Souris

Ce sont des tests de toxicité commandés pour constituer des dossiers d'autorisation de mise sur le marché. 1 900 souris et 7 600 rats vont y être utilisés, tous tués à l'issue pour analyse anatomopathologique, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Ils reçoivent des molécules dont les effets toxiques sont par définition inconnus, subissent des prélèvements de sang répétés, des biopsies de peau sous anesthésie, jusqu'à seize heures d'isolement pour le recueil d'urine, et une partie est réutilisée d'une étude à l'autre après une période de repos. Sur le remplacement, l'établissement se borne à renvoyer aux lignes directrices des instances internationales, qui rendraient le recours in vivo "nécessaire".

Objectifs

Ce projet vise à d’évaluer la sécurité et la toxicité de molécules avant leur utilisation, selon les recommandations internationales des instances médicales et pharmaceutiques, chez deux espèces de rongeurs : la souris et le rat. Leur évaluation est effectuée conformément aux exigences des autorités réglementaires et nécessaire pour leur mise sur le marché et avant tout utilisation chez l’humain. Pour chaque molécule, afin de caractériser ses potentiels effets toxiques, d’identifier ses organes cibles et de définir ses marges de sécurité, plusieurs études complémentaires et séquentielles sont nécessaires : - Des études préliminaires qui permettent d’identifier la dose appropriée pour les études réglementaires ultérieures. Elles aident également à déterminer les effets du xénobiotique afin de confirmer les études règlementaires et de garantir le succès du dépôt d'une demande d'autorisation de mise sur le marché. - Des études de toxicologie, qui ont pour objectif de déterminer le niveau sans effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé, en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale. Elles permettent aussi de collecter des données de toxicité et de pharmacocinétique du xénobiotique avant que son utilisation soit autorisée. Le projet s’inscrit dans une démarche d’amélioration continue du bien-être animal en appliquant les principes des 3R. Les procédures sont optimisées pour limiter le nombre d’animaux requis, agir en étapes progressive pour raffiner le choix des doses et réduire la douleur et la contrainte, notamment par l’utilisation de techniques moins invasives et la validation d’approches alternatives.

Bénéfices attendus

Les études de toxicologie ont pour objectif de déterminer le niveau sans effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale, et de collecter des données de toxicité et de pharmacocinétique nécessaire à leur autorisation d’utilisation. Ces données sont des prérequis avant le passage aux essais cliniques chez l’humain ainsi que pour la constitution du dossier d’autorisation de mise sur le marché. Par ailleurs, le projet favorisera l’application des principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner), en optimisant les protocoles d’étude et en limitant l’impact sur le bien-être animal, ce qui renforcera la qualité scientifique des résultats et la conformité aux normes éthiques et réglementaires.

Procédures

Les animaux sont soumis dans ce projet : - des prélèvements de sang réguliers réalisés dans le cadre de recommandations vétérinaires, vigiles (sauf en cas d'anesthésie prévus pour d'autres prélèvements, cf ci-dessous). Chaque prélèvement dure quelques minutes, le nombre total est établi en fonction des caractéristiques du produit testé et limité en suivant les recommandations vétérinaires internationales. -des prélèvements d'urine, de manière passif (isolement jusqu’à recueil d'urine ou bien de 16h maximum), ou échoguidé sous sédations (quelques minutes). Généralement, un prélèvement au début et un prélèvement en fin d’étude sont suffisants. - prélèvement d’autres fluides biologiques (autres que le sang) : jusqu’à une fois par semaine, sous anesthésie d’une quinzaine de minutes environs - des biopsies de peau par ponction échoguidée (mini invasive), sous anesthésie (10 minutes environ) - des contention manuelle, notamment dans le cadre d'examen clinique pour détecter des effets toxiques, d’environ 10 minutes. Afin d’éviter la répétition d’actes anesthésiques, les prélèvements peuvent être réalisés au cours d’une même anesthésie, permettant, en 10 à 15 minutes, de recueillir plusieurs échantillons de tissus et liquides biologiques. A chaque étude, tous ces prélèvements ne sont pas effectués, à l’exception des prélèvements de sang qui sont systématiques. Ils sont choisis selon la nature du produit testé et les données préliminaires déjà connues (in vivo ou in vitro).

Impact sur les animaux

Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. - Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress. - Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de tissus biologiques (principalement de sang) et l’administration répétée de la molécule testée peut provoquer des lésions et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. De plus,, les animaux sont placés en cage individuelle pendant la phase d’évaluation de prélèvement d’urine. - Liées à une toxicité de la molécule testée : les études de toxicologie visent à évaluer la toxicité d’une molécule. Ce type de nuisances est difficilement estimable : selon le mécanisme d’action (anticorps, anticancéreux, neurologique, etc), la voie d’administration, ou encore la biodistribution, divers effets toxiques sont possibles (neurologique, immunologiques, inflammation, métabolique, etc).

Devenir

Les études de toxicologie nécessitent généralement une analyse pathologie et donc la mise à mort des animaux d'après les recommandations des instances pharmaceutiques et médicales internationales.

Remplacement

Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ces études. Suivant les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques internationales, il est nécessaire de recourir à des modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est fixé au minimum permettant de garantir la fiabilité des données obtenues d’après les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques internationales. Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données et la caractérisation correcte des effets toxiques potentiels. Afin de le réduire, des animaux peuvent faire plusieurs études préliminaires (ou de pharmacocinétique) après une période de repos (wash-out, dépendant de la demi-vie du xénobiotique testé), dans le cadre d’une utilisation continue. Des études pilotes sont menées, lorsque cela est pertinent, afin d’optimiser les conditions expérimentales et d’affiner les protocoles, ce qui permet de réduire le besoin en animaux pour les études principales. De plus, les tissus et échantillons biologiques collectés au cours des études sont réutilisés pour des analyses complémentaires (histopathologie, biomarqueurs, etc.), ce qui évite de recourir à des animaux supplémentaires pour des tests additionnels. L’ensemble de ces mesures s’inscrit dans une démarche proactive de réduction du nombre d’animaux, en accord avec les principes des 3R et les exigences des bonnes pratiques de laboratoire. La réutilisation d’animaux issus d’autres procédures expérimentales de gravité réelle ‘’légère’’ ou ‘’modérée’’ est possible tant que ces animaux n’ont pas reçu de xénobiotique en cours de test et après une période de repos d'au moins 2 semaines. Cela permet de réduire le nombre global d’animaux utilisé au sein de l’établissement et d’utilisés des animaux bien habitués aux manipulations liées aux études. Cette réutilisation est validée par un vétérinaire et la structure en charge du bien-être animale.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 5 jours minimum pour les rongeurs est respectée à réception des animaux. Pendant cette période d’acclimatation, les animaux peuvent bénéficier d’un programme d’habituation adapté aux procédures qu’ils vont subir, afin de réduire leur stress et de favoriser leur coopération. Ce programme inclut des manipulations progressives et régulières, permettant aux animaux de s’habituer au contact humain et aux équipements utilisés. Un programme d’enrichissements validé par la structure en charge du bien-être animale. est appliqué quotidiennement pour garantir des conditions de vie optimales/minimiser les impacts des expérimentations.. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi structure en charge du bien-être animale.. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique est en place, un fois par semaine pendant la phase d’administration du principe actif. L’examen clinique complet est effectué par un personnel formé pour évaluer les fonctions motrices, nerveuses, cardiaques, respiratoires, la température et l’état général des animaux. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse. L’établissement développe des techniques les moins invasives possibles comme des gilets de télémétrie permettant d’analyser les fonctions cardiaques, respiratoires et l’activité sans contrainte physique ou pose d’implants par chirurgie. Les volumes prélevés/administrés respectent lesrecommandations vétérinaires.

Choix des espèces

D’un point de vue réglementaire, ces animaux sont des espèces reconnues pour leur aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de xénobiotiques. Les lignes directrices instances médicales et pharmaceutiques internationales requièrent généralement deux espèces (rongeurs et non rongeurs) selon la nature du produit à tester (molécule chimique de synthèse, peptide, protéine, anticorps monoclonal ou produit de thérapie génique ou cellulaire). Des demandes d’autorisations de projet pour des espèces non rongeurs ont déjà été déposées par l’établissement. Selon ces lignes directrices, il convient d’utiliser de jeunes animaux sains après sevrage. Les rongeurs sont inclus en étude en général à partir de 6 semaines.

Injectées dans la glande mammaire, dans la veine ou derrière l'œil, 1 826 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Une partie reçoit des cellules tumorales, dont la croissance peut gêner les déplacements et faire ulcérer la peau, et la taille de la tumeur est mesurée de façon répétée sous anesthésie. Il s'agit de comprendre comment une catégorie de cellules immunitaires, les cellules dendritiques de type 1, coordonne la défense contre le cancer du sein. Le porteur écrit que les interventions se limitent à des manipulations courtes réalisées sous anesthésie, tout en déclarant pour une partie des animaux un niveau de souffrance sévère.

Objectifs

Ce projet prolonge un travail précédent qui vise à mieux comprendre comment certaines cellules du système immunitaire, appelées cellules dendritiques de type 1, aident le corps à se défendre contre le cancer. Ces cellules ne détruisent pas directement les cellules cancéreuses. Leur rôle est plutôt de coordonner la réponse immunitaire, un peu comme un chef d’orchestre. Elles activent d’autres cellules du système immunitaire, notamment : • Des globules blancs capables de tuer les cellules cancéreuses ; • D’autres cellules qui participent aussi à cette défense. Sans elles, le système immunitaire a plus de mal à repérer et attaquer les tumeurs, même avec l’aide de traitements comme l’immunothérapie. Leur rôle important a été démontré dans des études chez l’animal, et des recherches chez des patients, notamment atteints de cancer du sein, suggèrent qu’elles peuvent aussi avoir un effet protecteur. Des traitements qui ciblent ces cellules sont actuellement en test, et les résultats sont prometteurs. Ces cellules sont efficaces car elles montrent aux globules blancs ce qu’ils doivent attaquer, en leur présentant des fragments de cellules cancéreuses, appelés antigènes. Elles envoient aussi des messages chimiques qui attirent d’autres cellules immunitaires vers la tumeur et les aident à mieux fonctionner. Mais certaines questions restent encore sans réponse : • Comment aident-elles les globules blancs à s’installer dans la tumeur ? • Ont-elles aussi un effet sur d’autres cellules immunitaires ? Pour y répondre, nous utilisons des modèles expérimentaux chez la souris, dans lesquels nous induisons le développement de tumeurs en injectant des cellules cancéreuses. Ces outils nous permettent de : 1. Voir si ces cellules aident les globules blancs à bien se positionner pour attaquer la tumeur ; 2. Comprendre comment elles les activent ; 3. Étudier si elles influencent aussi d’autres cellules impliquées dans la défense contre le cancer. En comprenant mieux leur fonctionnement, nous espérons contribuer au développement de traitements anticancéreux plus efficaces et mieux ciblés.

Bénéfices attendus

Notre projet identifiera à court terme chez la souris des marqueurs, groupes de gènes et mécanismes associés aux fonctions protectrices des celles dendritiques conventionnelles de type 1 contre le cancer. Leur conservation chez l’homme sera évaluée en déterminant leur valeur pronostique par réanalyse des données publiques provenant de patientes atteintes de cancer du sein. Cela pourrait nous aider à identifier de nouvelles caractéristiques des réponses immunitaires associées à une évolution plus favorable de la maladie et à mieux comprendre comment cela fonctionne. Une autre étape importante sera à moyen terme de transposer les résultats obtenus chez la souris aux cellules humaines. Pour ce faire, nous allons utiliser nos techniques de culture de cellules souches humaines, qui nous permettent de générer et de manipuler en laboratoire un grand nombre de cellules dendritiques de type 1. Ces recherches devraient nous aider à mieux comprendre comment ces cellules fonctionnent chez l’homme et comment elles peuvent être exploitées pour améliorer les traitements du cancer, notamment dans le cadre du développement de vaccins thérapeutiques basés sur l’activation optimale de la réponse immunitaire antitumorale.

Procédures

Les interventions prévues dans le cadre de ce projet se limitent à des manipulations courtes, réalisées sous anesthésie, et classées au-dessus du seuil réglementaire. Elles sont décrites ci-dessous. Les animaux recevront une ou plusieurs injections d’anticorps et/ou de cellules, effectuées sous anesthésie générale dont la durée est inférieure à une minute. Certaines souris recevront également une injection unique de cellules tumorales, réalisée sous anesthésie générale. Cette intervention, d’une durée d’environ cinq minutes. Au cours du suivi expérimental, la mesure de la taille tumorale sera réalisée de manière répétée, sous anesthésie légère. Cette manipulation, très brève (quelques secondes), permet de suivre l’évolution de la tumeur tout en limitant le stress pour l’animal.

Impact sur les animaux

L’anesthésie utilisée pour les injections dans les souris est de courte durée (5 minutes). Elle est appliquée avant des injections dans la glande mammaire ou intraveineuse. Cela peut provoquer un léger stress pendant quelques secondes. Dans de rares cas, surtout avec une certaine lignée de cellules tumorales, la taille de la tumeur peut gêner la mobilité des souris et présenter des signes d’ulcération au niveau de la tumeur..L'injection dans la veine située derrière l'œil, même sous anesthésie peut causer de la douleur legère de courte durée qui sera réduit au minimum à l’aide d’un anesthesiant local.

Devenir

Dans le but de réaliser les analyses histologiques, immunologiques et moléculaires sur les différents organes d’intérêt, la mise à mort des animaux est nécessaire afin de permettre leur prélèvement. Cette étape est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Au total, l'ensemble des animaux du projet sera concerné.

Remplacement

Ce projet nécessite de mesurer différents éléments de la réponse du système immunitaire lors de la lutte contre le cancer. Les interactions entre les cellules du système immunitaire entre elles et avec les cellules tumorales sont très nombreuses et complexes, et pour mieux les comprendre il est indispensable de les étudier dans des modèles in vivo et aucun modèle in vitro ou ex vivo disponible à l’heure actuelle ne permet d’étudier la complexité des interactions (mobilisation et activation) entre cellules dendritiques et autres cellules de l’immunité.

Réduction

Le nombre de souris pour chaque groupe et chaque procédure a été soigneusement calculé en cohérence avec les principes éthiques de réduction, c’est-à-dire pour ne pas être excessif, mais être suffisant à permettre une analyse statistique fiable des résultats, en fonction de notre expérience sur la variabilité des réponses au sein de chaque groupe expérimental et entre groupes.

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux, ceux-ci seront maintenus en groupes sociaux stables, formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Les injections de molécules ou de cellules tumorales seront réalisées sous anesthésie gazeuse de facon à limiter au maximum le stress des animaux. L’apparence des animaux et leur activité, la taille de la tumeur , seront observées quotidiennement et le poids des souris mesuré tous les 3 jours, afin de determiner un score permettant de d’identifier de manière précoce et prédictive des signes de souffrance et mettre en places de mesures correctives adéquates comme l’accès à la nourriture et à l’eau facilité grâce à la mise à disposition de gel diététique, l’ajout d’enrichissements supplémentaires pour nidation, une fréquence d’observation augmentée, ou une mise à mort précoce. L’ensemble des manipulations réalisées sur animaux vigiles (examen du site d’injection, suivi du poids) sera realisé par du personnel compétent et experimenté afin de réduire au maximum le stress lié à ces gestes.

Choix des espèces

Les souris sont le modèle idéal pour ce type d'études parce qu'elles se reproduisent rapidement, ont une taille pratique pour les expériences, et leur génétique est bien connue. Pour les recherches que nous prévoyons, il est parfois nécessaire d'utiliser des souris génétiquement modifiées. Le corps des souris fonctionne de manière assez similaire à celui des humains, ce qui permet de transposer les conaissances acquises sur le fonctionnement chez l’Homme. Des souris âgées de 8 à 15 semaines seront utilisées car elles ont un système immunitaire mature et leurs glandes mammaires sont pleinement développées. Pour éviter que des différences d’âge ne faussent les résultats, nous veillons à ce que l'écart d'âge entre les souris d'un même groupe ne dépasse pas 2 semaines.

Greffés d'un glioblastome dans le cerveau au cours d'une opération de trente minutes, 3 510 souris et 705 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, tous tués pour les prélèvements. Chaque animal peut subir jusqu'à cinquante-six injections, vingt-huit prélèvements sanguins, cinquante et une séances d'imagerie, huit ouvertures de la barrière hémato-encéphalique, une résection de la tumeur et une séance de radiothérapie, avec un transport entre deux établissements. Le porteur indique que la tumeur provoque des troubles neurologiques et des difficultés de déplacement, et que les animaux immunodéficients attrapent plus facilement des infections. Les bénéfices restent formulés comme une ambition, identifier des traitements qui pourront ensuite être évalués chez l'humain, quand les 4 215 greffes, elles, sont programmées.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales primitives et en particulier les glioblastomes sont des cancers très résistants aux traitements anti-tumoraux conventionnels (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie cytotoxique). En effet, la survie globale médiane des patients est comprise entre 12 et 24 mois. De nouveaux traitements sont donc indispensables pour améliorer le pronostic des patients souffrant de glioblastome. Les traitements candidats sont évalués dans le cadre d’essais cliniques longs et coûteux, et le plus souvent négatifs, avant leur approbation pour une utilisation en pratique clinique chez les patients. Compte tenu du nombre important de traitements candidats, notre projet vise l’accélération de l’évaluation de ces traitements innovants candidats et leur hiérarchisation en vue d’essais cliniques chez l’Homme. En effet, une évaluation préclinique rigoureuse permet de réduire le taux d’attrition des essais cliniques. Le projet se déroulera dans deux établissements en raison de la nécessité d'utiliser des appareils d'imagerie spécifiques disponibles seulement dans le second établissement.

Bénéfices attendus

Les gliomes et en particulier les glioblastomes (GBM) sont les cancers cérébraux les plus fréquents et les plus graves chez l’adulte. Le pronostic des patients souffrant de glioblastome est réservé (12-24 mois de survie médiane) malgré des traitements lourds. De nouveaux traitements sont donc nécessaires. Le projet présenté ici vise donc à évaluer de nouvelles thérapies dans un contexte le plus biologiquement pertinent grâce à nos modèles de glioblastome qui sont en quelque sorte des avatars de patients atteint de cette maladie. Ultimement, nous visons à identifier de nouveaux traitements actifs contre le glioblastome qui pourront être évalués dans le cadre d'études cliniques chez l'homme.

Procédures

Les animaux auront tous une greffe tumorale cérébrale (30minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) ou une greffe tumorale cutanée (1minute, 1x, animal anesthésié). Tous les animaux auront un suivi par prélèvement sanguin (2minutes, 28x maximum, animal vigile ou anesthésié et analgésié si l'animal est en fin de procédure) et certains par imagerie également (5minutes à 4h, 51x maximum, animal anesthésié). Certaines imageries nécessiteront un transfert d'un établissement à un autre (transfert de 10 minutes, 1 fois, animal vigile). Une partie des animaux auront également des traitements administrés par injections simples (1min, 56x maximum, animal vigile) ou par injections nécessitant une chirurgie (30min maximum, 1x, animal anesthésié et analgésié). Les administrations pourront être couplées à une ouverture de la barrière hémato encéphalique (pour que le traitement atteigne le cerveau) (1h maximum, 8x, animal anesthésié) ou à une résection tumorale (30 minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) et;ou à de la radiothérapie (10 minutes, 1 fois, animal anesthésié).

Impact sur les animaux

La greffe de cellule tumorale induit une croissance tumorale qui peut donner des troubles neurologiques ou des difficultés de déplacement. Les chirurgies pourront engendrer une douleur modérée post opératoire ainsi que des risques d’infection. Les anesthésies peuvent engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire. Les traitements pourront avoir des effets secondaires comme des diarrhées ou des inflammations aux sites d’injection engendrant une perte de poids. Les piqûres peuvent induire une douleur légère de courte durée au point d’injection. Les prélèvements sanguins pourraient induire une douleur légère de courte durée ainsi qu’un hématome. Les imageries pourront induire un léger stress chez les animaux. Certaines imageries devront être réalisées dans un autre établissement, les animaux pourront ressentir un stress lié au transport entre les deux établissements et aux changements d'environnement. Le phénotype dommageable des animaux immunodéficients ou immunodéprimés induit une sensibilité accrue aux infections.

Devenir

Pour toutes les procédures, tous les animaux sont euthanasiés à un temps défini (ie quelques jours/heures post traitement etc) ou dès qu’ils atteignent les points limites décrits afin de faire des prélèvements post mortem.

Remplacement

Chez l’Homme, les tumeurs cérébrales sont des tumeurs complexes. Il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement qui joue un rôle clé dans le comportement spontané ou sous traitement des cellules tumorales. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Il est impossible de reconstituer ce contexte (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales in vitro ; que ce soit par le biais de cultures de cellules tumorales issues de patients (PDCLs) ou bien de culture 2D ou encore 3D. Ces approches in vitro sont réalisées en amont des procédures in vivo pour justifier l'intérêt scientifique. De plus, cet environnement module la biodisponibilité d’une molécule thérapeutique au sein de la tumeur. Aussi, positionner les cellules tumorales cérébrales chez l’animal, dans un microenvironnement tissulaire et moléculaire complexe (cérébral) constitue un modèle d’étude pertinent. Ce dernier se rapproche au maximum des conditions observées chez les patients souffrant de tumeur cérébrale et chez qui les cellules cancéreuses prolifèrent dans du tissu nerveux central complexe.

Réduction

4215 animaux seront utilisés dans ce projet. Les efforts fournis afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sont: i) Seuls les composés efficaces in vitro par rapport aux traitements standards, seront testés in vivo. ii) Les cellules tumorales cérébrales greffées chez l’animal sont visibles par fluorescence ce qui permet de suivre le développement tumoral, cela évite l'euthanasie à différents temps et réduit donc le nombre d’animaux utilisé (iii) La fluorescence des tumeurs permet également de suivre l’efficacité des traitements testés en temps réel ce qui apporte une information supplémentaire à la survie. (iv) Une étude statistique détermine le nombre d’animaux nécessaire minimum pour atteindre un niveau de significativité acceptable. Cela permet de limiter le nombre d’animaux et d’éviter les études ne permettant pas de répondre à une question posée par manque de puissance statistique.

Raffinement

Durant toute la durée de leur vie, les animaux sont logés en groupe afin de favoriser leur bien-être social, l’isolement étant évité autant que possible. Cette approche groupée est cruciale, car les souris, comme de nombreux rongeurs, sont des animaux sociaux et leur isolement peut entrainer un stress psychologique et des comportements anormaux. Elles sont hébergées sur des portoirs ventilés, qui permettent une circulation d'air optimale et un environnement propre. Chaque cage est équipée d’un système d'abreuvement automatique garantissant un accès constant à l’eau et d’un approvisionnement ad libitum en nourriture, ce qui répond à leurs besoins nutritionnels et hydriques tout en permettant une gestion optimale des ressources. Le milieu de vie est enrichi avec au moins deux éléments, tels que des objets manipulables ou des matériaux permettant d'explorer et de satisfaire les comportements naturels des souris, comme le grattage, le fouissage ou la nidification. Cet enrichissement environnemental est essentiel pour prévenir l’apparition de comportements stéréotypés liés à l'ennui ou au stress et pour assurer une qualité de vie optimale tout au long de l’étude. Les animaux sont suivis quotidiennement par des vétérinaires et du personnel qualifié. Lors de procédures susceptibles de provoquer des douleurs modérées à sévères, comme des interventions chirurgicales, les animaux reçoivent une anesthésie générale appropriée et en complément, un analgésique leur est administré en préopératoire et postopératoire pour prévenir toute douleur et minimiser l'inflammation. Pour prévenir les risques d'infections des souris immunodéprimées, les animaux sont hébergés dans des cages propres avec litière, aliment et enrichissement irradiés ainsi que de l'eau osmosée pour boisson. Les injections seront toujours réduite au minimum suivant le composé testé (fréquence et volume), l'alternance des sites sera privilégiée quand cela est possible et les animaux seront anesthésiés si nécessaire pour leur bien être. Un système de points limites est mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’inconfort, tant à court qu'à long terme. Ces points limites prennent en compte des critères variés : l’observation du comportement, l'aspect général de l’animal, son niveau d'activité, ainsi que son poids corporel. Si un animal présente des signes de détresse, des mesures immédiates sont prises pour garantir son confort et sa santé.

Choix des espèces

Les souris sont choisies dans nos études thérapeutiques en raison de leur petite taille et de leur poids faible. Cette caractéristique permet l’utilisation de quantités réduites de composés cytotoxiques. De plus, ces modèles permettent l’utilisation de volumes expérimentaux limités, facilitant ainsi les études tout en respectant les principes de réduction des animaux dans la recherche. Les souches de rongeurs telles que les souris immunodéficientes sont particulièrement utiles pour leur incapacité à rejeter les cellules tumorales humaines. En parallèle, les souches immunocompétentes sont indispensables pour étudier la croissance tumorale dans un contexte immunologique complet. Les modèles animaux immunodéprimés sont utiles pour explorer l’impact d’un système immunitaire humanisé dans les réponses thérapeutiques contre les cancers. Enfin, les rats, sont choisis ici pour des scénarios nécessitant une plus grande précision chirurgicale. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 mois car le glioblastome est une tumeur de l’adulte chez l’Homme.

1 782 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Des cellules de cancer du pancréas leur sont injectées sous la peau ou directement dans le pancréas au cours d'une opération de quarante-cinq minutes, puis elles passent des séances d'IRM d'une heure et de TEP sous anesthésie avant d'être irradiées. Le porteur décrit une tumeur pancréatique qui peut gêner la prise alimentaire, une tumeur sous-cutanée qui peut se nécroser et entraver la marche, et annonce une preuve de concept transférable en clinique. Les souris qui perdent 20 % de leur poids sont mises à mort immédiatement, et les tumeurs sous-cutanées sont mesurées au pied à coulisse deux fois par semaine pour surveiller le volume à partir duquel l'animal sera tué.

Objectifs

L’un des objectifs majeurs de la recherche en cancérologie est l’amélioration de l’efficacité des traitements anticancéreux. Cette amélioration combine un meilleur ciblage de la tumeur avec une meilleure efficacité tout en limitant les dommages qu’ils peuvent causer au tissu sain (effets secondaires). Un des axes de recherche développé dans cet objectif est la fabrication de composés théranostiques (qui provient de la contraction des mots thérapie et diagnostic). Ces composés moléculaires permettent la cartographie des cellules cancéreuses dans le corps et leur traitement de façon ciblée. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des composés chimiques en cours de validation in vitro (toxicité, activation par les radiations ionisantes). Les composés les plus prometteurs, une fois injectés, sont détectés par des techniques d’imagerie (cartographie de la tumeur) puis activés par radiothérapie de façon à induire les effets thérapeutiques souhaités, tels que la destruction des cellules cancéreuses, l’activation du système immunitaire, etc ... L’action thérapeutique est donc contrôlée de façon à limiter l’impact sur les tissus sains et les effets secondaires associés à une chimiothérapie classique. Dans ce projet nous nous intéresserons particulièrement à des tumeurs solides du pancréas dont les traitements actuels sont peu efficaces. L’objectif de ce projet est donc d’étudier la biodistribution de nos composés théranostiques les plus prometteurs, de déterminer l’efficacité de leur effet thérapeutique sous radiothérapie dans des modèles de cancers du pancréas chez la souris avec pour finalité une utilisation dans le domaine clinique.

Bénéfices attendus

La grande majorité des composés activables par stimulations externes actuellement décrits dans la littérature ne permettent pas une application dans le domaine clinique. Notre projet vise à combler ce manque en caractérisant des composés théranostiques développés pour une application clinique. Ces composés représentent un outil innovant dans la recherche en cancérologie, car ils permettent à la fois une visualisation de la tumeur et une amélioration de l’efficacité de la radiothérapie. Si la preuve de concept se fera sur des tumeurs du pancréas, la non-spécificité de nos molécules pour un type de cancer donné ouvre la perspective d’une application à d’autres types de tumeurs solides. A court terme, ce projet permettra de valider ce concept innovant de traitement qui pourra par la suite être transféré en clinique.

Procédures

Dans un premier lot d’animaux, des cellules tumorales pancréatiques seront injectées en sous-cutané (durée du geste inf à 10 sec) ou dans le pancréas de souris placés sous anesthésie générale, analgésiques et antalgiques (durée du geste 45 min). La croissance des tumeurs est observée via des imageries de bioluminescence réalisées au maximum toutes les semaines (durée de l’acquisition d’image : 1 min, avec les animaux sous anesthésie générale gazeuse). Dans un second lot d’animaux sains, la toxicité des composés sera étudiée. Plusieurs formulations de composés à différentes concentrations seront injectées aux souris saines par plusieurs voies d’administrations (durée des injections inférieur à 1 min par animal, réalisé une seule fois). Dans un troisième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, des imageries seront réalisés (IRM : réalisé une seule fois, durée d’une heure par animal sous anesthésie générale gazeuse ; TEP : réalisé plusieurs fois si nécessaire avec un délai minimal de 15 jours entre chaque imagerie, durée de 10min par animal sous anesthésie générale gazeuse) afin de visualiser l’anatomie de la tumeur et caractériser son activité métabolique. Ensuite, nous ferons de prélèvements d’organes afin de doser la quantité de composé accumulée dans les organes vitaux. Dans un quatrième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, plusieurs doses d’irradiation seront testées sur différents animaux afin de vérifier la dose la plus appropriée pour nos futurs traitements (durée d’irradiation de 15 min maximum par animal, sous anesthésie générale gazeuse). Dans un cinquième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, les composés seront injectés (la formulation, la concentration et la voie d’administration seront choisies en fonction des résultats obtenus sur le 2ème lot d’animaux, la durée des injections reste inférieur à 1 min par animal) puis un traitement par radiothérapie sera réalisé (la dose d’irradiation sera choisie en fonction des résultats obtenus sur le 3ème lot d’animaux, avec une durée d’irradiation de 15 min maximum par animal). Nous étudierons ainsi l’efficacité de nos composés sur les tumeurs pancréatiques.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales comprenant des implantations tumorales peuvent occasionner des douleurs. Le développement tumoral dans le pancréas peut engendrer des difficultés dans la prise alimentaire ou encore une perte de poids. Le développement tumoral sous-cutané peut engendrer de la nécrose ou une gêne lors de certains mouvements, notamment pour la locomotion. Lors des tests de toxicité, une perte de poids peut être observée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour les analyses post-mortem

Remplacement

Avant toute étude chez l’animal, les composés théranostiques (famille appelée radioswitch) ont subi de nombreux tests préliminaires in vitro., notamment pour valider leur capacité à se fixer sur leurs cibles présentes à la surface des cellules tumorales. Ces travaux ont montré des résultats très concluants in vitro, qui nécessitent à présent d’être confirmés in vivo. En effet, il s’agit d’étudier la capacité de ces composés à se fixer sur leurs cibles lorsque les cellules tumorales sont présentes dans un organisme et également à délivrer après activation un signal conduisant à la mort de la cellule (directement ou bien grâce à l’intervention du système immunitaire)

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d’un test logrank sur logiciel G*power.

Raffinement

Pour limiter le stress des animaux, l’attention est portée sur leurs conditions d’hébergement. Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Pour limiter la souffrance des animaux, la procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale avec recours aux anesthésiques locaux et aux analgésiques. Les animaux sont également observés après les greffes afin de détecter tout signe de souffrance ou de mal être. Les animaux sont observés quotidiennement et pesés 5 fois par semaine durant la 1ère semaine suivant les chirurgies. Puis, les animaux sont observés et pesés 3 fois par semaine afin de détecter tout signe de mal être ou de détérioration de leur état durant le développement des tumeurs. Si une souris présente une perte de poids de 20% par rapport à son poids initial, elle sera immédiatement mise à mort. Les tumeurs en sous-cutanée, sont mesurées au pied à coulisse au minimum 2 fois par semaine afin de suivre leur vitesse de pousse. Nous serons particulièrement attentifs à l’atteinte du point limite éthique lié au volume de la tumeur selon le site d’implantation. Pour les tests de toxicité, les animaux sont observés et pesés 7 fois par semaine durant la 1ère semaine suivant l’injection des composés, puis ils sont pesés 3 fois par semaine. Si les animaux présentent des effets secondaires suite à l’injection des composés, les symptômes seront identifiés et traités de façon adéquat. Les irradiations ne sont pas douloureuses et sont réalisées sous anesthésie gazeuse afin d’éviter les mouvements de l’animal. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Nous serons attentifs à tout signe de mal-être tel que décrit dans la grille de score et prendrons les mesures adéquates pour arrêter la souffrance de l’animal notamment la mise en place de soins de support. En cas d’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort

Choix des espèces

La souris est le modèle communément utilisé pour les expériences menées en biologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de biodistribution / biopharmacocinétique et de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique largement utilisé pour les études impliquant des molécules et/ou de la radiothérapie ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes car les tumeurs du pancréas chez l’homme touchent quasi exclusivement l’adulte.. Les souris arriveront à l'animalerie, âgées de 6 semaines. Après une période d'adaptation de 7 jours à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 7/8 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats Des animaux adultes et ayant fini leur développement sont nécessaires auquel cas, lors des implantations, les tumeurs pourraient migrer et nos études seraient alors inexploitable.