Souris

À huit semaines, 48 souris passent à un régime hypercalorique pour 21 semaines, qui les rend diabétiques vers la seizième. À vingt semaines, elles reçoivent une injection quotidienne pendant cinq jours pour bloquer une voie de production du glucose par le foie. Suivent deux tests de glycémie sous contention, quatorze prélèvements de sang à la queue, une mesure de composition corporelle et 72 heures seules en cage métabolique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un dernier prélèvement de sang après six heures de jeûne, puis la mise à mort immédiate, pour prélever les tissus sensibles à l'insuline.

Objectifs

L’obésité et le diabète sont actuellement reconnus comme des épidémies mondiales et nécessitent de proposer de nouvelles stratégies de traitement. Diminuer la production de sucre (glucose) par le foie est une stratégie efficace de traitement du diabète de type 2. Cependant, les médicaments utilisés et prescrits en première intention induisent des effets secondaires et ne peuvent pas être utilisés par l’ensemble des patients. La production de sucre par le foie dépend de deux mécanismes : une sortie dans le sang par un transporteur et une sortie par des vésicules. L’inhibition de la production de glucose par les vésicules permet de protéger du développement du diabète. L’objectif de ce projet réalisé dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2) est de déterminer si l’inhibition de la production de glucose par les vésicules permet de traiter le diabète de type 2, une fois qu’il est installé. L’inhibition de cette production de glucose spécifique sera réalisée grâce à des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de déterminer si l’inhibition de la production de glucose par des vésicules dans le foie est efficace pour traiter le diabète de type 2, lorsqu’il est induit par un régime hypercalorique chez la souris. Ces résultats permettront de mettre en évidence une nouvelle stratégie de traitement du diabète de type 2 et ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements efficaces, et présentant potentiellement moins d’effets secondaires que les médicaments actuels.

Procédures

Toutes les souris : - seront soumises à un régime hypercalorique dès l’âge de 8 semaines et pendant 21 semaines. Ce régime est connu pour induire un état diabétique à partir de la 16ième semaine de régime chez des souris témoins (EU1 + EU2). - recevront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes par souris) pour inhiber la voie de production vésiculaire de glucose par le foie (EU1). - subiront 2 tests pour analyser la régulation de leur glycémie pendant 2h après l’injection de glucose ou d’insuline (injections réalisées en 20 à 30 secondes chez la souris maintenues en contention) chez des animaux mis à jeun pendant 6h (EU1). Pour chaque test, 7 prélèvements de sang seront réalisés à l’extrémité de la queue en 15 secondes à 1 min maximum sur des souris libres de mouvement. Une seule incision de l’extrémité de la queue sera réalisée avant le premier prélèvement de sang. - seront soumises à mesure de la composition corporelle par un analyseur dédié (EU2). Cette mesure sera réalisée chez l’animal éveillé mais maintenu immobile. Elle est rapide (2 minutes) et non invasive, - seront isolées pendant 72h dans des cages spécifiques pour mesurer leur dépense énergétique (EU2). On mesurera leurs échanges gazeux (respiration), leur prise alimentaire et hydrique et leur activité physique. Cette mesure se fait de manière non-invasive. En fin d’expérience, une prise de sang terminale sera faite rapidement (en moins de 15-20 secondes) après une mise à jeun pendant 6h (EU1). L’animal sera mis à mort immédiatement après la prise de sang pour permettre le prélèvement de certains organes, qui seront ensuite étudiés en laboratoire (EU1).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : - un léger stress lors de leurs immobilisations nécessaires pour la réalisation de certains gestes (biopsie, injections), - une légère douleur lors des injections - une possible inflammation localisée au niveau de la zone d’injection - une soif augmentée, une envie fréquente d’uriner, de la fatigue, et éventuellement le développement d’un état légèrement anxieux, symptômes précoces liés au développement du diabète. - une douleur lors de l’incision de l’extrémité de la queue - les symptômes liés à une hypoglycémie liée à l’injection d’insuline, c’est-à-dire une baisse de leur activation jusqu’à leur prostration, un mal-être, voir des convulsions et un coma si l’hypoglycémie est sévère. -un stress léger dû à la privation de nourriture pendant 6h. - un stress lié à l’immobilisation pour la mesure de la composition corporelle et pendant l’isolement de 72h pour la dépense énergétique

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes afin d’analyser si l’amélioration de l’état diabétique est observée dans les différents tissus sensibles à l’insuline.

Remplacement

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact de la modification d’une fonction hépatique sur la physiologie de l’organisme entier. Cette réponse physiologique dépend de plusieurs dialogues inter-organes complexes (entre le foie, les reins, l’intestin, les muscles, le cerveau) qui ne peuvent actuellement pas être reproduits par des modèles cellulaires ou virtuels.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire pour observer une amélioration de la réponse à l’apport important (bolus) de glucose, qui est affectée chez les patients diabétiques de type 2, est le paramètre pris en compte pour calculer le nombre d’individus nécessaire. Ce nombre a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des résultats d’études précédentes : soit un maximum de 12 individus par groupe. Cette étude sera réalisée en comparant des souris témoins (sans modification de leurs gènes), qui développent un diabète lorsqu’elles sont nourries avec un régime hypercalorique, et des souris modifiées génétiquement dont la production de glucose par le foie est réduite de moitié. L’étude sera réalisée chez des mâles et chez des femelles. Au total, ce projet nécessitera 48 souris (24 mâles et 24 femelles).

Raffinement

- Pour éviter les inflammations des organes causées par les injections dans l’abdomen, la modification génique sera réalisée par une injection d’un produit sous la peau à différents endroits. - La préhension des souris sera réalisée par transfert à l’aide d’un tunnel pour réduire le stress. - Pour les mesures répétées de la glycémie, une petite incision de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une pommade anesthésiante. Le sang sera ensuite prélevé sans autre incision en grattant la croute et en massant la queue pour éviter toute autre incision. Les volumes de sang prélevés resteront très limités conformément aux recommandations internationales sur le bien-être animal. - Afin de limiter l’état légèrement anxieux développé par les souris rendues diabétiques, leur hébergement sera très enrichi pour leur permettre de s’isoler, de se cacher. - Le changement de la litière et la surveillance de leur consommation d’eau seront plus fréquents après 16 semaines de régime hypercalorique. - Le stress lié à l’isolement pour la mesure du métabolisme énergétique sera atténué en plaçant de la litière souillée de la cage d’origine des souris et par l’ajout d’un tube leur permettant de se cacher. Une période de découverte de ce nouvel environnement sera réalisée pendant 3 h, puis une période d’acclimatation de 24h précédera les mesures. - Les animaux seront pesés toutes les semaines et seront observés pour détecter tout signe de mal-être, souffrance, lésions ou de détérioration de l’état de santé général avec la mise en place de points limites précoces. Les souris seront euthanasiées soit à la fin de l’étude ou plus tôt si leur état de santé se dégrade, afin de prélever différents organes pour des analyses moléculaires.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris pour notre projet de recherche car, contrairement à d’autres espèces comme le poisson, elle possède des mécanismes de régulation de la glycémie similaires à ceux de l’être humain. De plus, il est possible dans cette espèce de désactiver précisément un gène important dans le foie grâce à des techniques génétiques avancées. Enfin, les outils d’analyses moléculaires, comme des anticorps, spécifiques de la souris sont disponibles en laboratoire. Le modèle de souris génétiquement modifié est unique et original car il permet de réduire de moitié la production de glucose par le foie. Les manipulations sur les souris seront limitées et réalisées à différents âges : La biopsie de tissu pour caractériser les gènes des souris sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7-10 jours. Les souris seront nourries avec un régime hypercalorique à l’âge adulte (8 semaines) pendant 8 semaines pour induire un état prédiabétique. La modification génique sera induite à ce stade (20 semaines), et son impact sera mesurée par différentes approches métaboliques nécessitant environ 9 semaines avant la mise à mort des souris.

Une heure par jour pendant quinze jours, une partie des 200 souris de ce projet est enfermée seule dans une cage sans litière, sans eau ni nourriture, face à un dispositif de stimulation lumineuse. Ces 200 souris vont toutes être tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie crânienne de deux heures leur pose des électrodes à trois mois, puis elles enchaînent des tâches de reconnaissance d'objet et d'association place-objet, avec des enregistrements de sommeil de 24 heures qui les isolent trois fois de suite. Le projet cherche à savoir si l'enrichissement de l'environnement et la stimulation lumineuse à 40 Hz renforcent la réserve cognitive du cerveau, une autre partie des souris passant deux mois en cages enrichies. Le porteur retient la souris parce que la plupart des modèles d'Alzheimer existants y ont été développés et parce que son laboratoire en a l'expertise de longue date.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA), première cause de démence dans le monde, se caractérise par un déclin cognitif progressif classiquement associé à des marqueurs histo-pathologiques spécifiques comme les dépots amyloides. Pourtant, certains individus présentant une importante accumulation de ces marqueurs neuropathologiques conservent des fonctions cognitives intactes, remettant en question le rôle déterminant de ces marqueurs dans l’expression clinique de la pathologie. Ces observations ont conduit au concept de « réserve cognitive » : la capacité du cerveau à compenser les atteintes liées à la maladie en mobilisant d’autres circuits neuronaux. Alors que de nombreuses approches thérapeutiques visant la réduction les dépôts amyloïdes pour soigner la MA ont échoué, renforcer cette réserve cognitive apparaît comme une stratégie thérapeutique prometteuse. À ce titre, l’enrichissement environnemental (consistant en des conditions d’hébergement plus stimulantes cognitivement avec un hébergement en groupe, des labyrinthes et autre…) et une méthode de stimulation sensorielle non invasive, principalement visuelle à une fréquence de 40Hz, appelée GENUS (Gamma Entrainment Using Sensory stimulation), ont récemment montré un fort potentiel pour le renforcement de cette réserve. Nous pensons que les troubles liés à la MA proviennent avant tout d’un dysfonctionnement des dynamiques cérébrales, plutôt que de la seule accumulation de protéines anormales. En étudiant un nouveau modèle de souris atteintes de la maladie, nous avons observé que les premiers troubles de la mémoire sont liés à une baisse de la fluidité de l’activité cérébrale. Fait marquant, de brèves stimulations visuelles rythmiques (vGENUS) ont permis de rétablir cette fluidité, ainsi que les capacités cognitives. Notre projet a deux objectifs : (1) suivre l’évolution de l’activité cérébrale dans ce modèle animal pour identifier des signes précoces de troubles cognitifs, et (2) tester l’effet de l’enrichissement environnemental et du GENUS sur cette activité et sur les performances mentales. Nous pensons que ces interventions pourraient restaurer une activité cérébrale plus efficace, et ainsi renforcer la résistance du cerveau face à la maladie. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant directement le fonctionnement des réseaux neuronaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la dynamique cérébrale au cours de l’évolution de la maladie d’Alzheimer et des déficits cognitifs associés, afin d’identifier des biomarqueurs précoces, donc des marqueurs de dynamique cérébrale pathologique pouvant être détecté à des stades très précoces de la maladie. Dans un second temps, ce projet visera à comparer les effets bénéfiques de l’Enrichissement environnemental avec un protocole de stimulation sensorielle non-invasive (vGENUS). Dans son ensemble, ce projet apportera donc une meilleure compréhension et une meilleure caractérisation des stades précoces et de l’évolution de la maladie d’Alzheimer, dans l’optique de pouvoir développer des outils diagnostique précoces de la pathologie. De plus, mieux comprendre l’impact de différents protocoles thérapeutiques ayant déjà montré leurs effets bénéfiques optimisera leur mise en place, dans l’optique d’une démocratisation de ces stratégies thérapeutiques non-invasive pour la prise en charge de patient atteint de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Pour les 3 procédures les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale (environ 2h) à 3 mois pour la mise en place d’électrodes. Ils seront isolés le temps du réveil de la chirurgie (maximum 12h), entre les phases d’acquisition et de rétention des taches de reconnaissance d’objet (24h de délai, pendant lesquels le sommeil des souris est enregistré) et la tâche d’association place-objet (5 min de délais), et également pendant des enregistrements de sommeil de 24 ± 1h répétés 3 fois entre les sessions de comportement. Les sessions de comportement durent 6 jours pour la première puis 4 jours pour les suivantes où les essais des tâches durent 10 minutes et les animaux feront un maximum de 2 essais par jours ce pendant la tâche d’association place-objet. Pour la procédure 2, les animaux seront exposés à un protocole de stimulation lumineuse, ils seront placés 1h par jour pendant 15 jours isolé dans une cage sans litière, nourriture et boisson avec un seul côté de la cage transparent, faisant face au dispositif de stimulation. Les tâches comportementales seront réalisées avant et après ces protocoles. Pour la procédure 3, les animaux seront placés dans des cages d’enrichissement comportemental (Dans les cages ‘Marlaux’) pendant 2 mois avant de réaliser les tâches comportementales. A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort après une anesthesie générale.

Impact sur les animaux

La chirurgie stéréotaxique peut potentiellement induire de la douleur et une altération de l'état de santé général des animaux pendant 48h au maximum. Également, la plaie pourrait présenter des problèmes de cicatrisation, notamment des infections. Enfin, les périodes d’isolement de maximum 25h entre deux expériences où lors des enregistrements de sommeil peuvent induire du stress chez les animaux.L’injection d’anesthésique avant la mise à mort peut induire une douleur aigüe de courte durée.

Devenir

Tous les animaux (200) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem

Remplacement

Ce projet vise à étudier la dynamique cérébrale globale dans les stades de la MA précoces, ainsi, cette étude nécessite l’usage d’un modèle qui permet d’étudier les stades précoces présymptomatiques de la maladie, ce qui n’est pas possible chez l’humain. De plus les mesures de dynamique globale nécessitent le système cérébral dans son ensemble, couplé aux performances mnésiques pour évaluer la progression de la MA, cette étude ne peut donc pas être réalisée in-vitro et doit être réalisée chez l’animal.

Réduction

Le nombre d'animaux dans chaque groupe représente le minimum nécessaire, déterminé grâce à une analyse statistique rigoureuse. Cette analyse prend en compte plusieurs facteurs importants incluant la variation naturelle du comportement chez la souris ou la mortalité naturelle due au vieillissement. Le nombre d'animaux choisi nous permet donc d'obtenir des résultats scientifiquement valables malgré ces contraintes.

Raffinement

La chirurgie sera opérée sous anesthésie gazeuse supplémentée par une couverture analgésique locale au niveau de la zone d’incision chirurgicale. Une pommade d’anesthésique local limitera les douleurs aux oreilles dues aux barres d’oreilles, l’ajout de pommade à base de vitamine A limitera le dessèchement oculaire. Pendant la chirurgie un anti-inflammatoire non stéroïdien assurera l’analgésie et il sera ajouté au biberon pendant 1 à 3 jours pour assurer l’analgésie post-opératoire. Enfin, la température corporelle sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté. La lutte contre l’hypothermie se poursuit jusqu’au réveil complet de l’animal en plaçant sa cage sous une lampe chauffante. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience par du personnel formé, plus particulièrement avec une observation détaillée la semaine suivant la chirurgie. Des points limites ont été déterminés afin de soustraire les animaux à toute souffrance inutile. En amont des expériences, les animaux seront familiarisés à la manipulation par l’expérimentateur afin de diminuer le stress. Ils seront également habitués à l’utilisation d’une boite pour le transport de l’animal depuis sa cage d’hébergement au dispositif expérimental et vice versa.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour cette étude est la souris, dont le système nerveux central présente une organisation anatomique et fonctionnelle proche de celui de l’humain, en particulier en ce qui concerne les bases neurobiologiques de la mémoire. L’étude de la mémoire spatiale chez le rongeur constitue un modèle pertinent de la mémoire épisodique humaine. Par ailleurs, la majorité des modèles animaux de la maladie d’Alzheimer (MA) actuellement disponibles ont été développés chez la souris. Le modèle que nous utilisons présente une avancée significative par rapport aux précédents : il ne repose pas sur la surexpression artificielle des protéines clés de la MA, ce qui limite les effets secondaires associés à cette approche. Ce modèle reproduit une apparition progressive des troubles mnésiques, comparable à celle observée au stade préclinique de la MA chez l’humain. De plus, nous disposons d’une expertise de longue date dans l’étude des bases neurobiologiques de la mémoire chez la souris, ainsi que dans l’analyse de modèles murins de la MA. Toutes les souris utilisées seront issues d’un fond génétique homogène. L'étude suivra les souris de l'âge adulte (3-4 mois) jusqu'à un âge avancé (18 mois). Cette période nous permet d'observer l'évolution complète des capacités cognitives au cours du vieillissement normal et pathologique et d’observer l’effet de l’enrichissement environnemental ou du vGENUS sur ces performances.

Rendues diabétiques par 21 semaines de régime hypercalorique, 48 souris reçoivent des injections d'insuline dont le porteur indique qu'elles peuvent provoquer prostration, convulsions et coma. Elles subissent aussi quatorze prélèvements de sang à l'extrémité de la queue, une mesure de composition corporelle sous contention et 72 heures d'isolement en cage métabolique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties entre deux établissements. Le porteur qualifie ces deux dernières mesures de non invasives, tout en listant le stress qu'elles causent. Les 48 souris sont tuées après un dernier prélèvement de sang, pour prélever les tissus sensibles à l'insuline et vérifier si l'état diabétique s'améliore.

Objectifs

L’obésité et le diabète sont actuellement reconnus comme des épidémies mondiales et nécessitent de proposer de nouvelles stratégies de traitement. Diminuer la production de sucre (glucose) par le foie est une stratégie efficace de traitement du diabète de type 2. Cependant, les médicaments utilisés et prescrits en première intention induisent des effets secondaires et ne peuvent pas être utilisés par l’ensemble des patients. La production de sucre par le foie dépend de deux mécanismes : une sortie dans le sang par un transporteur et une sortie par des vésicules. L’inhibition de la production de glucose par les vésicules permet de protéger du développement du diabète. L’objectif de ce projet réalisé dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2) est de déterminer si l’inhibition de la production de glucose par les vésicules permet de traiter le diabète de type 2, une fois qu’il est installé. L’inhibition de cette production de glucose spécifique sera réalisée grâce à des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de déterminer si l’inhibition de la production de glucose par des vésicules dans le foie est efficace pour traiter le diabète de type 2, lorsqu’il est induit par un régime hypercalorique chez la souris. Ces résultats permettront de mettre en évidence une nouvelle stratégie de traitement du diabète de type 2 et ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements efficaces, et présentant potentiellement moins d’effets secondaires que les médicaments actuels.

Procédures

Toutes les souris : - seront soumises à un régime hypercalorique dès l’âge de 8 semaines et pendant 21 semaines (EU1 + EU2). Ce régime est connu pour induire un état diabétique à partir de la 16ième semaine de régime chez des souris témoins. - recevront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes par souris) pour inhiber la voie de production vésiculaire de glucose par le foie (EU1). - subiront 2 tests pour analyser la régulation de leur glycémie pendant 2h après l’injection de glucose ou d’insuline (injections réalisées en 20 à 30 secondes chez la souris maintenues en contention) chez des animaux mis à jeun pendant 6h (EU1). Pour chaque test, 7 prélèvements de sang seront réalisés à l’extrémité de la queue en 15 secondes à 1 min maximum sur des souris libres de mouvement. Une seule incision de l’extrémité de la queue sera réalisée avant le premier prélèvement de sang. - seront soumises à mesure de la composition corporelle par un analyseur dédié (EU2). Cette mesure sera réalisée chez l’animal éveillé mais maintenu immobile. Elle est rapide (2 minutes) et non invasive, - seront isolées pendant 72h dans des cages spécifiques pour mesurer leur dépense énergétique (EU2). On mesurera leurs échanges gazeux (respiration), leur prise alimentaire et hydrique et leur activité physique. Cette mesure se fait de manière non-invasive. En fin d’expérience, une prise de sang terminale sera faite rapidement (en moins de 15-20 secondes) après une mise à jeun pendant 6h (EU1). L’animal sera mis à mort immédiatement après la prise de sang pour permettre le prélèvement de certains organes, qui seront ensuite étudiés en laboratoire (EU1).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : - un léger stress lors de leurs immobilisations nécessaires pour la réalisation de certains gestes (biopsie, injections), - une légère douleur lors des injections - une possible inflammation localisée au niveau de la zone d’injection - une soif augmentée, une envie fréquente d’uriner, de la fatigue, et éventuellement le développement d’un état légèrement anxieux, symptômes précoces liés au développement du diabète. - une douleur lors de l’incision de l’extrémité de la queue - les symptômes liés à une hypoglycémie liée à l’injection d’insuline, c’est-à-dire une baisse de leur activation jusqu’à leur prostration, un mal-être, voir des convulsions et un coma si l’hypoglycémie est sévère. -un stress léger dû à la privation de nourriture pendant 6h. - un stress lié à l’immobilisation pour la mesure de la composition corporelle et pendant l’isolement de 72h pour la dépense énergétique

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes afin d’analyser si l’amélioration de l’état diabétique est observée dans les différents tissus sensibles à l’insuline.

Remplacement

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact de la modification d’une fonction hépatique sur la physiologie de l’organisme entier. Cette réponse physiologique dépend de plusieurs dialogues inter-organes complexes (entre le foie, les reins, l’intestin, les muscles, le cerveau) qui ne peuvent actuellement pas être reproduits par des modèles cellulaires ou virtuels.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire pour observer une amélioration de la réponse à l’apport important (bolus) de glucose, qui est affectée chez les patients diabétiques de type 2, est le paramètre pris en compte pour calculer le nombre d’individus nécessaire. Ce nombre a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des résultats d’études précédentes : soit un maximum de 12 individus par groupe. Cette étude sera réalisée en comparant des souris témoins (sans modification de leurs gènes), qui développent un diabète lorsqu’elles sont nourries avec un régime hypercalorique, et des souris modifiées génétiquement dont la production de glucose par le foie est réduite de moitié. L’étude sera réalisée chez des mâles et chez des femelles. Au total, ce projet nécessitera 48 souris (24 mâles et 24 femelles).

Raffinement

- Pour éviter les inflammations des organes causées par les injections dans l’abdomen, la modification génique sera réalisée par une injection d’un produit sous la peau à différents endroits. - La préhension des souris sera réalisée par transfert à l’aide d’un tunnel pour réduire le stress. - Pour les mesures répétées de la glycémie, une petite incision de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une pommade anesthésiante. Le sang sera ensuite prélevé sans autre incision en grattant la croute et en massant la queue pour éviter toute autre incision. Les volumes de sang prélevés resteront très limités conformément aux recommandations internationales sur le bien-être animal. - Afin de limiter l’état légèrement anxieux développé par les souris rendues diabétiques, leur hébergement sera très enrichi pour leur permettre de s’isoler, de se cacher. - Le changement de la litière et la surveillance de leur consommation d’eau seront plus fréquents après 16 semaines de régime hypercalorique. - Le stress lié à l’isolement pour la mesure du métabolisme énergétique sera atténué en plaçant de la litière souillée de la cage d’origine des souris et par l’ajout d’un tube leur permettant de se cacher. Une période de découverte de ce nouvel environnement sera réalisée pendant 3 h, puis une période d’acclimatation de 24h précédera les mesures. - Les animaux seront pesés toutes les semaines et seront observés pour détecter tout signe de mal-être, souffrance, lésions ou de détérioration de l’état de santé général avec la mise en place de points limites précoces. Les souris seront euthanasiées soit à la fin de l’étude ou plus tôt si leur état de santé se dégrade, afin de prélever différents organes pour des analyses moléculaires.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris pour notre projet de recherche car, contrairement à d’autres espèces comme le poisson, elle possède des mécanismes de régulation de la glycémie similaires à ceux de l’être humain. De plus, il est possible dans cette espèce de désactiver précisément un gène important dans le foie grâce à des techniques génétiques avancées. Enfin, les outils d’analyses moléculaires, comme des anticorps, spécifiques de la souris sont disponibles en laboratoire. Le modèle de souris génétiquement modifié est unique et original car il permet de réduire de moitié la production de glucose par le foie. Les manipulations sur les souris seront limitées et réalisées à différents âges : La biopsie de tissu pour caractériser les gènes des souris sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7-10 jours. Les souris seront nourries avec un régime hypercalorique à l’âge adulte (8 semaines) pendant 8 semaines pour induire un état prédiabétique. La modification génique sera induite à ce stade (20 semaines), et son impact sera mesurée par différentes approches métaboliques nécessitant environ 9 semaines avant la mise à mort des souris.

924 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur leur est implantée dans la patte arrière droite, ce qui selon le porteur peut réduire leur mobilité au point de gêner leur accès à la nourriture, et peut se nécroser en provoquant une douleur. Suivent cinq gavages, une injection dans l'abdomen, puis la mise à mort échelonnée un, trois, cinq, huit et dix jours après traitement, pour prélever tumeurs, poumons, rates et ganglions. L'objectif est de savoir si ajouter une chimiothérapie au régorafénib élimine les cellules immunosuppressives que ce médicament fait apparaître, le porteur concluant que "les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d'un organisme".

Objectifs

Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. Le régorafénib est un traitement utilisé dans le traitement de multiples cancers solides. En dépit des conséquences bénéfiques connues contre la tumeur après ce traitement, nous avons observé l’augmentation d’une population de cellules immunosuppressives. Le but de ce projet est d’évaluer si la combinaison du Régorafénib avec un autre traitement couramment utilisé contre le cancer, une chimiothérapie connue pour éliminer ce type de cellules immunosuppressives, permettrait d’obtenir une meilleure efficacité antitumorale et de comprendre pourquoi. Nous regarderons les conséquences de cette combothérapie sur la croissance tumorale et sur l’infiltrat immunitaire au cours du temps avec l’espoir de pouvoir prochainement proposer une nouvelle combinaison thérapeutique à tester en étude clinique.

Bénéfices attendus

Le cancer représente un enjeu majeur de santé publique, nécessitant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces et mieux tolérées par les patients. Ce projet s'inscrit dans une démarche appliquée visant à évaluer l'intérêt de la combothérapie associant le Régorafénib et le 5-FU dans le modèle murin de cancer colorectal MC38. L'objectif est de déterminer si cette approche combinée permet d'améliorer l'efficacité du traitement en modulant favorablement l'environnement tumoral et en renforçant la réponse immunitaire antitumorale. En validant cette stratégie thérapeutique dans un modèle préclinique, ce projet pourrait contribuer à l'optimisation des traitements actuels et ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques plus performantes et mieux tolérées en clinique.

Procédures

Les animaux sont injectés en sous-cutané dans la patte inférieure droite sous anesthésie gazeuse avec les cellules tumorales (5 minutes pour l’anesthésie et 30 secondes pour l’injection). Par la suite, un suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine : les souris seront traitées en intra-péritonéale (30 secondes), une seule fois. Le gavage aura lieu 5 fois avec des sondes souples pour limiter le risque de blessures à l’œsophage. 1,3,5,8 et 10 jours après les traitements par chimiothérapie et Régorafénib, les souris sont mises à mort sous anesthésie générale à l’isoflurane (5 minutes pour l’anesthésie et 10 secondes pour la mise à mort). Par la suite, les tumeurs, les ganglions drainants et rates sont récupérés (2 minutes).

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales au niveau patte inférieur droite pourrait entrainer une diminution de la mobilité des souris. Cette diminution de mobilité pourrait diminuer la capacité des souris à se nourrir. L’injection des cellules tumorales se fait en sous-cutanée. De ce fait, nous pourrions observer des nécroses au niveau de la tumeur conduisant à une douleur chez l’animal. Les chimiothérapies utilisées peuvent entrainer une perte de poids chez les souris.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les poumons, tumeurs, rates et ganglions.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=7 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 3 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections sous-cutanées (cellules tumorales), intra-péritonéales (traitements) et intra-veineuse (cellules tumorales) seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les modèles expérimentaux pour lesquels on trouve plus facilement et en plus grand nombre des réactifs spécifiques à l’espèce. Les souris sont l’espèce de référence pour les études précliniques en cancérologie, permettant la reproduction et la validation des résultats facilement pas la communauté scientifique. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

Laissées vieillir jusqu'à dix-huit ou vingt et un mois, les souris de ce projet développent tumeurs, fibroses rénales, cataractes, alopécies et plaies cutanées, et le porteur anticipe qu'un cinquième d'entre elles mourra de mort naturelle avant la fin. 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des organes. Chacune reçoit six injections en trois mois, trois prélèvements sanguins de 200 microlitres, trois collectes d'urine, de fèces et de poils, et douze pesées. Des points limites précoces sont annoncés dès les premiers signes de souffrance, alors que la dégradation liée à l'âge constitue ici le matériau même de l'expérience.

Objectifs

Ce projet fait partie d'une étude plus globale de caractérisation du rôle d’une réponse immunitaire face à des cellules abîmées ou stressées par le vieillissement dites sénescentes. Nous avons observé que bloquer un composé présent sur les cellules sénescentes par un anticorps avait un effet bénéfique sur la survie des animaux et le développement des maladies liées à l’âge, notamment la fibrose pulmonaire. Cet effet est conservé jusqu’à un an après l’arrêt du traitement. Le sujet de cette étude est de comprendre le mécanisme de maintien de l’effet vaccinal induit par cet anticorps.

Bénéfices attendus

Par cette étude on s’attend à avoir une meilleure compréhension mécanistique des interactions entre le système immunitaire et les cellules sénescentes au cours du vieillissement. Cela pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement les cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âge incluant le cancer. Les résultats de cette étude devraient nous permettre de mieux développer l’anticorps et d’envisager des essais cliniques de phase précoce chez l’homme.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injections: chaque animal recevra 6 injections, réalisées toutes les deux semaines pendant une durée de 3 mois. Prélèvements sanguins : chaque animal fera l’objet de 3 prélèvements de 200 µL, réalisés une fois par mois pendant la durée de l’étude (3 mois). Collecte d’urine, de fèces et de poils : chaque animal sera soumis à une collecte mensuelle, soit 3 collectes au total. Pesées : chaque animal sera pesé une fois par semaine, soit 12 pesées sur la durée de l’étude. Ces interventions sont réalisées sur l’ensemble des 200 animaux inclus dans le projet.

Impact sur les animaux

Le phénotype âgé favorise l’apparition de nombreuses maladies. Entre 18 et 21 mois, nous anticipons une perte de 20 % des animaux par mort naturelle. Les souris âgées peuvent ainsi développer : des tumeurs, de la fibrose rénales, des cataractes, des alopécies et des plaies cutanées Les injections peuvent provoquer une très légère douleur et de l’inflammation sur le site d’injection et l’animal peut ressentir un stress au moment de la contention.

Devenir

Afin de caractériser l'effet de notre vaccination notamment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les différents organes des animaux traités et non traités. Nous devons pour cela procéder à l’euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire, cellulaire et histologique est indispensable pour évaluer les effets de notre anticorps sur le vieillissement cellulaire.

Remplacement

Nous avons montré in vitro que certaines cellules sénescentes (cellules stressées ou endommagées qui s’accumulent avec le vieillissement) produisent des molécules capables de bloquer l’action du système immunitaire. L’utilisation d’un anticorps spécifique a permis de restaurer cette action et de limiter le développement de la fibrose, avec un effet bénéfique sur la survie des souris. Ces résultats ont été observés à la fois dans des modèles de fibrose induite et chez des souris âgées. Ces expériences ont permis d’identifier les doses efficaces et le bon moment d’action de l’anticorps. Nous souhaitons désormais comprendre comment ce traitement agit dans un organisme complet, en particulier chez des animaux âgés, où les cellules sénescentes apparaissent naturellement. Les interactions entre cellules immunitaires et cellules sénescentes sont complexes et impliquent plusieurs organes. Aucune méthode in vitro ne peut reproduire cette complexité. Seule une étude chez l’animal permet de savoir si le traitement réduit bien la présence de cellules sénescentes, réactive le système immunitaire, et limite les maladies liées à l’âge tout en améliorant la santé à long terme.

Réduction

Pour cette étude, nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer une taille d'effet attendue et ajuster en conséquence le nombre d'animaux nécessaires en utilisant des données préliminaires. Cela garantit des résultats fiables, tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous mettons en place plusieurs mesures pour réduire la douleur, le stress et la souffrance : Suivi quotidien : Les animaux seront observés chaque jour à l’aide d’une grille clinique. En cas de dégradation de leur état, la fréquence du suivi sera augmentée. Cohésion sociale : Les animaux seront hébergés par petits groupes compatibles, afin de préserver leur bien-être social tout au long de l’étude. Habituation : Une phase d’habituation à la manipulation est prévue avant les interventions, afin de limiter le stress lors des gestes expérimentaux. Points limites précoces : Des seuils d’arrêt clairement définis seront appliqués dès l’apparition des premiers signes de souffrance, pour éviter toute douleur inutile. Suivi longitudinal : Un suivi dans le temps permettra de détecter précocement d’éventuels signes de mal-être, notamment par le contrôle du poids, du comportement et de l’état général. Alimentation adaptée : En cas de difficultés de déplacement ou de prise alimentaire, de la nourriture humidifiée sera mise à disposition directement dans la cage. Utilisation d'une méthode d'anesthésie (la plupart des animaux expérimentaux). Enrichissements supplémentaires : matériaux à manipuler (copeaux de bois compacts) et des objets à déplacer (bâtonnets) Toutes ces mesures sont mises en place pour limiter la souffrance, améliorer le confort des animaux, et garantir des conditions expérimentales éthiques et rigoureuses.

Choix des espèces

Le modèle murin a une physiologie proche de l’homme (squelette osseux, poumons) et un cycle de vie relativement court. Chez la souris, les mécanismes de réparation et de dérégulation de la physiologie des tissus sont très bien décrits. Ils permettent une analyse précise de l'ensemble des phases mises en jeu au cours de ces évènements biologiques. Le modèle murin choisi est le seul nous permettant une approche intégrative des processus impliqués dans les maladies liées à l’âge. En effet, il permet d’étudier de façon concomitante les cellules immunitaires, les cellules sénescentes et l’avancement des maladies.

Une pince arrache une petite touffe de poils à chaque animal, souriceau compris, pour vérifier que la modification génétique a bien pris. 1 225 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec un traitement d'induction administré dès l'âge de un à sept jours ou à des femelles gestantes et allaitantes, six prélèvements sanguins sur les jeunes, des immobilisations en tube de moins de trois minutes et deux injections dans la semaine précédant la mise à mort. Le porteur compare la douleur de l'arrachage de poils à "celle des interactions sociales entre deux souriceaux". Toutes seront tuées pour que leurs os soient examinés en histologie et que le taux d'inactivation du gène cible soit mesuré.

Objectifs

La croissance chez l’humain est un phénomène complexe, influencé à la fois par la génétique, l’épigénétique, l’environnement et les interactions entre ces facteurs. Les mécanismes régulant ce développement ne sont pas tous complètement connus notamment lorsque leurs dérégulations conduisent à des retards de croissance. Une meilleure compréhension des causes de déficits de croissance chez l’enfant en période périnatale permettrait à la médecine de mieux accompagner les familles concernées par ce problème chez leurs enfants et de leur proposer un traitement adapté le cas échéant. L’axe hormonal somatotrope coordonne la croissance fœtale, post-natale, le métabolisme, et le vieillissement chez les humains ainsi que chez les rongeurs. L’inactivation de cet axe hormonal impacte la durée de vie et affecte l’ossature globale des souris en conduisant à de petites tailles. La possibilité de provoquer un retard de croissance en période périnatale au sein d’un modèle animal permettra de mieux définir d’éventuelles pistes thérapeutiques dans le contexte de la croissance de l’enfant. Notre projet vise donc à contribuer à la compréhension de l’impact de l’axe hormonal somatotrope sur la croissance périnatale.

Bénéfices attendus

Cette étude renforcera les connaissances de bases sur les défauts de croissance osseuse observés chez les enfants qui ont un faible poids de naissance et conservent un retard de croissance. Dans la population, le petit poids de naissance représente 9 pourcents de l’ensemble des naissances. Leur croissance est le plus souvent rattrapée dans les deux premières années de vie, mais seulement 10 pourcents de ces enfants restent petits. Cette étude montrera le rôle essentiel des facteurs de croissance dans la croissance osseuse. Les connaissances acquises grâce à ces travaux seront utiles en clinique pour proposer de nouveaux traitements contre les retards persistants de croissance chez l’enfant.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement afin d’induire la modification génétique. Plusieurs modes d’administration et stades de développement au moment de l’administration seront possibles selon la question scientifique : par l’alimentation (prise spontanée durant 1 à 3 jours), par injection selon différentes voies (pendant 3 jours, 10 secondes sur animal vigile), par administration orale (1 fois par jour pendant 3 jours, 10 secondes sur animal vigile). Tous les animaux se verront prélever une petite touffe de poils pour la vérification de l’induction du modèle à l’aide d’une pince (animal vigile, quelques secondes par animal). Les animaux seront ensuite pesés/mesurés régulièrement pour suivre la croissance. Les animaux seront impliqués dans une détermination longitudinale de composition corporelle (masse grasse, masse maigre, eau) à l’aide d’un équipement d’imagerie en plaçant l’animal vigile dans un tube et en l’immobilisant durant moins de 3 minutes. Certains jeunes animaux subiront des prélèvements sanguins de faible quantités (6 fois, moins de 30 secondes, animal vigile). D’autres prélèvements sur adultes seront effectués sur 2 mois afin de réaliser des dosages hormonaux (4 fois, moins de 30 secondes, animal vigile - espacés de 2 semaines entre chaque prélèvement). Une semaine avant l’euthanasie, une partie des animaux recevront deux injections espacées d’une semaine nécessaire pour visualiser la croissance osseuse (animal vigile, quelques secondes par animal). Enfin, une partie des animaux subiront une injection unique au niveau de l’abdomen quelques minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. L’ensemble des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

Le traitement nécessaire à l’induction du modèle implique l’administration d’une molécule aux animaux. Ainsi, une contention est nécessaire, ce qui peut entrainer un léger stress et une douleur/irritation de courte durée au site d’administration. En cas de répétition des injections, il y a un risque (rare) de péritonite. La prise d’aliments contenant cette molécule pourra aussi être source d’un léger stress lors du changement d’aliment car les souris sont de nature néophobe (peur de la nouveauté) et une perte de poids. Les prélèvements de sang nécessaires aux dosages d’hormones seront source d’un stress et d’une douleur de courte durée. Un risque de saignement ou d’hématome existe à l’issu du prélèvement. Le prélèvement de poils pour la vérification de l’induction du modèle sera effectué par prise de très petites touffes de poils. Ce type de prélèvement induit une légère douleur similaire à celle des interactions sociales entre deux souriceaux. Les animaux seront impliqués régulièrement dans un suivi impliquant une pesée, une mesure de la taille, une mesure de la composition corporelle, ce qui pourra induire un stress de courte durée lié à la contention manuelle ou dans un tube pour maintenir l’animal (inférieur à 3 minutes). Une semaine avant l’euthanasie, une partie des animaux recevront deux injections espacées d’une semaine nécessaire pour visualiser la croissance osseuse. Ces deux injections peuvent induire un stress en raison de la contention et une douleur de courte durée liée à la piqûre. Enfin, l’anesthésie précédant certaines euthanasies implique une injection pouvant induire un stress en raison de la contention et une douleur de courte durée liée à la piqûre.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issue des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour l’étude histologique ou biochimique des tissus osseux. La récupération des tissus post-mortem permettra une analyse des taux d’inactivation du gène cible.

Remplacement

Ce projet a pour but d’étudier comment les différents organes communiquent lors de la croissance d’un individu. Pour cela, il utilise un organisme vivant et complet, qui permet de modéliser la croissance humaine. En effet, aucun modèle cellulaire ne peut reproduire les interactions complexes entre les organes d’un corps entier. Les souris sont choisies pour ce projet car leur croissance est influencée par des facteurs hormonaux similaires à ceux des humains. Elles permettent donc de mieux comprendre la croissance, notamment en observant l’impact de l'arrêt de certains gènes dans un contexte hormonal. L’utilisation de modèles vivants (in vivo) est essentielle, car seule cette approche permet de suivre l’effet des hormones sur la croissance. En plus, les recherches sur les souris bénéficient d’outils et de protocoles bien établis. Les études faites sur ces animaux ont permis d’obtenir des informations cruciales sur le fonctionnement des organes, que l’on ne pourrait pas obtenir à partir de cellules seules, car elles manquent de régulation hormonale.

Réduction

Le projet impliquera un total de 1225 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte-tenu des données de la littérature et des effets espérés, un test de puissance statistique a été́ utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour cette étude. Des tests statistiques seront également utilisés pour les analyses des résultats. Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Les procédures expérimentales sont affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. L’utilisation de l’ensemble des animaux issu d’une portée qui inclue les mutants et les contrôles permet de réduire substantiellement le nombre de souris nécessaire pour l’étude proposée. Le nombre d’animaux par groupe testés dans chaque expérience nous permettra donc une comparaison statistique adaptée tout en tenant compte des impératifs de réduction.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi en continu à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures et nos gestes expérimentaux afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive des naissances et de la croissance post-natale. Les pesées seront réalisées dans les premiers jours de vie par préhension avec les mains en forme de coupelle pour minimiser le stress de l’animal. Nous avons inclus dans les protocoles de mesure de croissance une grille d’évaluation des animaux, incluant des observations cliniques et le suivi de poids des animaux. Nous prenons soin de constituer des groupes où des individus de petite taille sont accompagnés d’individus de taille normale afin d’assurer une bonne maintenance de leur température corporelle. Les animaux fragiles identifiés seront soumis à une vigilance accrue et des décisions appropriées seront prises afin de minimiser une éventuelle douleur de l’animal. Des soins adaptés quand cela est possible/nécessaire seront prodigués voire une euthanasie compassionnelle si cela est requis. Les administrations seront réalisées avec du matériel adapté à l’âge des animaux et par du personnel formé/compétent pour les actes mis en œuvre.

Choix des espèces

JJustification de l’espèce : Le récepteur aux facteurs de croissance est spécifique des mammifères et ne permet pas l’utilisation d’autres organismes plus simples. La régulation de la croissance chez la souris est similaire à celle de l’homme. Dans une étude intégrée des phénomènes de perturbation de la croissance, la souris représente un modèle idéal puisqu’elle est un des seuls mammifères qui permet assez facilement une approche par transgénèse avec élaboration de modèles génétiques complexes. Justification des stades de développement : Les traitements au tamoxifène seront initiés sur des animaux âgés de 1 à 7 jours, ou sur des femelles de 2 mois allaitantes ou gestantes. Nous analyserons les effets de ce traitement sur les premières phases de croissance pré-pubertaire. Le suivi des animaux sera poursuivi sur 6 mois au maximum. L’objectif du projet est d’étudier les répercussions sur la morphologie de la structure osseuse dès les premiers jours de vie et jusqu’à l’âge adulte.

384 souris porteuses d'une mutation qui détruit la cohésion des cellules du cœur vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La thérapie génique leur est injectée entre le deuxième et le cinquième jour de vie, sur souriceau vigile, puis chaque animal passe quatre à six examens cardiaques, électrocardiogramme sans anesthésie ou échographie sous anesthésie légère. Le porteur indique qu'une mort subite peut survenir à partir de huit mois, comme chez les personnes atteintes, et que les souris reproductrices seront tuées à cet âge. Il décrit par ailleurs les tissus cardiaques humains qu'il fabrique en trois dimensions à partir de cellules souches comme très prometteurs, avant de conclure qu'un modèle animal "reste nécessaire".

Objectifs

La cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit est une maladie génétique du cœur qui touche environ 1 personne sur 5000, soit plusieurs milliers de cas en France. Elle provoque une perte de cohésion entre les cellules du cœur, ce qui entraîne des troubles du rythme cardiaque et peut provoquer une mort subite chez de jeunes adultes. À ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour cette maladie. Les recherches se concentrent sur le muscle du cœur, pour mieux comprendre sa structure et son fonctionnement. Pour étudier la maladie de façon réaliste, il est nécessaire d’utiliser une lignée de souris qui reproduit fidèlement la maladie humaine. L’objectif est de tester chez ces souris une thérapie génique capable de prévenir l’apparition de la maladie ou, au minimum, d’en ralentir le développement.

Bénéfices attendus

Ce projet utilise un modèle de souris déjà existant, qui reproduit très fidèlement la maladie humaine appelée cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit. Cette maladie génétique empêche les cellules du cœur de bien rester attachées entre elles, ce qui provoque des troubles du rythme cardiaque et peut conduire à une mort subite chez de jeunes adultes. Les résultats de ces recherches permettront de valider une stratégie de thérapie génique et pourront aussi aider à mieux comprendre d’autres formes de la maladie causées par d’autres gènes. À long terme, l’objectif est de mettre au point une thérapie génique capable de traiter tous les patients atteints de cette maladie, quelle que soit l’anomalie génétique en cause.

Procédures

Dans ce projet, la thérapie génique sera testée avec une seule injection, effectuée sur le souriceau vigile. L’injection ne dure que quelques secondes. Pour suivre l’évolution, chaque souris sera examinée minimum 4 fois au cours de sa vie (et 6 foix au maximum) grâce à des méthodes simples et indolores : un électrocardiogramme sur animal vigil pour contrôler le rythme du cœur, ou une échographie cardiaque sous légère anesthésie pour observer son fonctionnement. Ces examens sont rapides (environ 15 minutes au total) et réalisés de façon regroupée pour limiter le stress et les manipulations des animaux.

Impact sur les animaux

L’injection prévue peut provoquer une douleur légère et passagère chez le nouveau-né. Comme pour toute injection, il existe aussi un faible risque d’infection à l’endroit où elle est réalisée. La manipulation des animaux peut être une source de stress. Avant l’âge de 8 mois, certains animaux peuvent présenter une augmentation des troubles du rythme cardiaque, ce qui peut leur causer un inconfort. À partir de 8 mois, une mort subite peut survenir, comme cela est décrit dans cette maladie. Les examens cardiaques (électrocardiogramme et échographie)sont non invasifs et largement utilisés, sans effets secondaires connus. Pour l’échographie, une anesthésie légère est nécessaire : elle peut entraîner un refroidissement de l’animal, un ralentissement de la respiration et du rythme cardiaque, mais ces effets sont contrôlés et réversibles.

Devenir

Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront euthanasiés en fin de procédure. Les animaux surnuméraires dans un groupe serviront pour compléter d'autres groupes. En fin d'inclusion, des euthanasies seront effectuées par une méthode règlementaire.

Remplacement

Depuis plusieurs années, nous essayons de développer des modèles de cœur humain en laboratoire, grâce à des cellules souches et à des techniques de bioingénierie en 3 dimensions. Ces approches permettent de créer des tissus cardiaques et de réduire l’utilisation d’animaux pour les recherches. Cependant, il n’est pas encore possible de reproduire en laboratoire toute la complexité d’un organisme vivant, avec l’ensemble des mécanismes qui régulent le cœur et expliquent l’apparition de maladies comme la cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit. De plus, l’effet réel d’une thérapie génique ne peut pas encore être évalué uniquement avec ces méthodes de substitution, même si elles sont très prometteuses. C’est pourquoi un modèle animal reste nécessaire pour répondre à certaines questions essentielles, notamment pour vérifier et valider de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Pour ce projet, nous avons utilisé des simulations statistiques afin de déterminer le nombre minimal de souris nécessaires. L’objectif est d’obtenir des résultats fiables tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Les calculs tiennent compte des différents groupes de comparaison (selon les gènes et les traitements) et de la mortalité attendue dans certains cas. De cette façon, nous nous assurons d’avoir 5 à 10 animaux par groupe en fin d’étude, ce qui est le strict minimum pour pouvoir tirer des conclusions solides. Les deux sexes sont utilisés et répartis de façon équilibrée. Les naissances sont ajustées au fur et à mesure pour éviter un excès d’animaux, et les souris surnuméraires sont intégrées uniquement si elles permettent de compléter un groupe manquant. Au total, le plan de recherche prévoit environ 384 souris sur 5 ans, auxquelles s’ajoutent une petite marge liée à la reproduction nécessaire pour maintenir la lignée. Ce chiffre correspond au nombre le plus réduit possible, tout en permettant de répondre aux questions scientifiques posées.

Raffinement

Les souris sont élevées dans de bonnes conditions de confort, en groupe avec leurs congénères, dans des locaux où la température, l’humidité et l’alternance jour/nuit sont soigneusement contrôlées. Elles ont en permanence accès à de la nourriture et de l’eau grâce à un système automatique. Leur environnement est maintenu parfaitement sain grâce à la stérilisation du matériel et à l’utilisation d’eau purifiée. Des objets d’enrichissement (papier, coton, bois, rouleaux en carton ou abris) sont également ajoutés pour stimuler leur comportement naturel. La santé des animaux est vérifiée chaque jour. Pour limiter le stress, les manipulations sont réduites au minimum, faites rapidement et avec douceur. Lors des injections, tout est prévu pour réduire au maximum l’inconfort : les souriceaux sont sortis de la cage pour une durée très courte, maintenus au chaud, manipulés avec précaution, puis replacés immédiatement dans leur nid, avec vérification qu’ils soient bien repris par leur mère. Pendant les examens cardiaques non-invasifs, des mesures spécifiques assurent leur bien-être : l’échographie est réalisée sous une anesthésie très légère pour stabiliser cœur et respiration, et un gel protecteur est appliqué sur les yeux si l’examen dure plus de dix minutes ; l’électrocardiogramme (ECG) est effectué sans anesthésie, afin d’éviter des manipulations supplémentaires. Les animaux sont suivis attentivement tout au long de leur vie. Une surveillance renforcée est mise en place dès l’âge d’un mois pour les animaux les plus fragiles. Si un problème de mobilité survient, de la nourriture hydratée est placée au sol pour qu’ils puissent s’alimenter facilement.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé et le mieux documenté pour étudier les maladies du cœur. La lignée sur laquelle nous travaillerons reproduit fidèlement la cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit chez l’homme, une maladie grave pour laquelle il n’existe pas encore de traitement curatif. C’est le seul modèle connu qui permette de tester une thérapie génique et d’étudier les modifications au niveau des cellules, des molécules et du fonctionnement du cœur. L’objectif est de stabiliser les structures des cellules cardiaques affectées par la maladie. Le suivi du cœur se fera grâce à des examens non invasifs qui permettent de mesurer le rythme et la contraction cardiaque, et de vérifier l’efficacité de la thérapie. Les résultats obtenus chez la souris pourront ensuite servir à envisager un développement de cette thérapie chez l’homme. Comme la maladie se déclare tôt chez l’homme, les injections de thérapie génique seront réalisées sur des souris très jeunes (2 à 5 jours), et les animaux seront suivis jusqu’à l’âge de 6 mois. Les souris utilisées pour la reproduction seront employées jusqu’à 8 mois avant d’être euthanasiées, conformément aux règles de l’expérimentation animale.

Une posture inhabituelle, un poil hérissé, un dos voûté, un retrait des congénères : ces signes déclenchent la mise à mort immédiate de l'animal. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus impliqués dans l'homéostasie calcique. Une maladie rénale chronique leur est induite par un changement d'alimentation qui provoque une perte de poids culminant au dixième jour, avec vingt et un gavages quotidiens et quatre prises de sang sous contention. Ce que le projet doit établir tient en une phrase du porteur, savoir si une molécule "dont l'utilisation a récemment été protégée par un brevet" prévient ou guérit la maladie.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques (MRC) touchent environ 10% de la population mondiale et représentent une cause majeure de morbidité et de mortalité. Actuellement, les traitements disponibles ralentissent la progression mais ne permettent pas la régénération des tissus rénaux ni l’arrêt complet de la maladie. La compréhension fine des mécanismes de fibrose, d’inflammation et de perte néphronique est indispensable pour développer des thérapies innovantes. Le présent projet vise à déterminer si une molécule innovante dont l'utilisation a récemment été protégée par un brevet, prévient, ou traite les MRC.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si le traitement permettra de prevenir ou de guérir la MRC.

Procédures

Quatre prises de sang suivie d'une compensation hydrique sur animal vigile sous contention à une distance d'au moins 15 jours (30 secondes par prelevement). Vingt et une administration journalière par gavage (30 secondes par administration). Tous les 2 jours, un suivi du poids corporel (30 secondes par souris) est réalisé.

Impact sur les animaux

Comme la MRC, ce modèle est accompagné d'une perte de poids qui atteint son pic à jour 10 après changement de nourriture (modérée). Si les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera mis à mort immédiatement (sévère). Aucun effet secondaire n'a été rapporté pour la molécule utilisée dans cette étude. Bien que ce risque soit quasiment nul, la répétition des gavages par une personne formée en utilisant des sondes adaptées à la taille de la souris pourrait conduire à une fausse route (modérée). Les prises de sang dont la contention pourrait produire un stress (léger).

Devenir

En cas de point limite atteint et à la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour analyser les différents tissus impliqués dans l'homéostasie calcique.

Remplacement

La physiologie rénale murine présente une très forte analogie avec celle de l'Homme permettant une transposition pertinente des résultats. Les reins ont une structure complexe et des interactions cellulaires impossibles à reproduire intégralement in vitro. Les modèles animaux permettent d’étudier l’évolution de la maladie sur le long terme dans un organisme complet, de tester l’efficacité et la sécurité des molécules candidates avant le passage chez l’humain, et de comprendre les voies de signalisation impliquées.

Réduction

Afin de déterminer le potentiel thérapeutique de notre molécule, des analyses histologiques, de l'expression de gènes et de protéines, ainsi que de cytométrie devront être réalisées sur les animaux. Les souris ayant 2 reins, nous pourrons diminuer le nombre de souris par lot. Les deux reins d'un animal ne seront jamais analysés deux fois par la même technique. Des analyses de variances utilisant les différents lots de souris seront réalisées pour déterminer avec précision les effets thérapeutiques.

Raffinement

L'environnement sera enrichi pour l'ensemble des animaux. La surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis tout au long de l'expérience, par observation de leur comportement général, ainsi que par mesure de leurs poids tous les 2 jours ouvrés. Après les prises de sang, une compensation hydrique sera réalisée ainsi qu'une surveillance de la zone de prélevement. Pour eviter un stress supplémentaire, les souris seront hebergées en groupe de 2-5 et tous les animaux auront de la nourriture liquide gélifiée dans la cage à partir de l'instant où un animal est amaigri. Une grille de scoring de la douleur sera utilisée pour l’évaluation de la douleur, et la mise à mort ne sera effective que si suffisamment de critères sont réunis d’après la dite grille. Un volume equivalent de NaCl tiédi sera administré pour respecter la compensation hydrique et une surveillance du site de prélevement sera réalisée dans les 24 heures suivantes. Après les gavages, la capacité des souris à se déplacer et s'alimenter sera surveillée.

Choix des espèces

La physiologie rénale murine présente une très forte analogie avec celle de l'Homme permettant une transposition pertinente des résultats. La MRC se declarant à l'age adulte, nous utiliserons des souris males et femelles agées de 8-10 semaines.

304 souris génétiquement modifiées pour développer un cancer de la glande surrénale vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 192 d'entre elles sont gavées tous les jours pendant deux mois, 144 reçoivent des injections dans l'abdomen deux jours par semaine sur la même durée, et les 304 sont rasées sur les flancs pour quatre échographies sous anesthésie gazeuse. Le porteur revendique une réduction du nombre d'animaux en exploitant les deux surrénales de chaque individu, l'une pour l'analyse moléculaire, l'autre pour l'histologie, et affirme qu'aucune nuisance n'est attendue de la tumeur puisque les souris seront tuées avant qu'elle ne les gêne. Le cancer visé frappe 0,5 à 2 personnes par million et par an, et le bénéfice annoncé se limite à démontrer, chez la souris, le potentiel de deux approches thérapeutiques.

Objectifs

Avec un dimorphisme sexuel présentant un ratio femmes/homme de 1.5 à 2.5 :1, et une incidence annuelle de seulement 0,5 à 2,0 cas par million d'individus, le carcinome corticosurrénalien est considéré comme un cancer agressif, environ 35 % des patients présentant des métastases lors du diagnostic initial. Le mauvais pronostic du carcinome corticosurrénalien peut être attribué au manque de thérapies efficaces. En effet, un traitement curatif n'existe que pour les patients porteurs de carcinome corticosurrénalien à faible agressivité qui subissent une résection chirurgicale complète. Par conséquent, les patients présentant une récidive ou une maladie métastatique, pour lesquels la chirurgie n’est pas une option, n’ont pratiquement aucune chance de survie à long terme. L'immunothérapie a sans aucun doute révolutionné le traitement du cancer au cours des années précédentes. Cependant, les résultats des essais d'immunothérapie pour le carcinome corticosurrénalien ont été modestes, probablement à cause de l’hyperactivité endrocrine trouvée dans 50 à 60% des carcinome corticosurrénalien qui induit une immunosuppression. Des approches alternatives visant à augmenter l’efficacité des immunothérapies doivent donc être envisagées. Une option c’est de lever cette immunosuppression en modulant l’activité endocrine, plus spécifiquement en inhibant les glucocorticoïdes, afin de pouvoir favoriser l’activité anti-tumorale de différents acteurs du système immunitaire, notament les lymphocytes T et les macrophages. En utilisant un modèle de souris génétiquement modifiée, reproduisant des altérations génétiques identifiées chez les patients poteurs de carcinome corticosurrénalien, nous allons donc évaluer le potentiel thérapeutique de l’inhibition des glucocorticoïdes sur des carcinomes corticosurrénaliens avancés, seule ou en co-thérapie avec les différentes immunothérapies afin de stimuler l’activation des différents acteurs anti-tumoraux du système immunitaire et augmenter l’efficacité du traitement. De même, l’échec des immunothérapies peut s’associer à la présence de macrophages pro-tumoraux, qui vont eux aussi induire une immunosuppression. Ainsi, ce projet vise aussi à évaluer l’impact de la déplétion des macrophages pro-tumoraux sur le système immunitaire et la progression tumorale, afin d’évaluer la possibilité de la combiner avec des immunothérapies.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet nous permettra de démontrer le potentiel thérapeutique de l’inhibition des glucocorticoïdes ou de la déplétion des macrophages pro-tumoraux dans un modèle murin de carcinome corticosurrénalien avancé, avec l’objectif d’améliorer le pronostic du carcinome corticosurrénalien.

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes : - - Technique d’administration de médicaments guidée par micropipette (MDA) : cette technique ne nécessite pas d’anesthésie préalable. 192 souris (mâles et femelles confondues, âgés de 4 mois), seront gavées au quotidien pendant 2 mois avec des inhibiteurs de glucocorticoïdes ou le solvant correspondant. Le geste sera réalisé une fois par jour et ne durera que quelques secondes. - Injections intrapéritoneales : cette technique ne nécessite pas d’anesthésie préalable. 144 souris (mâles et femelles confondues, âgées de 4 mois), seront injectées deux jours par semaine pendant 2 mois avec des anticorps communément utilisés en immunothérapie, soit seuls (48 souris) , soit en combinaison avec l’inhibition des glucocorticoïdes (réalisée par gavage, 96 souris). 32 souris (mâles et femelles confondues, âgées de 4 mois), seront injectées une fois par semaine pendant 2 mois avec un anticorps neutralisant ou son contrôle pour éliminer les macrophages pro-tumoraux. Le geste sera réalisé une fois par jour et ne durera que quelques secondes. - Alimentation supplementée avec ou sans inhibiteur des macrophages : 32 souris, mâles et femelles confondues, âgées de 4 mois, seront nourries pendant 2 mois avec de la nourriture standard ou formulée avec l’inhibiteur de macrophages. - Échographie : realisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, 304 souris de 4 mois, mâles et femelles confondus, seront rasées sur les flancs et la taille de la tumeur sera mesurée à l’aide d’un échographe. Ce geste sera réalisé 4 fois par souris : une fois au début du traitement, une fois après un mois de traitement, et puis à 72 et 48h avant la mise à mort de la souris, et ne durera que 30 minutes à chaque fois.

Impact sur les animaux

L’administration de traitements par MDA (Administration de médicaments guidée par micropipette) est une technique de courte durée qui requiert seulement la contention des animaux. De même, les injections intrapéritoneales requierent seulement une brève contention des animaux (technique de courte durée). Pour cela, ces techniques réalisées de façon isolée n’induisent qu’un stress léger. Cependant, vu que les procédures décrites dans cette demande impliquent la répétition des MDAs tous les jours et des injections péritonéales plusieurs fois pas semaine pendant plusieurs semaines, ceci peut conduire à l’apparition d’un stress modéré et une douleur de faible intensité. Finalement, le modèle murin de CCS avancé (les souris dKO) présente un développement tumoral et éventuellement des métastases. Cependant, on n’attend pas de nuissances associés au dévelopement tumoral, puisque tous les animaux seront mis à mort avant que le développement tumoral n’induise une gêne.

Devenir

Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de réaliser les prélèvements nécessaires à la réalisation de différentes analyses ciblant le potentiel de l’inhibition des glucococorticoîdes ou l’élimination des macrophages pro-tumoraux comme nouvelles approches térapeutiques dans le traitement de corticosurrénalomes métastatiques.

Remplacement

Afin d’eviter la douleur et l’inconfort de l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux euthanasiés sans manipulation préalable. Cette technique est un bon modèle alternatif pour tester des facteurs clés ayant un potentiel comme agent antitumoral. Cependant, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.

Réduction

Dans l’optique de réduire de nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour une extraction d’ARN pour une analyse moléculaire et l’autre pour des analyses d’immunohistochimie. De même, le sang des animaux euthanasiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales ou de detection de cellules tumorales circulants. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimun nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 8 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests adaptés.

Raffinement

L’administration répetée des différents traitements experimentaux peut entrainer une augmentation du stress chez les animaux. Afin de diminuer au maximum le stress de l’animal, on utilisera des techniques de manipulation non aversives, tels que la manipulation par tunnel, l’administration des médicaments par micropipette, ou la mise en place de procédures d’habituation à la contention nécessaire pour les injections intrapéritoneales. De même, nous donnerons un morceau de fromage à la fin de la manipulation en guise de récompense. En plus de la surveillance quotidienne par du personnel qualifié, une surveillance accrue sera réalisée pendant les 30 minutes suivant la manipulation des souris afin de vérifier l’absence de signes de douleur tels que comportements anormaux (léchage, grattage) ou altération des expressions faciales (changement dans la position du nez ou les oreilles), sur la base des points limites adaptés à la recherche animale en cancérologie. En cas des signes de douleur ou souffrance, des analgésiques seront administrés.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant les corticosurrénalomes. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Afin d’évaluer le potentiel de l’inhibition de glucocorticoïdes et de l’élimination des macrophages pro-tumoraux, en combinaison avec des immunothérapies, comme nouvelles approches thérapeutiques pour les carcinomes corticosurrénaliens métastatiques, nous utiliserons un modèle murin tumoral à 4 mois, moment où les premiers signes de malignité ont été détectés.