pour une durée de procédure pouvant aller de 3 semaines à 8 semaines, les animaux seront soumis à différentes interventions : • Administration unique du composé testé dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie et une couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ) • Administrations d’analgésique (moins de 10 sec) (maximum 2 fois par jour) • Prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile (la contention est d’une durée maximale de 2min et chaque prélèvement dure moins de 30s ; maximum 6 prélèvements sur 24h) • Tests neurocomportementaux non invasifs (observations, max 15 min/semaine) et fonctionnels (évaluation de la motricité, max 10 min/semaine) réalisés pour chaque animal 1 fois avant traitement puis de façon hebdomadaire jusqu’à la fin de la procédure (3 à 8 semaines après traitement). Tests évaluant les performances neuro-locomotrices des souris et permettant de mieux, et plus rapidement, déceler la toxicité retardée à la suite de l’administration de candidats médicaments. • Administration d’anesthésique en fin d’expérimentation avant euthanasie. (moins de 10 sec)

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet et pour une durée de procédure pouvant aller de 3 semaines à 8 semaines, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : Conséquences directes des actes expérimentaux : • La phase de chirurgie (30 min) nécessaire à l’administration du composé d’intérêt dans le cerveau ainsi que la période post-opératoire peuvent générer du stress et une douleur modérée • Les administrations d’analgésiques et anesthésiques, maximum 2 fois par jour pendant 2 jours peuvent générer des douleurs légères et de courte durée • Maximum 6 prélèvements de faible volume de sang répartis sur 24h (1 seule fois par animal pour toute la durée de l’étude), effectués sur animal vigile avec une contention d’une durée maximale de 2min et chaque prélèvement dure moins de 30 sec (Degré de sévérité léger de courte durée) • Administration de l’anesthésique en fin d’expérimentation préalable à l’euthanasie (degré de sévérité léger) Conséquence indirecte des actes expérimentaux : Le composé testé peut en lui-même induire des effets cliniques et peut provoquer une nuisance modérée pour l’animal (impacts sur l’activité, état général, variation du poids corporel par exemple).

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet sera euthanasié à l’issue de chaque procédure (au bout de 3 à 4 semaines ou 8 semaines post injection selon la procédure mise en œuvre). Des collectes de sang/ liquide céphalo-rachidien pour analyses et d’organes pour lecture anatomopathologique seront effectuées. Tous les animaux pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire) et qui n’ont pas reçu de candidat médicament ou son/véhicule pourront être réutilisés dans un autre projet. Ces situations peuvent se produire, dans le cas où une dose d’un candidat médicament ou son véhicule montre des signes de toxicité immédiate consécutive à l’administration, les administrations prévues pour le reste des souris du groupe ne sont alors pas réalisées. Ces animaux ayant déjà reçu au préalable l’analgésie avant la chirurgie pourront dans ce cas être réutilisés dans d’autres DAP.

Remplacement

Ce projet étudie la sécurité des candidats médicaments pour les maladies neurologiques. Actuellement, il est nécessaire d'utiliser des animaux pour ces études car il n'existe pas d'autres méthodes validées scientifiquement et réglementairement. Cependant, avant de tester sur les animaux, des méthodes en laboratoire (in vitro) et sur ordinateur (in silico) sont utilisées pour choisir les médicaments les plus prometteurs. Cela permet de réduire le nombre d’études sur les animaux. Seuls les candidats médicaments qui semblent les plus efficaces et sûrs sont ensuite testés sur les animaux pour vérifier leur sécurité. Les maladies neurologiques sont complexes, et ces études sont essentielles pour évaluer l'efficacité et la toxicité des médicaments. En retour, les résultats des données collectées dans les études in vivo chez l’animal améliorent les méthodes de prédiction in vitro avec pour objectif final de remplacer intégralement le modèle animal.

Réduction

Les médicaments à visée neurologique les plus prometteurs sont présélectionnés grâce à des études in vitro en laboratoire avant de les tester sur des animaux dans les études incluses dans ce projet. Le nombre d'animaux utilisés est ajusté en fonction des paramètres étudiés. En général, seuls 3 animaux/dose/médicament sont utilisés, ce nombre « standard » pour ce type d’études assure un effectif par groupe faible mais suffisant pour permettre d’interpréter les résultats. Pour évaluer la toxicité des candidats médicaments, ces derniers sont administrés directement dans le cerveau des animaux. Les administrations se font de façon séquentielle : dans le cas où une toxicité aigüe surviendrait chez un premier animal d’un groupe, les administrations suivantes prévues pour les autres animaux ne seront pas réalisées. Des études préliminaires ont montré qu’une approche par observations comportementales des animaux, comme prévu dans ce projet, peut prédire la toxicité tardive des médicaments. Sa mise en œuvre vise à affiner et rendre plus efficace la sélection des candidats médicaments et ainsi réduire le nombre d’études et d'animaux nécessaires aux processus de recherche de candidats médicaments. Lors des évaluations comportementales, chaque animal est suivi dans le temps et est son propre contrôle, ce qui évite d’inclure systématiquement des groupes témoins dans les études et réduire ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Divers examens cliniques et prélèvements peuvent être effectués pour limiter encore plus le nombre d'animaux utilisés. Les résultats obtenus sécurisent les études de pharmacologie en évitant l’utilisation de doses toxiques possible aux doses testées. Les prélèvements de petits volumes de sang permettent de suivre la cinétique sur un même animal tout en respectant son bien-être, réduisant également le nombre d'animaux nécessaires pour chaque étude. Enfin, les données recueillies lors des études sur les animaux aident également à améliorer les méthodes de prédiction de toxicité in vitro. Ces méthodes prédictives de toxicité in vitro permettent ainsi de limiter l’utilisation des animaux dans les études ultérieures et pourraient à terme les réduire de moitié voire les remplacer.

Raffinement

Dans ce projet, les médicaments sont administrés dans le cerveau de manière séquentielle au sein d’un même groupe d’animaux. Si un premier animal montre des signes cliniques peu après le traitement, le traitement est arrêté. Si des signes de toxicité apparaissent, une décision rapide est prise par le vétérinaire, le responsable scientifique, l'équipe de bien-être animal ou les équipes en charge des animaux. Cette décision peut inclure des soins, l'arrêt du traitement, ou, en dernier recours, l'euthanasie de l’animal. Un suivi précis des animaux est réalisé via différentes grilles de score complémentaires (incluant des évaluations comportementales) permettant ainsi de détecter au plus tôt les signes de toxicité et de réduire ainsi la souffrance des animaux. Tous les animaux sont hébergés dans des conditions strictes de confinement avec à disposition un enrichissement spécifique (tunnel, éléments de nidification) et manipulés par du personnel formé au bien-être animal. De faibles quantités de sang peuvent être rapidement prélevées chez les souris de manière peu invasive et peu stressante, ce qui limite l'impact sur les animaux et respecte leur bien-être. Cette méthode évite d’utiliser les procédures classiques qui nécessitent de placer l'animal dans une enceinte thermorégulée pour dilater les vaisseaux. L'administration du candidat médicament nécessite une incision de la peau et est réalisée sous anesthésie générale avec une couverture analgésique afin de limiter tout risque de douleur au réveil de l'animal.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé sur l’espèce souris car de nombreux modèles mimant des pathologies humaines sont disponibles chez la souris et seront utilisés dans les études ultérieures de détermination de l’efficacité du candidat médicament. Cette espèce présente une forte homologie génétique et physiologique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle permettant d’obtenir la meilleure prédiction possible chez l’Homme. S’ajoutent à cela les données historiques (internes, issues de la littérature, par souche, âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets. Chez la souris, les candidats médicaments sont délivrés directement au niveau du système nerveux central par voie intracérébroventriculaire, pour palier le problème du mauvais passage de la barrière hémato-encéphalique. En outre, cette voie d’administration nécessite une chirurgie moins invasive que la voie intrathécale utilisée chez d’autres espèces comme le rat. Pour se placer dans les mêmes conditions que les études d’efficacité puis les études requises ultérieurement, les souris utilisées seront des jeunes adultes et adultes, correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet. Ces études vont permettre de présélectionner des candidats médicaments pour les études ultérieures effectuées chez le rat par voie intrathécale, même voie utilisée chez l’Homme pour la délivrance de thérapeutiques.