Souris
Mécanorécepteurs: Etude du rôle en hémostase et thrombose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tuées sans jamais se réveiller pour 378 d'entre elles, 438 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, les 60 autres dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Aucune ne peut survivre au prélèvement de sang dans l'aorte, et celles qui passent par la chirurgie sont mises à mort pour éviter, selon le porteur, toute souffrance au réveil. Chaque souris subit une mesure du temps de saignement par section du bout de la queue, quarante minutes durant, ou une chirurgie de prélèvement aortique, ou une expérience de thrombose de cinquante minutes, sous anesthésie profonde. Le porteur compte comme réduction le fait de réutiliser les souris passées par le temps de saignement pour en prélever le sang, et annonce qu'il renoncera aux expériences de thrombose in vivo si les essais en microfluidique ne montrent rien.
Objectifs
Les plaquettes sanguines jouent un rôle clé dans l'hémostase pour éviter les hémorragies mais à l'inverse sont aussi responsables des thromboses artérielles. Lors de lésions ou de thromboses, les plaquettes sont activées, agrègent et forment un clou plaquettaire (hémostase) ou thrombus (thrombose), partiellement ou totalement occlusif. Les plaquettes sont les acteurs principaux des thromboses artérielles. Depuis une dizaine d'année, on sait que les forces mécaniques sont ressenties par des récepteurs spécialisés présents dans la membrane des cellules et modifient le comportement des cellules. L'objectif est de décrypter le rôle de ces récepteurs encore peu étudiés afin de trouver de nouveaux traitements pour éviter les hémorragies et prévenir les thromboses. Pour cela, nous effectuerons des expériences de thrombose sur souris génétiquement modifiées pour ces récepteurs.
Bénéfices attendus
Ces expériences nous permettront de comprendre dans quelle mesure ces récepteurs sont impliquées en hémostase normale ou en thrombose. De manière plus générale, les perspectives de ce projet sont pour l'instant essentiellement fondamentales mais le cas échéant ouvrent à terme des perspectives cliniques et thérapeutiques intéressantes pour de nouveaux traitements anti-thrombotiques ou anti-hémorragiques.
Procédures
Contention et piqûre pour les anesthésies (moins d'une minute). Mesure du temps de saignement par section de l'extremité de la queue (1 mesure par souris, durée totale 40 minutes), chirurgies pour prélèvements de sang au niveau de l'aorte (durée totale 10 minutes, 1 prélèvement par souris) et expériences de thromboses (durée totale 50 minutes, 1 expérience par souris), l'ensemble de ces procédures se faisant sur souris profondément anesthésiées.
Impact sur les animaux
Pour toutes les procédures, une complication attendue est le risque de saignement au site d’injection ou d’incision. Les piqures pour l’injection des anesthésiants entrainent une douleur légère de courte durée au point d’injection. La section de l’extrémité de la queue induit une légère douleur au réveil, de courte durée.
Devenir
Les animaux ne peuvent survivre à l'issue des prélèvements de sang en aorte. A l'issue des procédures chirurgicales, les animaux sont mis à mort pour éviter toute souffrance au réveil. De plus, ayant déjà subi une intervention cardiovasculaire, ils ne pourraient être réutilisés pour des raison de fiabilité des résultats scientifiques.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle de protéines plaquettaires dans l’hémostase et la thrombose artérielle. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle d’hémostase in vitro. Cependant, il existe des modèles de perfusion de sang dans des chambres microfluidiques qui miment partiellement les mécanismes de la thrombose artérielle. Ils seront également utilisés pour visualiser l’impact de l’inactivation des gènes dans la souris. Les processus d’hémostase et de thrombose étant particulièrement complexes et faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, protéines plasmatiques) ainsi que les conditions de flux sanguin, les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité.
Réduction
Les animaux utilisés pour les modèles de temps de saignement seront réutilisés pour le prélèvement de sang pour thrombose in vitro afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Au cas où nous n'aurions aucune différence en thrombose in vitro, nous ne ferons pas les expériences de thrombose in vivo. Nous avons utilisé des tests statistiques adaptés pour déterminer un nombre d’animaux qui nous permettra d’atteindre l’objectif de notre projet.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués : - Par l’hébergement en groupes sociaux. Les cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui permet aux souris d’organiser leur environnement selon leurs besoins. - Par une anesthésie générale de l’animal avant toutes les procédures et une analgésie adaptée à chaque procédure, maintien de l'animal sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie, l’application de gel hydratant sur les yeux pour éviter la sécheresse oculaire. - Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites, s'ils sont atteints, permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris car nous disposont de souris génétiquement modifiées avec inactivations de gènes. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, entre 8 et 18 semaines, à l'exception des expériences de thrombose sur mésentère qui nécessitent des souris de 3 semaines, au delà le dépot de graisse entraine des résultats peu fiables. Mâles et femelles seront évalués.
Evaluation de la performance diagnostique de produits de contraste IRM sur un modèle de métastases cérébrales chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
Toutes tuées à l'issue, à la fin du suivi par IRM, à un point limite ou, faute de métastase visible à six semaines, pour fournir des tissus témoins, 144 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Sous anesthésie, chacune reçoit dans le cœur une injection de cellules humaines destinée à provoquer des métastases cérébrales, puis passe de la deuxième à la sixième semaine deux séances d'IRM par semaine, d'une heure à une heure quinze chacune. Le porteur décrit des tremblements, une incoordination et des paralysies partielles, et prévient qu'au-delà de quatre semaines un envahissement massif du cerveau peut survenir, avec "un risque élevé de souffrance sévère et de décès spontané". Le projet compare un nouvel agent de contraste IRM à des produits de référence, et le porteur décrit comme "indispensable" l'absence de rejet des cellules humaines, d'où le choix de souris immunodéficientes.
Objectifs
L’imagerie IRM (imagerie par résonnance magnétique) avec administration d’un agent de contraste permet de mieux détecter de nombreuses pathologies cérébrales, notamment en cancérologie, en en rehaussant le signal de la lésion. Outre le dépistage de la maladie et la pose du diagnostic, l’IRM avec agent de contraste permet le suivi de l’évolution de la pathologie et le suivi de l’efficacité thérapeutique mise en place pour le patient. L’enjeu est particulièrement important dans la détection de métastases cérébrales où le pronostic du patient (par exemple : taux de survie à 5 ans) est étroitement corrélé au stade de développement tumoral. Un diagnostic le plus précoce possible de l’ensemble des lésions a un impact direct sur la bonne prise en charge du patient. Le nombre de tumeurs et/ou de métastases ainsi que les caractéristiques de ces lésions (infiltrantes, vascularisées…), leur localisation et l’identification de leurs marges tumorales sont d’autant d’éléments importants pour proposer le meilleur traitement au patient (chirurgie, radiothérapie ciblée, etc..). Dans cet objectif final, le projet vise à évaluer les performances diagnostiques d’un nouvel agent de contraste IRM dans la détection précoce de tumeurs et/ou de métastases cérébrales. Les agents de contraste faisant partie de la classe des médicaments injectables, il s’agira de trouver le meilleur compromis entre la nature et la dose de produit de contraste injectée et l’apport diagnostique pour le patient. Le présent projet sera conduit sur un modèle de souris reproduisant la maladie. Des produits au stade prototype ou déjà commercialisés et considérés à l’heure actuelle comme des références serviront de comparatifs. Cette étude préclinique nous permettra d’obtenir des éléments de réponse avec des paramètres quantitatifs (rehaussement de contraste, nombre et temporalité des lésions détectées) et d’estimer au plus juste la dose qui apportera le meilleur compromis entre performance de détection des lésions et réduction de l’agent de contraste administrée au patient.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous aurons une idée cliniquement pertinente de la performance diagnostique du produit testé et de la dose à administrer (comparativement à des produits de référence) pour une détection précoce des métastases cérébrales tout en proposant la dose efficace la plus faible possible (compromis entre dose de gadolinium administrée au patient et efficacité du rehaussement à détecter, caractériser et suivre l’efficacité du traitement mis en place). Nous aurons une idée précise, pour une dose donnée, si le nombre de métastases détectées est augmenté par rapport au produit de référence, si la taille minimale de détection et ou le délai d’apparition est réduit, permettant un diagnostic plus précoce, et évaluerons la facilité de délimitation tumorale. Ces résultats permettront d’éclairer les choix de la dose à tester en étude clinique dans l’objectif de mettre à disposition des radiologues un produit de contraste plus performant, en termes de détection et de précocité de détection, améliorant ainsi la prise en charge des patients et, potentiellement, leur taux de survie à 5 ans.
Procédures
Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux anesthésiés et sédatés. Le projet se déroulera en trois phases : Phase A – Mise en place du modèle expérimental Chaque animal recevra une intervention unique, d’une durée d’environ 10 à 15 minutes, visant à simuler un processus de dissémination tumorale. Cette étape sera réalisée une seule fois par animal, au début de l’étude. Phase B – Suivi par imagerie cérébrale À partir de la semaine 2 et jusqu’à la semaine 6, les animaux seront suivis par imagerie cérébrale deux fois par semaine. Chaque séance durera environ 1h à 1h15 par animal, incluant la préparation, l’installation et l’acquisition des images. Ce suivi permettra d’observer l’évolution des lésions et de comparer différents protocoles d’imagerie. Une semaine supplémentaire de suivi pourra être ajoutée selon l’état de santé des animaux. Phase C – Fin de l’étude L’euthanasie sera pratiquée : • à la fin du suivi par imagerie, • ou plus tôt en cas de problème ou selon les critères de fin d’étude.
Impact sur les animaux
L’administration de médicaments, tels que les analgésiques morphiniques ou l’anesthésie générale, chez l’animal vigile peut provoquer une douleur aiguë au moment de l’injection, ainsi qu’un stress lié à la contention. L’injection intra-cardiaque, utilisée pour l’induction du modèle, est une procédure invasive pouvant entraîner des nuisances importantes. Elle est susceptible de provoquer des douleurs transitoires, des arythmies, des lésions myocardiques, des réactions inflammatoires ou infectieuses, ainsi que des hémorragies internes. Au cours de la phase de développement des métastases cérébrales, les animaux peuvent présenter des troubles neurologiques modérés à sévères : tremblements, incoordination, paralysies partielles, apathie, diminution de la prise alimentaire, perte de poids et déshydratation. Ces signes traduisent une altération progressive de l’état général. L’imagerie par IRM, nécessitant des anesthésies répétées et prolongées, peut induire une hypothermie et une déshydratation. Ces effets sont d’intensité modérée mais peuvent s’accumuler au fil des séances, entraînant une réduction des prises alimentaires et hydriques. Enfin, au-delà de quatre semaines après l’injection tumorale, un envahissement métastatique massif du cerveau peut survenir, provoquant une dégradation rapide de l’état de l’animal, avec un risque élevé de souffrance sévère et de décès spontané.
Devenir
Les souris ayant développé des lésions métastatiques au niveau cérébral (ou dans d’autres territoires si cela arrivait) seront euthanasiées à l’issue du suivi par imagerie IRM, ou à l’atteinte des points limites. Eventuellement, le cerveau des animaux sera prélevé et une analyse histologique ou imagerie élémentaire/moléculaire de coupes cérébrales seront réalisées. Les souris n’ayant pas eu de pousse métastatique (visible en IRM) au bout de 6 semaines post-induction seront euthanasiées et des tissus prélevés pour être utilisés comme matrices biologiques témoins (vierges de certains produits) ou pour des mises au point de bioanalyses.
Remplacement
Si les paramètres physico-chimiques d’un agent de contraste peuvent être déterminés in vitro, l’ensemble des paramètres d’internalisation (entrée dans les cellules cérébrales) et d’extravasation (sortie des vaisseaux) / élimination dans une lésion tumorale sont directement dépendants des caractéristiques intrinsèques de la lésion étudiée et ne peuvent donc être évalués que sur des modèles in vivo. En effet, l’accès à celle-ci dépend directement de l’état d’ouverture de la barrière sang-cerveau et de sa localisation dans le territoire cérébral, ainsi que des caractéristiques propres à chaque lésion (perméabilité, taille, état de vascularisation, tortuosité des vaisseaux, grade, structure du tissu… etc…).
Réduction
L’étude, réalisée en cross-over (comparaison des performances diagnostiques de deux agents de contraste ou doses différents chez un même animal à 24h d’intervalle) permet de diminuer le nombre d’animaux de moitiéen permettant également d’augmenter la puissance statistique d’analyse comparative car : - Chaque lésion métastatique est son propre témoin entre deux comparaisons, permettant de comparer les deux produits sur des lésions avec exactement les même propriétés (taille, perméabilité, accessibilité, nécrose, type…) - Un animal peut présenter plusieurs métastases cérébrales augmentant ainsi le nombre de lésions métastatiques analysé sans augmenter le nombre d’animaux Enfin, selon notre retour d’expérience, le rendement d’animaux répondeur étant variable, l’étude sera réalisée par lot d’implantation de seulement n = 12 animaux à la fois, avec une phase de mise au point afin d’ajuster ce chiffre, de façon à s’approcher au plus juste de l’effectif attendu, c’est-à-dire n = 8 animaux avec lésion(s) métastatique(s) au niveau cérébral. Les animaux ne présentant pas de lésions métastatiques ni signes cliniques pourront servir de matrices biologiques en vue de mises au point d’imagerie moléculaire ou élémentaire.
Raffinement
L’implantation tumorale mise au point sous échographie évite toute ouverture de la peau au niveau du crâne, réduisant de façon importante la souffrance et favorisant la récupération de l’animal. Elle ne sera effectuée qu’une seule fois, avec un volume faible. Par rapport à l’étude antérieure, le protocole d’imagerie a été optimisé afin de réduire les temps d’acquisition des séquences IRM, permettant une anesthésie totale plus brève (de la pose de la voie intraveineuse au réveil, environ 1h contre 1h30 lors de la précédente étude), tout en conservant une bonne qualité de détection des lésions en imagerie réhaussée. D’autre part, une administration d’anti-douleur sera mise en place avant toute intervention invasive afin d’assurer une bonne analgésie. L’administration d’anti-douleur pourra être renouvelée si l’état des animaux le nécessite. Lors des anesthésies générales, les muqueuses oculaires des animaux seront protégées par du gel oculaire pour prévenir de la déshydration. Un appareil de mesure de la respiration nous permettra de suivre la profondeur de l’anesthésie qui sera adaptée en fonction de la réponse de chaque animal. Afin de lutter contre une hypothermie éventuelle, une plaque thermostatée ou un circuit d’eau chaude thermostatée passant sous l’animal seront utilisés lors des anesthésies. Lors des phases de réveil, les animaux seront placés sous lampe rouge (chauffante). Pour le suivi clinique des animaux, une grille de scoring avec différents paliers sera mise en place. Au besoin, nous consulterons un vétérinaire et des mesures seront prises : système particulier d’alimentation ou d’hydratation, analgésie supplémentaire, traitement médicamenteux, etc. Enfin, par retour d’expérience, l’étude menée en interne en 2014 a montré qu’un suivi journalier rigoureux à l’aide de la grille de scoring minimisait fortement les dommages inhérents au modèle et que l’imagerie IRM permettait de détecter les lésions cérébrales avant que celles-ci n’engendrent une souffrance animale sévère ou un décès spontané.
Choix des espèces
Le modèle murin reste le plus utilisé dans la recherche en neurologie et cancérologie et largement reconnu pour apporter robustesse et prédictivité. Les grosses métastases observées chez la souris sont très comparables (tailles, vascularisation, localisation spatiale) à de petites métastases humaines. Sa faible taille remplit tous les critères d’accessibilité pour les administrations d’agents de contraste, taille suffisante pour les implantations tumorales et analyses robustes des images acquises en imagerie IRM. L’attraction importante des cellules pour le cerveau permet qu’aucune lésion tumorale ne soit observée dans d’autres organes. Ce modèle repose sur des souris immunodéficientes, c’est-à-dire qu’elles de possèdent pas ou peu de système immunitaire fonctionnel. Cela évite le rejet des cellules humaines implantées, ce qui est indispensable pour que ces cellules puissent survivre, proliférer et former des métastases dans l’animal et qui serait impossible avec un modèle de souris ayant une immunité classique. Les animaux seront adultes (au minimum âgés de 6 semaines) au moment de l’induction du modèle. En effet, la population d’étude visée est l’adulte.
Identification des gènes bactériens du méningocoque nécessaires à la colonisation vasculaire dans un modèle murin humanisé par xénogreffe de peau.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Sévèrement immunodéficientes, donc très sensibles aux infections, les 275 souris de ce projet reçoivent une greffe de peau humaine sur le dos, à la place d'un morceau de leur propre peau. Elles vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance sévère et toutes tuées à l'issue. Après une chirurgie de trente minutes, sept jours de bandage qui gêne leurs mouvements et quatre semaines d'attente, elles sont infectées au méningocoque dans un tube de contention, et développent une septicémie qui les fait passer d'une baisse d'activité à la prostration en seize heures. Le porteur précise qu'elles ne peuvent être ni réutilisées, ni replacées, ni adoptées, parce qu'elles portent de la peau humaine et une infection.
Objectifs
Le méningocoque est une bactérie pathogène de l’homme responsable de septicémies (infections généralisées) et de méningites (infections du système nerveux). Ces infections graves sont souvent associées à des séquelles importantes, et restent parfois mortelles (10-20% des cas) malgré les traitements disponibles. Le pouvoir pathogène du méningocoque réside dans sa capacité à « coloniser » les vaisseaux sanguins humains. Après 24 à 48 heures, ce processus aboutit à la destruction du vaisseau colonisé. Nous cherchons à étudier la colonisation vasculaire, étape cruciale lors de ces infections. Nous nous intéressons notamment à deux phénomènes : aux gènes bactériens nécessaires à la colonisation vasculaire ainsi qu’à l’environnement rencontré par la bactérie lors de la colonisation. 2 objectifs imbriqués sont attendus pour ce projet : 1) L’identification des gènes importants pour la colonisation vasculaire à des temps d’infection court et long 2) La validation de ces gènes L’identification des gènes importants pour la colonisation passe par la réalisation d’une analyse des 1600 gènes non essentiels de la bacétrie après passage dans notre modèle animal. La validation des gènes importants sera réalisée via des expériences de compétition individuelle entre la souche d’intérêt et deux souches de contrôle dans notre modèle animal. Nous espérons qu’une meilleure compréhension des mécanismes d’infection permettra l’amélioration des traitements disponibles.
Bénéfices attendus
Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est à ce jour le seul et unique modèle murin permettant de reproduire chez la souris les grandes caractéristiques des infections invasives à méningocoque observées chez l’homme, à savoir la fixation et la multiplication des bactéries sur la paroi des vaisseaux sanguins, entrainant le déclenchement d’une septicémie. A court et moyen terme, ce projet nous permettra : • D’étudier les déterminants bactériens impliqués dans la mise en place du phénomène de colonisation vasculaire • De mieux caractériser l’environnement dans lequel la bactérie évolue lors de l’infection A long terme nous espérons que ce projet permettra l’amélioration des traitements des infections invasives à méningocoques chez l’homme en permettant une prise en charge précoce plus efficace.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans cette étude sont greffés avec de la peau humaine. Le greffon est implanté sur le dos de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale d’une durée d’environ 30min réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux portent un bandage pour protéger le greffon pendant 7 jours. Une fois les bandages enlevés et au minimum 4 semaines après l’implantation du greffon, les animaux seront utilisés dans 1 type d’expériences : des expériences où les animaux sont infectés par l’injection de bactéries. Les injections se feront sur des animaux vigiles placé dans un tube de contention pendant 2min. Les animaux sont infectés pendant 6 ou 16 heures puis une ponction de sang. La souris est immobilisée pendant 2 minutes.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des différentes procédures expérimentales présentes dans ce projet : • du fait de leur degré d’immunodéficience sévère, ces animaux sont très sensibles aux infections • le retrait d’une petite partie de la peau du dos pour la remplacer par de la peau humaine est une chirurgie qui entrainera une douleur modérée pendant quelques jours. • La présence de bandages maintenus pendant 7 jours pour protéger le greffon et favoriser sa prise entraineront une gêne et une mobilité réduite. • Lors des expériences d’infection par le méningocoque, les animaux infectés par l’injection de bactéries développent une septicémie entrainant progressivement une baisse de leur activité (0-6h post-infection) allant jusqu’à leur prostration (6h-16h post-infection) et la survenue du décès de l’animal (plus de 24h post-infection). L’introduction de l’aiguille lors de l’injection entraine une douleur légère de courte durée. Nos procédures ne dépasseront pas 16h post-infection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils sont greffés avec de la peau humaine et infectés par le méningocoque.
Remplacement
Du fait de la spécificité du méningocoque pour les cellules humaines, la majorité des études portant sur cette bactérie utilise des cultures in vitro de cellules humaines infectées, sur lesquelles la bactérie peut se fixer. Il est cependant encore impossible de reproduire in vitro la complexité et dynamique du système vasculaire et son interaction avec le système immunitaire. Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est le seul à ce jour à fournir ce niveau de complexité et représente donc un modèle de choix pour l’étude des infections invasives à méningocoque.
Réduction
Le calcul des effectifs des groupes d’animaux de cette étude s’est fait sur la base du retour d’expérience d’une précédente étude où nous avons pu identifier plusieurs causes potentielles de perte d’animaux lors de nos expériences, ainsi qu’avec l’expertise de biostatisticiens : 1. Une mort prématurée lors de la chirurgie de greffe de peau : hémorragie, non réveil de l’animal 2. Une mauvaise évolution du greffon au cours du temps conduisant à l’exclusion de l’animal : lésions de grattage, diminution importante de la taille 3. Une mauvaise qualité du greffon : présence de peu de vaisseaux humains 4. Une mort prématurée de l’animal lors des infections Une étude pilote sera réalisée sur 5 animaux, pour optimiser la technique de séquençage. Une étude pilote sera également mise en place pour confirmer la taille du goulot d’étranglement, afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour le projet. Cette étude repose sur 10 souris utilisées dans une procédure sévère d’infection du modèle murin. Les 1600 gènes non essentiels sont testés pour le criblage par groupes de 400 souches bactériennes, en raison des limitations de notre modèle animal. La variabilité technique conduit à ce qu’une souche bactérienne se retrouve dans le sang dans 80% des cas. Nous pouvons estimer que le nombre nécessaire d'animaux est de 80 par groupe. La procédure nécessite donc un effectif total de 160 animaux, afin de mesurer des effets de taille forts à très forts. Concernant la validation individuelle des gènes candidats établis précédemment, nous supposons ici que les effets à chercher sont forts. Pour un gène candidat, 5 souris seront suffisantes. Nous estimons que 10 gènes bactériens apparaitront comme nécessaires à la colonisation bactérienne, après le criblage haut débit. Cela nous conduit donc à estimer pour cette procédure un effectif total de 50 animaux. Toutes les procédures conduisant à la mise à mort des animaux, aucune des procédures ne permet la réutilisation d’animaux.
Raffinement
Souris immunodéficientes Les animaux immunodéficients étant considérés comme ayant un « phénotype dommageable », ceux-ci seront hébergés dans une animalerie au statut sanitaire adapté. Xénogreffe de peau humaine : Utilisation d’antalgique avant la chirurgie. La chirurgie (~30 min) est réalisée sur des animaux anesthésiés, et les animaux placés sur un tapis chauffant (37°C) pour éviter la baisse de leur température corporelle. Avant de placer les animaux greffés dans leur cage de réveil, ceux-ci sont réhydratés par une injection de sérum physiologique. Les animaux sont ensuite placés dans une cage de réveil, propre et placée sous une lampe chauffante. Un gel de réhydratation enrichi en sucres est placé dans la cage pour favoriser leur récupération. Un traitement antalgique est fourni aux animaux pendant 5 jours après la chirurgie. Si des signes de souffrance persistent 2 jours après la chirurgie malgré le traitement (poils hérissés, changements d’expressions faciales, abattement, perte d’activité …), les animaux sont mis à mort. Les animaux sont évalués quotidiennement les 5 premiers jours suivant la chirurgie pendant le port de leur bandage afin de détecter des signes éventuels de souffrance et vérifier l’intégrité des bandages protégeant le greffon. Si l’animal a détérioré son bandage sans léser le greffon, le bandage est refait sous anesthésie. Si l’animal a détérioré son bandage et lésé le greffon de peau humaine, l’animal est mis à mort. Une fois le bandage enlevé, l’évolution des greffons est suivie hebdomadairement pendant 4 semaines. Infection par le méningocoque : Les animaux infectés ont ensuite placés dans des cages contenant des gels de réhydratation enrichi en sucres et dont la moitié du sol de la cage est chauffé à l’aide de chaufferettes pour aider au maintien de la température corporelle des animaux infectés. Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérience. Hébergement : Les animaux ayant subi une xénogreffe de peau humaine sont hébergés au nombre de 4 maximum par cage dans des cages contenant du coton et un igloo.
Choix des espèces
Cette étude utilise des souris car le système vasculaire de la souris est proche du système vasculaire humain. De plus les modèles immunodéficients disponibles chez cette espèce en font le modèle le choix pour la xénogreffe de peau humaine. Les greffes de peau humaine sont réalisées chez des souris adultes immunodéficientes âgées de 6 à 12 semaines, période pendant laquelle la prise du greffon est maximisée selon nos observations. Les expérimentations sont ensuite réalisées 4 semaines minimum après la chirurgie, période nécessaire à une bonne prise du greffon.
MODIFICATION Effet d’un traitement par exposition au plasma froid sur un modèle de carcinogenèse prostatique murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
96 souris génétiquement modifiées pour développer un cancer de la prostate vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. À six mois au moins, avec un carcinome installé, elles subissent une ouverture de l'abdomen de dix minutes et l'exposition de leur prostate antérieure à une torche à plasma froid, ou à un jet d'hélium pour les témoins, puis sont gardées sept jours avant d'être tuées. L'enjeu déclaré est le traitement des marges chirurgicales lors des prostatectomies robotisées chez l'humain, un domaine que le porteur présente comme une aire de développement technologique de premier plan. Il écrit que les organoïdes et tumoroïdes permettent "de ne pas recourir à l'expérimentation animale", et conclut dans la même rubrique que la souris reste "indispensable".
Objectifs
Le projet est basé sur l’intérêt de l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale (ablation de la prostate) chez des patients présentant un cancer localisé. Il existe aujourd’hui plusieurs appareillages pour le traitement focalisé d’une tumeur mais sans prostatectomie (Ultrasons, lasers, radiothérapie etc.). En revanche, l’utilisation de module spécifique pour le traitement des marges chirurgicales au cours de la prostatectomie est très limitée et encore exploratoire. De plus, la très large majorité des prostatectomies sont aujourd’hui réalisées par assistance robotisée sous coelioscopie. Cette technologie connaît un essor exponentiel et constitue une aire de développement technologique de premier plan dans la chirurgie de la prostate. L’opportunité de traiter avec une source plasma constitue donc une approche nouvelle qui nécessite d’être évaluer in vivo avant tout transfert technologique vers la clinique. La torche à plasma froid est constitué́ de deux électrodes entourant un tube de quartz dans lequel est injecté de l'hélium. Des pics de tension sont appliqués, transformant l'hélium et l'air environnant en plasma (mélange d'ions, de radicaux et d'électrons). Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par plasma sur un modèle de cancer de la prostate induit chez des souris transgéniques. Une étude pilote sur un modèle de souris ayant subi une greffe de cellules tumorales dans la prostate nous a permis d'identifier les paramètres de fonctionnement de la torche à plasma in vivo. Ainsi, deux paramètres seront étudiés, i) l’effet spécifique du plasma comparé à de l’hélium non excité et ii) l'impact du milieu d’imprégnation du tissu pendant son exposition au plasma. Les zones de traitement seront analysées par des approches histologiques et moléculaires. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude pilote sera conduite permettant de vérifier la pertinence du traitement par plasma froid.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à caractériser in vivo l'effet d'une exposition d'un tissu tumoral à une source de plasma froid. Nous souhaitons ainsi obtenir, sur ce modèle préclinique, des informations sur le type de lésions engendré: apoptose? nécrose? inflammation? et la profondeur tissulaire atteinte. Ces résultats ont une valeur importante et capitale pour envisager un transfert vers la clinique humaine. Un projet vient d'être accepté dont l'exploration fonctionnelle sur ce modèle vivo fait parti. Par ailleurs, nous avons montré, ex vivo, que le milieu d'imprégnation des cellules tumorales est un paramètre important. Nous allons donc testé 2 milieux caractéritique pour tester l'efficacité de la torche in vivo : un milieu phosphate buffer saline (PBS 1X) de formulation très simple et un milieu de culture plus complexe adapté à la croissance des cellules tumorales prostatiques (RPMI1640).
Procédures
Les animaux subiront une laparotomie et un traitement par plasma froid de la prostate antérieure ou un traitement control (expostion jet Helium). L'ensemble de la procédure opératoire dure en moyenne 10 minutes +/- 2minutes. Les animaux seront maintenus en hébergement pendant 7 jours avant leur mise à mort et le prélèvement des tissus d'interêt. Les animaux pourront être pris en charge par un traitement anti-inflammatoire AINS le cas échéant par injection intraperitonéale. Cette injection, contention de l'animal comprise, durera environ 15 secondes.
Impact sur les animaux
Les potentiels effets indésirables sont attendus comme plutôt mineures puisque que le traitement est localisé à la prostate antérieure qui ne constitue pas un organe essentiel à la survie de l'animal. Par ailleurs, la procédure de traitement de la prostate par laparotomie est une procédure exécutée en routine par l'équipe et dont les suites post-opératoires sont completement connues et maitrisées. Toutefois, il est possible que le traitement par le plasma conduisent à une réponse inflammatoire du tissus prostatique. Grâce au suivi renforcé, nous surveillerons les points limites en terme de mal être ou de souffrance qui conduiraient à l'utilisation d'un traitement anti-inflamatoire si cela s'avérait nécessaire.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés et prélevés pour analyse du tissu prostatique traité.
Remplacement
La caractérisation des effets du plasma sur les tissus tumoraux sera complétée par des expositions sur des organoïdes et des tumoroïdes permettant ainsi de ne pas recourir à l'expérimentation animale. Ces experiences conduites in vitro permettent de calibrer des paramètres critiques (tension, débit helium, temps d'exposition...) du jet plasma sur des modèles intermédiaire entre culture 2D et modèle vivo. Cette approche permet dans une certaine mesure d'anticiper la réponse in vivo. Pour autant, l'utilisation sur le modèle souris est indispensable pour valider cette technologie sur organisme mammifère entier et envisager un transfert vers la clinique humaine.
Réduction
Ce projet d'exposition au plasma froid fait suite, d'une part, à des travaux réalisés en culture cellulaire qui ont permis de caractériser les paramètres d'utilisation de la torche à plasma froid, et d'autre part, à une expérimentation pilote sur un modèle de greffes orthotopiques intra-prostatiques. Ainsi, toute une partie du projet a été réalisé sur des modèles cellulaires en remplacement du modèle vivo et permet de limiter l'utilsation de l'animal à des conditions expérimentales que nous avons définies au préalable ex vivo. Concernant le nombre d'animaux utilisés pour l'étude, il est justifié pour assurer une puissance statistique suffisante pour l'exploitation des résultats et paramètres biologiques.
Raffinement
Le traitement par plasma froid d'un tissu vivant reste une procédure exploratoire, dont les conséquences restent à établir. Ainsi l'emergence potentielle de mal être ou souffrance de l'animal sera étudiée grâce à un suivi renforcer (visites 2x par jour). Si nécessaire les animaux pourront recevoir un traitement anti-inflammatoire. Enfin, les cages seront soumis à un enrichissement renforcé : cage individuelle avec tube carton et pad-fibre.
Choix des espèces
Modèle de souris transgénique invalidé pour l'oncosuppresseur PTEN. pas d'équivalent dans d'autres espèces adaptées à l'étude. Nous utiliserons de souris agées au moins de 6 mois qui permettront de traiter un carcinome de prostate installé. (Cinétique de carcinogenèse très largement décrite dans la littérature et maitrisée par l'équipe de recherche).
Environnement et prédisposition génétique : Rôle sur la mise en place des circuits neuronaux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Injection dans l'utérus de femelles gestantes après ouverture de l'abdomen, injection déclenchant une naissance prématurée, transfert des nouveau-nés prématurés à une mère adoptive, anesthésie de souriceaux sur la glace, chirurgie stéréotaxique de deux heures sur adultes : 4 185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur prévoit des saignements vaginaux, des mises bas prématurées difficiles et le rejet possible des petits par la mère adoptive. Le projet cherche comment une inflammation pendant la gestation ou une naissance prématurée perturbent la construction du cerveau, croisées avec des risques génétiques de troubles neuropsychiatriques. Il annonce des procédures "établies afin de limiter la douleur, l'angoisse ou le stress", après avoir décrit un protocole qui provoque délibérément des naissances prématurées et sépare des nouveau-nés de leur mère.
Objectifs
L’objectif de notre projet est de mieux comprendre la mise en place d’un organe complexe tel que le cerveau des mammifères. En effet, il a été montré que des défauts de son développement, contribuent à l’étiologie de plusieurs maladies neurologiques et psychiatriques (troubles du spectres autistique, schizophrénie ou troubles bipolaires). Il apparaît donc essentiel mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent le développement du cerveau. En particulier nous voulons comprendre comment des changements environnementaux au cours du développement (inflammation pendant la gestation et chez le juvénil, naissance prématurée ou absence de cellules immunitaires embryonnaire) perturbent l’élaboration du cerveau. De plus, nous analyserons l'impact additif, convergent ou synergique des perturbations environnementales avec des risques génétiques associés aux troubles neuropsychiatriques. Notre projet vise à déterminer le lien entre environnement et prédisposition génétique sur la mise en place du cerveau chez la souris. En combinant la génétique de la souris avec un ensemble d’outil d’analyses biologiques disponible nous souhaitons comprendre comment la naissance prématurée ou les fonctions immunitaires au cours de la gestation provoquent des perturbations pouvant causer de défauts de développement du cerveau associés à des pathologies.
Bénéfices attendus
Les maladies neuropsychiatriques trouvent souvent leur origine dans des perturbations du développement du cerveau, notamment au cours de périodes critiques allant de la vie prénatale à l'adolescence. Cette complexité provient d'une combinaison de facteurs génétiques et d'influences environnementales incluant des perturbations immunitaires (inflammations) lors des étapes cruciales du développement ou une naissance prématurée. Des études ont montré qu’une grande prématurité et des perturbations immunitaires modifient non seulement directement le développement, mais ont également un impact sur les cellules immunitaires du cerveau. De plus, nous analyserons l'impact additif, convergent ou synergique des perturbations environnementales avec des risques génétiques qui ont été identifiés dans divers troubles neuropsychiatriques chez l’homme. Ainsi, comprendre comment des perturbations gène/environnement impact sur les processus développementaux entourant la naissance et sur la formation du cerveau représente un intérêt majeur de santé publique.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à différents gestes techniques selon les questions scientifiques : 1) Chirurgie sur femelle gestante analgésiées et anesthésiées pour procéder à une injection in utero de molécules dans des embyrons (20 minutes). 2) Injection unique sur femelle gestante ou animal juvenil vigiles d’une solution induisant une inflammation (quelques secondes). 3) Injection unique sur femelle gestante vigile d’une solution permettant d’induire une naissance prématurée par voie basse (quelques secondes). 4) Adoption de nouveaux nés prématurés par une mère adoptive issué d’un autre croisement. 5) Injection répétée quotidiennement d’une substance permettant de moduler les niveaux de sérotonine dans des nouveaux nés (quelques secondes). 6) Anesthésie sur glace et injections de marqueurs neuronaux sur souriceaux (environ 10 min). 7) Chirurgie sur animaux adultes analégésiés et anesthésiés pour injections stéréotaxiques de traceurs axonaux (max 2h).
Impact sur les animaux
Les contentions nécessaires à la réalisation d'une injection peuvent induire un stress chez les animaux, principalement en raison de la manipulation et de la restriction physique temporaire imposées. Ce stress, bien que transitoire, peut perturber le comportement normal des animaux et provoquer des réactions physiologiques liées à l’anxiété. De plus, elles peuvent engendrer une douleur légère de courte durée consécutive à l’introduction de l’aiguille ainsi que la possibilité de saignement. L’anesthésie peut quant à elle provoquer des effets secondaires comme : un stress thermique, une hypotension ou une détresse respiratoire. Plus spécifiquement : 1) La chirurgie requise sur femelle gestante analgésiée et anaesthésiée pour l’injection in utero de molécules peut avoir un impact sur i) le déroulement de la gestation des femelles en provoquant des saignements vaginaux ou au site d’incision abdominale ; ii) sur le développement des embryons conduisants à des mises bas prématurées et des difficultés de mise bas. 2) Les injections sur femelle gestantes pour déclencher une naissance prématurée ou sur nouveaux-nés pour moduler la sérotonine peuvent engendrer un stress lié à la contention, provoquer un léger saigenement au site d’injection. 3) Le transfert de nouveaux nés prématurés à une mère adoptive peut engendrer un stress chez les petits ou chez la mère pouvant conduire à une reget de celle-ci. 4) Les injections de molécules inflammatoires sur femelles gestantes ou animal juvenile peuvent engendrer un stress lié à la contention, un léger saigenement ainsi qu’une réaction inflammatoire transitoire au site d’injection. 5) Les chirurgies requisent pour es injections de traceurs axonaux i) chez les nouveaux-nés, peuvent provoquer des saignements au point d’incision et d’injection ; ii) chez l’adulte, nécessite une chirurgie de l’animal analgésié sous anesthesie gazeuse qui peut conduire à des effets secondaires lié à l’anesthesie (stress thermique ou respiratoire) ainsi qu’à des saignements au site d’incision.
Devenir
L'ensemble des animaux impliqués dans ce projet (4185) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites. Pour l'ensemble du projet, les cerveaux des souris seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques, immunohistochimiques ou transcriptomique.
Remplacement
L’étude des interactions des gènes et de l’environnements dans l’élaboration cerveau en cours de développement nécessite impérativement l’utilisation d’un organisme complet. Ce processus dépend en effet d’une multitude de signaux corporels qui influencent directement le comportement des cellules et leurs interactions avec le tissu. Des signaux hormonaux, immunitaires, de tensions des tissus, de la circulation sanguine, de l’environnement de la mère ou des neurones en développement. Ces processus, hautement coordonnés, ne peuvent être reproduits ni par des systèmes de culture (in vitro), qui présentent des limitations spatiales et temporelles, ni par des organoïdes, qui manquent de la diversité et des interactions cellulaire nécessaires. Les simulations informatiques, quant à elles, se limitent aux molécules bien caractérisées et ne permettent pas d’étudier les mécanismes encore largement inconnus qui régissent les phases précoces de développement du cerveau. De plus, nos travaux s’inscrivent dans la continuité de nos recherches antérieures. L’utilisation d’un modèle mammifère in vivo est indispensable pour observer ces mécanismes dans leur environnement physiologique
Réduction
Un total de 4185 animaux sera nécessaire à la réalisation de ce projet. Notre projet est conçu pour minimiser le nombre de souris utilisées tout en garantissant des résultats scientifiquement robustes. La taille de chaque stade d’analyse a été optimisée pour pouvoir utiliser le test statistique approprié et obtenir des résultats statistiquement fiables. En effet, à cause des variabilités inter-animal et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Ainsi, grâce à notre expérience préalable dans des projets similaires, nous avons déterminé que 8 animaux (4 de chaque sexe) constituent la taille optimale par groupe expérimental. Cela équilibre le besoin de robustesse statistique et la réduction du nombre d'animaux. Les procédures expérimentales ont été établies pour éviter l’utilisation inutile de souris. De plus, après le sevrage des souriceaux, les mères non traitées pourront être réutilisées dans de nouveaux accouplements. Enfin, dans nos différentes conditions expérimentales, si un résultat n’est pas concluant lors de la première analyse (immunohistochimie), alors les autres expériences prévues ne seront pas réalisées. Cette stratégie contribue significativement à la réduction du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les mesures de raffinement qui seront mises en œuvre sont liés aux aspects des procédures et concernent l’établissement de points limites, l’hébergement et l’enrichissement de l’environnement des souris. Nous réduirons au maximum l’inconfort ces souris car les procédures que nous mettons en œuvre sont établies afin de limiter la douleur, l’angoisse ou le stress. Nous appliquerons des soins et ou actes nécessaires. Durant les procédures, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux et des séances d’habituation à la manipulation des animaux pourront être anticipées afin de limiter le stress de contention lors des injections. Nous examinerons le comportement et l’apparence des souris ayant subi une procédure ou dont la mère aura subi un traitement pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté. La présence de points limites définis et adaptés pour chacune des procédures nous permettra de détecter toute souffrance chez la souris. En cas d’atteinte de points limites et de souffrance grave ne pouvant être traitée, l’animal sera immédiatement retiré du projet et euthanasié sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie, si l’expérimentateur n’est pas joignable. Les animaux sont hébergés dans des conditions respectant la réglementation en vigueur : hébergement en surpression, portoirs avec des cages ventilées individuellement, stabulation en nombre limité par cage, eau et nourriture à volonté, change litière et biberons hebdomadaires, vérification quotidienne, température et hygrométrie contrôlées, intensité et durée d’éclairage définies, enrichissement du milieu : papier kraft, coton et maison en carton. L’ensemble des procédures seront toujours réalisées par des personnes formées et compétentes.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de laboratoire largement utilisées pour étudier le fonctionnement du corps et les effets de ses dysfonctionnements à différents niveaux, que ce soit au niveau du comportement, du fonctionnement physiologique ou des organes. Elles sont également essentielles pour créer des modèles qui nous aident à mieux comprendre certaines maladies humaines. Leur grande similarité génétique avec l'homme, combinée à la possibilité d'utiliser un grand nombre de souris modifiées génétiquement, en fait un excellent choix pour répondre à nos questions de recherche. En outre, leur cycle de reproduction rapide et leur petite taille facilitent leur gestion tout en permettant d’étudier une espèce ayant un développement proche de celui des humains. La courte période de gestation des souris, ainsi que le nombre élevé d’embryons, nous permettent de générer suffisamment d'animaux pour mener plusieurs expériences à partir de quelques parents seulement. Dans le cadre de nos recherches en cours et pour tirer parti des outils génétiques disponibles dans notre laboratoire, nous continuerons à utiliser ce modèle de souris. Dans le cadre de notre projet, les animaux seront utilisés à différents stades de développement, adaptés aux objectifs expérimentaux spécifiques allant de l’embryon jusqu’à l’adulte. Ainsi, les cerveaux seront analysés à 2 stades embryonnaires, en fin de gestation, stades critiques pour l‘élaboration du cerveau. Les cerveaux des souriceaux seront étudiés à diiférents stades après la naissance, des périodes critiques pour la maturation du cerveau. Enfin, les souris juvéniles et adultes seront utilisées pour explorer la persistance et les conséquences à long terme Ce choix stratégique garantit une compréhension globale des processus allant de la formation fœtale à la maturation et au maintien des circuits dans des contextes normaux et pathologiques.
ATOPID : impact d’un déficit immunitaire sur la dermatite atopique et la marche atopique, Etude de la marche atopique chez les souris DOCK8-/-
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
Anesthésiées quinze minutes, rasées, la peau du dos abrasée au ruban adhésif, 360 souris reçoivent chaque jour pendant quatorze jours un patch chargé d'ovalbumine, la protéine de l'œuf. Une partie d'entre elles porte l'inactivation du gène DOCK8, qui altère leur système immunitaire et sert ici à modéliser un eczéma d'enfant. S'ajoutent un gavage oral et un isolement de vingt minutes pour la récolte des fèces, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, avec démangeaisons, rougeurs, œdème, lésions de grattage et inflammation possible de l'œsophage. Toutes sont tuées à la fin, organes et fluides prélevés pour mesurer les biomarqueurs de l'eczéma et de l'allergie alimentaire, et "valider nos modèles".
Objectifs
Les déficits immunitaires monogéniques sont des maladies génétiques induisant une altération du fonctionnement du système immunitaire (susceptibilté aux infections, auto immunité, cancers, allergies) Les déficits immunitaires avec allergie désignent une sous-catégorie de déficits immunitaires primitifs rares associés à des manifestations allergiques (eczéma, allergies alimentaires, asthme). Sur les 500 déficits immunitaires répertoriés, environ 50 gènes liés aux déficits immunitaires avec allergie ont été décrits, les plus fréquents incluent le déficit en STAT3 (syndrome de Job-Buckley), DOCK8, WAS, et IPEX . Outre les allergies, les déficits immunitaires avec allergie se manifestent par des infections potentiellement graves, des maladies auto-immunes, cancers, retards de croissance et anomalies osseuses et du tissu conjonctif. Ces déficits restent souvent sous-diagnostiqués, surtout lorsque les signes se limitent à une manifestation allergique isolée sans infection. Le retard diagnostique peut avoir des conséquences importantes sur le pronostic de ces patients en retardant une prise en charge adaptée (antibioprophylaxie, greffe) et en aggravant éventuellement le risque infectieux. L’eczéma associé aux déficits immunitaires avec allergie semble souvent précoce mais ses caractéristiques cliniques et sa physiopathologie sont mal connus. En particulier, les différences entre l’eczéma associé aux deficits immunitaire et l’eczema classique ne sont pas connues ainsi que les différences concernant la survenue d’autres manifestations allergiques (asthme, allergie alimentaire, marche atopique= survenue successive de manifestations allergiques au cours du temps : eczema, asthme, allergie alimentaires). Une meilleure connaissance de la l'eczema associé aux deficits immunitaires permettrait un diagnostic plus précoce des deficits immunitaires avec allergie (en particulier au sein de la population atteinte d'eczema) et une meilleure compréhension des mécanismes de la marche atopique dans les déficits immunitaires et l'eczema atopique. L’objectif de ce projet est de déterminer si le deficit immunitaire impacte la sévérité et la physiopathologie de l'eczéma et de la survenue d'allergie dans un modèle murin DOCK8 -/-.
Bénéfices attendus
Nous espérons mettre en évidence les caractéristiques cliniques, les mécanismes fondamentaux et les biomarqueurs associés à l’eczéma associé aux déficits immunitaires, ainsi que la sévérité et l'évolution des manifestations allergiques associées (allergie alimentaire, marche atopique). Cela permettra de mieux identifier les enfants atteints de déficit immunitaire, de les dépister plus précisément, et de faciliter une prise en charge plus ciblée (traitements systémiques ciblés, allogreffe de moelle).
Procédures
Anesthésie (15 min), rasage (5 min), tape striping (1 min) application journalière pendant 14 j, d’un patch contenant l'allergène de l'oeuf (ovalbuline) (5 min) isolement pour la récolte des feces (20 min) gavage oral (2 min)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont la gêne liée la présence d’un patch sur le dos qui peut induire des grattages, les symptômes liés à la mise en place de la DA (démangeaisons, rougeurs, oedème et lésions de grattage), les anesthésies gazeuses peuvent induire une hypothermie, une hypotension, une hypoventilation ou une hypoxémie, les gavages oraux peuvent induire une inflammation de l’œsophage
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'expérimentation. Leurs organes et fluide biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de l'eczéma atopique ou de l'allergie alimentaire et ainsi de valider nos modèles.
Remplacement
Dans le cadre de l’étude de l'eczéma atopique (DA), il est impossible de reproduire efficacement in vitro les symptômes cutanés mais aussi les interactions très complexes entre les systèmes biologiques notamment lorsqu’il s’agit des interactions entre le microbiote cutané, le système immunitaire et les barrières épithéliales (peau, intestin, poumon).
Réduction
En effectuant un test de puissance , nous avons besoin de 12 animaux par groupes afin d’obtenir un score de sévérité de la DA (three item severity score (TIS) statistique et avoir assez de matériel biologique pour effectuer des coupes histologiques et des mesures des biomarqueurs immuns de la DA dans la peau et dans le serum. De plus, ce nombre d'animaux permettra d'obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d'analyses statistiques .
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 3-4 souris par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Les interventions ( rasage, tape stripping et patch) seront réalisées sous anesthésies. L’évaluation des points limites sera réalisée quotidiennement tout au long de l'étude et est basée sur la présence de signes cliniques notables et sévères . En présence de 3 signes cliniques notables ou 1 seul signe clinique sévère, le responsable service du bien être animal et le responsable de l’étude analyseront l’animal et prendront la décision de laisser l’animal au sein du protocole en accord avec la cellule du bien-être animal ou de procéder à la mise à mort de l'animal
Choix des espèces
Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur l'eczéma atopique en raison de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques clés de la maladie humaine, notamment les altérations de la peau, les réponses inflammatoires de type 2, et les déséquilibres du microbiote cutané. Ces modèles permettent d’explorer les mécanismes immunologiques et moléculaires impliqués dans le développement et l’aggravation de l'eczema, tout en offrant un système contrôlé pour tester l’efficacité et la sécurité de nouvelles approches thérapeutiques. De plus, les souris sensibilisées avec des allergènes spécifiques permettent d’étudier les liens complexes entre les facteurs environnementaux, la génétique, et les réponses immunitaires. Les souris seront âgées de 4 semaines comme décrit dans les modèles de la littérature. Cela correspond à un âge jeune de la souris, similaire à l'eczema chez l’enfant qui peut apparaitre dès les premiers mois de vie.
Effet des métabolites microbiens sur la réponse immunitaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Sept jours d'antibiotiques dans l'eau de boisson, puis pour une partie des souris sept jours d'un agent qui déclenche une colite, plus un gavage quotidien pendant 7 à 19 jours et deux à trois prises de sang sur animal éveillé. 10 711 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, 8 246 dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger et 2 465 modéré. Certaines lignées transgéniques employées font des prolapsus rectaux en vieillissant, un point que le porteur signale sans le rattacher à la gravité déclarée. Ce chiffre de 10 711 ne repose sur aucun calcul présenté, mais sur "notre expérience de plus de 15 ans d'utilisation des modèles en question".
Objectifs
Le microbiote intestinal (ensemble des micro-organismes hébergés au sein de l’intestin) participe à la physiologie, au métabolisme et à la réponse immunitaire de l’hôte, via notamment la production ou la modification de petites molécules, appelées métabolites. Des travaux ont montré que la production de ces métabolites est altérée chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Ces métabolites sont présents ensemble dans la lumière intestinale, où ils peuvent interagir les uns avec les autres et avec les cellules hôtes. Nous souhaitons décrypter l’effet propre et combiné de certains métabolites du microbiote in vivo afin de mieux comprendre la dynamique de la réponse immunitaire et les métabolites impliqués. Ce projet permettra également de mettre en évidence de nouvelles connexions entre microbiote et santé et ouvriront des perspectives pour de nouvelles thérapies. Nous analyserons l’effet des métabolites soit en les administrant aux animaux soit en bloquant leur production à l’aide inhibiteurs. Ces expériences seront d’abord réalisées chez des souris commerciales puis dans les lignées transgéniques déjà disponibles. Nous testerons également les effets des métabolites et des inhibiteurs en condition inflammatoire.
Bénéfices attendus
Ce projet représente un programme de recherche complet et ciblé sur le métabolisme dans le contexte de la santé et des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). En France, les MICI concernent aujourd’hui près de 300 000 personnes (données 2021). L'approche que nous proposons est complètement nouvelle et basée sur des découvertes concernant le rôle des certains métabolites dans les processus inflammatoires. Notre approche est basée sur la modulation de certaines voies métaboliques, perturbées dans les maladies inflammatoires, afin de restaurer la production normale de métabolites anti-inflammatoires tout en diminuant la production de métabolites pro-inflammatoires. Ce projet multidisciplinaire intègre plusieurs facettes de l'immunité et métabolisme. Les études décrites dans le projet devraient améliorer notre compréhension des mécanismes délétères impliqués dans les MICI tout en identifiant une nouvelle stratégie thérapeutique utilisable chez les patients atteints de maladie inflammatoire de l’intestin.
Procédures
Au cours de ce projet, les souris seront impliquées dans un traitement antibiotique administré via l’eau de boisson (prise spontanée) sur une période de 7 jours. A l’issue des 7 jours de traitement antibiotique, une partie des animaux sera soumise à une colite expérimentale mimant les aspects des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Les animaux seront exposés à un agent dans l’eau de boisson pendant 7 jours puis replacé en eau standard durant 5 jours (prise spontanée). En parallèle, les animaux recevront une ou plusieurs molécules à tester par administration oral quotidienne durant 7 à 19 jours (animal vigile, moins de 30 secondes). Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraiches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état métabolique des souris, les animaux subiront 2 à 3 prélèvements de sang maximum (espacé au minimum de 7 jours) effectué sur animal vigile par simple contention par une personne formé avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.
Impact sur les animaux
Les modèles de souris transgéniques utilisés présentent un phénotype altéré pouvant impliquer une baisse de la fertilité, une taille réduire, une sensibilité accrue aux infections et pouvant provoquer des prolapsus rectaux au cours du vieillissement. Le traitement antibiotique mis en œuvre avant l’administration des molécules à tester peut induire une diminution transitoire de la prise hydrique en raison de la néophobie de la souris. De plus, ce traitement pourrait induire quelques désordres intestinaux pouvant conduire à des selles plus liquides que la normal. Les molécules à tester seront administrés par voie orale pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. La répétition des administrations orales peut induire des irritations ou des microlésions. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus liée à l’inflammation intestinale (perte de poids, selles molles, etc.). On peut estimer que son intensité sera légère à modérée au maximum. Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraiches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons deux à trois prélèvements sanguins pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire, d’une part afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques (sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie) et d’autre part parce qu’ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés du fait de leur modification génétique.
Remplacement
Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. Nous avons réalisé au préalable un criblage de 220 métabolites sur des lignées cellulaires in vitro. Ces expériences nous ont permis de sélectionner 15 métabolites pour les tests in vivo. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait indispensable.
Réduction
Ce projet impliquera un maximum de 10711 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Les productions d’animaux seront adaptées en fonction des expériences à mener et des capacités de traitement par les personnels concernés afin d’éviter toute surproduction. Les expériences seront menées de manière séquentielle pour permettre de réduire le nombre de conditions en sélectionnant systématiquement les conditions de traitement les plus intéressantes avec des résultats significatifs en utilisant le moins d’animaux. Si cela est possible, nous mutualiserons les conditions contrôles permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux impliqués. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que si les résultats vont dans le sens de l’hypothèse de travail et que la puissance statistique n’est pas encore atteinte. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. La principale contrainte dans le cadre de ce projet est liée à la colite induite expérimentalement et aux signes cliniques qui y sont associés. Néanmoins, nous disposons d’une très grande expérience de ce type de modèle et assurons un suivi quotidien associés à un scoring de la sévérité de la colite permettant une prise de décision immédiate en cas d’aggravation des symptômes. La colite dans ce projet est estimée à modérée compte-tenu des points limites mis en œuvre. Les lignées de souris transgéniques utilisées sont plus sensibles au niveau gastro-intestinal. Afin de réduire les risques d’inflammation supplémentaires, les animaux sont hébergés dans des conditions exemptes d’organisme pathogène spécifique (matériel stérile, manipulation sous hotte, procédures strictes, etc.). De plus, nous appliquons une surveillance accrue dans les accouplements afin de limiter les risques d’extériorisation du rectum (possible notamment chez les femelles parturientes). Pour les administrations, nous utilisons du matériel adapté (petite taille) afin de réduire aux maximum la contrainte. L’ensemble des actes sont parfaitement maitrisés et sont effectuées par un personnel formé et autorisé.
Choix des espèces
Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en nutrition, infectiologie et immunologie qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris commerciales non transgéniques et des lignées transgéniques d’intérêts. Justification des stades : Les animaux seront traités aux antibiotiques entre 6 et 12 semaines de vie. Cet âge est couramment utilisé dans la littérature pour les traitements antibiotiques et les modèles de colites. Le choix de l’âge entre 6 et 12 semaines de vie étant courant dans la littérature, nous souhaitons utiliser des conditions qui permettent une reproductibilité et une comparaison avec les études précédemment publiées.
Evaluation de l’efficacité de nouveaux dispositifs médicaux sous forme de crèmes sur la cicatrisation de plaies cutanées chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Pour comparer trois crèmes brevetées à un placebo et à une crème de pharmacie, 50 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une plaie leur est ouverte sur le dos sous anesthésie et maintenue ouverte par un anneau de silicone posé autour, pour empêcher la peau de se contracter. Pendant trois semaines, chacune vit seule en cage, anesthésiée trois fois par semaine le temps d'être photographiée et traitée, jusqu'à cicatrisation complète. Un point limite atteint fait mettre l'animal à mort avant la fin de l'étude, sans que le porteur précise lequel.
Objectifs
Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants liés à la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo chez la souris de nouveaux dispositifs médicaux sous forme de crèmes qui seront appliqués directement sur les plaies cutanées. Des études effectuées sur modèles cellulaires et modèles de peau reconstruite ont permis de démontrer des activités pro-cicatrisante et anti-inflammatoire des principes actifs sélectionnés qui composeront les 3 formulations de crème à évaluer. Ce projet constituera la toute première évaluation sur un modèle de plaie cutanée chez la souris de ces formulations sous forme de crème, en comparaison avec un placebo et une crème de référence disponible en pharmacie. Les traitements débuteront dès la fin d’induction des plaies cutanées et seront effectués jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. A l’issue de l’étude, des analyses biologiques seront effectuées sur le sang, la peau cicatrisée et des organes vitaux. Les résultats de ce projet permettront de sélectionner la ou les formulations de crème ayant la meilleure efficacité pour en poursuivre leur développement préclinique et envisager par la suite un développement clinique afin de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de plaies cutanées chroniques.
Bénéfices attendus
La cicatrisation des plaies cutanées est un phénomène naturel de reconstruction de la barrière cutanée mais si les plaies sont mal soignées, cela peut aboutir à des complications. La cicatrisation cutanée fait intervenir différentes phases qui entrainent la disparition de la lésion et le remplacement des cellules atteintes par des cellules saines. Les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les plaies chirurgicales, les ulcères du pied chez le diabétique, les ulcères veineux… représentent un fardeau pour les patients, les professionnels de la santé et les systèmes de soins de santé, affectant plus de 40 millions de patients et induisant des coûts d’environ 50 milliards d’euros annuellement, et avec un taux de mortalité plus élevé que dans la population générale, pouvant atteindre jusqu’à 20% en fonction de la pathologie considérée. Il est donc très important de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements ou de développer de nouveaux dispositifs médicaux sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de ces plaies, surtout les plaies chroniques. Nous allons donc évaluer l’efficacité de nouveaux dispositifs médicaux expérimentaux brevetés se présentant sous forme de crème, tout d’abord sur un modèle de plaie simple, dans la perspective de réalisation par la suite d’études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques chez la souris saine et diabétique. Ces nouveaux dispositifs médicaux pourraient ainsi à terme, être utilisés chez l’Homme, pour le traitement de plaies cutanées chroniques qui ne cicatrisent pas ou très difficilement.
Procédures
Les 50 souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos et la pose d’un anneau en silicone pour éviter la contraction de la plaie cutanée, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 15 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis réitéré après si nécessaire. Les plaies cutanées, protégées par un pansement de couverture, seront observées, photographiées et traitées 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète, sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Un maintien des souris en cage individuelle est nécessaire après induction des plaies cutanées et traitement de celles-ci, pendant 3 semaines, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles l’anneau en silicone, le pansement de couverture et les sparadraps protégeant les plaies cutanées et permettant le maintien des traitements au contact de celles-ci, mais avec un enrichissement de leur milieu pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes ouvertes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les souris d’un même portoir. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous traitement analgésique et anesthésie générale profonde à la fin de l’étude et avant euthanasie des animaux, en 2 minutes environ.
Impact sur les animaux
L’induction d’une plaie cutanée et la pose d’un anneau en silicone, effectuées sous couverture analgésique et anesthésie générale en 10 minutes environ, peut induire une souffrance mais limitée dans le temps. L’hébergement en cage individuelle des souris est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles l’anneau en silicone, le pansement de couverture et les sparadraps protégeant les plaies cutanées et permettant le maintien des traitements au contact de celles-ci. Cet hébergement en cage individuelle des souris, pendant une durée de 3 semaines maximum, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.
Devenir
Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 50 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiées et des prélèvements de peau, au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, et d’un ensemble de tissu et d’organes, seront effectués pour réaliser des analyses biologiques.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’effectuer l’ensemble des analyses envisagées et d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études in vitro sur cultures cellulaires et à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle de plaie cutanée chez la souris ayant montré des effets importants de traitements sur la cicatrisation (surface des plaies cutanées notamment). Des analyses statistiques des résultats obtenus seront réalisées à la fin de l’étude.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire), ainsi que lors de chaque traitement effectué. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 3 fois par semaine lors de chaque observation des plaies cutanées et lors de chaque traitement lorsqu’il aura lieu. En cas d'atteinte d'un point limite, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les souris seront hébergées dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des petites briques de bois, des carrés de papier absorbant et une balançoire seront placés dans chaque cage de souris comme dispositifs d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes ouvertes permettra de maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les souris d’un même portoir.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille ne nécessitant pas l’utilisation d’un gros volume de formulation très coûteuse à produire, de sa facilité de manipulation, et du modèle de plaie cutanée validé dans cette espèce qui pourra être utilisé pour la poursuite de ce projet avec des études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques chez la souris saine puis diabétique. Les animaux seront de jeunes souris mâles et femelles âgées de 6 semaines et d’un poids de 18-20 g à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines et d’un poids de 20-22 g pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge et au poids de souris utilisées lors de précédentes études sur ce modèle de plaie cutanée ayant donné des résultats significatifs.
Production d’anticorps monoclonaux chez la souris
- Production de routine
- Tests réglementaires
Produire des anticorps thérapeutiques pour les chiens et les chats, et des réactifs de laboratoire au passage : 1 250 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque souris reçoit quatre injections sous la peau en quatre points, éveillée, puis une injection dans l'abdomen ou la veine de la queue, et jusqu'à neuf injections si elle ne répond pas au bout de quatre, avec un risque de nodules qui peuvent éclater et se nécroser. Le sang est prélevé en cours de route à la mâchoire ou à la queue, puis en terminal dans le cœur sous anesthésie, avant une mise à mort par dislocation des cervicales. Selon le porteur, les alternatives comme le phage display ou les bibliothèques synthétiques restent d'une diversité "artificielle", et l'immunisation d'animaux vivants demeure une étape "nécessaire".
Objectifs
L’objectif principal du projet est de générer de nouveaux anticorps thérapeutiques en médecine vétérinaires pour les animaux de compagnie. En effet, les anticorps thérapeutiques représentent une avancée majeure en santé humaine depuis plusieurs dizaines d’années et commencent à être de plus en plus utilisés en médecine vétérinaire. Ils permettent une approche ciblée pour des maladies complexes, ils vont agir sur des cibles moléculaires très précises, limitant ainsi les effets secondaires. Le projet vise à développer de nouveaux traitements répondant à des besoins médicaux non satisfaits, à l’aide d’anticorps thérapeutiques qui cibleront des voies de signalisation bien définies afin de limiter les effets secondaires. Un objectif secondaire sera de générer des anticorps et serums polyclonaux pour des réactifs de laboratoire afin de réaliser des analyses pour une meilleure compréhension des indications ciblées.
Bénéfices attendus
La finalité de ce projet est de développer des traitements vétérinaires innovants, qui présenteront une meilleure efficacité thérapeutique associé à un risque minimal d’effets secondaires. Ces nouveaux traitements permettront d’améliorer significativement la qualité de vie et longévité des animaux de compagnie en leur offrant des solutions mieux adaptées à leur besoins cliniques. Par ailleurs, les analyses réalisées avec des réactifs générés lors de ce projet contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les pathologies ciblées.
Procédures
Les animaux auront tous les actes suivants : Si animaux immunisés après les 4 premiéres injections : - Injection sous cutanée en 4 points : 4 injections animaux vigiles. Pour chaque injection temps inférieur à 1 minute - Prise de sang intermédiaire soit en submendibulaire soit à la veine de la queue : 1 animaux vigiles. Pour chaque prélévement temps inférieur à 1 minute - Injection intraperitonéale ou veine de la queue : 1 injection animaux vigiles. Pour chaque injection temps inférieur à 1 minute - Prise de sang terminale sur animaux anesthésiés en intracardiaque. Pour chaque prélévement temps inférieur à 1 minute - - Euthanasie sur animaux anesthésiés par dislocation des cervicales Si animaux immunisés ne présentant pas de réponse après 4 injections : - Injection sous cutanée en 4 points : 9 injections animaux vigiles. Pour chaque injection temps inférieur à 1 minute - Prise de sang intermédiaire soit en submendibulaire soit à la veine de la queue : 2 prélèvements sur animaux vigiles. Pour chaque prélévement temps inférieur à 1 minute - Injection intraperitonéale ou veine de la queue : 1 injection possible animaux vigiles. Pour chaque injection temps inférieur à 1 minute - Prise de sang terminale possible sur animaux anesthésiés en intracardiaque. Pour chaque prélèvement temps inférieur à 1 minute - Euthanasie sur animaux anesthésiés par dislocation des cervicales
Impact sur les animaux
L’administration d’un produit et les prélèvements sanguins peuvent occasionner un stress et une douleur chez l’animal. En fonction de l’adjuvant utilisé une possible apparition de nodules caséeux aux points d’injections sans perte de mobilité de l’animal peuvent apparaitre. Si ces nodules devaient entrainer une perte de mobilité et/ou un éclatement avec nécrose une euthanasie sera réalisée. En cas d’éclatement des nodules sans nécrose des soins locaux seront mis en place selon les recommandations du vétérinaire désigné. Une perte de poids pourrait être observée en cas de boost répétés. Une apathie de moins de 24 heures pourrait être observé en fonction de l’antigène.
Devenir
Les animaux font l’objet d’un prélévement sanguin terminal et sont euthanasiés en fin d’étude. De plus des prélèvements post-mortem sont nécessaires. Dans des cas exceptionnels en cours d’étude si des animaux atteignent des points limites ils seront euthanasiés
Remplacement
L’immunisation d’animaux vivants et notamment de souris est une étape nécessaire car elle permet de générer une réponse anticorps hautement spécifiques et fonctionnels. L’immunisation permet de déclencher une réponse immunitaire complète dans un contexte physiologique. Le schéma d’immunisation s’appuie sur la répétition d’injection de l’antigène ce qui favorise la sélection naturelle des lymphocytes B produisant des anticorps de plus en plus spécifiques. Cette sélection est orchestrée par la système immunitaire dans les centres germinatifs des organes lymphoïdes tels les ganglions ou la rate grâce à des hypermutations somatiques et la maturation d’affinité. Actuellement, ces mécanismes ne peuvent pas être totalement reproduits in vitro. La spécificité et l’affinité sont des critères cruciaux, notamment pour les applications thérapeutiques car elles conditionneront l’efficacité du traitement tout en minimisant les effets secondaires. Bien que des alternatives comme le phage display ou les bibliothèques synthétiques soient disponibles et utiles dans certains contextes, elles présentent des limitations importantes. La diversité des bibliothèques synthétiques, bien que vaste, reste artificielle et ne reflète pas la complexité et diversité du système immunitaire naturel. De plus, les anticorps issus d’animaux immunisés présentent une stabilité et une capacité de reconnaissance des conformations natives des antigènes, souvent supérieures à celles obtenues par des méthodes in vitro. L’utilisation de ces méthodes alternatives sera envisagée lorsque les anticorps recherchés ne nécessitent pas une haute affinité ou une reconnaissance dans un environnement physiologique complexe.
Réduction
Il a été défini que 5 souris par groupe étaient nécessaires afin de pouvoir être sûr d’avoir au moins 4 souris qui répondent à l’immunisation. Une diminution du nombre de souris par groupe entrainerait un risque d’invalidation d’une étude. Différentes souches de souris étant testées à chaque étude en cas d’absence de réponses sur 3 études avec le même antigène une souche pourra être abandonnée (réduisant ainsi le nombre d’animaux par études). Dans le cadre d’évaluation de nouvelles souches de souris il sera possible très occasionnellement de faire une étude avec plus de 5 animaux par groupe. En fonction de leur réponse le nombre d’animaux par groupe pourra être réduit à 3 animaux
Raffinement
Pour chaque protocole une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Des points limites spécifiques sont mis en place et appliqués. Les conditions d’hébergement mis en place sont là pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe. Une pesée hebdomadaire sera réalisée afin de surveiller la perte de poids possible. Après chaque vaccination et après la prise de sang intermédiaire il est envisagé de mettre un complément alimentaire/hydrique pour le bien-être des animaux et en cas de difficultés à récupérer après un acte technique. Ensuite dans chaque cage sera mis en place un enrichissement spécifique des souris qui pourront être des nids, des igloos, etc… Les animaux seront sous la responsabilité du vétérinaire désigné qui pourra intervenir à tout moment en cas de soin à réaliser.
Choix des espèces
Le modèle murin permet d’avoir une réponse spécifique à un antigène d’une autre espèce. Il permet donc de ne pas avoir recours à l’espèce cible et de produire une grande diversité d’anticorps. Ce modèle animal permet aussi une facilité de manipulations. La production d’anticorps monoclonaux chez la souris est un modèle de référence largement reconnu dans la bibliographie. La procédure est réalisée sur des animaux sevrés (dès 21 jours). Les caractéristiques de ces animaux sont bien connues car communément utilisés à partir de cet âge (bibliographie, données fornisseurs agréés)
Evaluation de l’efficacité thérapeutique d’un agoniste ocytocinergique, le LIT-002, dans des modèles de douleur neuropathique et de dépression induite par le stress chronique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie du nerf à la cuisse pour 140 souris, dix injections de vincristine en deux semaines pour 140 autres, 21 jours de contention, de suspension et de chocs pour les 210 dernières : 490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. La souffrance déclarée est modérée pour 280 d'entre elles et sévère pour 210. Le porteur mesure ensuite leurs réactions par des tests de retrait de la patte, de préférence entre espace clair et sombre et de nage forcée, pour évaluer un composé ciblant les récepteurs de l'ocytocine face à la duloxétine, la prégabaline et la fluoxétine. Il décrit ces contraintes comme de "petits stresseurs" et des "chocs très légers", et avance que les souris "pourraient donc être soulagées de leurs symptômes douloureux".
Objectifs
Ce projet de recherche préclinique vise à caractériser les effets thérapeutiques d’un nouveau composé ciblant les récepteurs de l’ocytocine dans des contextes pathologiques pertinents. Plus précisément, il s’agit d’évaluer son potentiel analgésique dans deux modèles murins de douleur neuropathique (chimio-induite et lésionnelle), ainsi que son potentiel antidépresseur dans un modèle de dépression induite par un stress chronique variable. Les effets de ce composé seront comparés à ceux de traitements de référence déjà utilisés en clinique (duloxétine, prégabaline, fluoxétine).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité d’un nouveau candidat thérapeutique dans des pathologies à fort impact clinique et sociétal : les douleurs neuropathiques chroniques et la dépression. Il pourrait ouvrir la voie à l’utilisation de nouvelles approches pharmacologiques ciblant le système de l’ocytocine comme alternative ou complément aux traitements actuels.
Procédures
Les animaux de ce projet participeront à différentes interventions : • Douleur neuropathique pour 140 d'entre eux: une petite chirurgie est réalisée sur la cuisse de l’animal sous anesthésie (environ 30 minutes) pour provoquer une légère douleur similaire à celle observée après certaines atteintes nerveuses. Après une semaine de récupération, les animaux sont suivis régulièrement avec des tests simples et non invasifs (par ex. réaction de retrait de la patte à une stimulation légère). • Douleur liée à la chimiothérapie pour 140 animaux : les animaux reçoivent un traitement par vincristine, un médicament anticancéreux connu pour causer des douleurs nerveuses. Dix injections sont administrées sur deux semaines (deux séries de 5 jours, séparées par une pause de 2 jours). Les réactions nociceptives sont mesurées chaque jour avec des tests courts (5 à 20 minutes). • Stress chronique pour les 210 autres: pendant 21 jours, les souris sont soumises à différents petits stresseurs (contention, suspension, chocs très légers), chacun durant environ une heure. À la fin, leur comportement est évalué avec 4 tests (par ex. préférence pour un espace lumineux ou sombre, nage forcée), réalisés sur 4 jours consécutifs. Les traitements sont donnés chaque jour sous forme liquide, que les animaux apprennent à boire spontanément au bout d’une micropipette. Cela évite de les contraindre et réduit le stress. Enfin, à la fin de l’étude, certains animaux sont profondément anesthésiés pour un prélèvement de tissus (système nerveux) afin de réaliser des analyses scientifiques.
Impact sur les animaux
Les souris pourront ressentir des douleurs nerveuses, provoquées soit par une petite chirurgie sous anesthésie, soit par l’administration répétée d’un médicament anticancéreux (vincristine). Ces douleurs peuvent durer plusieurs semaines. Dans un autre modèle, les animaux seront exposés à des situations de stress pendant 21 jours afin de reproduire des symptômes de type anxieux ou dépressif. Pour évaluer ces symptômes, les souris seront soumises à des tests comportementaux courts (3 à 20 minutes), réalisés une ou deux fois par jour au maximum, sur plusieurs semaines selon le modèle. Des limites précises sont établies pour arrêter immédiatement la procédure si un animal présente des signes persistants de souffrance. L’objectif de ce projet est de tester un nouveau traitement qui pourrait soulager à la fois la douleur chronique et les troubles anxio-dépressifs. Les animaux pourraient donc être soulagés de leurs symptômes douloureux et/ou anxio-dépressifs.
Devenir
Toutes les procédures : Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des analyses post-mortem des tissus nerveux.
Remplacement
Le remplacement par des méthodes in vitro ou in silico n’est pas envisageable dans ce projet. Les comportements de douleur, anxiété ou dépression nécessitent l’observation de l’animal vivant et vigile dans un contexte environnemental contrôlé.
Réduction
Toutes les expériences seront menées en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaire pour garantir la fiabilité scientifique des résultats. Pour cela, des calculs ont été réalisés à partir de données déjà obtenues afin de déterminer combien d’animaux sont indispensables, sans excès. Chaque souris sera testée sur plusieurs comportements, ce qui permet de recueillir un maximum d’informations avec un même individu. Dans les modèles de douleur, 10 animaux par groupe et par sexe suffisent pour obtenir des résultats fiables. Dans le modèle de stress chronique, où tous les animaux ne développent pas les mêmes symptômes, il est nécessaire d’avoir jusqu’à 15 animaux par groupe et par sexe afin d’assurer une analyse statistique robuste.
Raffinement
Les souris seront hébergées collectivement dans des cages enrichies avec du coton pour la nidation et des bâtonnets de bois à ronger, afin de favoriser leur bien-être. Avant le début des expériences, elles bénéficieront d’une période d’habituation aux manipulations et aux dispositifs expérimentaux, y compris aux tests comportementaux, ce qui permet de réduire leur peur et leur stress. Pendant toute la durée du projet, les animaux seront observés quotidiennement pour vérifier leur état de santé. Lors des chirurgies, ils seront placés sous anesthésie, installés sur un tapis chauffant et protégés par un gel ophtalmique. Après l’opération, ils retrouveront leur cage d’origine, avec un accès facilité à la nourriture et à l’eau. Les traitements seront administrés par une méthode volontaire : les souris boiront une solution appétente au bout d’une micropipette, ce qui évite les injections et réduit fortement le stress. Les tests comportementaux réalisés sont courts et espacés dans le temps afin de limiter la fatigue et la contrainte pour les animaux. Enfin, si de nouvelles méthodes moins invasives apparaissent au cours du projet, elles seront adoptées après validation avec la Structure Bien-Être Animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle largement utilisé en neurosciences et dans l’étude de la douleur. Ses systèmes biologiques sont proches de ceux de l’humain, ce qui permet de tirer des conclusions transposables aux maladies étudiées. Elle présente aussi l’avantage de disposer de nombreuses données de référence et de lignées bien caractérisées, ce qui facilite la comparaison avec d’autres travaux scientifiques. Les animaux utilisés seront des adultes (8 semaines, > 20 g), stade nécessaire à la maturité comportementale.
Évaluation du métabolisme des nucléotides chez les modèles de souris de maladies mitochondriales knock-out Parl, Ttc19 et Ndufs4
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Les 96 souris de ce projet portent l'inactivation d'un gène qui les rend malades : dégénérescence du cerveau, parésie des membres postérieurs, dos voûté, difficultés à respirer, cécité, perte des compétences motrices. Le préjudice principal, le porteur le reconnaît, tient aux symptômes de cette maladie construite et non aux gestes expérimentaux, la procédure elle-même durant moins de cinq minutes sous anesthésie terminale. Elle est déclarée d'un niveau de souffrance léger. Les souris sont tuées entre cinq et six semaines, au moment où apparaissent les troubles locomoteurs et la perte de poids, pour prélever plusieurs tissus d'un coup.
Objectifs
L'objectif du projet est de comprendre comment et dans quelle mesure le bon fonctionnement des nucléotides (composant de notre ADN) est maintenue lorsque la production de l'énergie est défaillante dans les cellules des modèles murins de maladies mitochondriales humaines. L'objectif ultime est de comprendre les causes de la diversité des symptômes dans les maladies mitochondriales.
Bénéfices attendus
Ce projet aborde une question très fondamentale sur les maladies mitochondriales : comment les cellules et les organes affectés par les maladies mitochondriales font-ils face au dysfonctionnement de la production d'énergie dans les cellules pour maintenir le bon fonctionnement des nucléotides ? Comprendre les systèmes de régulation mis en place, ainsi que les réponses cellulaires sous-jacentes est essentiel pour comprendre les maladies mitochondriales et développer des thérapies. Ce projet apporte également de nouvelles connaissances sur la diversité des symptômes spécifiques des maladies mitochondriales en évaluant le fonctionnement des nucléotides de manière globale dans les tissus symptomatiques et asymptomatiques de plusieurs modèles de souris différents.
Procédures
Des échantillons de tissus seront collectés sur chacunes des souris expérimentales inconscientes sous anesthésie terminale. Chaque animal sera soumis à une seule procédure d'une durée de moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les souris dites Knock Out (KO) modélisent des maladies mitochondriales car leur ADN a été modifié pour inactiver un gène essentiel au bon fonctionnement des cellules. Le principal préjudice attendu pour ces animaux est lié aux symptomes de leur maladie. Ces symptomes sont les suivants : une dégénérescence du cerveau, des troubles locomoteurs, une parésie des membres postérieurs, un dos voûté, des difficultés à respirer et une perte de poids,une neuropathie légère, une intolérance à l’effort, un retard de croissance, une léthargie, une perte des compétences motrices et une cécité. Lors de l’anesthésie, l’isoflurane peut provoquer une irritation des voies respiratoires et un inconfort pendant quelques secondes avant la perte de conscience.
Devenir
Le projet nécessite une collecte terminale des échantillons. Pour cela, les 96 animaux utilisés dans le projet seront mis à mort.
Remplacement
De nombreuses manifestations des maladies mitochondriales ne sont pas reproduites dans les modèles cellulaires in vitro. De plus, la plupart des maladies mitochondriales affectent des cellules qui ne se divisent plus plutôt que des cellules en prolifération, ce qui rend les expériences in vitro significatives difficiles. Néanmoins, chaque fois que cela est justifié, nous utilisons des modèles non animaux pour les expériences.
Réduction
En collectant les échantillons à partir de souris sous anesthésie terminale, nous pouvons prélever plusieurs tissus sur le même animal tout en minimisant les altérations , ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires. Avec une collecte d’échantillons post-mortem standard, nous ne pourrions prélever qu’un seul tissu par souris, avec une qualité compromise pour la quantification des nucléotides. Dans la mesure du possible, nous utiliserons des tissus archivés issus d’études antérieures afin d’éviter le recours à de nouvelles souris expérimentales. Nous suivons des protocoles optimisés et standardisés pour les tests biochimiques afin de minimiser la variation technique et le nombre de souris nécessaires.
Raffinement
Nous suivrons les meilleures pratiques en matière de manipulation des animaux afin de minimiser le stress. Afin d'améliorer les conditions de vie des animaux, les cages sont agrémentées de cabanes, tunnels et de morceaux de bois à ronger. De plus pour les animaux à phénotype dommageable, la nourriture sera placée au sol et des tétines de biberons longues seront installées afin de leur en faciliter l'accès. Le suivi régulier des animaux mis en place et l'application d'un score interne au laboratoire pour déterminer les points limites permettra de réduire les souffrances des animaux.
Choix des espèces
Les modèles murins (= souris ou rat) appropriés existent déjà et reproduisent les maladies humaines étudiées. Les souris possèdent des organes similaires à ceux des humains, contrairement à d'autres organismes. Nos protocoles sont optimisés pour les échantillons de souris. Il n’existe aucune justification pour l’utilisation de modèles animaux plus grands. Des souris adultes jeunes seront utilisées pour les expériences. Toutes les souris seront euthanasiées à l’âge de 5-6 semaines , lorsqu'elles commencent à présenter des troubles locomoteurs et une perte de poids. L’objectif est de collecter des données pertinentes pour caractériser la maladie. L’évitement des stades plus avancés vise à minimiser les souffrances inutiles des souris malades.
Evaluation de l’effet des antidépresseurs sur l’épilepsie des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
270 souris génétiquement modifiées pour développer la maladie d'Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie de 90 minutes leur implante des électrodes crâniennes, puis leur activité cérébrale est enregistrée en continu pendant 15 à 25 jours, seules en cage, sous antidépresseurs administrés dans l'eau de boisson ou par injection pendant 10 à 20 jours. Le porteur suspecte qu'une partie de ces molécules aggrave les crises d'épilepsie et indique qu'elles pourraient provoquer des crises sévères ainsi qu'une atteinte précoce des points limites. Il qualifie l'isolement prolongé d'"indispensable" à la conduite des enregistrements et écrit être dans l'"obligation" d'utiliser un modèle murin qui "ne peut donc être remplacé par aucun autre modèle".
Objectifs
Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui développent la maladie d’Alzheimer (MA) et des activités épileptiques. Nous étudierons les effets de 3 antidépresseurs sur les activités épileptiques présentes chez nos souris. Pour cela, nous utiliserons des techniques d’enregistrement continu de l’activité cérébrale par électroencéphalographie. Compte tenu des connaissances actuelles sur les mécanismes d’action des antidépresseurs et de nos travaux antérieurs, nous suspectons un effet aggravateur de certains anti-dépresseurs et un effet protecteur pour d’autres sur l’activité épileptique dans le cadre de la MA. Notre projet pourrait, à long terme, permettre de limiter la survenue de l’épilepsie chez les patients atteints de la MA en remplaçant les traitements antidépresseurs aggravateurs par d’autres traitements ayant des bénéfices au moins similaires mais non responsables de l’accélération du déclin cognitif.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de déterminer si certains antidépresseurs exacerbent les activités épileptiques présentes chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer et si d'autres antidépresseurs ont un rôle protecteur vis-à-vis de ces mêmes activités. Ainsi, si notre hypothèse se vérifie, ce projet justifiera la mise en place d’études cliniques permettant de tester cette hypothèse chez les patients. A long terme, ce projet pourrait donc permettre de mieux adapter les traitements et ainsi apporter un bénéfice considérable aux patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA) en évitant de majorer leur épilepsie.
Procédures
Les animaux anesthésiés et analgésiés auront une chirurgie (d'une durée maximale de 90 minutes) pour la pose d’électrodes afin de réaliser des électro-encéphalogrammes. Les encéphalogrammes des animaux seront réalisés en continu pendant 15 à 25 jours. Les anti-dépresseurs seront administrés par voie orale en les mélangeant à l’eau de boisson ou injectés durant 10 à 20 jours.
Impact sur les animaux
La chirurgie est susceptible d’induire une douleur modérée au stade post opératoire durant 24-48 heures. L’isolement des animaux au cours des enregistrements électrophysiologiques durera 15 à 25 jours : ceci peut induire un stress modéré. Cet isolement est indispensable à la conduite des enregistrements. Habituellement, les évènements épileptiques des souris modèles de la MA sont essentiellement des pointes isolées qui surviennent pendant le sommeil et ne sont pas associées à une modification comportementale. Mais l’administration chronique de certains antidépresseurs pourraient exacerber ces activités épileptiques et provoquer des crises d'épilepsie sévères et ainsi provoquer une atteinte précoce des points limites. Les pesées peuvent entrainer un stress léger de quelques dizaines de secondes. Le génotypage des animaux pourra entrainer une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en vue d'analyses histologiques.
Remplacement
Le projet a pour objectif d’évaluer les effets des antidépresseurs couramment utilisés en clinique sur l’épilepsie dans la maladie d’Alzheimer (MA). L'épilepsie comme la dépression dépendent d'interactions qui se font entre différentes régions cérébrales au sein de larges réseaux, qui ne peuvent pas, à l'heure actuelle, être mimées dans de simples cultures cellulaires. Une approche par modélisation informatique des interactions entre maladie d'Alzheimer, épilepsie et antidépresseur ne pourra se faire que sur la base de données expérimentales qui ne sont que parcellaires pour le moment. Ainsi, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle murin de la MA qui ne peut donc être remplacé par aucun autre modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe (n = 12 à 16) a été déterminé sur la base de nos études antérieures de l’activité épileptique des souris modèles de la MA, de sorte à avoir une puissance statistique suffisante pour les analyses nécessaires aux comparaisons intergroupes (4 différents traitements) et intragroupes (comparaisons entre chacun des 10 à 20 jours de traitement à la baseline).
Raffinement
Avant le début des enregistrements, les souris sont habituées à la présence de l’expérimentateur grâce à trois séances de manipulation de 10 minutes chacune. Si leur état semble se détériorer, une grille d’évaluation est utilisée pour décider de la conduite à tenir. Deux situations nécessitent une vigilance particulière : La chirurgie, qui peut entraîner douleur ou inconfort. Pour limiter cela, les animaux reçoivent un traitement analgésique avant l’opération, sont maintenus sous anesthésie générale pendant toute la durée de l'intervention, et un anti-inflammatoire est administré à la fin puis le lendemain de la chirurgie. Leur état est contrôlé chaque jour pendant les deux semaines suivant l’intervention. L’isolement lors des enregistrements EEG est nécessaire pour éviter que les souris ne rongent les câbles ou ne se perturbent entre elles. Comme un isolement prolongé peut nuire au bien-être, sa durée est réduite au maximum (15 à 25 jours, alors que la plupart des études sur le sujet imposent jusqu’à 5 semaines).
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer. Cette lignée reproduit de nombreuses caractéristiques de la pathologie observées chez l’humain : plaques amyloïdes, déclin cognitif progressif et activités épileptiques, entre autres. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour l’étude des effets des antidépresseurs sur l’épilepsie dans la MA. Les animaux seront inclus dans le protocole à l’âge adulte, entre 3 et 5 mois. A cet âge, les souris modèles de la MA sont à un stade précoce de la maladie d’Alzheimer mais présentent déjà des activités épileptiques qui ne progressent pas avec l’âge.