Souris
Impact des microplastiques alimentaires sur la réponse inflammatoire intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles boivent pendant 78 jours une eau chargée en microplastiques, et la moitié d'entre elles reçoit en plus un agent chimique qui déclenche une colite, quatre fois cinq jours à quinze jours d'intervalle, avec douleurs, saignements rectaux et perte de poids. Le dernier jour, 180 souris subissent une coloscopie sous anesthésie, puis toutes reçoivent une ponction de sang dans le cœur avant d'être tuées par dislocation cervicale. Le porteur écrit que ce traitement est "sévère mais nécessaire" pour étudier les mécanismes de l'inflammation intestinale, et annonce qu'il baissera la dose au cycle suivant si elle s'avère trop forte.
Objectifs
Les microplastiques sont de minuscules particules, environ 70 fois plus fines qu’un cheveu, que l’on retrouve sous diverses formes (fragments, fibres, films, billes…) et compositions chimiques. Présents partout dans l’environnement, ils s’accumulent dans tous les écosystèmes, entraînant une ingestion involontaire par l’Homme évaluée à environ 52 000 particules par an. Notre projet vise à comprendre comment les microplastiques ingérés affectent le système immunitaire et l’inflammation intestinale. Nous évaluerons leur capacité à induire une inflammation intestinale, seuls ou en combinaison, dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce travail permettront de mieux comprendre par quels mécanismes, les microplastiques affectent la santé de l’intestin et dans quelle mesure ces derniers sont responsables de l’aggravation de l’inflammation de l’intestin. Les résultats nous permettront aussi de déterminer si certains microplastiques sont plus néfastes que d’autres. De tels résultats sont indispensables pour comprendre comment la pollution environnementale influence notre santé digestive et pour proposer de nouvelles approches thérapeutiques aux patients chroniques afin de freiner la progression de la maladie et d’améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Ce projet comporte 4 interventions : (1) L’administration des microplastiques via l’eau de boisson dans les biberons, pendant toute la durée du projet (78 jours) sur 320 animaux (tous sauf les contrôles), (2) le traitement pro-inflammatoire pour induire l’inflammation intestinale sera réalisé sur la moitié des animaux (200) avec un agent chimique administré dans l’eau de boisson 4 fois, à raison de 5 jours tous les 15 jours. (3) La coloscopie, examen de quelques minutes (10 maximum), sera réalisé sur 180 animaux le dernier jour du protocole sous anesthésie générale. (4) Un prélèvement de sang intracardiaque (3 minutes) sera réalisé sous anesthésie générale sur la totalité des animaux juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
L’administration des microplastiques via l’eau de boisson ne devrait pas induire de nuisance pour les animaux et ne pas provoquer de perturbation au niveau de la faim et de la soif des animaux. Le traitement pro-inflammatoire (200 animaux) induit des inconforts, de la douleur, une perte de poids liée à une diminution de la prise alimentaire et/ou des saignements rectaux. Ce traitement est sévère mais nécessaire pour étudier les mécanismes de l’inflammation intestinale. Ce modèle est maîtrisé par le laboratoire depuis longtemps et le protocole proposé a été validé dans un projet précédent. Nous savons repérer les symptômes rapidement afin de limiter la souffrance des animaux. La coloscopie (180 animaux) et le prélèvement sanguin intracardiaque (tous les animaux) seront réalisés sous anesthésie générale suivis immédiatement de la mise à mort par d’une dislocation cervicale. Il n’est pas attendu d’effets indésirables de ces interventions pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort après la dernière intervention afin de récupérer les différents organes.
Remplacement
La toxicité des microplastiques a été étudiée in vitro sur des modèles de cellules épithéliales intestinales et cellules immunitaires. Néanmoins, ces modèles in vitro ne permettent pas, actuellement de reproduire entièrement le processus d’inflammation intestinale. En effet, la complexité de la physiologie intestinale implique plusieurs systèmes cellulaires distincts notamment le système digestif, le système immunitaire et le microbiote intestinal. Les réponses inflammatoires sont des processus temporels et évolutifs impliquant tous les organes liés ou non au tube digestif dont les ganglions lymphatiques et la rate. Ainsi, aucun modèle in vitro ne peut actuellement se substituer aux modèles animaux pour étudier de manière fiable et intégrée les mécanismes sous-jacents à notre question de recherche.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre de souris par groupe, à savoir 40 souris par groupes réparties dans 10 groupes, soit un total de 400 souris, pour obtenir la puissance statistique suffisante pour toutes les analyses prévues, conformément aux exigences éthiques en expérimentation animale. Sur la base des données issues de la littérature scientifique et de nos données précédentes, les test statistiques réalisés ont donné un nombre d'animaux à 40 par groupe afin d'obtenir la puissance statistique nécessaire pour réaliser à la fois les analyses in vivo (colite expérimentale, endoscopie rectale) et post mortem (profil immunitaire par cytométrie en flux, analyses transcriptomiques, microbiote intestinal, histologie, dosages biologiques) aux deux points finaux prévus dans le projet. Les expériences ont été conçues afin de réaliser un maximum d’analyses différentes compatibles sur les mêmes animaux afin d'en réduire le nombre tout en ayant suffisamment de matériel pour réaliser les différentes analyses. Cette approche intégrée vise à maximiser les données obtenues par individu et à limiter au strict minimum le nombre total d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées, avec à disposition des copeaux de bois, des cabanes en métal pour se cacher et grimper, et des buchettes de bois pour usure des dents. Pour éviter toute source extérieure de contamination en plastique, les enrichissement en carton et plastiques ne seront pas utilisés. Les coloscopies et prélèvements intracardiaques se feront sous anesthésie générale (isoflurane 4% à l’induction puis réduite à 2% en maintien), sans réveil. Une procédure d’estimation et de suppression de la douleur est mise en place en amont. Pendant la colite, l’activité de la maladie sera scorée quotidiennement. De plus, les animaux seront surveillés deux fois par jour pour détecter des signes éventuels de mal-être (prostration/mouvements, yeux fermés/grimace, dos voûté, aspect du pelage, déshydratation). Le point limite est fixé selon ce score et les signes éventuels de mal-être (Annexe 3). A la fin de ce protocole, les animaux seront mis à mort et les organes prélevés permettront des analyses biologiques. Le modèle de colite expérimentale est un modèle maîtrisé par le laboratoire depuis longtemps. Il est à noter que la sévérité de la réponse au traitement pro-inflammatoire est aussi très dépendante de l’environnement (microbiote intestinal). Si la dose s’avère trop sévère au premier cycle, elle sera réduite pour les cycles suivants. Grâce à notre expertise, nous sommes en mesure de repérer très rapidement les signes cliniques de la maladie afin d’intervenir sans délai et de limiter au maximum la souffrance animale.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix dans l’étude des maladies inflammatoires de l’intestin. Le modèle d’inflammation par agent chimique est très largement utilisé en raison de sa simplicité d'administration (dans l'eau de boisson), de la facilité de contrôle du dosage (pour déterminer la gravité) et de la durée courte d’analyse du processus inflammatoire et de « récupération ». En matière d’étude préclinique, ce modèle reste le modèle de choix couramment décrit dans la littérature. Les souris utilisées auront 8 à 9 semaines. Le projet démarrera après deux semaines d’acclimatation. Ce stade correspondant au passage à la maturité sexuelle chez la souris soit au passage au stade « Jeune Adulte», ce qui correspond aux besoins du projet, les patients étant majoritairement de jeunes adultes.
Réalisation de biopsies d’oreilles pour le génotypage chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
L'extrémité de l'oreille est coupée sur chaque animal au sevrage, entre trois et quatre semaines, en même temps que la pose d'une puce électronique. 10 000 souris vont être soumises à ce prélèvement dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et toutes seront gardées en vie pour être utilisées dans d'autres expériences. Le porteur présente l'opération comme un gain pour les souris elles-mêmes, puisqu'elle évite les contentions répétées qu'imposait le génotypage sur poils. Il invoque dans le même paragraphe les gestes posturaux du personnel et le coût économique et écologique du doublement des analyses moléculaires.
Objectifs
L’animalerie réalise l’identification des lignées de souris par l’injection d’une puce électronique nécessaire au suivi des animaux et aux expérimentations. Un échantillon au niveau de l’oreille est prélevé sur l’animal afin de procéder au génotypage. En effet, le génotypage sur poils n’a pas permis de donner des résultats robustes et fiables, notamment pour des triples lignées à génotyper, ainsi que pour des gènes situés dans des parties condensées du génome moins accessibles. De plus l’utilisation de la méthode de génotypage sur bulbes pileux engendrent également des contaminations éventuelles qui n’est pas observé pour des biopsies d’oreilles. Cela entraîne de devoir reprélever parfois plusieurs fois les animaux, ce qui va à l’encontre du principe de raffinement (nouvelle contention des souris), des gestes posturaux répétés pour le personnel, et le doublement des techniques moléculaires de génotypage ayant un coût économique et écologique notamment. Le nombre total d’animaux dans ces expériences sera de 10000 souris.
Bénéfices attendus
Nous réduirons le stress des souris en leur évitant de multiples contentions et prélèvement de poils.
Procédures
Une biopsie de l’extrémité de l’oreille sera prélevée à 3-4 semaines pour le génotypage de tous les animaux. La durée du prélèvement est de maximum 10 secondes.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l’extrémité de l’oreille afin de pouvoir réaliser le génotypage de façon robuste entraîne un léger stress lors de la contention et une douleur légère de courte durée .
Devenir
La totalité des animaux parentaux seront gardés en vie à l’issu de cette procédure pour des fins expérimentales
Remplacement
Le prélèvement de poils ou de biopsie d’oreilles ne peut être remplacé pour génotyper les animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum, puisque certains accouplements issus d’accouplements homozygotes ne seront pas prélevés.
Raffinement
Le milieu est enrichi avec entre autres, une cabane en carton et des frisotis en papier kraft pour optimiser le maintien de leur chaleur corporel et de leur bien-être. Les animaux seront habitués au contact du personnel, et les prélèvements sont les plus brefs possibles. Au sevrage, des bouchons d’aliments seront placés directement dans la cage pour favoriser la prise alimentaire des jeunes sevrés. Des points limites ont été mis en place pour limiter la douleur pour chaque procédure et seront appliqués.
Choix des espèces
Les biotechnologies de création de lignées transgéniques sont très développées chez la souris et permettent d'obtenir des modèles rapidement et à moindre couts. De plus, la souris se reproduit vite et exprime divers comportements publiés dans de nombreux articles scientifiques depuis très longtemps ce qui permet l'étude de mécanismes de la reproduction et des comportements qui sont les thèmes principaux de recherche abordés par les utilisateurs. Tous les animaux auront donc une biopsie de l’extrémité de l’oreille qui est peu innervée et irriguée à 3-4 semaines au moment du sevrage qui est réalisée en même temps que le puçage des animaux. Le stade choisi permet d'exercer une seule contention brève pour le puçage et le génotypage.
Etude d’efficacité de nouveaux candidats médicaments dans deux modèles de souris de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), ou maladie de Charcot
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Des souris de deux lignées génétiquement modifiées, dont les motoneurones dégénèrent, reçoivent des candidats médicaments par la bouche ou en injection jusqu'à une fois par jour pendant trois mois, par le nez chaque jour pendant six mois, ou jusqu'à trois fois dans la colonne vertébrale lors d'une chirurgie sous anesthésie générale, avec un risque de lésion de la moelle épinière dans moins de 5 % des cas. 3 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, ou plus tôt si elles atteignent un point limite. Les souris d'une lignée perdent peu à peu l'usage des pattes arrière jusqu'à la paralysie complète, et les souris ont subi chez le fournisseur la coupe d'un morceau de queue à dix jours, puis un transport en avion pouvant durer jusqu'à cinq jours. Pour tester ces médicaments contre la maladie de Charcot, le porteur fonde l'effectif de 15 souris par groupe sur des "tests comportementaux" et des "tests moteurs" sans en nommer aucun.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), appelée couramment maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative qui se caractérise par une dégénérescence progressive des neurones du cortex moteur, des motoneurones du tronc cérébral et de la moelle épinière. On distingue des formes sporadiques et des formes familiales. Quelle que soit la forme de la maladie, les signes cliniques sont identiques. Cependant, en fonction de la région initiale d’atteinte, on distingue deux variétés de SLA : (1) une forme spinale qui affecte tout d’abord les motoneurones de la moelle épinière et qui est caractérisée par une atteinte de la motricité des membres supérieurs et inférieurs; et (2) une forme bulbaire, affectant les motoneurones du tronc cérébral et provoquant des troubles de la parole et de la déglutition. Au cours des 25 dernières années, la recherche sur les patients SLA a révélé des mutations dans plus de 20 gènes, dont 2 d’entre eux sont les plus affectés et ont été associés à des cas familiaux de la SLA. Des mutations de ces 2 gènes ont été associées à la neurodégénérescence observée dans la SLA. Par conséquent, ces deux gènes font actuellement l’objet de nombreuses recherches, notamment pour le développement de stratégies thérapeutiques. Afin d’étudier la progression de la maladie et d’aider au développement de nouveaux candidats médicaments, des modèles de souris transgéniques ont été générés pour mettre en évidence les mécanismes physiopathologiques responsables de la dégénérescence moto-neuronale observée dans la SLA. Par conséquent et pour étudier deux voies fortement représentés chez les malades de la SLA, nous utiliserons dans ce projet deux modèles de souris transgéniques dont les deux gènes d'intérêt ont été modifiés et présentant des signes pathologiques qui reprennent la pathologie humaine sous sa forme spinale avec une dégénérescence progressive des motoneurones entraînant un déficit moteur progressif. Les souris présentent, à partir de 6 semaines, des tremblements des membres inférieurs, des signes de faiblesse musculaire ainsi que des déficits moteurs qui s’aggrave avec l’âge. Ces deux modèles fournissent des outils précieux pour identifier les mécanismes sous-jacents à la pathogenèse SLA et pour étudier les stratégies thérapeutiques à mettre en place pour arrêter la maladie, et dans notre cas, d’étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Bénéfices attendus
La sclérose latérale amyotrophique (SLA), ou maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte des motoneurones à la fois centraux et périphériques. Il s'agit de la plus fréquente des maladies du motoneurone de l'adulte (environ 2.5 malades pour 100000 habitants en France). Son diagnostic repose avant tout sur des éléments cliniques et l'exclusion d'autres pathologies. Ainsi, le délai entre l'apparition des symptômes et la pose du diagnostic est souvent long (9 à 13 mois), alors même que l'évolution de la maladie est rapide, avec un décès survenant généralement dans les 3 à 5 ans (le plus souvent par détresse respiratoire). Il s'agit d'une pathologie complexe et hétérogène dont les processus physiopathologiques sont encore mal compris. Les seuls traitements actuellement utilisés chez les patients atteints de SLA ne permettent, tout au plus, qu'une amélioration mineure de la survie, avec des résultats controversés. Ainsi, ce projet est utile pour avancer dans le traitement de cette maladie et donc le développement de nouveaux candidats médicaments.
Procédures
Dans ce projet, 2 lignées d’animaux génétiquement modifiés à phénotype dommageable sont étudiée. Les deux lignées sont des modèles de la sclérose latérale amyotrophique (ou maladie de charcot) mais ne développent pas la maladie de la même façon puisque les voies altérées dans les deux lignées sont différentes. Pour la lignée SOD1, les animaux développent des déficits moteurs qui évoluent tout au long de la vie de l’animal pour atteindre une paralysie des membres postérieurs et une diminution significative du poids (points limites définis dans le projet). Pour la lignée TDP-43, les animaux développent des déficits moteurs qui évoluent assez rapidement et se limite au bout de quelques semaines à une atteinte des membres postérieurs induisant une démarche laborieuse. Contrairement à la lignée SOD1, aucune paralysie des membres postérieurs n’est observée, les animaux ne montrent pas de perte de poids significative et il n’y a pas de mort prématurée observable sur la durée de notre projet. Des administrations seront réalisées sur animaux vigiles (1 à 2 minutes selon le type d’administration hormis pour les administrations intrathécales). Les fréquences d'administration dépendront des caractéristiques pharmacologiques des candidats médicaments. La fréquence et la durée maximales d'administration sont définies selon le type d'administration utilisée de la façon suivante : -Administration orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée : 1 administration par jour pendant 3 mois -Administration intraveineuse : 2 administrations par semaine pendant 3 mois -Intranasale : 1 administration par jour pendant 6 mois -Intrathécales 3 administrations maximum réalisées sous anesthésie générale à une fréquence d’une par mois (temps minimal entre chaque administration). La durée de l’administration sera de 15-20 min environ. Des prélèvements de sang à la veine mandibulaire seront réalisés tous les mois (durée environ 2 min).
Impact sur les animaux
Ces modèles de souris transgéniques présentent des phénotypes dommageables qui reprennent la pathologie humaine avec une dégénérescence progressive des motoneurones entraînant un déficit moteur. Pour une des lignées, les animaux développent des difficultés progressives de mouvements des membres postérieurs sans induire de paralysie complète de ces membres, de perte de poids significative ou de mort prématurée avant la fin de l’étude. Les animaux issus de l'autre lignée utilisée dans ce projet développent également des difficultés progressives de mouvements des membres postérieurs allant jusqu’à la paralysie complète. Chez le fournisseur, les animaux à l'âge de 10 jours sont soumis au prélèvement d'un petit morceau de queue utilisé comme matériel biologique pour le génotypage. Lors du transport des animaux par avion d'une durée maximale de 5 jours (entre le moment où les animaux sortent de l’animalerie du fournisseur et celui où ils arrivent dans nos locaux), les animaux jeunes (3-4 semaines au minimum soit après sevrage) peuvent présenter un déficit moteur précoce léger dans le cas de la première lignée. Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. Dans notre projet, des études in vivo ont déjà été réalisées au préalable avec les candidats médicaments et ne montrent aucune toxicité particulière de ceux-ci. Les futurs candidats médicaments peuvent avoir différents mode d’administration. Une administration (intra-veineuse, per os, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intranasale) d’un candidat médicament entraîne une contention de l’animal qui peut induire un stress particulier. L’administration dans la colonne vertébrale sous l'arachnoïde au niveau lombaire (intrathécale) si elle a lieu, induit un acte de chirurgie et sera réalisée sous anesthésie générale précédée d’une analgésie. Cet acte de chirurgie peut entrainer une perte de poids des animaux ainsi qu'une légère déshydratation durant les 24 à 48h qui suivent. Un risque de lésion de la moelle épinière est possible dans moins de 5% des cas. Un stress peut également être présent lors de la manipulation des animaux pour leur passage dans les différents tests moteurs. Des prélèvements de sang au niveau de la veine submandibulaire seront réalisés avec un intervalle minimal d’un mois sur animaux anesthésiés.
Devenir
En fin d’étude, pour des analyses sérologiques, histologiques, moléculaires et immunohistochimiques, les animaux seront soumis à différents types de prélèvements (organes) post mortem. L’ensemble des animaux arrivant au point limite avant la fin de l’étude comportementale sera mis à mort.
Remplacement
L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte d’un grand nombre de ces phénomènes, et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer les symptômes moteurs de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc incontournable pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.
Réduction
Les études internes précédemment réalisée dans notre EU sur les tests moteurs utilisés dans ce projet avec d’autres lignées ont montré qu’un nombre d’animaux égal à 15 par groupe est nécessaire pour observer des effets significatifs des candidats médicaments dans les tests comportementaux utilisés dans cette étude. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés. Les données seront présentées en moyenne et erreurs standard à la moyenne (SEM). Les différences entre les groupes seront évaluées à l’aide de tests paramétriques. Les tests paramétriques seront utilisés car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Des tests non paramétriques pourront être utilisés en deuxième intentions . Le choix des tests paramétriques ou non paramétriques sera fait en fonction des résultats obtenus dans un test de normalité. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, en plus des analyses comportementales, des prélèvements de sang et d’organes seront réalisés sur les animaux pour des études complémentaires.
Raffinement
Une période d’habituation sans expérimentation est laissée aux animaux d’au minimum une semaine après leur arrivée. Durant cette période d'habituation, les animaux sont soumis à une évaluation journalière suivant la grille scoring mise ne place dans ce projet mais aucune pesée de sera réalisée pour éviter de rajouter un stress lié à la préhension de l'animal en surplus du stress récent induit par le transport et le changement d'environnement. Les souris seront ensuite pesées une fois par semaine. Lorsqu’une perte de poids sera observée, la fréquence des pesée pourra être augmentée en fonction de la perte de poids et de l‘apparition des déficits moteurs. Par ailleurs, leur état général sera évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un des points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Des procédures particulières seront mises en place suivant l’atteinte moteur des animaux (alimentation hydratée et hydrogel placé dans le fond de la cage). Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale afin de réduire le stress des animaux. Pour la procédure chirurgicale (administration dans l'espace sous arachnoïdien de la colonne vertébrale au niveau lombaire appelée administration intrathécale), les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Après la chirurgie et afin de faciliter leur convalescence, de l’hydrogel sera placé dans le fond de la cage pour les premières 24h et plus si besoin. Le poids des animaux sera suivi quotidiennement pendant une période minimale de 72h et jusqu’à reprise du poids initial. Des procédures particulières pourront être mise en place en cas d’altération de l’état physique des animaux après la chirurgie (mise en place d’une analgésie, alimentation hydratée et hydrogel dans le fond de la cage en concertation avec le vétérinaire). Une période d’au moins 10 jours de récupération sera respectée, après la chirurgie liée à l’administration dans l'espace sous arachnoïdien de la colonne vertébrale au niveau lombaire avant que les animaux ne soient soumis à un autre test de comportement.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments, et les données obtenues nous permettent maintenant de calculer les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette pathologie dans toute sa complexité. En effet, les animaux sont essentiels pour modéliser les mécanismes physiopathologiques de la SLA. Ils sont donc nécessaires pour évaluer l'efficacité des candidats médicaments. Au minimum 5 semaines pour la lignée TDP-43 et 12-13 semaines pour la lignée SOD1 au début de l’analyse comportementale. Dans ce projet, l’expérience et l’administration de traitements sont initiés à un moment où les animaux sont jeunes, avant le début des premiers symptômes pour pouvoir commencer à administrer le candidat médicament au moment où les premiers symptômes de la maladie apparaissent. Le génotypage est effectué chez le fournisseur à l'âge de 10 jours. Ils partiront de chez lui, après sevrage, à l'âge de 3-4 semaines pour la lignée TDP-43 (au minimum) et plus tardivement pour les souris SOD1 (au minimum 10 semaines).
Evaluation de l’effet thérapeutique de la cytokine IL-34 humaine dans des modèles de maladies inflammatoires chroniques chez la souris NSG humanisée
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Dépourvues de système immunitaire fonctionnel par construction génétique, les souris NSG utilisées ici reçoivent des cellules humaines qu'elles ne peuvent pas rejeter. 280 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Irradiation sur animal vigile, injection intraveineuse de cellules humaines, prélèvements sanguins derrière l'orbite de l'œil toutes les deux semaines, instillation intra-rectale d'un mélange de produits, pose de mini-pompes osmotiques dans la cavité péritonéale sous anesthésie générale, le suivi courant de la cinquième à la vingtième semaine de vie. Le porteur conclut que le passage à ces animaux dits humanisés est "indispensable" pour évaluer une molécule dont les essais sur cellules humaines ont déjà donné, selon lui, des résultats prometteurs.
Objectifs
L'objectif est d’étudier l’effet thérapeutique d’une molécule régulatrice afin d'approfondir notre compréhension des mécanismes d’action de cette molécule sous sa forme native et de les comparer à des formes modifiées dans des modèles de maladies inflammatoires, dont la composante immunitaire est bien décrite. Ce projet fait suite à de précédents travaux au sein de notre équipe et vise ici à tester la meilleure molécule modifiée et ses versions améliorées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’intérêt thérapeutique de cette molécule humaine dans de nouveaux modèles de maladies inflammatoires, ainsi que de confirmer les résultats obtenus précédemment par l’équipe en testant notre molécule modifiée favorite ainsi que ses formes améliorées et optimisées pour une possible utilisation en clinique.
Procédures
Irradiation des souris vigiles (1 fois, 3 minutes/souris) ; Injection des cellules humaines par voie intraveineuse sur souris vigiles (1 fois, 5 minutes/souris) ; Prélèvements sanguins des souris sous anesthésie gazeuse (2 fois les 3-4 premiers mois puis tous les deux semaines, 5 minutes/souris) ; Instillation de mélange de produits en intra-rectal sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes/souris) ; Injection des traitements en intraveineuse (1 fois, 5 minutes/souris) ou en intra-péritonéale (1 fois/jour pendant 10 jours, 2 minutes/souris) sur souris vigiles ; Mise en place des mini-pompes osmotiques dans la cavité péritonéale sous anesthésie générale (1 fois, 30 minutes/souris)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont principalement liés 1. À l'injection de cellules humaines (douleur) ; 2. A l’injection intra-rectale d’un mélange de produits (douleur) ; 3. Intervention chirurgicale pour la mise en place de mini-pompes sous la peau (douleur, saignement) 4. Injection des traitements en intraveineuse ou intra-péritonéale ; 5. Au prélèvement sanguin réalisé derrière l'orbite de l'œil (douleur, saignement). Ces interventions sont réalisées sous anesthésie générale (gazeuse) et/ou analgésie (pré et post-opératoire pour les mini-pompes) pour pallier aux différentes douleurs rencontrées par les animaux, même si elles peuvent néanmoins conduire à une douleur légère et de courte durée, ainsi qu'à un stress.
Devenir
A la fin de l’expérience, tous les animaux seront autopsiés afin d’effectuer des prélèvements d’organes/tissus ce qui justifie l’euthanasie de chaque souris.
Remplacement
Malgré des résultats prometteurs dans les études fonctionnelles in vitro de la molécule native et des molécules modifiées sur cellules humaines, ceux-ci sont limités par l'absence de contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire. Le passage aux modèles in vivo chez des animaux dit « humanisés » (proche de l’homme, car mimant le système immunitaire humain) est indispensable pour évaluer l’effet de cette molécule humaine et de ces nouvelles formes modifiées.
Réduction
Pour ce projet, le nombre minimum d’animaux sera utilisé et analysé par le biais de tests statistiques, permettant d’obtenir des résultats robustes et significatifs. Nous prévoyons d’utiliser au maximum 280 animaux répartis sur 3 protocoles différents. Si nous n’observons pas d’effet in vivo lors de premiers tests (groupe de 3 à 4 souris par expérience), les expériences ne seront pas reproduites et la totalité des souris ne sera donc pas utilisée.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux maximum et auront des formes d’enrichissements à leur disposition (Sizzle nest, tube, dôme) afin de réduire leur stress. Dans tous les protocoles mis en œuvre, les interventions invasives et les interventions chirurgicales plus longues seront effectuées sous anesthésie gazeuse et analgésie ou sous anesthésie générale associée à une analgésie pré et post-opératoire. Les animaux seront suivis quotidiennement dès le début du protocole, au niveau du poids et de l’apparition de signes cliniques. Enfin, des points limites ont été mis en place et seront appliqués en cas de souffrance de l’animal.
Choix des espèces
Ce projet a pour but d’étudier une molécule humaine dans une perspective thérapeutique. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal capable d’accueillir des cellules humaines. Nous avons choisi la souris car certaines lignées particulières n’ont pas de système immunitaire fonctionnel, ce qui permet d’y greffer des cellules humaines sans qu’elles soient rejetées. La souris est également un animal couramment utilisé en recherche, car elle se reproduit facilement, son hébergement est bien maîtrisé et sa manipulation est relativement simple. Les souris recevront les cellules humaines lorsqu’elles auront 4 à 5 semaines, un âge où elles sont assez robustes pour supporter la procédure. Elles seront ensuite suivies jusqu’à environ 16 à 20 semaines, âge auquel leur croissance est terminée et leur poids est stable. Cela facilite les manipulations, comme l’injection des traitements ou les prélèvements d’échantillons, tout en assurant un suivi attentif de leur bien-être.
Etude du rôle de l’IL10 dans l’augmentation des NK après traitement par anti VEGFR2 chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une greffe de cellules tumorales puis une injection de traitement, chacune d'une minute, résument à elles seules les procédures décrites pour 60 souris. Toutes relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes sont tuées à l'issue. La tumeur ainsi implantée peut réduire leur mobilité et leur capacité à se nourrir, et provoquer des nécroses cutanées que le porteur qualifie de très rares, ce qui laisse le protocole tenir en deux minutes de manipulation par animal quand la croissance tumorale, elle, court sur toute la durée de l'étude. Les 60 souris sont mises à mort pour analyser le microenvironnement de leur tumeur.
Objectifs
Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. Plusieurs études se sont déjà attachées à identifier le rôle des différents globules blancs au cours d’un cancer et d’autres études ont montré que la chimiothérapie pouvait moduler les proportions des différentes populations de globules blancs. L’immunothérapie est une catégorie de traitement très prometteur, notamment dans le cancer colorectal mais les conséquences de tels traitements sur les globules blancs restent à déterminer précisément afin de potentiellement améliorer leur efficacité. Le but de ce projet est d’étudier comment l’interaction entre 2 acteurs immunitaires impacte le reste de la réponse immunitaire au sein de la tumeur.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - 2 administrations de 60 secondes chacune pour administrer un traitement unique et afin de permettre le développement d’une tumeur
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis à 2 injections de 1 minute chacune. L’administrations du traitement n’est pas connue pour être particulièrement douloureuses, particulièrement sous anesthésie. L’injection des tumeurs pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. Il est parfois possible d’observer la formation de nécroses cutanées mais elles sont très rares dans le modèle choisi pour cette étude et cette durée d’étude. Les injections sur animaux vigiles pourront entrainer du stress. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (60) pour analyse du microenvironnement tumoral.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. 10 animaux par groupe seront utilisés pour évaluer l’impact ou non de ces différents traitements sur le système immunitaire. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être importantes, nous répèterons les expériences 3 fois de manières indépendantes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à 10 par cage dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Chaque animal sera examiné et pesé 3 fois par semaine, tout le long de l’expérimentation. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. L’injections de cellules tumorales sera réalisée sous anesthésie. Aucune douleur associée à ce geste n’est donc attendue. L’injection de traitement sera réalisée sur des souris vigiles. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.
Choix des espèces
Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation de par l’utilisation de souris génétiquement modifiés. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 14 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature
Modulations pharmacologiques des mécanismes communs dans les différents types d’accidents vasculaires cérébraux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 980
Soixante minutes d'interruption de la circulation dans une artère cérébrale, sans qu'aucun analgésique ne soit administré ensuite. 1 260 souris et 980 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, une partie étant opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil. D'autres subissent une hémorragie intracérébrale provoquée chirurgicalement, une injection intra-artérielle destinée à créer des microhémorragies, ou un drainage d'hématome, auxquels s'ajoutent des traitements quotidiens, des séances d'imagerie de quarante-cinq minutes, des prélèvements sanguins mensuels et des tests de mémoire, d'anxiété et de motricité étalés sur plusieurs semaines. Le recours à deux espèces de rongeurs, le porteur l'appuie sur les recommandations STAIR, un ensemble de critères établis par des experts du domaine.
Objectifs
L’objectif global du projet est de moduler pharmacologiquement les mécanismes communs entre les différents types d’AVC (Accident Vasculaire Cérébral) afin d'en contrer les effets néfastes ou les complications, à court terme ou à long terme.
Bénéfices attendus
Concernant les hémorragies cérébrales, à la phase aiguë (c’est-à-dire jusqu’à 7 jours), ce projet permettra de proposer plusieurs pistes thérapeutiques pour l’évacuation de l’hématome. Au-delà de 7 jours, ce projet permettra de proposer une piste anti-inflammatoire pour contrer les effets délétères de l’œdème présent autour de l’hématome résiduel. En ce qui concerne les ischémies cérébrales, des modulations pharmacologiques à court et et à long terme par des médicaments aux multiples effets permettra d'évaluer les bénéfices de ces traitements sur les troubles de la mémoire et la récupération fonctionnelle post AVC.
Procédures
Les animaux vont être soumis respectivement et de manière unique à - une intervention chirurgicale afin d'induire un accident vasculaire ischémique (interruption de la circulation sanguine dans une artère cérébrale d'une durée de 60 min) - une intervention chirurgicale afin d'induire d'une hémorragie intracérébrale (d'une durée de 30 minutes) - une injection intra-artérielle de molécules permettant la constitution de microhémorragies cérébrales (d'une durée de 10 minutes) - une intervention chrirugicale post hémorragique et drainage de l'hématome (d'une durée de 60 min). Pour l'ensemble de ces procédures, les animaux recevront des traitements pharmacologiques innovants quotidiennement (par voie orale ou par injection d'une durée de 5 minutes par administration), en parrallèle d'évaluations comportementales visant à tester la mémoire, l'anxiété et la motricité (tests s'étalant de quelques heures à plusieurs semaines), de séances d'imagerie (d'une durée de 45 minutes/séance) et de prélèvements sanguins mensuels (5 minutes/prélèvement).
Impact sur les animaux
L'induction des AVC ischémiques et des HIC chez les animaux se fait par une chirurgie réalisée sous anesthésie. Malgré nos précautions, il se peut que cela entraine une gêne chez l'animal à plus ou moins long terme (perte d'appétit, de motivation, augmentation de l'anxiété). De plus, la principale nuisance attendue dans le modèle d'AVC ischémique repose sur le fait qu'aucun analgésique ne sera administré et que cela peut entrainer une douleur. Une perte de mobilité transitoire peut également être observée dans les 72h qui suivent l'intervention. De même, les animaux subiront une IRM nécessitant une anesthésie non invasive sous isoflurane pouvant entrainer un stress et un mal-être chez l'animal mais qui reste proche de l'induction et dont les effets sont minimes et à court terme. De potentiels effets indésirables peuvent apparaitre en fonction des traitements administrés, même si les doses sont non toxiques (troubles digestifs, nuisance liée à la piqure). Une douleur peut être générée lors du prélèvement rétro-orbital. Aucune nuisance n'est attendue lors des tests comportementaux, hormis la légère restriction alimentaire lors d'un test comportemental. La mise en place d'une surveillance rapprochée et de points limites permettra de limiter au maximum ces gênes potentielles (voir document associé).
Devenir
A la fin des protocoles, les animaux seront mis à mort après différents temps d'intérêt, entre 24h et 6 mois post chirurgie, pour des études du tissu cérébral qui nécessitent d'avoir accès à l'organe.
Remplacement
L’expérimentation proposée vise à comprendre les mécanismes impliqués dans la survenue d'un accident vaculaire cérébral. Il s’agit de l’étude d’un trouble physiopathologique intégré faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux mécanismes dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro.
Réduction
L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 2240 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats. Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie.
Raffinement
Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au mieux (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une vigilance particulière sera réalisée sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les mesures spécifiques seront la mise à disposition de gel nutritif enrichi lors d'une perte importante de poids, de la désinfection en cas de plaies et d'un ajout d'enrichissement en cas de comportement aggresif anormal. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique, ou seront mis à mort dans une salle dédiée. La structure du bien-être animal ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air) et de l'enrichissement dans les cages.
Choix des espèces
En accord avec les données de la littérature et surtout afin de stabiliser la reproductibilité et la fiabilité des résultats obtenus, nous avons choisi de travailler sur des animaux (rats et souris) jeunes adultes nous permettant d'envisager des études à long terme. Le choix de 2 espèces de rongeurs repose sur les recommandations STAIR (Stroke Therapy Academic Industry Roundtable) qui rassemblent des critères expérimentaux définis par des experts internationaux et adaptés à l’évaluation expérimentale.
Etude de l’effet de nouvelles cibles thérapeutiques dans un modèle d’inflammation aigue pulmonaire induite par l’administration de Lipopolysaccharide chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Tester les candidats médicaments d'un client donneur d'ordre suppose ici de provoquer une inflammation pulmonaire aiguë par administration de lipopolysaccharide bactérien. 1 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à trente administrations du composé testé et deux prélèvements sanguins sur animal vigile, une partie subissant en fin d'étude une pléthysmographie invasive sous anesthésie profonde, sans réveil. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'évaluer les candidats médicaments sur un "organisme vivant entier", et précise que le client s'engage par contrat à avoir eu recours en amont à tous les modèles "nécessaires".
Objectifs
Les lésions pulmonaires aiguës (ALI : Acute Lung Injury) sont considérées comme une sorte de syndrome clinique critique. Le lipopolysaccharide (LPS) est le composant majeur de la membrane des bactéries Gram négatif. De nombreuses études ont indiqué que les infections à ces bactéries sont parmi les causes les plus importantes des lésions pulmonaires aiguës, et que le LPS peut entraîner des lésions pulmonaires et une réponse inflammatoire. Des études ont démontré que l'administration de LPS peut induire la production de médiateurs inflammatoires. Par conséquent, le but de ce projet est de tester de nouveaux traitements contre l'ALI induite par le LPS. Ce projet est un renouvellement, par conséquent le modèle est bien connu et maitrisé.
Bénéfices attendus
Il n’existe pas encore de pharmacothérapie spécifique aux lésions pulmonaires aiguës (ALI) ayant un effet significatif et uniforme sur le développement de la maladie et la mortalité, bien que les essais précliniques aient montré des résultats prometteurs. Ce projet a pour but de tester de nouveaux médicaments à visée anti-inflammatoire permettant de diminuer ou d’inhiber le développement de la maladie en réduisant l’inflammation pulmonaire. Nous avons pu identifier, dans notre précédent projet, l'effet bénéfique d'une molécule sur la résistance pulmonaire. Grâce à ce nouveau projet, nous espérons pouvoir en identifier de nouvelles ayant également des effets anti-inflammatoires.
Procédures
Administrations de composé: maximum 30 administrations (30 secondes/souris); Prélèvements de sang: maximum 2 prélèvements (30 secondes/souris, maximum 1 prélèvement par semaine) durant l'étude sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal (30 secondes/souris). Dans certains cas, les animaux vont être soumis à la pléthysmographie invasive sous xylasine/kétamine (anesthésie profonde) (durée: 15 minutes, analyse en terminale sans réveil). Une étude d'efficacité de composés durera au maximum 21 jours dans cas d’un traitement préventif ou maximum 6 jours dans le cas d’un traitement curatif.
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie (pic inflammatoires situé de 3.5h à 24h post administration). La douleur pourra générer une perte de poids (2-5% sur 24h) et être quantifiée par des scores attribués quotidiennement (pesée quotidienne). Aucune nuisance n’est attendue lors de l’induction mis à part un léger stress dû à la manipulation. L’administration de traitement par injections répétées (1 à 2x /j ou 2x/semaine pour les i.v.) pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Pour les traitements en gavage (1 à 2x /j), aucune douleur n'est attendue mis à part un léger stress (quelques secondes) lié à la contention des animaux. Le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire la maladie (douleurs inflammatoires). Sur les études réalisées lors de la DAP précédente, 99% de animaux étaient en gravité réelle légère et 1% en gravité modéré. Aucune nuisance n'avait été relevée. Lors de l’analyse de la capacité respiratoire, la douleur sera prise en charge par l’ajout d’un analgésique en plus du cocktail de l’anesthésie général. Le rythme cardiaque est régulier et monitoré durant tout l’enregistrement. De plus les animaux seront mis à mort avant réveil, n’engendrant par conséquent aucune douleur post-opératoire
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.
Remplacement
Nous proposons dans ce projet de mettre en place un modèle d’inflammation pulmonaire chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies. Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale telle que la culture cellulaire, les organoides ou la modélisation informatique ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidats médicaments. Les études in vitro ne permettent pas l’étude des intéractions systémiques (inflammatoires, immunitaires) intervenant dans la maladie. Il est indispensable d’évaluer les candidats médicaments sur un organisme vivant entier. Les effets d’un médicament relèvent en effet de mécanismes extrêmement complexes, qui impliquent la plupart du temps de nombreux organes, interagissant les uns avec les autres. Ces tests permettront notamment de déterminer la dose optimale à administrer lors des essais cliniques qui suivront. Le client donneur d’ordre s’engage sur le contrat signé auprès de notre EU à avoir eu recours à tous les modèles nécessaires, s’ils existent, en amont de l’étude afin de limiter l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire (n=12/groupe maximum, nombre validé par l’expérience acquise des dernières années), dû à la variabilité individuelle observée pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés seront: - le test de Kruskal-Wallis non paramétrique (comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable) - ainsi que la 2way ANOVA (comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 2 variables)
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré. Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec des cylindres de coton, des frisures kraft ainsi que des dômes/tunnels et objet de rongeage en bois dès leur arrivée permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal. Dans le cas d'une analyse de la capacité pulmonaire, la pléthysmographie sera effectuée sous anesthésie générale avec administration d'un analgésique et anesthésique local. La température corporelle sera maintenue constante entre 37 et 38°C par un matelas chauffant. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux pour lesquels les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenue. Ces souris sont mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Notre modèle a été initialement mis au point et développé à partir de données de la littérature. Ce projet est un renouvellement, le modèle est maintenant parfaitement maitrisé, et nous a permis de réaliser des études avec succès lors du précédent projet. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un poumon avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).
Imagerie TEP des récepteurs aux œstrogènes dans le cancer du sein chez la souris (EU1/2).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des cellules de cancer du sein humain sont injectées dans la glande mammaire de souris femelles immunodéprimées, qui sont ensuite gavées quatre jours de suite, mises à jeun une nuit, puis imagées deux fois sous anesthésie générale. 36 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur compte parmi les bénéfices d'"éviter des prélèvements invasifs" aux patientes, et qualifie l'état immunodéprimé des souris de "dommageable" tout en le jugeant "indispensable". Toutes sont tuées après les examens pour que leurs tumeurs soient analysées, faute de quoi les images de TEP ne pourraient pas être validées.
Objectifs
Ce projet, réalisé dans 2 établissements utilisateurs, cherche à savoir si un traceur radioactif utilisé en imagerie médicale peut aider à repérer certaines mutations génétiques dans les cancers du sein. Ce produit imite une hormone féminine, appelée œstrogène, et se fixe normalement sur des récepteurs spécifiques dans les cellules cancéreuses. Or, certaines mutations peuvent empêcher ces récepteurs de fonctionner correctement, rendant les traitements hormonaux inefficaces. L'idée est donc de vérifier si ce traceur peut détecter ces mutations sans avoir besoin de faire un prélèvement et ainsi prédire si un traitement hormonal sera efficace ou non pour chaque patiente.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices majeurs, notamment : 1- Mieux prédire l'efficacité des traitements hormonaux : Certaines patientes atteintes d'un cancer du sein reçoivent un traitement hormonal, mais si leur tumeur présente certaines mutations, ce traitement peut être inefficace. Ce projet pourrait aider à adapter le traitement. 2- Éviter des prélèvements invasifs : actuellement, pour analyser les récepteurs aux hormones féminines et détecter d'éventuelles mutations, il faut prélever un échantillon de la tumeur, ce qui peut être douloureux et risqué.
Procédures
Site 1: Les souris recevront une injection de cellules tumorales humaines pour induire un cancer du sein, ce qui prendra environ 10 minutes par souris, sous anesthésie générale. Elles seront gavées 1x par jours pendant 4 jours avec une molécule permettant l'activation des récépteurs aux oestrogènes dans la tumeur, ce qui prends 1 minutes par souris. Elles seront suivies pendant 11 jours et auront 2 examens d’imagerie médicale à J9 et J11, toujours sous anesthésie générale. Site 2: Le premier examen, d’une durée de 25 minutes, servira à détecter la présence du récepteur aux hormones féminines, grâce à une hormone féminine radioactive. Site 2: Après une nuit de jeun, le second examen d’une durée de 25 minutes, permettra d’observer l'activité métabolique de la tumeur, grâce au glucose radioactif. Cette durée de 25-30 minutes comprend l'injection du produit radioactif (5 minutes), l'anesthésie (2 à 3 minutes), l'examen (11 minutes et 20 secondes) et le réveil de l'animal. Site 2: Avant l'examen de l'activité métabolique de la tumeur, un prélèvement sanguin pour mesurer la glycémie sera effectué sur chaque souris, ce qui prendra au maximum 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables prévus sont les suivants : • Douleur liée à l’injection mammaire des cellules tumorales. • Irritation des muqueuses de l'oesophage • Hypoglycémie potentielle due à un jeûne d’environ 12 heures avant l’examen. • Hypothermie potentielle causée par l’anesthésie générale. • Douleur liée au développement tumoral. • Le modèle de souris immunodéprimées est indispensable pour permettre l’implantation de tumeur humaines sans provoquer de rejet. Cette caractéristique est essentielle pour garantir la validité des résultats dans un contexte préclinique visant à reproduire au mieux lce qui est observé chez l’humain. L’état immunodéprimé des souris peut entraîner une vulnérabilité accrue aux infections. Bien que les animaux soient maintenus dans des environnements strictement contrôlés, cette condition est considérée comme dommageable. Cette nuisance est compensée par une surveillance quotidienne rigoureuse et des conditions d’hébergement adaptées, visant à minimiser les impacts sur le bien-être des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés après les examens pour permettre l’analyse des tumeurs. Ces analyses sont essentielles pour valider les données obtenues lors des examens d’imagerie.
Remplacement
Les expériences sur les cellules en laboratoire ne permettent pas de reproduire précisément les interactions complexes entre les cellules tumorales, les vaisseaux sanguins et les tissus environnants. L’utilisation d’un modèle vivant est donc nécessaire pour répondre aux questions posées par le projet.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé en fonction d’analyses statistiques basées sur des résultats préalablement obtenus, et des données bibliographiques, afin de minimiser les effectifs nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. De plus, les techniques d'imagerie choisies permettent de suivre les animaux tout au long de l'étude sans avoir à les euthanasier à chaque étape, ce qui réduit considérablement le nombre d'animaux nécessaires. Un groupe de 6 souris a dû être ajouté à l'étude initiale du fait du non livraison de traceur.
Raffinement
À leur arrivée, les souris seront installées dans des cages adaptées, avec de la litière changée régulièrement, un enrichissement (comme des tunnels et du coton), ainsi que de la nourriture et de l’eau à volonté. Elles auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement. Ensuite, une injection sera faite afin que les souris développent une tumeur. Leur état sera suivi de près : on surveillera la taille de la tumeur pour s’assurer qu’elle ne grossisse pas trop, et on vérifiera aussi régulièrement leur poids. À partir du 5ème jour, elles seront gavées avec la molécule qui induit l'expression des récepteurs aux œstrogènes. Ce produit peut induire une déshydratation des souris lorsqu'il est donné dans l'eau de boisson, le gavage permet donc d'éviter cet effet indésirable. Pour les examens d’imagerie, les souris seront anesthésiées afin qu’elles restent immobiles. Elles seront placées sur un lit chauffant pour ne pas avoir froid, et leur respiration et leur cœur seront surveillés en continu. Une fois l’examen terminé, elles resteront sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil. Certains examens demandent aux souris d’être à jeun pendant une nuit. Comme cela peut baisser leur taux de sucre, on vérifiera leur glycémie en prélevant une goutte de sang avant de commencer. Pendant toute la durée de cette étude, nous appliquerons les points limites que nous nous sommes fixés afin d’éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Des souris femelles immunodéprimées seront utilisées pour permettre l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Le cancer étudié étant le cancer du sein, il est plus représentatif de la réalité clinique d’utiliser des femelles. De plus, des femelles âgées de 9 semaines ont une glande mammaire suffisamment développée pour garantir une injection correctement localisée.
Efficacité in vivo de nouveaux composés dérivés des flavonoïdes dans le glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Quinze gavages par animal et une greffe de cellules tumorales directement dans le cerveau, opération de trente minutes : 61 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées, dans le cadre d'études de survie, pour l'analyse histologique des cerveaux ou à l'issue de la recherche de dose maximale tolérée. Il s'agit de tester des dérivés de flavonoïdes contre le glioblastome, la croissance de la tumeur entraînant perte d'appétit, dénutrition et perte de poids, et la craniotomie des douleurs après l'opération. Les souris utilisées sont des nude immunodéficientes, choisies pour accepter la greffe de cellules humaines, et le décompte annonce 45 animaux greffés et 61 recevant le composé par voie orale pour un effectif total de 61.
Objectifs
L'objectif du projet est d'évaluer le potentiel anti-tumoral de nouveaux dérivés de flavonoïdes sur un modèle murin de glioblastome. Des études in vitro dans nos équipes ont montré l’efficacité de ces nouveaux composés sur la croissance des cellules tumorales de glioblastome, ainsi que sur des modèles ex vivo (tumoroïdes de glioblastome). La validation in vivo de l'efficacité de ces composés sur la progression de la tumeur pourrait permettre la mise en place d’une nouvelle stratégie thérapeutique contre le glioblastome.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est une tumeur cérébrale dont le pronostic est sombre. Il n’existe aucun traitement curatif et la survie médiane des patients est de un an environ avec un traitement combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. La validation in vivo de l'efficacité antitumorale de ces nouveaux composés permettrait la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le glioblastome.
Procédures
Les animaux recevront une greffe intracérébrale de cellules tumorales (45 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ). La greffe intracérébrale est une procédure chirurgicale. Des animaux recevront une administration orale de composé anticancéreux ou de solvant (61 animaux, intervention de 30 secondes environ, 15 interventions/animal).
Impact sur les animaux
La manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques ou d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La craniotomie peut générer des douleurs post-opératoires. La progression tumorale provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids. Des souris seront traitées par gavage. Les souris nude sont immunodéficientes.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études de survie, pour les analyses histologiques (prélèvement de cerveaux) et à la fin de l'étude de dose maximum tolérée (une semaine après la dernière administration).
Remplacement
L'efficacité thérapeutique de ces nouveaux dérivés de flavonoïdes sur la croissance tumorale de tumeurs cérébrales nécessitent une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment robuste pour mimer toute la complexité biologique et physiologique de ces tumeurs. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit dans la continuité d'expériences et de résultats que nous avons obtenus in vitro et ex vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux sera limité au strict minimum requis pour l'obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement. Des cages pourvues de couvercles filtrants seront disposées dans une armoire ventilée. Les animaux seront anesthésiés avant l’intervention chirurgicale. Avant chirurgie et en post- opératoire, une analgésie est prévue. Pour les administrations orales, nous utiliserons des sondes souples. Un anesthésique local sera injecté sur le site d’incision et appliqué aux points de pression de l’appareil stéréotaxique. Du sérum physiologique préchauffé sera injecté pour hydrater et réchauffer l’animal. Un onguent ophtalmique sera appliqué sur les yeux durant la chirurgie pour assurer leur hydratation. Pour les administrations orales, nous utiliserons des sondes souples pour éviter la moindre irritation ou blessure. Des croquettes imbibées d’eau et de la gelée nutritive seront déposées dans la cage après la chirurgie pour faciliter la prise alimentaire. La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d'une grille de score. En fonction des scores obtenus, il sera envisagé une analgésie ou l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales. L'utilisation de lignées murines immunodéficientes permet la transplantation de cellules d'une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d'une espèce différente (souris). Les tumeurs de glioblastome générées dans ce modèle animal sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 5 semaines et utilisées à l’âge de 6 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ces modèles physiopathologiques.
Étude des altérations du protéome de manière pathologie-spécifique dans des modèles murins de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Établir quelles protéines des neurones et des astrocytes se modifient dans la maladie d'Alzheimer conduit à utiliser 978 souris, dont des modèles transgéniques et des porteuses du facteur de risque ApoE. Toutes relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Elles reçoivent une injection sous anesthésie vers quatre ou cinq mois, puis une injection quotidienne pendant deux semaines, et la moitié passe un mois sous régime modifié destiné à supprimer les cellules immunitaires du cerveau. Paralysie des membres postérieurs, épilepsie, hydrocéphalie et malocclusion sont annoncées comme phénotypes possibles. Le porteur n'utilise que des mâles, en indiquant que le recours aux deux sexes exigerait un nombre d'animaux "bien trop important d'un point de vue éthique", tout en reconnaissant que ce serait un atout scientifique.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle aucun remède n’existe à ce jour. Les pathologies Alzheimer dans le cerveau, ainsi que la neuroinflammation, sont des caractéristiques de la MA qui entraînent une perte synaptique et neuronale, constituant la base du déclin cognitif. Certains gènes sont connus pour contribuer à la neurodégénérescence, à la neuroinflammation, aux pathologies Alzheimer, mais les mécanismes restent encore mal compris. Nos études suggèrent que les microglies (cellules immunitaires du cerveau) et les astrocytes (cellules nourricières des neurones) pourraient être des médiateurs de cette toxicité génétique, mais des études sont nécessaires pour confirmer ou infirmer cette hypothèse. L'investigation des changements protéomiques des neurones et des astrocytes causés par les pathologies Alzheimer, ainsi que le rôle de certains gènes pro-Alzheimer et des microglies dans ces processus, est donc essentielle pour comprendre la MA et développer des traitements efficaces. Le projet vise à dévoiler comment 1) les pathologies Alzheimer, 2) les facteurs de risques génétiques, et 3) les microglies modifient les protéines des neurones et des astrocytes, conduisant à la neurodégénérescence. Nous utiliserons des souris : 1) contrôles (saines), 2) modèles Alzheimer, en présence ou en absence de microglies. Nous utiliserons également des souris exprimant le principal facteur de risque génétique (ApoE) de la MA. Cette étude nous permettra d'identifier avec précision les changements protéomiques émergents induits par la MA dans les neurones et les astrocytes.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence neuronale dans la MA. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des effets néfastes des pathologies Alzheimer et des microglies pour préserver les neurones et qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.
Procédures
Tous les animaux subiront une anesthésie gazeuse afin de recevoir une injection unique à 4/5 mois. Tous les animaux vigiles subiront une injection quotidienne (environ 30 secondes) pendant 2 semaines avant la fin du protocol. Un mois avant l'euthanasie et la collecte des tissus pour les 2 cohortes, la moitié des souris seront traité avec une diète modifiée afin de supprimer les cellules immunitaires dans le cerveau pendant un mois (soit à 6 ou à 9 mois).
Impact sur les animaux
L'injection unique à 4/5 mois peut générer une douleur, un saignement ou une inflammation. Les injections quotidienne pendant 2 semaines peuvent entraîner un stress et une douleur de courte durée et un risque d'infection. Un de nos modèles de la maladie d'Alzheimer peut développer une paralysie des membres postérieurs qui pourra à la longue les empêcher d'accéder normalement à la nourriture et à l'eau. Ces souris peuvent aussi faire de l'épilepsie, de l’hydrocéphalie et de la malocclusion (mauvais alignement des dents) qui pourront générer de la souffrance, du stress et une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analysé.
Remplacement
Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence neuronale ainsi que les pathologies alzheimer sont très/assez difficiles à obtenir in vitro. Les souris modèles de la maladie d'Alzheimer du projet représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence neuronale et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte neuronale ainsi que les pathologies tau et amyloïde, nous nous tournons donc vers ce modèle murin.
Réduction
Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Pour analyser comment les différentes pathologies alzheimer et les cellules immunitaires du cerveau modifient les protéines des neurones et des astrocytes (cellules nouricières du cerveau), nous utiliserons des mâles et des femelles. Concernant le rôle de certaines prédisposition génétiques, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Les mâles et les femelles ne peuvent pas être analyser ensemble car les souris alzheimer ont une variabilité pathologique importante entre mâles et femelles. Nous utiliserons les mâles car ils développent une pathologie plus tôt par rapport aux femelles. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les mécanismes découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.
Raffinement
Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages enrichies. Une observation quotidienne sera effectuée afin de s’assurer de leur bien-être. Lors des injections, chaque souris sera anesthésiée et recevra un anesthésiant. Une attention particulière sera portée aux souris lors des observations pour détecter d’éventuels effets indésirables. Comme un des modèles peut développer des phénotypes dommageables, des points limites stricts ont été définis et seront appliqués afin de réduire les nuisances causées aux animaux.
Choix des espèces
Les souris modèles Alzheimer constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, les pathologies cérébrales, ainsi que la neurodégénérescence progressive responsable des troubles cognitifs dans la maladie Alzheimer sont très difficilement modélisables in vitro et nécessites des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. - Une cohorte sera utilisée à 7 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades précoces de la maladie sans neurodégénérescence mais avec pathologies Alzheimer. - Une cohorte sera utilisée à 10 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la maladie avec neurodégénérescence résultant des pathologies Alzheimer.
Potentiel thérapeutique d’agonistes dans les déficits en ocytocine
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Opérées deux heures pour l'implantation d'un détecteur d'activité neuronale, ou tuées par ponction cardiaque sous anesthésie terminale, 4 828 souris vont être utilisées dans ce projet. 2 556 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 2 272 un niveau léger, toutes tuées pour des analyses ex vivo. L'objectif est de vérifier si l'activation d'une protéine restaure la sécrétion d'ocytocine chez des modèles murins d'autisme et de myopathie de Duchenne, jusqu'à sept tests de comportement et de force étant pratiqués par animal. Le porteur décrit ces tests comme des situations "soit non anxiogènes ou très peu", et fonde l'effectif de 4 828 animaux sur sa seule expérience du domaine.
Objectifs
De multiples maladies cérébrales sont associées à un déficit d’ocytocine (OT) et de vasopressine (VP), une neurohormone importante dans nos capacités d’interactions sociales et dans les comportements anxieux. Ceci concerne notamment des maladies neurodéveloppementales très différentes telles que le trouble du spectre de l’autisme (TSA) et les déficiences intellectuelles. Une possibilité intéressante émerge de nos données : améliorer la sécrétion endogène d'OT et/ou de VP cérébrale pour favoriser une libération physiologiquement appropriée. En effet , il a été démontré qu'une protéine joue un rôle majeur dans la libération d'OT et de VP par les neurones. Ainsi, le but de ce projet est de fournir la preuve de concept que cette protéine peut être pharmacologiquement ciblé pour restaurer les niveaux de ces neuropeptides dans des conditions pathologiques pour lesquelles elle sontt déficientes : le TSA, la myopathie de Duchenne (DMD) et la corticothérapie.
Bénéfices attendus
Les essais cliniques portant sur l’efficacité de l’administration exogène d’OT ne montrent pas de bénéfice à long-terme. Ce revers incite à une réévaluation de l'approche de supplémentation pour proposer des stratégies alternatives : augmenter la sécrétion endogène d'OT du cerveau pour obtenir une libération physiologiquement appropriée de ce neuropeptide. Cependant, cette quête est confrontée au défi important d'une compréhension insuffisante des mécanismes contrôlant la sécrétion d'OT. Notre étude permettra ainsi d’évaluer l'efficacité de l’activation de cette protéine comme stratégie thérapeutique de correction des sécrétions endogène d'OT mais également de VP dans des modèles murins de pathologies distinctes : TSA et DMD. Nous proposons en outre de tester si cette stratégie thérapeutique peut être efficace pour atténuer les effets secondaires associés à la corticothérapie dans la DMD. La corticothérapie étant utilisée dans de multiples maladies cérébrales associées à une neuroinflammation (par exemple, la sclérose en plaques, les lésions cérébrales périnatales, la neuroinflammation induite par le stress et la dégénérescence), nos résultats ont le potentiel d'avoir un impact thérapeutique élevé sur un certain nombre de conditions pathologiques.
Procédures
Une perfusion intracardiaque sous anesthésie sera réalisée sur les animaux pour un prélèvement du cerveau afin de réaliser une étude d'immunomarquage sur le cerveau ainsi fixé. La durée de cette procédure est de 30 minutes. Des souris seront sujettes à une intervention chirurgicale sous anesthésie pour analyser les variations cérébrales d'ocytocine et de vasopressine. La durée de cette procédure est d'une heure. Des souris seront également sujettes à une intervention chirurgicale d'une durée de deux heures visant à l'implantation d'un détecteur d'activité neuronale. Finalement, des animaux subiront une ponction cardiaque sous anesthésie afin de pouvoir mesurer l'ocytocine et la vasopressine plasmatique. Certain animaux subiront une série de tests comportementaux qui sera réalisée une seule fois après 5 semaines de traitement. Les tests d'une durée de 5 à 15 minutes seront réalisés une seule fois (un seul essai) avec des délais entre tests de 24h. Il y aura au maximun pour une souris 5 tests pour l'analyse comportementale et 2 tests pour l'évaluation de la force soit 7 tests maximun.
Impact sur les animaux
La contention ainsi que l’injection d’analgésique et d’anesthésique peuvent engendrer un stress chez l’animal. Certains animaux seront soumis à une chirurgie sous-anesthésie. Les animaux impliqués dans les tests d'évaluations comportementales sont dans des situations soit non anxiogènes ou très peu, n’impliquant pas de stress ou inconfort majeur. Finalement, des animaux subiront une ponction cardiaque sous anesthésie profonde et terminale sans réveil.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour l'analyses de parametres physiologiques ex vivo.
Remplacement
Le but du projet est d'étudier le potentiel thérapeutique de molécules dans la sécrétion de neurohormones qui regissent de nombreuses fonctions physiologiques et comportementales et dont la dérégulation est impliqué en dans de nombreuses maladies neurodéveloppementales. Dans ce contexte il est necessaire d'utiliser des animaux et un tissu nerveux intact afin de comprendre les mécanismes qui régulent les fonctions patho-physiologiques et comportementales liés à ces neurohormones hypothalamique. Effectuer cette étude sur un système in vitro aboutirait à une étude de processus non-physiologiques et ne serait donc pas pertinent.
Réduction
Pour réduire autant que possible le nombre d'animaux nécessaires, le nombre de souris total nécessaire utilisé pour chacune des stratégies correspond à notre expérience dans le domaine pour assurer la validité statistique des résultats.
Raffinement
Pour toute chirurgie, les animaux recevront les doses nécessaires d’anesthésiques, analgésiques et antalgiques en pré- et postopératoire. Les jours suivant l'opération chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés tous les jours par l'expérimentateur et/ou les animaliers (avec une fiche post-opératoire pour chaque animal), et recevront si besoin un analgésique. Une grille de score avec des points limites précoces pour évaluer le bien être des souris sera utilisée. Pendant la période de repos, aucune manipulation expérimentale n’est entreprise.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère dont le système nerveux central présente de nombreuses analogies avec les mammifères supérieur (dont l'humain). La grande maitrise des méthodes d'élevages, des conditions de bien-être animal et la haute standardisation des lignées en fait un organisme de choix pour une étude physiologique des interactions neurogliales. De plus, la modification génétique indispensable à la réalisation de ce projet est seulement disponible chez la souris. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 6 semaines, âge auquel les souris peuvent être traitées 5 semaines et être étudier à l’âge adulte (3 mois). Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 2 à 3 mois, âge auquel, la plupart des expériences décrites dans la littérature ont été réalisées. A ce stade de 2 mois, les animaux ont un cerveau qui a fini son développement et les animaux présentent un comportement d’adulte.
Étude du rôle du gène H13 au cours du développement chez la souris pour évaluer son implication dans une maladie rare, le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Colin.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Des souris construites pour porter l'anomalie d'empreinte parentale en cause dans le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin peuvent présenter un retard de croissance, un museau déformé, des troubles de l'alimentation et un tonus musculaire faible. 740 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont une lignée jamais étudiée pour laquelle 40 animaux font l'objet d'une surveillance renforcée. 240 sont pesées chaque semaine de 2 à 12 semaines, 120 embryons sont prélevés 14 jours et demi après la fécondation, 144 passent jusqu'à six tests moteurs et de mémoire, et 60 subissent deux prélèvements sanguins sans anesthésie. Toutes sont tuées à la fin du protocole, la majorité de leurs organes étant disséquée pour des analyses moléculaires et anatomopathologiques.
Objectifs
A la fécondation, nous héritons de deux copies de chaque gène, une de notre mère et une de notre père. Contrairement à la plupart des gènes qui sont activés de façon identique sur les deux copies, certains gènes sont activés différemment selon qu'ils proviennent du père ou de la mère. Ce phénomène, appelé "empreinte parentale", joue un rôle essentiel dans le bon déroulement de la croissance et du développement. Ainsi, lorsqu'une erreur survient dans ce mécanisme, cela peut entraîner des maladies rares. C’est le cas du syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin, qui se traduit par un retard de croissance, des difficultés pour s’alimenter et d’autres troubles du développement. Cette maladie est liée à une anomalie où un enfant reçoit deux copies d'un même chromosome uniquement de sa mère, au lieu d'une copie de chaque parent, ce qui perturbe l'équilibre nécessaire à une croissance normale. Afin de mieux comprendre les conséquences de ces erreurs d’empreinte, ce projet utilisera des lignées de cellules et de souris génétiquement modifiées. Plus précisément, les souris permettront d’étudier comment la transmission d’une modification génétique par la mère ou par le père influence la croissance, l’alimentation, le métabolisme et le développement général de l’animal. En comparant les effets selon l’origine maternelle ou paternelle, nous pourrons mieux cerner les mécanismes qui conduisent à l’apparition de troubles du développement. Ces recherches visent à améliorer la compréhension de ces maladies rares et pourraient, à long terme, aider à mettre en place de nouvelles stratégies de diagnostic et de traitement pour les patients.
Bénéfices attendus
Les maladies rares touchent environ 6 % de la population mondiale, ce qui constitue un enjeu important pour la santé humaine. La majorité d’entre elles sont dues à des anomalies génétiques et comprendre les causes de ces maladies est essentiel pour pouvoir mieux les diagnostiquer et, à terme, proposer des traitements plus adaptés. Ce projet s’intéresse à une maladie rare identifiée récemment, qui s’appelle le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin. Cette maladie provoque notamment des troubles de la croissance et du développement. Pour mieux comprendre ses origines, nous allons étudier une région de l’ADN, qui pourrait être impliquée dans son apparition. Grâce à des expériences menées chez la souris, nous allons analyser si des anomalies dans cette zone peuvent provoquer des symptômes similaires à ceux observés chez les patients. Si c’est le cas, cela permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de cette maladie. Cela pourrait aussi aider à identifier d'autres personnes atteintes de symptômes proches, mais dont la cause génétique n’a pas encore été trouvée. À terme, ce travail pourra contribuer à améliorer le diagnostic des maladies rares liées à la croissance et au développement, et ouvrir de nouvelles pistes pour aider les patients.
Procédures
Dans ce projet, plusieurs interventions seront réalisées afin d'étudier la croissance et le développement de différent modèle de souris. Pour l’une des lignées qui n’a jamais encore été étudiée, 40 animaux seront suivis de manière renforcée pour détecter tout signe de mal-être. Pour le suivi de la croissance après la naissance, 240 souris seront pesées une fois par semaine, de l’âge de 2 semaines à 12 semaines. Pour l’étude de la croissance embryonnaire, 120 embryons seront prélevés 14,5 jours après la fécondation (et 120 embryons à un autre stade si nécessaire) pour mesurer leur taille et leur poids. Parmi les souris dont la croissance aura été suivie, 144 seront soumises à des tests moteurs et neurodéveloppementaux, de difficulté légère à modérée, pour évaluer leurs capacités motrices, leur mémoire et leur niveau d'anxiété. Les nouveau-nés seront testés pour leur tonus musculaire entre 5 et 10 jours après la naissance. Ces manipulations seront brèves et limitées à 3 fois par animal. Chez les souris plus âgées, entre l’âge de 2 et 6 mois environ 144 souris seront observées pour évaluer leur activité motrice, leur équilibre, leur comportement face à des situations nouvelles ou légèrement stressantes, ainsi que leur capacité à mémoriser de simples trajets. Chaque animal réalisera jusqu’à 3 sessions d’observations espacées dans le temps (une toutes les 6 à 8 semaines environ), pour un total de 6 tests maximum par animal. Chaque session durera entre 5 et 30 minutes. Deux prélèvements sanguins (4 et 8 semaines) seront effectués sur 60 souris pour mesurer les hormones de croissance. Les prélèvements seront effectués sans anesthésie mais avec contention adaptée, par des personnes expérimentées.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés pourraient présenter certains signes observés dans une étude précédente, et proches de ceux décrits chez les personnes atteintes de la maladie étudiée. Cela peut inclure un retard de croissance, une augmentation du contenu minéral des os, une forme anormale du museau, des difficultés à bien réguler le taux de sucre après les repas, ainsi que des troubles de l’alimentation ou un tonus musculaire plus faible. Les interventions réalisées sur les animaux seront toutes effectués pour limiter l’inconfort des animaux. L’identification et le prélèvement pour analyse génétique seront réalisés une seule fois pour chaque animal. Cela pourra entraîner une gêne passagère et un stress très léger. Le suivi du poids, qui sera effectué chaque semaine, est une manipulation simple et rapide. Elle pourra générer un stress léger lié à la manipulation répétée. Les prélèvements sanguins, qui seront effectués au maximum deux fois dans la vie des animaux, pourra provoquer une gêne temporaire lors du prélèvement et un léger stress lié à la contention. Le test pour vérifier le tonus musculaire des nouveau-nés pourra entraîner un inconfort très bref dû à la manipulation. Les tests comportementaux réalisés sur les animaux plus âgés consisteront à observer leur activité, leur réaction à des environnements nouveaux ou leur capacité de mémoire. Ces observations, espacées dans le temps et limitées en nombre, pourront provoquer un stress passager lié à la nouveauté ou à une situation inhabituelle mais ne causeront pas de douleur.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés au cours des différentes procédures du projet décrit ici sera mis à mort à la fin du protocole. La majorité des organes sera disséquée et prélevée afin de poursuivre les études moléculaires et anatomo-pathologiques après avoir caractérisé le phénotype global des animaux.
Remplacement
Ce projet a pour but de mieux comprendre la fonction d’une région particulière de l’ADN, afin de savoir si elle joue un rôle dans une maladie rare qui affecte la croissance et le développement. Cette maladie entraîne notamment un retard de croissance, des difficultés de développement, et des problèmes touchant les muscles et les os. Pour répondre à cette question, nous utiliserons comme modèle la souris. Ce choix est nécessaire, car certains signes de la maladie – comme les retards de croissance ou les effets sur le développement de l’embryon – ne peuvent être étudiés que dans un organisme complet, en développement. Par exemple, pour savoir si un retard de croissance est lié à un problème de placenta (organe qui nourrit le bébé pendant la grossesse), il faut observer l’embryon au cours de son développement dans l’utérus, ce qui n’est pas possible sans utiliser un animal entier. En parallèle, certaines analyses plus fines, qui concernent l’activité de cette région de l’ADN seront faites en laboratoire sur des cellules. Ces cellules sont soit déjà disponibles, soit seront prélevées sur les animaux pour être étudiées sans avoir besoin d’utiliser à nouveau un animal entier.
Réduction
Le projet a été conçu pour utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, tout en obtenant des résultats fiables et exploitables. Pour cela, les animaux sont élevés de manière optimisée : certaines portées contiendront à la fois les animaux à étudier ainsi que des contrôles, ce qui réduit le nombre total nécessaire. Les animaux participeront à plusieurs étapes de l’étude afin d’éviter les doublons : par exemple, les mêmes souris seront suivies pour leur croissance, soumises à des tests neuro développementaux simples, et recevront des prises de sang espacées. À la fin de l’étude, leurs organes seront conservés pour de futures analyses en laboratoire, ce qui permettra de continuer les recherches sans utiliser d'autres animaux.
Raffinement
Les animaux seront surveillés tous les jours par l’expérimentateur ou le personnel de l’animalerie afin de détecter rapidement tout signe de souffrance, et d’intervenir si nécessaire. Pour identifier les animaux, un prélèvement sera réalisé sur l’oreille. Cette procédure, effectuée par du personnel expérimenté, sera aussi rapide que possible pour limiter l’inconfort. La zone sera ensuite surveillée pendant deux jours afin de s’assurer qu’il n’y ait pas de complication. Certains animaux pourraient présenter des difficultés de croissance ou d’alimentation. Dans ce cas, un suivi renforcé sera mis en place, notamment par une surveillance régulière du poids. Si une perte de poids importante est constatée ou si l’animal montre des signes de difficulté à se nourrir, une alimentation spéciale et enrichie sera proposée. Pour l’un des modèles, pour lequel aucune donnée n’est disponible, une attention particulière sera portée sur deux générations. Des grilles d’observation standardisées permettront de décider si une surveillance renforcée est nécessaire ou, en cas de signes trop sévères, si l’animal doit être euthanasié. Enfin, tous les animaux vivront dans des cages spacieuses, en petits groupes, avec des éléments pour les stimuler et leur offrir du confort (abris en carton, papier pour faire des nids), conformément aux règles en vigueur.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle pour cette étude car elle partage avec l’être humain certains mécanismes importants (tel que celui étudié ici, l’empreinte parentale), ce qui permet d’étudier leur rôle dans des maladies humaines rares. Un modèle de souris spécialement conçu pour cette recherche existe déjà, ce qui permet de gagner du temps et d’utiliser des données déjà disponibles. La souris est aussi une espèce bien connue des chercheurs, pour laquelle de nombreux outils facilitent les analyses. Les souris utilisées seront âgées de quelques semaines à un an. Les études sur les jeunes souris commenceront à partir de 2 semaines après la naissance, pour suivre leur croissance et leurs comportements jusqu’à l’âge adulte. Pour comprendre les effets pendant la grossesse, certaines observations seront aussi faites sur les fœtus à différents moments de leur développement, en commençant par un stade précis et en adaptant ensuite si besoin.