Souris

Nourries pendant douze semaines avec une alimentation dont 60 % des calories proviennent des graisses, 142 souris mâles sont rendues obèses avant même le début du protocole. Elles sont ensuite hébergées seules en cage, pesées soixante fois, traitées jusqu'à cent douze fois, saignées douze fois après des jeûnes de quatre à six heures, et soumises à des mesures de force d'agrippement. Le porteur reconnaît que l'isolement constitue une nuisance pour une espèce sociale et que l'obésité réduit leur capacité de mouvement, avant la mise à mort sous anesthésie et le prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le composé testé vise à contrer la fonte musculaire provoquée par le tirzépatide, et l'étude sur animaux est décrite comme une "étape règlementaire incontournable" pour déposer un dossier d'essai chez l'être humain.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Parmi ceux-ci, le Tirzépatide a obtenu récemment une autorisation de mise sur le marché. Le tirzépatide présente une efficacité impressionante, du niveau de celle de la chirurgie bariatrique, mais certaines inquiétudes émergent car la perte de poids résultatnte de son utilisation provient à la fois d'une perte de masse grasse mais également d'une perte de masse musculaire. Cette dernière s'avère problématique chez l'obèse qui est déjà un sujet à risque de de faiblesse musculaire. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisses. Le composé testé a pour intérêt majeur de cibler des voies de signalisation impliquées à la fois dans la régulation du poids corporel et dans la fonction musculaire. Des données préliminaires ont en effet permis de montrer que le composé testé était capable d'améliorer la fonction et la masse musculaire dans plusieurs pathologies musculaires et qu'il induisait une perte de poids chez des modèles obèses. Le composé testé sera ainsi testé en administration seule ou combinée avec le tirzépatide. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament seul sur le poids corporel du modèle d'obésité. Dans le cadre des administrations combinées avec le tirzépatide, l'objectif est d'observer un additivité des effets et, ainsi, une amélioration des effets de la combinaison comparativement au tirzépatide seul, mais également d'étudier la capacité du composé testé à contrer les effets délétères du tirzépatide sur la fonction musculaire.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, dont le tirzépatide qui est le plus efficace et le plus prescrit. Néanmoins, le tirzépatide présente un effet délétère sur la masse et la fonction musculaire lors d'administration chroniques. Le bénéfice attendu du présent projet est double car si les résultats sont concluants, le composé testé pourra venir compléter l'arsenal thérapeutique anti-obésité, en administration seule ou combinée avec le tirzépatide, et dans ce dernier cas, il pourrait en améliorer l'efficacité tout en contrant ses effets secondaires au niveau musculaire.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (60 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration des traitements (60 administrations pour 36 animaux et 112 administrations pour 106 animaux ; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (4 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Prélèvements sanguins (12 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 5) Mesures de force d'agrippement (3 sessions de mesures de 5 minutes); 6) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel, les mesures de composition corporelle ainsi que les tests d'agrippement pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations des traitements occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. La mise à jeun de 4h ou 6h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères. De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issus de l'étude.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genres.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Avant la mesure de la composition corporelle, les animaux seront habitués à être installés dans le tube de couleur rouge permettant de réduire le stress des animaux au cours de la mesure. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures. Les prélèvements sanguins via la veine de la queue seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages pharmacocinétiques ultérieurs et une crème à base de lidocaïne sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Avant la mesure des dépenses énergétiques, les animaux seront également habitués à leur nouvel environnement durant 20h. Les animaux seront sous contrôle direct et permanent des expérimentateurs pendant les tests d'agrippement. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 21 semaines. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de 12 semaines de régime enrichi en graisses chez le fournisseur.

Chaque souris est opérée du cerveau pendant une trentaine de minutes, puis soumise à un test de mémorisation où l'on mesure son temps d'immobilité, et à deux injections sous contention. 768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin pour analyse de leur cerveau. Il s'agit de créer une mémoire traumatique puis de manipuler les zones cérébrales qui la maintiennent, pour voir s'il est possible de rétablir un souvenir normal de l'événement. Ni la nature de la chirurgie, ni le contenu des deux injections, ni le protocole du conditionnement ne sont précisés, alors que l'effectif de 768 souris repose sur des groupes d'au moins douze animaux.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier la participation de différentes structures cérébrales qui sont impliquées dans la formation de la mémoire traumatique et dans son maintien. Dans le cas des troubles de stress post-traumatiques, on assiste très souvent à une altération de la mémoire. Cette altération se caractérise par une amnésie des éléments du contexte où a eu lieu l'expérience traumatisante et par une hypermnésie d'élements plus anodins qui sont à la source de "Flashback" incontrolés. Chez l'homme comme chez animal, le maintien de la mémoire traumatique est associé à une sur-activation de certaines zones cérébrales ou au contraire à une sous-activation d'autres zones. Le but de ce projet est de manipuler l'activation de ces structures chez la souris afin d'évaluer si il est possibke de restaurer une mémoire normale de l'événement traumatique.

Bénéfices attendus

En identifiant les bases neurobiologiques spécifiques de la mémoire traumatique, ce projet doit ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement de ce trouble lié au stress.

Procédures

768 souris seront soumises à une procédure de chirurgie d'une durée de 30 minutes environ sous anesthésie. Toutes ces souris seront soumises à un test comportemental de mémorisation. Le test comportemental dure 5 minutes pour la séance d'apprentissage et 6 minutes pour le test de rappel de la mémoire au cours duquel nous mesurons le temps d'immobilité des animaux. Deux injections seront faites chez les 768 souris qui seront immobilisées par contention et dureront moins de 20 secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie est un acte expérimental de classe modérée. Les douleurs post-opératoires sont minorées par l'administration d'antalgiques. 768 souris seront soumises à un test comportemental de mémorisation, qui peuvent induire un stress: un acte de classe modéré. Les injections nécessite d'immobiliser les souris (768) une minute et peut provoquer un faible stress: un acte de classe modérée

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour l'analyse des cerveaux.

Remplacement

L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus de mémorisation. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus à l'espèce humaine.

Réduction

Concernant la réduction, l’effectif de 768 souris se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chaque condition expérimentale afin que les analyses statistiques envisagées puissent être concluantes. Notre expérience des approches comportementales indiquent que des effectifs d’au moins 12 animaux par groupe s’avèrent nécessaires pour atteindre le seuil de significativité des résultats. Un nombre inférieur de souris par groupe à la fin de l'étude comportementale pourrait impliquer une réplication de l'expérience.

Raffinement

Tout au long du projet, les animaux seront surveillés par du personnel qualifié, des points limites spécifiques seront établis et des critères d'arrêt seront prévus pour éviter toute souffrance inutile. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous couverture anesthésique et antalgique et des méthodes de raffinement (réchauffement, asepsie) adaptées. En cas de problème constaté, les animaux seront traités selon l'arbre décisionnel prévu.

Choix des espèces

La souris adulte (8 à 16 semaines): -est un mammifère proche de l'espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. La souris représente l'animal classiquement décrit dans littérature, pour ce type d‘expérimentation et l’essentiel des données de l’équipe concernant la mémoire émotionnelle ont été obtenues chez la souris adulte: Nous utiliserons des souris àgées de 8 à 16 semaines, âge qui correspond à l’état adulte de la souris. Pour une comparaison des résultats, l’étude des réseaux impliqués dans la formation de le maintien d'une mémoire implique l’utilisation de cette espèce. -permet d'accéder au niveau cellulaire grâce à des procédures de biologie réalisables en laboratoire.

Opérées du cerveau pendant trente à quarante minutes, 276 souris reçoivent d'abord une injection de produit chimique qui tue les neurones d'une zone du striatum, puis une greffe de cellules nerveuses humaines au même endroit. Certaines subiront deux interventions crâniennes espacées de sept à trente jours, si la greffe ne survit pas à la première formule testée. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et toutes seront tuées, de deux semaines à cinq mois après la greffe, pour prélever leur cerveau. Le porteur écrit recourir à l'anesthésie et aux antidouleurs "afin d'éviter toute douleur", et reconnaît plus loin que les conséquences d'un rejet de greffe sur le bien-être de la souris sont encore mal comprises.

Objectifs

La greffe de cellules nerveuses issues de cellules souches humaines est une méthode prometteuse pour traiter des maladies du cerveau comme la maladie de Huntington. Ces cellules sont conçues pour remplacer celles détruites par la maladie. La plupart du temps, ces greffes utilisent des cellules provenant d’un donneur différent du patient, car c’est moins coûteux. Cependant, ce type de greffon cellulaire est attaqué par le système immunitaire du patient, ce qui peut entraîner un rejet. Pour éviter cela, on utilise des médicaments qui affaiblissent le système immunitaire, mais ces traitements augmentent les risques d’infections et de cancer. Une autre solution consiste à modifier génétiquement les cellules greffées pour qu’elles passent inaperçues auprès du système immunitaire. Ce procédé, appelé "camouflage immunitaire", pourrait permettre d’éviter au patient greffé de prendre les médicaments qui affaiblissent le système immunitaire. Le but de ce projet est de tester différentes façons de rendre ces cellules greffées plus tolérables pour le système immunitaire. Pour cela, on modifie les cellules pour qu’elles libèrent des substances qui apaisent le système immunitaire ou qu’elles soient moins facilement détectées. Nous comparerons la survie, après leur greffe dans le cerveau de modèles animaux rongeurs (souris), de ces cellules nerveuses modifiées génétiquement, en regardant si elles sont attaquées ou non par le système immunitaire. Nous étudierons aussi l’influence du stade de développement des cellules au moment de la greffe. Ces expériences seront réalisées sur des souris présentant un système immunitaire actif ou déficient, afin d’évaluer la survie des greffons testés en l'absence de tout rejet immunitaire. Ce projet marque une première étape dans l'évaluation de cette stratégie avant de procéder des essais cliniques, sur l'être humain.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels utilisant des cellules souches pour soigner des maladies comme Parkinson et Huntington nécessitent souvent des greffons cellulaires établis à partir de cellules provenant d'un donneur, et non du patient lui-même. Comme ces cellules sont différentes de celles du patient, le corps peut les rejeter. Pour éviter cela, les patients doivent prendre des médicaments qui affaiblissent leur système immunitaire, mais généralement seulement pendant un an, car ces médicaments peuvent causer de graves effets secondaires. Malheureusement, une fois le traitement arrêté, les greffons sont souvent rejetés, ce qui stoppe leur efficacité. Pour résoudre ce problème, des chercheurs explorent une idée innovante : modifier les cellules des greffons grâce à des techniques génétiques pour qu'elles soient "invisibles" au système immunitaire. Cela s’appelle l’immuno-camouflage. Cette étude vise à tester cette idée chez des souris, en évaluant différentes modifications génétiques pour trouver celles qui fonctionnent le mieux. Les bénéfices attendus sont : - Identifier une stratégie de modifications génétiques parmi plusieurs qui permettrait au greffon cellulaire de mieux survivre et d’être moins rejeté par le système immunitaire des souris. - Confirmer l’efficacité des meilleures options identifiées, avec différents types de cellules nerveuses et stades de développement des greffons, pour affiner les résultats. A court terme, le bénéfice attendu est d’identifier la meilleure stratégie pour éviter le rejet des greffons. Cette méthode de l’immuno-camouflage pourra ensuite être testée chez des modèles animaux primates. À plus long terme, des essais cliniques chez l’être humain pourraient être envisagés afin de confirmer l'efficacité de la stratégie de l’immuno-camouflage sur la tolérance de greffon de cellules nerveuses chez les patients. L’objectif final est de développer des greffons dont la survie et donc l’effet thérapeutique ne dépendent plus de traitements qui affaiblissent le système immunitaire, ouvrant ainsi la voie à des traitements plus sûrs et efficaces pour les maladies neurodégénératives.

Procédures

Tous les modèles animaux, soit 276 souris, subiront une intervention chirurgicale d’une durée de 30 à 40 minutes sur le cerveau pour transplanter le greffon d'une durée d’une heure. Cette intervention impliquera une anesthésie et une analgésie générales et locales. Une première injection en 3 minutes d’un composé chimique pour induire la mort des neurones de la région ciblée permettra de mimer les pertes neuronales observées dans la maladie de Huntington. Pendant la même opération, une deuxième injection de cellules nerveuses en 6 minutes, soit contrôles, soit modifiées génétiquement pour être invisibles au système immunitaire, sera effectuée au même endroit. Certains animaux contrôles ne subiront que la première injection (lésion). Si les premières expériences de transplantation révèlent que la survie des cellules greffées est compromise par l’injection préalable du composé chimique induisant la mort des neurones lors de la même opération, cette dernière sera soit supprimée (première option testée), soit effectuée 7 à 30 jours avant l’injection des cellules, lors d’une autre intervention chirurgicale de 30-40 minutes sur le cerveau et selon la même procédure (option envisagée si la première échoue). Dans ce dernier cas, les animaux subiront deux interventions chirurgicales. Aucune intervention autre que le suivi de l’aspect et du poids ne sera effectuée sur les animaux jusqu’à leur mort provoquée par injection d’euthanasiant, entre 2 semaines et au plus 5 mois après la greffe.

Impact sur les animaux

Tous les modèles animaux qui participent à l'étude subiront une ou au maximum deux opérations chirurgicales du cerveau. Pour cela, nous utilisons une anesthésie générale et des antidouleurs (généraux et locaux) afin d’éviter toute douleur. Cette opération, peut entraîner des effets secondaires chez les souris, comme le stress, la fatigue, une légère baisse de température corporelle, la déshydratation, des douleurs, une petite perte de poids et un risque d'infection à l'endroit de l'opération. Ces effets ne sont pas systématiques, restent faibles et ne durent que quelques heures (pour le stress, le froid, la déshydratation) ou quelques jours après l'opération. La mort des neurones par procédé chimique d'un seul côté du striatum (une zone du cerveau) pourrait entraîner des difficultés permanentes de mouvement et compromettre la prise de poids normale des souris en vieillissant. Cependant, la dose de composés chimiques que nous prévoyons d’utiliser est trois fois inférieure à celle décrite dans la littérature, qui décrit une perte de mobilité de deux tiers. La greffe additionnelle de cellules nerveuses dans le striatum n’aggrave pas les effets négatifs de la mort des neurones ; au contraire, elle pourrait même les réduire. Les conséquences d'un rejet des cellules greffées dans le cerveau sur le bien-être de la souris sont encore mal comprises. Elles pourraient se manifester par des problèmes neurologiques et de comportement pendant plusieurs semaines ou jusqu’au rejet complet de la greffe (moins d'activité, perte de poids, stress). Nous surveillerons attentivement ces signes lors des premières analyses pour pouvoir ajuster notre suivi et nos décisions, en collaboration avec le vétérinaire de l'animalerie afin d’éviter toutes souffrances.

Devenir

Afin de caractériser l’intensité du rejet immunitaire des différents greffons cellulaires testés (ou l'absence de rejet pour les animaux contrôles présentant un système immunitaire déficient), nous devons récupérer les cerveaux des animaux greffés et/ou présentant une lésion cérébrale induite par procédé chimique en fin d'expérience. Nous devons pour cela procéder à l'euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude histologique permettra ensuite de reconnaître les cellules du greffon et celles du système immunitaire de la souris ayant envahi le greffon (signe de rejet immunitaire en cours) ou l’absence totale de cellules greffées (signe de rejet complet du greffon). La comparaison de ces analyses histologiques nous permettra d’identifier les stratégies de camouflage immunologique les plus efficaces.

Remplacement

La réaction immunitaire d’un organisme face à un greffon étranger mobilise différents acteurs cellulaires et moléculaires de la réponse immunitaire, ce qui rend très difficile sa modélisation complète in vitro. Uniquement certains aspects de la réaction contre des cellules immuno-camouflées est modélisable in vitro. Il est possible d’observer la réaction de cellules immunitaires humaines immortalisé en en contact avec un greffon. Ces expériences évaluent si elles s’activent ou produisent des substances signalant une réaction. Toutefois, ces méthodes sont jugées moins représentatives que celles qui utilisent des cellules immunitaires du sang. Cette méthode à partir de prélèvements sanguin est dite ex vivo, et permet de tester certains aspects de la réaction contre un greffon immuno-camouflées dont : 1) La caractérisation in vitro des molécules produites par les cellules immunitaires du sang de receveurs en présence de cellules du greffons ; 2) l’évaluation de la prolifération de ces cellules, signe d’une réponse immunitaire active en présence du greffon ; 3) la mesure de la mort cellulaire des greffons lorsque il est présenté aux cellules immunitaires purifiées issues du sang de receveurs. Les études avec de sang de macaque sont considéré comme de l’expérimentation animale et donc pas une étude de remplacement. Par ailleurs, plusieurs limitations associées à ce type d’étude ex vivo imposent la réalisation d’études in vivo parallèles : 1. Complexité du microenvironnement cérébral :les tests ex vivo ne permettent pas de reproduire le microenvironnement complexe du cerveau. Ils ne tiennent notamment pas compte de la barrière entre le sang et le cerveau, ni de la présence de cellules microgliales présentes uniquement dans le cerveau, mais qui contribuent de manière significative à la réaction immunitaire cérébrale. 2. Dynamique temporelle de la réponse immunitaire : les tests ex vivo sont courts (quelques jours), ils ne permettent pas d’évaluer la réponse immunitaire après une exposition prolongée. 3. Réponse immunitaire systémique : les tests ex vivo ne permettent pas de mesurer la mobilisation et l'infiltration des cellules immunitaires du sang dans le cerveau. En résumé, ces tests ex vivo ne suffisent pas à eux seuls. Pour une compréhension complète de la réaction immunitaire face à une greffe de neurones, il est essentiel de combiner des tests in vitro à des expériences réalisées sur des modèles animaux vivants.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés par groupe a été défini comme le minimum nécessaire pour pouvoir mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Nous suivons un arbre décisionnel dépendant de résultats d’étapes intermédiaires du projet afin de restreindre les expériences aux seules nécessaires, tout en évitant les répétitions superflues. L'approche statistique proposée dans le cadre de cette étude s'appuie sur les résultats antérieurs que nous avons obtenus, ainsi que nos collaborateurs et d'autres groupes de recherche sur ce domaine.

Raffinement

Pour ce type d'étude, soit une unique opération soit deux opérations distinctes sont nécessaires : pour créer une petite lésion dans une zone du cerveau, et 10 minutes ou une semaine plus tard, pour injecter les cellules que nous étudions. Afin de réduire au maximum le stress et les effets de l'anesthésie sur les animaux, nous prévoyons de tester une méthode qui combine ces deux étapes en une seule opération chirurgicale : injection du produit de lésion, puis des cellules greffées, lors d’une unique chirurgie. Si cette approche unique s'avère négative pour la survie des cellules, nous envisagerons de ne pas injecter le produit de lésion. Si cette deuxième option ne donne pas de bons résultats car l’absence de lésion mimant la lésion nuit de manière trop marquée à la survie des cellules chez les souris, alors nous reviendrons à la méthode classique en deux opérations, espacées de 7 à 30 jours. Dans tous les cas, si des points limites apparaissent après la lésion ou la greffe, les mesures adéquates seront mises en œuvre. Une analgésie est prévue lors interventions si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal classiquement utilisé dans la littérature pour ce type d'expérimentation sur le rejet immunitaire. Nous utiliserons des lignées de souris (dotées d'un système immunitaire fonctionnel) et des lignées de souris génétiquement modifiées pour avoir un système immunitaire déficient, afin de disposer de conditions de contrôle où la survie des greffes cellulaires sans rejet est assurée. L'utilisation de souris adultes nous permettra de valider nos observations dans un système immunitaire qui fonctionne normalement i, ce qui est essentiel pour envisager un développement futur de nos travaux chez l'homme. Comme le préconise la littérature scientifique pour ce type d'expérimentation, les modèles animaux utilisés seront adultes, âgés de plus de 8 semaines, afin que leur système immunitaire soit mature. Autre raison : la maladie de Huntington et le traitement par thérapie cellulaire ne se déclarent et ne sont envisagés que chez l’adulte.

Des nanoparticules sont injectées à travers la peau, directement dans une tumeur greffée, jusqu'à deux fois par animal, entre des séances d'imagerie sous anesthésie générale pouvant aller jusqu'à huit dans la vie d'une souris. 580 souris Balb/c nude, dépourvues de thymus et donc incapables de rejeter des cellules tumorales humaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le RNT reconnaît qu'il n'existe "aucune donnée sur la tolérance des nanoparticules sur des organismes vivants", et présente pourtant ces mêmes nanoparticules comme une innovation prometteuse en cancérologie. Cinquante souris échapperont à la mise à mort immédiate pour être versées à d'autres projets, à condition que la tumeur n'ait pas pris ou qu'elle ait pu être retirée au bistouri.

Objectifs

Le cancer du pancréas, notamment sous sa forme la plus fréquente appelée adénocarcinome canalaire pancréatique, reste aujourd’hui l’un des cancers les plus difficiles à traiter. Les traitements disponibles sont peu efficaces, et le taux de survie à 5 ans après le diagnostic reste très faible. Ce projet propose de tester une nouvelle approche basée sur l’utilisation de nanoparticules innovantes capables à la fois de diagnostiquer et de traiter la tumeur. Ces nanoparticules seront injectées directement dans la tumeur à travers la peau, chez des souris. Cela permettra d’évaluer leur efficacité antitumorale, leur tolérance, leur capacité à rester localisées dans la tumeur, et l’effet sur la croissance tumorale après exposition à des rayons X, qui auront pour effet d’activer l’effet traitement de ces nanoparticules. La conception modulable de ces nanoparticules les rend potentiellement transposables à d’autres types de cancers dits solides, notamment grâce à sa capacité à agir aussi en tant que produit de contraste, ce qui sera également évalué.

Bénéfices attendus

Grâce aux progrès récents dans la compréhension des cancers dits « solides », de nouvelles approches thérapeutiques voient le jour. L’une d’elles consiste à injecter directement les traitements au cœur même de la tumeur, ce qui permettrait d’augmenter leur efficacité tout en réduisant les effets secondaires sur le reste du corps. Le projet présenté ici s’inscrit dans cette dynamique, avec une nouvelle classe de nanoparticules conçues pour être injectées directement dans la tumeur. Elles pourraient offrir une solution pour les patients atteints d’un cancer du pancréas qui ne peuvent plus bénéficier d’une chirurgie, qui reste aujourd’hui le traitement le plus efficace. En réduisant la taille de la tumeur, ces nanoparticules pourraient permettre à certains patients de redevenir éligibles à cette opération. En plus de leur effet thérapeutique, ces nanoparticules peuvent aussi servir à suivre l’évolution de la maladie, ce qui évite de multiplier les examens et les interventions. Cela pourrait améliorer la qualité de vie des patients tout en réduisant les coûts liés aux soins. Enfin, grâce à leur conception, ces nanoparticules pourraient être utilisées à l’avenir pour traiter d’autres types de cancers solides, qu’ils soient facilement accessibles ou situés plus en profondeur dans le corps du fait de ses caractéristiques particulières et activables par rayons X, ce qui en fait une innovation prometteuse dans le domaine de la cancérologie.

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales sous la peau sous anesthésie générale (durée approximative : 5 minutes ; une fois et potentiellement une 2e fois 5 semaines après si la tumeur n’a pas poussé. Ils recevront également des injections sous la peau d’anti-douleur ou anti-inflammatoire, et de solution de réhydratation (en vigile, 30 secondes par animal) selon les procédures. Les animaux seront ensuite suivis régulièrement pour évaluer la croissance tumorale, à l’aide de mesures simples par pied à coulisse en routine, 2 fois par semaine (en vigile, durée : 1 minute), et des imageries médicales pourront être dispensées (sous anesthésie générale, 3 fois maximum par semaine, dans la limite de 8 fois dans la vie de l’animal, durée : 20 min à 40 min selon les modalités d’imagerie (IRM ou scanner ou échographie)). Sur les animaux qui serviront à la mise au point du modèle et ne pouvant pas intégrer de groupes expérimentaux, une chirurgie pour retirer la tumeur pourra être réalisée (sous anesthésie générale avec anti-douleur, durée : 20 minutes). Des injections directes de nanoparticules dans la tumeur à travers la peau seront réalisées pour tester leur efficacité (sous anesthésie générale avec analgésie, 20 à 30 minutes selon les paramètres d’injection, dans la limite de deux fois dans la vie de l’animal). Des prélèvements sanguins pourront être effectués (sous anesthésie générale légère, durée : 3 minutes, dans la limite de 3 fois dans la vie de l’animal (avant injection intra-tumorale, après injection, et en suivi long terme)).

Impact sur les animaux

Effets indésirables possibles : Souris immunodéprimés Balb/c nudes : susceptibilité de contracter des infections. Croissance de la tumeur : Peut causer un inconfort (gêne, grattage...) ou affecter la locomotion (perte de poids / diminution de la prise alimentaire) et la tumeur peut s’infecter ou s’ulcérer. Stress léger liée à la manipulation des animaux pour la mesure de la tumeur en vigile par pied à coulisse ou par imagerie (anesthésie générale et injection de produit de contraste). Injection intra-tumorale des nanoparticules et/ou imagerie avec produit de contraste : Inconfort transitoire après l’injection et stress léger lié à la contention. Sous anesthésie longue. Aucune donnée sur la tolérance des nanoparticules sur des organismes vivants. Injection de cellules tumorales et analgésiques : inconfort transitoire après injection. Anesthésie générale : Inconfort au réveil de l’animal transitoire, déshydratation due à l’anesthésie et perte transitoire de poids. Prises de sang : Douleur localisée au site de prélèvement et gêne transitoire. Diminution transitoire de la volémie (remplacement par solution de réhydratation). Lésions au site de prélèvement (hématome).

Devenir

Les animaux servant à la mise au point du modèle de pousse tumorale pourront être réutilisés dans d’autres projets après 2 échecs d’induction tumorale (vérification par imagerie, semaine 3 et 5) et que l’animal n’a pas subis d’autres procédures, ou alors seront euthanasiés. Les autres animaux de cette même mise au point (avec pousse tumorale) seront euthanasiés à la fin de la caractérisation. Cependant, si les conditions le permettent, une exérèse peut être pratiquée (si la tumeur ne présente pas d’envahissement et est facilement dissécable) et la souris pourra alors être réutilisée également pour un autre projet. En l’absence de ces conditions, une euthanasie sera pratiquée. Les animaux servant à l’étude d’efficacité des nanoparticules injectées en intra-tumoral seront euthanasiés à la fin des expérimentations. Si les souris ne présentent pas de pousse après la première tentative d’induction, après vérification par imagerie de l’absence de nodules tumoraux (comme précédemment) les souris pourront être réutilisées dans d’autres projets ou euthanasiées (pas de possibilité d’une deuxième tentative d’induction du fait de l’âge trop avancée des animaux pour une étude d’efficacité).

Remplacement

Les nanoparticules pouvant être utilisées dans ce projet auront été testées au préalable sur des cellules en culture (in vitro). Certaines de ces cellules serviront ensuite à la mise au point du modèle de cancérologie sur la souris (in vivo). Ainsi leur tolérance, stabilité, efficacité, et les paramètres physicochimiques auront été testés in vitro au préalable, permettant de tester in vivo les plus pertinentes. Après cette première sélection, il s'agira d'évaluer l'efficacité et la distribution de ces nanomatériaux injectés dans la tumeur. L’expérimentation animale n’est pas substituable pour la détermination de la distribution, de l’innocuité et de l’efficacité thérapeutique de nos agents du fait de la multitude de paramètres physiopathologiques (génétiques, immunologiques, structuraux) entrant en jeu dans la genèse et la progression tumorale. Aussi la physiologie générale d’un organisme vivant ne peut pas être mimée in vitro. Il est notamment très complexe de reproduire la physiopathologie de paramètres tels que la perméabilité des barrières cellulaires, la taille, l’état de vascularisation, la tortuosité des vaisseaux, le grade de la tumeur, l’homogénéité et la structure des matrices extracellulaires etc… paramètres clefs pour s’approcher de la pathologie humaine.

Réduction

Conformément au principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner), le nombre d’animaux utilisés sera strictement limité aux besoins scientifiques. Une phase de mise au point expérimentale est prévue afin d’évaluer la variabilité du modèle, d’optimiser les conditions expérimentales et de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour l’étude. Le nombre d'animaux sera ajusté en fonction des résultats obtenus lors de la phase de mise au point (taux de pousse tumorale). Les analyses statistiques seront adaptées à la distribution des données. L’injection de cellules tumorales sera optimisée pour améliorer la prise tumorale. En cas de résultats insuffisants, d’autres milieux d’injection seront testés pour maximiser l’efficacité de prise tumorale tout en respectant les objectifs scientifiques. La réutilisation des animaux sera envisagée uniquement si l'animal n'a pas vécu de signes cliniques sévères, et après validation vétérinaire. Les animaux sans pousse tumorale pourront être réintégrés dans l’étude sous conditions strictes : absence d’effets secondaires, bonne santé, délai de 5 semaines, et imagerie médicale confirmant l’absence de tumeur. Une seule tentative de réinduction tumorale sera autorisée. Les animaux présentant une pousse tumorale non exploitable pourront faire l’objet d’une exérèse tumorale pour constituer une banque de tissu tumorale en vue d’une phase ultérieure du projet. Cette procédure sera réalisée uniquement si la tumeur est facilement dissécable et sans envahissement. Enfin, les animaux réutilisables pourront être affectés à d’autres projets (sauf oncologie), à des formations, ou à la récupération de matériel biologiques pour des analyses bioanalytiques, contribuant ainsi à la réduction globale du nombre d’animaux utilisés ultérieurement.

Raffinement

Un suivi rigoureux est assuré tout au long des expériences. Les animaux étant immunodéprimés, recevront une alimentation irradiée et de l’eau filtrée. Elles sont pesées tous les quatre jours, puis plus fréquemment selon leur état clinique (jusqu’à deux fois par jour en cas de signes cliniques ou lors du suivi tumoral). Afin de limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation dès la fin de la phase d’acclimatation. Les zones d’implantation sont palpées un jour sur deux, et les tumeurs détectées sont mesurées au minimum deux fois par semaine (en routine) à l’aide d’un pied à coulisse sur animal vigile. Des procédures d’imagerie pourront être réalisées pour documenter la pousse tumorale. Le suivi clinique est assuré au minimum deux fois par semaine et intensifié selon les scores cliniques, évalués à l’aide d’une grille spécifique au projet. Des points limites prédictifs sont définis pour anticiper toute souffrance. Toutes les procédures (greffes, injections, etc.) sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et analgésie. Des analgésiques et/ou anti-inflammatoires non stéroïdiens seront administrés en post opératoire si nécessaire pour une couverture anesthésique complète. Des mesures de confort seront mises en place lors des procédures : gel ophtalmique pour prévenir le dessèchement oculaire, maintien de la température corporelle (tapis chauffant ou système à sonde rectale), réveil sous lampe chauffante ou en couveuse. Les animaux sont surveillés jusqu’à réveil complet avant retour en hébergement. En cas de chirurgie avec sutures, un hébergement individuel temporaire (

Choix des espèces

L’espèce de souris la plus couramment utilisée en recherche en oncologie est la souris commune Mus musculus. De nombreuses souches consanguines (immunodéficientes ou non) sont disponibles, permettant la mise au point et l’utilisation de modèles pathologiques se rapprochant le plus possible de la clinique humaine. De plus, grâce à leur fond génétique se rapprochant de celui de l’Homme, la Souris est un modèle de choix pour des études comparatives et permet une croissance tumorale assez rapide comparativement au Rat. Les animaux seront des jeunes souris Balb/c nude adultes sevrées et sans thymus (ce qui fait d’elles des souris immunodéprimées, en déficit d’immunité) induites à partir de 6 semaines (optimal selon la bibliographie) et jusqu’à 11 semaines. Les souris Balb/c nude sont très majoritairement utilisées dans la littérature. En plus d’avoir une aplasie du thymus qui ne permet alors plus la production de lymphocytes T (cellules immunitaires), elles perdent également la capacité de produire des lymphocytes B (eux aussi impliqués dans l’identification et la réponse immunitaire), phénomène recherché pour éviter tout rejet des cellules tumorales d’origine humaine.

Une injection dans le ventre chaque jour, pendant toute la durée de l'étude, plus une greffe de tumeur sous la peau du flanc réalisée sous anesthésie : 80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse du microenvironnement tumoral, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit ces administrations comme non douloureuses et indique que le traitement peut accélérer la pousse tumorale, tout en jugeant que les tumeurs ne devraient pas entraver la vie des animaux. L'objectif reste de confirmer dans un corps vivant un mécanisme déjà identifié en culture cellulaire, la retombée thérapeutique étant renvoyée au plus long terme. Le choix de la souris tient à la modification génétique elle-même, le porteur affirmant qu'aucune autre espèce de rongeur ne la porte.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. Plusieurs études se sont déjà attachées à identifier le rôle des différents globules blancs au cours d’un cancer. Parmi eux, les lymphocytes T CD8 ont un rôle majeur mais ils sont très souvent peu présents dans les tumeurs. Ce projet s’appuie sur des observations réalisées au cours desquelles nous avons observé qu’un gène particulier bloque la présence des CD8 dans les tumeurs. In vitro, nous avons identifié un mécanisme d’action et nous voulons aujourd’hui valider in vivo ce mécanisme.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer nos résultats préliminaires et apporterait des informations nouvelles et inattendues sur les CD8. De plus, Ces données permettront à plus long terme de proposer une nouvelle cible thérapeutique dans les cancers soit dans un contexte de thérapie cellules ou dans le développement de nouvelles molécules.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - des injections dans le ventre de quelques secondes - une injection sous cutanée de 30 secondes sous anesthésie afin de permettre le développement d’une tumeur

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à 1 injection de traitement dans le ventre (de quelques secondes) par jour sur toute la durée de l’étude. Ils seront également soumis à 1 injection sous cutanée (30 secondes) sous anesthésie à l’isoflurane afin de mettre en place une tumeur. Ces administrations ne sont pas douloureuses mais la contention peut induire un peu de stress. Le traitement peut entrainer une pousse tumorale plus rapide. Mais la taille des tumeurs sera évaluée tous les jours. Les tumeurs se développerons sur le flanc des animaux. Du fait de leur faible taille et de leur localisation, elles ne devraient pas entraver la vie des animaux. De plus, ces tumeurs ne forment pas de métastases et ne nécrosent pas.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux (80) pour analyse du microenvironnement tumoral.

Remplacement

Les expériences réalisées préalablement in vitro nous ont permis d’identifier un mécanisme d’action responsable de l’accumulation des CD8 dans les tumeurs. Néanmoins, les expériences in vitro ne peuvent pas mimer la complexité d’un organisme vivant. De ce fait, nous avons besoin de valider nos observations in vivo.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. 10 animaux par groupe seront utilisés pour évaluer le recrutement des CD8 dans les tumeurs. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, nous réaliserons les expériences 2 fois de manières indépendantes pour augmenter la force statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en zone conventionnelle à 10 par cage dans un environnement adapté et enrichi (tunnels, cachettes, matériaux pour leur permettre de faire leurs nids). De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Les injections SC (cellules tumorales) seront réalisées sous anesthésie. Aucune douleur associée à ce geste n’est donc attendue. Les injections IP seront réalisées sur des souris vigiles. Lors des l’injections nous utiliserons des seringues à insuline, comportant les aiguilles les plus fines disponibles permettra de réduire la douleur chez l’animal. Chaque animal sera observé quotidiennement, tout le long de l’expérimentation. Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

Ce projet nécessite des animaux transgéniques afin de pouvoir étudier le recrutement des CD8 dans les tumeurs. Les souris sont la seule espèce de rongeur existante avec cette modification génétique. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 14 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature

Maintenues éveillées une heure vingt dans un dispositif d'imagerie cérébrale, à deux reprises, 32 souris subissent aussi une chirurgie de trente minutes, six injections intrapéritonéales, deux injections sous-cutanées, quatre prélèvements de sang à la queue et un jeûne pouvant aller jusqu'à vingt heures. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leur cerveau. Le projet cherche à savoir si des changements métaboliques, jeûne ou régime pauvre en sucre, stabilisent l'activité cérébrale altérée dans les troubles liés au stress. Le RNT range l'habituation et les séances d'imagerie en "stress léger", sans dire quelle intervention chirurgicale les souris subissent ni comment elles sont immobilisées pendant une heure vingt d'examen sur animal vigile.

Objectifs

Les troubles liés au stress, comme la dépression, sont souvent accompagnés par des déséquilibres métaboliques. De plus ces troubles sont caractérisés par de l'instabilité dans l’activité du cerveau. Ces troubles peuvent être améliorés par des changement métaboliques, par exemple lors d’un régime spécial ou d’un jeûne. Le but de ce projet est de comprendre comment le métabolisme peut aider à stabiliser l’activité cérébrale

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment les changements métaboliques, en stabilisant l’activité neuronales, peuvent améliorer les troubles liés au stress.

Procédures

6 Injections intrapéritonéales (IP) et 2 sous-cutanées (SC). 1 Chirurgie sous analgésie et anesthésie (30 minutes). Habituation progressive (de 5 minutes à 45 minutes) au dispositif d’imagerie sur 10 jours. 2 séances d’imagerie d’une durée de 1h20 sur animal vigile. 4 prélèvements de sang caudal sur animal vigile. 1 jeune d’une durée maximale de 20 heures.

Impact sur les animaux

Injections : douleur légère de courte durée. Période de récupération post-chirurgie : douleur modérée. Habitation et séance d’imagerie : stress léger. Prélèvement de sang : douleur légère de courte durée. Jeune : stress léger.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour préserver leur cerveau et analyse post-mortem

Remplacement

Dans des modèles de culture de cellules nerveuses, on a observé que certaines substances produites par l’organisme lors du jeûne ou d’un régime très pauvre en sucre peuvent soutenir l’activité du cerveau. Cependant, pour comprendre comment ces substances contribuent à stabiliser l’activité cérébrale, il est nécessaire d’avoir recours à des organismes plus complexes. Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative capable de reproduire toute la complexité du cerveau, ce qui rend les études chez l’animal indispensables.

Réduction

Nous menons des études dans lesquelles nous suivons chaque animal au fil du temps. Cela nous permet de comparer son état initial avec les différents stades métaboliques. Cette approche a l’avantage de réduire le nombre d’animaux tout en gardant des résultats fiables. D’après notre expérience, un groupe de 12 animaux est suffisant pour obtenir des résultats statistiquement solides. Des tests statistiques spécifiques au projet seront utilisés pour l'analyse des résultats.

Raffinement

Les souris seront élevées en groupes sociaux dans des cages comprenant du matériel de nidification (enrichissement). Un personnel formé au bien-être animal surveille les animaux tous les jours. L’apparition de signes de stress ou de douleur sera attentivement suivie en fonction d’une évaluation régulière de points limites appropriés. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur des animaux. Des goutes pour les yeux sont appliqués pour prévenir l’assèchement des yeux pendant la chirurgie. Des séances progressives d’habitation au dispositif d’imagerie serons effectué pour réduire le stress.

Choix des espèces

L’imagerie fonctionnelle à ultrason chez l’animal vigile est établie chez la souris. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Chez l’Homme, les troubles liés au stress sont fréquents chez les jeunes adultes des deux sexes. Les animaux seront utilisés entre 6 semaines et 4 mois de vie, ce qui corresponds à ce stade. Les deux sexes sont considérés.

3 612 souris vont être utilisées, toutes tuées, chacune subissant après sa mort un prélèvement de sang, de colonne vertébrale, des quatre pattes, de la trachée, des poumons et de l'aorte. À dix semaines de vie, elles subissent une chirurgie du genou droit qui déstabilise un ménisque pour provoquer une arthrose, puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant cinq jours. Le porteur décrit une prostration possible pendant trois jours, un isolement du groupe, l'arrêt du toilettage social, un risque d'infection des sutures et de péritonite. Les bénéfices annoncés se chiffrent en centaines de milliards d'euros d'économies européennes, quand le projet cherche d'abord à documenter, pour la première fois, le rôle d'une interaction moléculaire dans l'invasion vasculaire du cartilage.

Objectifs

L’arthrose, la plus répandue des maladies rhumatismales, impacte plus de 500 millions de personnes dans le monde. A ce jour, il n’existe pas de traitements qui permettent de soigner ou ralentir la maladie, les traitements disponibles sont uniquement palliatifs. Notre projet s’intéresse particulièrement aux mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la dégradation du cartilage articulaire lors de l’arthrose. L’une des étapes clé de cette dégradation correspond à une augmentation anormale du volume (i.e. hypertrophie) des cellules du cartilage (chondrocytes). A un stade plus avancé de la maladie, une invasion pathologique du cartilage articulaire par des vaisseaux sanguins nouvellement formés se met en place, via un mécanisme nommé « angiogenèse ». Cette invasion vasculaire accélère fortement la dégradation du cartilage. Nous proposons l’hypothèse que les chondrocytes hypertrophiques, joueraient un rôle fondamental dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Nos premiers résultats indiquent qu’une protéine ligand est spécifiquement produite par les chondrocytes hypertrophiques et que l’interaction avec son récepteur, présent à la surface des cellules endothéliales vasculaire, favorise l’angiogenèse. C’est dans ce contexte, que notre projet, se propose, pour la toute première fois, de documenter le rôle de l’interaction entre cette protéine ligand et son récepteur dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Pour ce faire, nous utiliser une lignée de souris génétiquement modifiées, permettant à la fois d’induire une invalidation du gène codant pour le récepteur spécifiquement au niveau des cellules endothéliales vasculaires mais aussi de visualiser cette population cellulaire grâce à une protéine fluorescente. Une arthrose sera induite chirurgicalement chez ces souris et l’invasion vasculaire du cartilage articulaire sera suivie au cours du temps. Par la suite, ces expérimentations nous permettrons de définir le moment idéal pour mettre en place des stratégies thérapeutiques anti-arthrose qui ciblent spécifiquement l’interaction entre la protéine d’intérêt et son récepteur.

Bénéfices attendus

Notre projet comporte plusieurs bénéfices attendus. Dans un premier temps, notre projet va permettre d’approfondir, de manière générale, les connaissances de la communauté scientifique sur les mécanismes cellulaires/moléculaires impliqués dans l’apparition de l’arthrose et plus précisément, sur le rôle de l’invasion vasculaire du cartilage dans le développement de cette maladie. Dans un second temps, les résultats obtenus, nous permettront d’évaluer l’intérêt de cibler l’étape d’invasion vasculaire du cartilage pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l’arthrose. Enfin, il faut prendre en compte que l’arthrose est une maladie chronique douloureuse et extrêmement répandue au sein de la population (40% des personnes de plus de 70 ans développe de l’arthrose), qui, de fait, exerce une pression importante sur le milieu médical. De manière connexe, l’arthrose de la hanche et du genou représente des poids financiers conséquents pour les pays européens, en effet, ils sont estimés entre 408-817 milliards d’euros et 350-700 milliards d'euros/an respectivement. Ainsi, au travers de l’étude de nouvelles cibles thérapeutiques, notre projet s’inscrit dans une démarche visant à améliorer la qualité de vie des patients (amélioration de la mobilité et de l’autonomie des patients, diminution des douleurs chroniques et de comorbidités associées) et à réduire les coûts socio-économiques (limitation de dépenses liées aux arrêts de travail prolongé et aux intervention) exercées par l’arthrose sur notre société.

Procédures

A l’âge de 10 semaines de vie post-natale, les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d’un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs de l’articulation) du genou droit. Les animaux âgés de 12 semaines recevront des injections intrapéritonéales du composé d’intérêt quotidienne de quelques secondes sur une période de 5 jours. Un site différent sera choisi pour chaque injection afin de limiter les risques d’irritation pour l’animal.

Impact sur les animaux

Dans les trois premiers jours suivant la chirurgie, si des douleurs sont ressenties par l’animal, celui-ci peut entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux de la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Cette douleur pourrait notamment être causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant les chirurgies. De plus, une infection pourrait survenir au niveau des sutures post-chirurgicales. Les injections intrapéritonéales, bien que ne durant que quelques secondes, peuvent entraîner une irritation au niveau du site d’injection. De même, les injections de tamoxifène et plus généralement la technique d’injection intrapéritonéale en elle-même peuvent entrainer des nuisances chez l’animal : stress/anxiété, perte d’appétit, inflammation du péritoine (péritonite), injection mal placée conduisant à l’accumulation du produit au niveau d’un site non ciblé (i.e. organes présents dans le péritoine) avec conséquences potentielles multiples

Devenir

L’ensemble des animaux de ce projet seront utilisés afin de réaliser des prélèvements multi-organes post-mortem. Ces prélèvements sont indispensables pour la validation de notre modèle murin génétiquement modifié et pour mener à bien notre étude visant à déterminer l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques contre le développement de l’arthrose.

Remplacement

Des modèles in vitro/ex vivo permettent d’étudier la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et sont utilisés en amont de la présente étude pour remplacer au maximum le recours aux expérimentations animales. Ces modèles impliquent l’utilisation de cellules endothéliales d’origine humaine pour des tests de formation de tubes ou de migration cellulaires. Lors de ces tests il est possible de faire varier plusieurs paramètres et d’évaluer l’effet de communication cellulaires d’intérêt. Cependant l’utilisation de ces modèles reste limitée par le fait que les cellules endothéliales nécessitent un milieu de culture spécifique, peu compatible avec de nombreux autres types cellulaires. Or, dans le cadre de l’arthrose, l’environnement articulaire se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial trop complexes à prendre en compte dans la mise en place de modèles in vitro ou informatiques, ni même dans un modèle d’animal invertébré. D’autre part, l’arthrose est une pathologie aux causes et conséquences multiples difficilement reproductibles dans un système in vitro non intégré. C’est pourquoi, aujourd’hui, aucun autre modèle substituable aux modèles animaux ne nous permet d’évaluer les processus impliqués dans le développement de l’arthrose ni l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Dans le cadre du respect des 3Rs en éthique animale, le nombre d’animaux utilisés dans les procédures a été réduit au strict minimum. Pour ce projet scientfique, les nombre de 9 et 35 animaux de chaque sexe par groupe a été calculé par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative. Pour l’analyse des résultats, le test statistique le plus adapté sera utilisé pour pouvoir comparer toutes les conditions. Il est également important de souligner que chaque souris fera l’objet de prélèvement multi-organes (prélèvement de sang, colonne vertébrale, pattes avant et arrières, trachée et poumons, artère aorte). Cette approche présente l’avantage de rassembler une collection d’échantillons suffisante sur un nombre restreint d’animaux. Enfin, notre projet comprend l’utilisation de techniques d’analyses très haut débit qui permettent de générer un grand nombre de données pertinentes scientifiques à partir d’un faible nombre d’échantillons.

Raffinement

Pour le protocole d’induction de l’arthrose, une analgésie est assurée en avant et après l’opération. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’écarter tout risque d’hypothermie. Les souris seront ensuite transférées dans une cage de réveil également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer. Après 6h et 24h post-chirurgie, un traitement antalgique est administré aux animaux dans un souci de raffiner la prise en charge de la douleur ressentie par ces derniers. Les animaux sont observés quotidiennement pendant les 3 premiers jours post chirurgie puis 2 fois par semaine. Des grilles de points limites ont été définies pour chacune des procédures et permettront une gestion de la douleur adaptée selon le nombre et la sévérité des signes cliniques observés.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle animal dans ce projet est fondé sur plusieurs critères. La souris est tout d’abord un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Notre projet est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui permettent des études précises et pertinentes dans les tissus squelettiques d’intérêt pour la recherche thérapeutique sur l’arthrose. Ces lignées de souris génétiquement modifiées sont déjà développées et disponibles. Le modèle de souris d’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médian est le plus décrit dans la littérature et fait ainsi office de référence pour l’étude de cette pathologie. Le choix de l’espèce souris s’explique également par la nécessité de travailler sur des animaux arrivés à maturité squelettique. Les animaux inclus dans cette étude seront à maturité squelettique et âgés de 10 à 22 semaines. La procédure chirurgicale sera réalisée à 10 semaines de vie, il s’agit du stade de développement consensus dans la littérature pour l’induction de l’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médial