Souris

Incision d'un centimètre à l'abdomen ou au crâne sous guidage stéréotaxique, injection de cellules tumorales, suture par clips retirés sept à quatorze jours plus tard sous une nouvelle anesthésie : 696 souris passent par cette chirurgie. 796 souris en tout vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une centaine d'entre elles développant spontanément des tumeurs mammaires vers vingt-quatre semaines. Il s'agit de faire exprimer aux cellules cancéreuses un antigène synthétique, un drapeau artificiel que des anticorps ou des macrophages génétiquement modifiés viendraient reconnaître, sur des protocoles pouvant durer huit mois. Le porteur écrit que l'isolement des animaux sera évité, puis qu'un isolement temporaire pourrait être envisagé si les clips de suture provoquent des comportements agressifs entre souris.

Objectifs

Ce projet vise à développer une nouvelle approche d’immunothérapie contre le cancer, capable de s’attaquer à un grand nombre de tumeurs solides, en contournant l’une des principales limites actuelles : la variabilité des antigènes tumoraux d’un patient à l’autre, voire au sein d’une même tumeur. Notre idée repose sur l’introduction dans les cellules cancéreuses d’un antigène synthétique, une sorte de « drapeau » artificiel qui signale la cellule cancéreuse au système immunitaire. Ce marquage pourrait ensuite être reconnu par des traitements immunothérapeutiques spécialement conçus pour cibler cet antigène. Le projet se structure autour de trois axes complémentaires : 1. Création de modèles de tumeurs exprimant l’antigène synthétique Nous développerons des lignées de cellules tumorales murines, notamment de cancer du sein et de tumeurs cérébrales (gliomes), modifiées pour exprimer cet antigène à leur surface. Ces lignées seront ensuite utilisées dans des souris avec un système immunitaire fonctionnel, afin d’étudier si le système immunitaire est capable de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses ainsi marquées. 2. Utilisation de vecteurs viraux pour délivrer l’antigène dans les tumeurs Nous utiliserons des petits virus à ADN non pathogènes, déjà bien connus pour leur sécurité, pour introduire le gène de l’antigène synthétique directement dans les cellules tumorales. Ces virus seront conçus pour cibler uniquement les cellules cancéreuses, grâce à des systèmes de régulation activés spécifiquement dans l’environnement tumoral. L’objectif est de garantir une expression du marqueur uniquement dans la tumeur, sans affecter les tissus sains. 3. Développement de traitements ciblés contre cet antigène Enfin, nous concevrons deux types d’immunothérapies ciblant spécifiquement cet antigène : des anticorps thérapeutiques, et des macrophages génétiquement modifiés (CAR-M). Ces cellules modifiées seront capables de reconnaître, attaquer et éliminer les cellules cancéreuses marquées, tout en stimulant une réponse immunitaire plus large contre la tumeur.

Bénéfices attendus

Ce projet représente une avancée majeure dans le développement d’une nouvelle immunothérapie capable de cibler spécifiquement les tumeurs solides du sein et du cerveau, en combinant l’utilisation d’un antigène synthétique, de vecteurs viraux adaptés et de traitements innovants tels que les anticorps thérapeutiques et les macrophages génétiquement modifiés (CAR-M). À court terme, il permettra de surmonter les limites des thérapies actuelles en offrant une méthode plus efficace et sécurisée pour éliminer les cellules tumorales, tout en limitant les effets sur les tissus sains. À plus long terme, cette approche pourrait être étendue à d’autres types de cancers solides, élargissant ainsi son impact thérapeutique. Par ailleurs, le projet vise à établir un protocole robuste pour l’intégration de cette stratégie dans les traitements cellulaires de nouvelle génération, améliorant la précision et la sécurité des immunothérapies. Enfin, si les résultats précliniques sont prometteurs, ce travail ouvrira la voie à une première application clinique, offrant une nouvelle option aux patients souffrant de tumeurs résistantes et contribuant ainsi à améliorer significativement leur prise en charge.

Procédures

Le projet se déroulera en 5 parties dont plusieurs étapes sont communes. Une partie des animaux (696 souris) sera pesée (1 min) puis recevra une injection d'anti-douleur (30 sec) avant d'être anesthésiée par voie gazeuse (durée anesthésie : 20 min). Sous anesthésie, une incision de 1 cm maximum sera réalisée au niveau de l'abdomen (348 animaux) ou du crâne à l'aide d'un appareil de guidage spécifique (348 animaux) (durée : 1 min). Des cellules tumorales seront alors injectées au niveau du site (1min) et une suture sera réalisée au moyen de clips (1 min). Les clips seront retirés après cicatrisation (7 à 14 jours) sous anesthésie gazeuse (durée : 5 min). Pour les modèles cérébraux (348 animaux), un système de canule de traitement sera mis en place afin de limiter de multiples interventions chirurgicales pour le traitement des tumeurs. Le poids des souris sera évalué 2 fois par semaine (1 min) et la croissance des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine au moyen d'un pied à coulisse (348 animaux ; 2 min) ou par imagerie sous anesthésie (348 animaux ; durée anesthésie : 20 min). Pour l'imagerie, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et maintenus sous anesthésie à l’aide d’un masque. Ils recevront ensuite l’injection d’une molécule permettant la réalisation de l’imagerie (durée : 30 sec). Dans les parties 1 et 2, 32 animaux recevront un traitement dans leur eau de boisson. Dans les parties 3, 4 et 5, une semaine après l'injection des cellules tumorales, 536 animaux recevront 1 à 2 injections de petits virus à ADN non pathogènes ou d’immunothérapies espacées de 4/5 jours (durée : 1 à 6 min) au niveau de la tumeur ou par voie générale. Pour 250 souris, cette injection se fera sous anesthésie gazeuse (durée 20 min). En parallèle, nous utiliserons dans la partie 5, des animaux (100 souris) développant spontanément des tumeurs au niveau mammaire à 24 sem. d'âge environ. Le poids des souris sera évalué 2 fois /semaine (1 min) et la croissance des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine avec un pied à coulisse (2 min). Ces animaux recevront 1 à 2 injections de petits virus à ADN non pathogènes ou d’immunothérapies espacées de 5 jours (durée : 1 à 6 minutes) au niveau de la tumeur. Les animaux seront surveillés quotidiennement selon des critères précis. Au moindre signe de souffrance, les animaux seront mis à mort selon la méthode réglementaire définie (durée max des procédures : 8mois).

Impact sur les animaux

Les procédures que nous prévoyons de réaliser pourraient être à l’origine d’un stress lié à la manipulation. De plus, le développement de tumeurs sur l’abdomen de l’animal ou au niveau de la zone subventriculaire du cerveau des animaux pourrait être à l’origine d’une faible gêne de la mobilité ou encore une potentielle perte de poids de l’animal. L’étape initiale d’injection des cellules nécessitant une anesthésie gazeuse, les animaux pourraient souffrir de stress au cours de cette manipulation qui serait de quelques minutes (2 ou 3 minutes jusqu’à l’anesthésie complète). Les pesées et mesures de masse tumorale pourront également conduire à un stress léger de courte durée (1 minute) répété deux fois par semaine. Malgré les précautions prises, l’utilisation de clips pour la suture des animaux après injection des cellules cancéreuses pourrait provoquer un inconfort ou des comportements agressifs inter-individuels jusqu’à la cicatrisation complète (5 à 7 jours). Dans ce cas, un isolement temporaire pourrait être envisagé après avis de la structure de Bien-être des Animaux et en accord avec les recommandations ministérielles. Les cellules injectées conduisant à la croissance tumorale et potentiellement à la dissémination de métastases, cette dernière pourrait avoir un effet sur le comportement des animaux qui sera étroitement surveillé.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales prévues dans ce projet, tous les animaux seront mis à mort selon les normes éthiques en vigueur, afin de limiter toute souffrance inutile et de permettre la récupération des tissus pour analyses scientifiques. La mise à mort interviendra soit à la fin du protocole expérimental planifié, soit de manière anticipée si des signes cliniques de souffrance, de détresse ou de dégradation de l’état général sont observés.

Remplacement

Dans un modèle cellulaire, nous avons développé l’antigène synthétique et confirmé son adressage à la membrane plasmique des cellules cancéreuses mammaires et de gliome par différentes techniques. Nous avons également établi des lignées cellulaires stables exprimant l’antigène synthétique, ainsi que des lignées à expression qui peut être induite. Ces cellules ont été cultivées dans des conditions avec très peu d’oxygène et l’expression de l’antigène a été vérifiée à l’aide des mêmes techniques. Par ailleurs, des co-cultures ont été réalisées entre les cellules cancéreuses exprimant l’antigène synthétique et les macrophages CAR évaluant ainsi leur capacité à reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Ces résultats confirment la pertinence de poursuivre par des études dans un modèle animal, essentielles pour valider nos hypothèses dans un environnement biologique plus complexe et pour développer de nouvelles stratégies d’immunothérapie.

Réduction

Nous avons mis en œuvre plusieurs stratégies pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant des résultats robustes et statistiquement significatifs. Tout d’abord, des expérimentations préliminaires dans des cellules ont permis de sélectionner l’antigène synthétique optimal et les conditions optimales pour l’efficacité des immunothérapies (macrophages CAR et anticorps thérapeutiques). Ces études incluent le développement et l’analyse de lignées cellulaires stables ou pouvant être induites ainsi que des co-cultures pour valider les interactions immunitaires. Ensuite, les calculs de puissance statistique ont été réalisés pour minimiser le nombre de souris nécessaires par groupe tout en assurant une détection fiable des différences biologiques. Enfin, des techniques avancées comme la cytométrie en flux et l’imagerie par bioluminescence seront utilisées pour maximiser les données obtenues à partir de chaque animal, réduisant ainsi le besoin d’augmenter les cohortes. Ces approches permettent de réduire au strict minimum le nombre d’animaux respectant ainsi le principe des 3R, sans altérer la robustesse de nos résultats.

Raffinement

Afin de minimiser la souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi (maison, carré de coton, copeaux de cartons...) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). L’isolement d’animaux sera évité. Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Afin de prévenir le stress des animaux lié à la manipulation par l’expérimentateur, les souris seront préalablement habituées à la présence de l’expérimentateur et à leur manipulation par l’humain. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant toute procédure pouvant provoquer un stress, une angoisse ou une souffrance. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. En cas de souffrance lié au score observé sur la grille d’évaluation de la douleur, un traitement analgésique sera envisagé jusqu’à disparition des signes de souffrance. Des points limites à ne pas dépasser ont été définis préalablement au projet et l’atteinte de l’un d’entre eux ou l’inefficacité du traitement analgésique conduirait à la mise à mort immédiate des animaux selon la méthode définie. Ces points limites comportent notamment toute blessure de la tumeur mais aussi toute atteinte aux libertés fondamentales de l’animal (telles que la gêne au déplacement, à la posture, à l’expression d’un comportement normal ou la présence de souffrance et/ou de détresse chez l’animal) Le poids des souris sera évalué deux fois par semaine. Une perte de poids de plus de 15% constatée et maintenue sur plus de 72h conduira à la mise à mort de l’animal. La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines, car à cet âge leur système immunitaire est pleinement développé. Cela est essentiel pour notre projet, qui étudie des traitements agissant via le système immunitaire pour éliminer les cellules cancéreuses. Le choix de la souris comme espèce repose sur plusieurs raisons : ● Tout d’abord, les cellules cancéreuses utilisées dans notre étude proviennent de souris. Il est donc logique et scientifiquement cohérent d’utiliser un modèle murin pour garantir une compatibilité biologique. ● Par ailleurs, la souris est l’un des modèles les plus utilisés en recherche sur le cancer, car elle présente de nombreuses similitudes avec l’humain en ce qui concerne le développement des tumeurs et la réponse immunitaire.

3 598 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent des cellules tumorales qui forment des tumeurs du poumon, jusqu'à quatre injections de bactéries, jusqu'à six injections d'anticorps et, pour les porteuses de tumeurs, une à deux séances d'imagerie sous anesthésie par semaine pendant trois à cinq mois. Le porteur indique que les bactéries peuvent provoquer une douleur modérée et une difficulté à se mouvoir et à s'alimenter, et que les tumeurs peuvent entraîner douleur, perte de poids et réduction de la mobilité, les souris atteignant un point limite étant alors tuées. Le but est de savoir si ces bactéries font apparaître dans les tumeurs des amas de cellules immunitaires qui renforceraient les immunothérapies, et le porteur qualifie la souris de "modèle nécessaire et indispensable" pour les étudier.

Objectifs

Les immunothérapies, notamment les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ou ICI), ont révolutionné le traitement de plusieurs cancers solides, dont le cancer du poumon. Cependant, seuls jusqu'à 40 pour cent des patients atteints d'un cancer du poumon obtiennent une réponse après traitement par ces immunothérapies. Des recherches récentes ont montré que la présence, dans les tumeurs, de petits groupements de cellules immunitaires appelés "structures lymphoïdes tertiaires" (ou TLS) est liée à une meilleure réponse à ces traitements. Ces structures se forment en cas d’inflammation et disparaissent une fois l’inflammation résolue. Il a été récemment montré qu’une molécule, issue de certaines bactéries, pouvait provoquer l’induction de TLS dans les poumons de souris. Ce projet vise donc à tester si certaines bactéries peuvent, elles aussi, induire la formation de ces structures, et si cela améliore l’efficacité des immunothérapies dans des modèles murins de cancer. Nous chercherons aussi à comprendre les mécanismes impliqués dans la formation et la maturation des TLS, dans l’objectif, à long terme, de développer de nouvelles stratégies pour renforcer l’efficacité des traitements chez les patients atteints de cancer.

Bénéfices attendus

En France, le cancer du poumon touche plus de 50 000 personnes chaque année et est responsable de près de 33 000 décès. Il représente également un coût économique majeur estimé à plus d’un milliard d’euros par an pour le système de santé. Malgré les avancées en immunothérapie, notamment avec les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ICI), seulement environ 40 pour cent des patients atteints d’un cancer du poumon répondent favorablement à ces traitements. Ce projet vise à renforcer l’efficacité des immunothérapies. Il reposera sur un modèle de cancer du poumon chez la souris, dans lequel des bactéries seront administrées soit à titre préventif (comme une vaccination), soit à titre curatif (après l’apparition de la tumeur). L’objectif est d’évaluer leur capacité à induire des structures immunitaires dans les tumeurs, appelées structures lymphoïdes tertiaires (TLS), et à améliorer la survie des souris. Le projet permettra de déterminer : 1) si ces bactéries améliorent la survie des souris et induisent la formation de TLS ; 2) si l’effet thérapeutique de ces bactéries est dû à la formation des TLS ; 3) les mécanismes immunitaires à l’origine de l’effet thérapeutique de ces bactéries 4) les mécanismes immunitaires à l’origine de l’induction et de la maturation de TLS. Les résultats de ce projet pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteints de cancer, soit en utilisant directement ces bactéries comme traitement, soit en développant de nouvelles molécules capables de stimuler la formation de TLS dans les tumeurs. Cette approche pourrait s’appliquer non seulement au cancer du poumon, mais aussi à d’autres types de cancers dans lesquels la présence de TLS est associée à un meilleur pronostic

Procédures

Les animaux seront soumis à : des injections pour administrer les cellules tumorales (animal vigil ou anésthésié, 1 à 2 fois, 1 minute), des injections pour administrer les bactéries (animal vigil, 1 à 4 fois, 1 minute), un suivi par imagerie (animal anesthésié, 1 à 2 fois par semaines pour 3 à 5 mois, 15 minutes) avec injection au préalable de produit de contraste (animal vigil, 1 à 2 fois par semaines pour 3 à 5 mois maximum, 1 minute) pour les animaux avec tumeurs, une injection d'une substance qui agit sur le système nerveux (animal vigil, 2 fois, 1 minute) ainsi qu'une injection d’anticorps dans certains cas (animal vigile, jusqu’à 6 fois au maximum, à raison de 2 fois par semaine pendant 3 semaines au maximum, 1 minute).

Impact sur les animaux

Les manipulations des animaux pourront induire un stress. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les injections répétées peuvent induire un risque de péritonite. L’injection de bactéries pourra engendrer une réponse inflammatoire générant une douleur modérée à l’animal associée à une difficulté de se mouvoir et s’alimenter. L’injection de cellules tumorales pourrait engendrer une gêne à se mouvoir. L'imagerie in vivo sera effectuée sous anesthésie et pourra engendrer une baisse de la thermorégulation. Ces administrations et anesthésies pourront également engendrer une gêne respiratoire transitoire. L'induction de tumeur pourra induire une douleur modérée, une perte de poids ainsi qu'une réduction de la mobilité.

Devenir

Les souris injectées avec des cellules tumorales développeront des tumeurs pulmonaires. Dès l’apparition de signes cliniques indiquant l’atteinte d’un point limite défini, elles seront euthanasiées afin de prévenir toute souffrance inutile. Les autres animaux seront euthanasiés à des temps définis expérimentalement pour permettre le prélèvement d’organes. Ces échantillons seront utilisés pour analyser la réponse immunitaire induite, notamment l’organisation locale du système immunitaire suite à l’injection de bactéries ou en réponse à la présence de cellules tumorales.

Remplacement

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. En effet, il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués dans l’effet thérapeutique du BCG (Bacillus Calmette-Guérin), une souche atténuée de Mycobactérium Bovis, et dans la formation des TLS. Ainsi, les modèles souris sont considérés comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumeur. Les éventuelles voies d’interactions entre les cellules immunitaires seront testées tout d’abord in vitro puis in vivo.

Réduction

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. En effet, il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués dans l’effet thérapeutique du traitement et dans la formation des TLS. Ainsi, les modèles souris sont considérés comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumeur. Les éventuelles voies d’interactions entre les cellules immunitaires seront testées tout d’abord in vitro puis in vivo Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé par un calcul de puissance statistique et réduit au strict nécessaire pour atteindre les objectifs sans compromettre la validité des résultats. En raison de la variabilité de la croissance tumorale entre les souris, 7 souris par groupe seront utilisées dans les expériences suivant l’effet des traitements sur la survie et la progression tumorale (jusqu’à atteinte d'un point limite ou au maximum 3 mois après la dernière injection de cellules tumorales). Pour étudier la présence et le stade de maturation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS), 3 souris par groupe seront utilisées à chaque point temporel. Afin d’établir les cinétiques d’induction et de maturation des TLS, 5 souris par time point seront nécessaires. Les analyses par cytométrie nécessiteront quant à elles 7 souris par groupe et par point temporel. Les écarts attendus entre les groupes devraient garantir une puissance statistique suffisante malgré la taille restreinte des groupes. Pour les expériences nécessitant des souris survivantes, 20 animaux seront inclus initialement pour assurer un nombre suffisant de survivantes, qui seront ensuite soit réinjectées avec des cellules tumorales, soit euthanasiées pour récupérer les cellules immunitaires. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé par imagerie, permettant des mesures répétées sur un même animal. Chaque expérience sera répétée au moins 2 fois afin d’assurer la reproductibilité des résultats, conformément aux bonnes pratiques expérimentales. Au total, 3 598 animaux seront utilisés dans ce projet

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des portoirs ventilés dans un environnement A2 et ne seront expérimentés qu'après une semaine minimum de stabulation. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (hébergement individuel limité à la fin des expériences s’il ne reste qu’une seule souris survivante dans la cage) en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le milieu est enrichi avec 2 des enrichissements ci-après : 6 à 10 bâtonnets de coton, 1 à 2 rouleau en carton ou 1 à 2 maisonnette. La taille des cages est variable, permettant d’héberger jusqu’à 12 souris, tout en respectant la densité réglementaire. Dans les situations nécessitant un hébergement individuel de l’animal (dernier animal dans la cage), il bénéficiera d’un enrichissement en plus et il sera vérifié par le responsable du Bien-Être Animal de l'animalerie pour valider son hébergement individuel. Les conditions de températures et d'hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Dans la réalisation de ce projet, l'ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie). Tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum les nuisances. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. L'évolution tumorale sera suivie et mesurée. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les animaux seront vérifiés quotidiennement. Ils seront également pesés au minimum deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de la procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie).

Choix des espèces

L’utilisation de souris comme modèle est un outil précieux pour étudier les structures lymphoïdes tertiaires (TLS), car leur système immunitaire fonctionne de manière similaire à celui des humains, en particulier pour les réponses immunitaires innée et adaptative. Malgré quelques différences, la souris reste un modèle pertinent pour comprendre comment se forment les TLS et comment les cellules immunitaires interagissent avec les cellules cancéreuses dans le microenvironnement tumoral. Le modèle de cancer que nous utiliserons a déjà permis d’observer des TLS chez la souris. De plus, il existe de nombreux outils expérimentaux adaptés à ce modèle, comme des anticorps spécifiques ou des cellules tumorales modifiées permettant le suivie de la croissance tumorale par imagerie, ce qui facilite les analyses. Enfin, plusieurs protocoles déjà validés chez les souris commerciales femelles non génétiquement modifiées permettent de mener les expériences efficacement, sans augmenter le nombre d’animaux, ce qui est essentiel dans une démarche préclinique responsable. Les animaux seront reçus à l'âge de 7 ou 11 semaines puis mis en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation. Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d'un système immunitaire mature. Les animaux seront identifiés par un code couleur et le nombre de points fait aux feutres sur la base de la queue de l'animal.

L'anticorps testé est développé par l'équipe depuis une dizaine d'années et vient d'entrer en essai clinique pour d'autres pathologies, l'enjeu étant ici d'étendre ses indications au cancer du côlon. 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever tumeurs et foie. Chaque animal reçoit une injection unique de cellules cancéreuses sous la peau sous anesthésie, puis pour certains deux injections d'anticorps par semaine pendant quatre semaines sur animal vigile, avant un prélèvement de sang terminal, la croissance de la tumeur pouvant provoquer une ulcération de la peau et une déshydratation. Le porteur écrit que la validation de l'approche exige un "modèle physiologique complet sur animal entier", après des essais déjà menés sur lignées cellulaires et sur tissus de patients.

Objectifs

Le cancer du côlon est la 2ème cause de mortalité attribuable au cancer dans le monde et est en augmentation depuis 20 ans. De nouveaux types de traitement faisant appel à des anticorps ciblant le système immunitaire se sont montrés efficaces dans d’autres types de cancers mais n’ont pas encore fait leur preuve pour le côlon. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du côlon. Nous avons montré dans le cancer du foie que notre anticorps pouvait réduire la taille des tumeurs, influencer le système immunitaire et améliorer les thérapies ciblant ce dernier à la fois chez l’homme et la souris. L’objectif de notre projet est d’étendre nos recherches au cancer du côlon afin d’évaluer l’efficacité de notre anticorps dans ces cancers.

Bénéfices attendus

Le cancer du côlon est un grave problème de santé public. Il est très fréquent et ses formes les plus graves se soignent très mal. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies ciblant le système immunitaire et ainsi la survie très nombreux malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologies.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux peut entraîner un stress physique modéré. L’injection de cellules tumorales en sous-cutané, ainsi que les injections intrapéritonéales répétées d’anticorps, induisent une douleur légère et transitoire liée à la piqûre de l’aiguille. Au cours de l’expérience, la croissance tumorale peut occasionner une gêne plus ou moins importante, selon la taille de la tumeur et sa localisation (ventrale, dorsale ou latérale). Dans certains cas, une ulcération cutanée peut apparaître au niveau du site d’implantation des cellules tumorales. De même une déshydratation peut survenir secondairement à la pathologie tumorale.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foie) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons prévu de procéder à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite en parallèle une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble pour le rongement et des tunnels en kraft pour le refuge. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans des cages sur portoir ventilé. Les injections de cellules tumorales en sous-cutané seront réalisées sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane, afin de limiter la douleur et le stress liés à la procédure. Les autres procédures potentiellement invasives ou stressantes seront également effectuées sous anesthésie et/ou analgésie, lorsque cela est nécessaire. Une période d’acclimatation de 14 jours sera respectée avant le début des procédures. Durant cette période, les souris seront laissées sans manipulation pendant les 2 à 3 premiers jours, puis progressivement habituées à la contention au cours de la deuxième semaine. Cette familiarisation permet de diminuer le stress lors des injections répétées et des mesures de suivi (taille tumorale, température corporelle). Des points limites précoces ont été définis afin d’interrompre immédiatement les procédures et de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance excessive

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront âgés au minimum de 8 semaines (adultes) afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.

Soumises la nuit à six séries de sons de trente minutes espacées de trois heures, soit trois heures de stress sonore, certaines souris sont utilisées comme modèle de fibromyalgie. D'autres reçoivent jusqu'à dix injections d'une molécule qui déclenche la migraine chez les patients migraineux, avec application de filaments fins ou de jets d'air sur la face ou la patte toutes les trente minutes pendant quatre heures les jours d'injection. D'autres encore boivent pendant une semaine une eau contenant une molécule qui irrite l'intestin, et une partie subit une chirurgie de quarante-cinq minutes sans réveil. 672 souris en tout, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort à la fin parce que les protocoles se terminent par un prélèvement d'organes.

Objectifs

Parmi les douleurs chroniques, la migraine qui affecte environ 15% de la population générale, est sur-représentée dans certaines autres maladies douloureuses chroniques. Ainsi, environ 20% des patients souffrant de douleurs viscérales au niveau des intestins sont également migraineux. Cette proportion atteint jusqu’à 45 à 80% des patients fibromyalgiques (douleurs musculaires diffuses), selon les études. Malgré ces observations cliniques, le(s) mécanisme(s) pouvant expliquer la présence de la migraine dans d’autres maladies douloureuses est(sont) encore peu connu(s). Ainsi, le but de notre projet est de mieux comprendre si un mécanisme commun entre les douleurs viscérales, la fibromyalgie et la migraine pourrait exister. Parmi les mécanismes sous-tendant ce type de douleur chronique, une activation trop importante des neurones pourrait être à l’origine de la sensibilité exacerbée de ces patients. Des cellules particulières appelées les cellules satellites gliales, entourant les neurones, semblent jouer un rôle clef dans la régulation de l’activité des neurones. Le but de notre projet est donc de caractériser le rôle des cellules satellites gliales entre différents modèles de douleur chronique, que sont la fibromyalgie, la douleur viscérale et la migraine à la fois chez les mâles et les femelles. Pour cela, nous évaluerons l'expression de plusieurs marqueurs spécifiques d’activation des cellules satellites gliales dans (i) un modèle de douleur, mimant la fibromyalgie, induite par le stress sonore, (ii) un modèle de migraine induite par des injections répétées d’une molécule qui provoque des migraine chez les patients migraineux et (iii) un modèle de douleur viscérale induite par l'administration orale d’une molécule induisant une inflammation du côlon.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes qui expliqueraient pourquoi la migraine est plus fréquente chez des patients souffrant déjà d’autres douleurs (douleurs viscérales inflammatoires et fibromyalgie), notamment le rôle de cellules particulières, appelées les cellules satellites gliales qui entourent les neurones. A plus long terme, comprendre ces mécanismes permettrait de tester de nouvelles molécules pharmacologiques pour cibler plus spécifiquement les patients présentant la présence de la migraine et d’une autre maladie douloureuse viscérale ou de fibromyalgie.

Procédures

Les interventions seront : Injections d’une molécule : chaque injection dure moins d’une minute (au total 10 injections sur plusieurs semaines). Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h toutes les 30 minutes ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. Les animaux peuvent être sous anesthésie gazeuse pour réaliser une chirurgie : elle a lieu une fois et elle sera sans réveil. La chirurgie dure environ 45 min. Stress induit par un son : série de sons pendant 30min, répétés toutes les 3 heures, soit 6 fois au cours de la nuit, ce qui représente un total de 3 heures de stress sonore.

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée chez l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : cette mesure se fait par l'application de filaments fins ou de jets d'air sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte qui entraine une douleur modérée. Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. La répétition d’un son entraine un stress chez l’animal. Une douleur légère est provoquée par les injections de molécules qui durent moins d'une minute. Cette molécule induit une irritation de l’intestin et la douleur provoquée est modérée. Les animaux seront sous anesthésie pour réaliser une chirurgie : le début de cette anesthésie peut induire un stress transitoire de l’animal qui dure moins de 2 minutes.

Devenir

Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par des techniques qui nécessitent le prélèvement d’organes : les animaux seront donc mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. Ainsi pour toutes les procédures, nous aurons 12 animaux (6 males et 6 femelles) par groupe. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela limitera le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur et le stress engendrés dans le cadre des différents modèles. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique ou de jet d'air), nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les points limites fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher ainsi que de papier de nidification, chose importante pour la souris. Une des procédures nécessite une chirurgie qui se fera sous anesthésie gazeuse par une personne expérimentée.

Choix des espèces

La souris est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans la migraine, ce qui peut être plus difficilement réalisé chez le rat. Les animaux seront âgés de 8-12 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les souris sont considérées comme de jeunes adultes. Ce stade de développement a été choisi car c’est chez le jeune adulte que le plus souvent la maladie migraineuse débute chez l’être humain. Les animaux génétiquement modifiés seront âgés de moins d’une semaine (injection virus) à 12-14 semaines (expérience d’imagerie calcique).

Chaque souris subit une ovariectomie puis la pose d'une capsule hormonale, avant une lésion électrique ou mécanique de la carotide. 540 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus prélevés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le but déclaré est de mesurer la cicatrisation des artères après la chute hormonale, pour comparer différents œstrogènes censés protéger les vaisseaux après la ménopause. Le porteur résume les conséquences de ces trois interventions par animal, soit 1 620 opérations au total, en une seule phrase qui mentionne une douleur, une perte de poids et un stress.

Objectifs

Les maladies du cœur et des vaisseaux sont la première cause de décès chez les femmes. Pourtant, on ne comprend pas encore très bien comment la ménopause joue un rôle dans ce phénomène. Après la ménopause, le taux d’œstrogènes (les hormones féminines) chute, ce qui pourrait augmenter le risque de problèmes cardiovasculaires. Ce projet cherche à savoir si certains traitements à base d’œstrogènes, ou de substances qui agissent comme eux, peuvent continuer à protéger les vaisseaux sanguins après la ménopause. Pour cela, on utilise un modèle de souris dont on retire les ovaires, afin de reproduire la baisse hormonale observée chez les femmes (car les souris n'ont pas de ménopause naturelle). L’efficacité des traitements est mesurée en observant comment les artères se réparent après une petite blessure, ce qui permet de voir si les molécules testées aident à maintenir une bonne santé vasculaire.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre d’identifier les traitements hormonaux les plus efficaces pour protéger les artères après la ménopause, une période où le risque cardiovasculaire augmente fortement chez les femmes. En comparant différents types d’œstrogènes et de molécules ciblant leur récepteur, il deviendra possible de mieux comprendre quels composés sont réellement bénéfiques pour le système cardiovasculaire. À terme, ces connaissances pourraient aider à améliorer les traitements existants ou en développer de nouveaux, plus sûrs et plus adaptés aux besoins des femmes ménopausées. Cela contribuerait à réduire la mortalité cardiovasculaire chez les femmes, en tenant mieux compte de leurs spécificités biologiques souvent négligées dans la recherche médicale.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1-Ovariectomie (10 à 20min) 540 animaux 2-Pose de capsule à libération prolongée (5min) 540 animaux 3-Lésion életrique de la carotide (20min) 270 animaux 4- Lésion mécanique de la carotide (20-30min) 270 animaux. Les animaux subissant la lésion électrique de la carotide ne sont pas les mêmes que ceux subissant la lésion mécanique.

Impact sur les animaux

Les chirurgies sur la souris telles que l’agression de la carotide (mécanique ou électrique), l’ovariectomie ou la pose de capsule à libération prolongée peuvent engendrer une douleur, une perte de poids et un stress.

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus prélevés.

Remplacement

L’utilisation du modèle murin nous permettra d’identifier et de quantifier les changements progressifs et dynamiques impactant le processus de cicatrisation endothéliale. Ce processus implique des phénomènes de communication intercellulaire et des notions de flux/débit sanguins qui ne peuvent pas être modélisés ou reproduits ex vivo ou in vitro. De plus, aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire des variations hormonales et ceci d’autant plus que l’ensemble des lignées cellulaires présentent dans le vaisseau « perdent » l’expression du récepteur des oestrogènes.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi il ressort que 5 animaux/groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les souris subiront des chirurgies dans une salle séparée de la salle d’euthanasie, elle-même séparée de leur pièce d’hébergement. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisament prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle permettant une modification génétique aboutissant à une délétion du récepteur aux oestrogènes ou de ces sous fonctions. Ces souris sont sous fond génétique C57BL6 qui est un modèle reconnu dans l’étude des maladies cardiovasculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, après la puberté, à partir de 7 semaines d’âge dans le cadre de l'étude de la ménopause.

Pour tester des composés candidats contre l'arthrite rhumatoïde et l'arthrite psoriasique, 434 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus. L'inflammation articulaire est provoquée par une injection intra-péritonéale ou par deux injections intradermiques espacées de dix-huit jours, suivies de traitements administrés par voie intraveineuse, sous-cutanée, orale ou topique, avec dépilation sous anesthésie. Raideur articulaire et douleur à la mobilisation sont attendues, et de la nourriture en gel est déposée dans la cage pour limiter les déplacements des souris arthritiques. Aucun antalgique ne leur sera administré, le porteur indiquant qu'il interférerait avec l'effet attendu des composés testés, la souffrance restant encadrée par une grille de score et un point limite.

Objectifs

Les maladies inflammatoires ostéo-articulaires sont parmi les pathologies douloureuses et invalidantes les plus courantes et les plus répandues dans le monde, dont la prévalence devrait augmenter principalement en raison de l'augmentation de l'espérance de vie. Ces pathologies sont le plus souvent difficiles à repérer, mais peuvent avoir des répercussions sur l’état psychologique des personnes affectées par les douleurs chroniques qu’elles engendrent, et à plus long terme sur la vie professionnelle. On estime que 25 % des personnes atteintes d’ostéo-arthrite sont incapables d'accomplir leurs activités quotidiennes. De plus en plus de références indiquent maintenant que l'inflammation, locale et systémique, est à l'origine de dommages aux articulations et aux os. L'objectif du projet est d'évaluer la pharmacocinétique et l'efficacité thérapeutique de nouvelles thérapies dans le domaine des maladies inflammatoires ostéo-articulaires telles que l'arthrite psoriatique ou l'arthrite rhumatoide. Les propriétés immunomodulatrices, anti-inflammatoires et anti-fibrotiques de ces nouveaux composés seront évalués afin de pouvoir les considérer comme nouvelles modalités de thérapies dans le traitement des maladies inflammatoires ostéo-articulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques dans le contexte des pathologies inflammatoires ostéo-articulaires, telles que la polyarthrite rhumatoide ou la spondylarthrite ankylosante. L'objectif est d'analyser les effets des traitements candidats dans la résolution de la pathologie. Les résultats attendus pourraient avoir un impact direct sur la prise en charge des patients en offrant de nouvelles options thérapeutiques. Ces traitements pourraient non seulement réduire la douleur et l’inflammation, mais également prévenir la progression des lésions articulaires, améliorant ainsi la qualité de vie des patients. L’identification de traitements plus efficaces permettrait également de limiter la dépendance des patients aux traitements traditionnels, souvent lourds et invasifs.

Procédures

Les souris recevront une injection intra-péritonéale pour induire le modèle sur souris vigile (

Impact sur les animaux

Ce projet, bien que conçu pour minimiser l'impact sur les animaux entraine des nuisances ou effets indésirables inhérents à la mise en œuvre de modèles d'arthrite psoriatique ou d'arthrite rhumatoide. Ces modèles peuvent entraîner une inflammation articulaire et des douleurs au niveau des membres. Les symptômes comprennent des signes cliniques dans ces modèles tels que la raideur articulaire et une douleur à la mobilisation. Chaque animal sera étroitement surveillé quotidiennement en aveugle tout au long de l'étude et leur état sera évalué d’après une grille de scores, selon des paramètres physiologiques, des critères d’apparence physique et de comportement général, afin d’intervenir tôt dans la prise de décision de la poursuite du protocole. Une grille de score est établie pour les deux modèles incluant un point limite pour chaque modèle. L’utilisation d’antalgiques n’est pas envisageable, elle interférerait avec l’effet attendu des outils thérapeutiques. Chez l’animal arthritique, nourriture et boisson seront apportées sous forme de gels placés dans la cage en cas de nécessité, afin de limiter les déplacements.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les tissus et réaliser des analyses ex vivo.

Remplacement

La recherche menée dans ce projet vise à développer des approches thérapeutiques innovantes pour traiter l'arthrite psoriatique et l'arthrite rhumatoïde. Les modèles in vitro et les simulations informatiques constituent des alternatives précieuses et seront exploitées dans les phases préliminaires. Ces méthodes contribueront à réduire le nombre d’animaux nécessaires en éliminant en amont les composés inefficaces ou potentiellement toxiques. Cependant, ces approches ne peuvent pas reproduire les processus biologiques complexes d’un organisme vivant, tels que les interactions immunologique ou l'inflammation ostéo-articulaire. Ce niveau de précision est indispensable pour garantir la robustesse et la transposabilité des résultats à un contexte clinique. Tous les efforts seront faits pour réduire leur nombre au strict minimum nécessaire et pour limiter leur inconfort par des soins appropriés et des critères d’arrêt clairs.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé sur la base d’analyses statistiques rigoureuses. Le nombre d’animaux sera de 8 par groupe de traitement. Des pratiques spécifiques seront mises en œuvre tout au long du projet pour limiter le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre les objectifs scientifiques : 1/ Études pilotes : Des expériences préliminaires seront réalisées sur un petit nombre d’animaux (24 pour la détermination des paramètres d’induction des modèles et 32 en incluant un traitement de référence pour chaque modèle) afin de tester la faisabilité des protocoles, valider les doses initiales des molécules et affiner les paramètres expérimentaux. Cela permettra d’optimiser les protocoles avant leur mise en œuvre à plus grande échelle. 2/ Modélisation informatique et études in vitro : Avant toute expérimentation in vivo, des approches in silico et des cultures cellulaires seront utilisées pour sélectionner les molécules ou formulations les plus prometteuses. Cette étape éliminera les composés inefficaces ou trop toxiques, réduisant ainsi les tests inutiles sur les animaux. 3/ Partage et réutilisation des tissus : Les prélèvements biologiques (sang, tissus, etc.) seront maximisés pour chaque animal afin de réaliser plusieurs analyses complémentaires. De plus, lorsque possible, les tissus prélevés pourront être partagés entre différentes études ou projets collaboratifs. 4/ Suivi longitudinal grâce à des techniques non invasives : L’utilisation de l’imagerie in vivo (bioluminescence, fluorescence) permettra de suivre l'inflammation au fil du temps, limitant la nécessité d’euthanasier des animaux à des points intermédiaires pour des analyses sanguines et histologiques. Les études seront conçues pour maximiser la qualité des données tout en limitant le nombre d’animaux : Les expériences pourront inclure des groupes de contrôle négatifs et positifs réduits, mais suffisamment représentatifs pour des comparaisons statistiquement valables. Une randomisation stricte des animaux dans les différents groupes sera appliquée pour minimiser les biais expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien être (alimentation, boisson, comportement général, grille de scores spécifiques au protocole...). Un enrichissement dans la cage (igloo et carrés de coton) permettra d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Dans le cadre de l’évaluation des seuils tactiles ou thermiques, les animaux seront apportés dans la salle d’expérimentation pour des séances d’habituation, se déroulant sur les deux journées consécutives précédent le début de la procédure. Durant ces sessions, les animaux seront mis en présence de l’expérimentateur et du matériel utilisé afin de les familiariser à cet environnement. Dans la mesure du possible, la même salle d’expérimentation sera utilisée tout au long de la procédure expérimentale. Leur poids sera évalué régulièrement, au minimum 3 fois/semaine, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse. L'utilisation d'analgésiques n'est pas réalisable sur ces modèles car apporterait un biais expérimental mais des points limites ont été définis afin de limiter la souffrance des animaux. Afin de limiter le stress et la douleur des animaux, les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés. Approches de fin d’étude respectueuses : Utilisation de méthodes approuvées pour garantir une euthanasie rapide et sans douleur avec vérification systématique de l’absence de conscience avant toute analyse post-mortem. Maximisation des données par animal : Réalisation de multiples analyses sur les tissus collectés pour limiter le recours à des animaux supplémentaires. Tous les intervenants sont formés à l'expérimentation animale et aux techniques d’imagerie et standardisation des procédures pour garantir la reproductibilité des résultats et minimiser les variations entre opérateurs. Cette stratégie de raffinement vise à améliorer le bien-être animal à chaque étape du projet, tout en maximisant et fiabilisant les données obtenues par animal. Elle repose sur des techniques avancées, une gestion rigoureuse des conditions expérimentales, et une surveillance constante du bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle expérimental de choix pour l'étude des maladies inflammatoires comme l'arthrite rhumatoïde et psoriasique. Les souris possèdent un système immunitaire bien caractérisé et similaire à celui des humains, permettant une extrapolation pertinente des mécanismes immunologiques étudiés. La disponibilité de lignées consanguines facilite l’exploration des réponses immunitaires spécifiques et des mécanismes d’action des traitements testés. Elles permettent de reproduire les caractéristiques cliniques, histopathologiques et immunologiques de ces pathologies, facilitant l’étude des mécanismes sous-jacents et l’évaluation de traitements thérapeutiques. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~7-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. En effet, il est bien établi dans la littérature que l'induction d’une inflammation menant au développement de maladies ostéo-articulaires chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible. Dans le cas de notre étude, ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques. Il s'agit également du stade auquel les animaux sont les moins susceptibles de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale.

Ligature de l'artère fémorale, injection d'une toxine dans le muscle de la patte, irradiation des pattes postérieures sous anesthésie : 180 souris subissent ces interventions, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection de cellules souches musculaires humaines, associées ou non à un biomatériau, pour évaluer une thérapie cellulaire de l'ischémie chronique des membres inférieurs. Les atteintes décrites comprennent une perte de poids de 10 %, un poil ébouriffé, une paupière fermée, une posture anormale et une mobilité réduite dans les vingt-quatre heures. Le porteur affirme pourtant qu'aucun signe de souffrance n'est observé après l'irradiation des pattes postérieures, la moelle osseuse étant selon lui parfaitement conservée.

Objectifs

L’ischémie chronique des membres inférieurs est la forme la plus grave de maladie vasculaires périphérique.s Elle est associée à une faiblesse et des douleurs musculaires qui ne peuvent s'expliquer uniquement par une réduction du flux sanguin. Le muscle squelettique adulte possède une forte capacité de régénération grâce à des cellules souches musculaires résidentes. Leur fonction réparatrice est étroitement régulée par leur environnement. Plusieurs études ont montré l’existence d’interactions entre les cellules souches musculaires et les cellules vasculaires environnantes lors de la réparation du muscle squelettique. Les signaux contrôlant ces interactions dans le contexte de l'ischémie des membres inférieurs ne sont pas connus. De même, les mécanismes du remodelage tissulaire et la contribution des cellules souches musculaires au développement des lésions musculaires post-ischémiques restent peu explorés. Nous avons observé qu’une exposition chronique à un faible taux d’oxygène altère la fonction des cellules souches musculaires et par conséquent la régénération musculaire chez la souris. Étant donné l'importance du tissu musculaire comme support biomécanique et biologique de la revascularisation, une altération fonctionnelle des cellules souches musculaires pourrait participer à l'aggravation des lésions musculaires et au défaut de perfusion des membres inférieurs chez les patients atteints d’ischémie des membres inférieurs. Dans ce contexte, nos objectifs sont 1) de caractériser l’altération des propriétés cicatricielles des cellules souches musculaires issues de patients atteints d'ischémie des membres inférieurs in vivo, et 2) d’évaluer le bénéfice thérapeutique de la restauration d’un tissu musculaire viable par des approches de thérapie cellulaire associant des cellules souches musculaires humaines de muscle sain et des biomatériaux innovants, sur la revascularisation et la régénération des membres ischémiés in vivo.

Bénéfices attendus

Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes responsables des lésions musculaires post-ischémiques chez les patients et offrira une nouvelle approche de thérapie cellulaire innovante pour le traitement de l'ischémie des membres inférieurs, en fournissant un support biomécanique favorable à la revascularisation des muscles ischémiés chez les patients.

Procédures

Les procédures invasives sur animal anesthésié sont au nombre de quatre : 1. Injection d'une toxine dans le muscle de la patte sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min) 2. Modèle de lésion musculaire par injection d'une toxine dans le Tibialis Anterior sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min) 3. Modèle de lésion musculaire par ligature de l'artère fémorale (modèle d’ischémie des membres inférieurs) sur animal anesthésié (1 fois, durée : 20 min) 4. Injection de cellules souches musculaires humaines associées ou non à un biomatériaux dans le Tibialis Anterior sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min). Les procédures non invasives sur animal anesthésié sont au nombre de une : irradiation des pattes postérieures de la souris sur animal anesthésié (1 fois, durée : 20 min)

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables sont ceux liés à la contention/manipulation des animaux pouvant engendrer du stress ou ceux liés à la récupération post-irradiation ou post-chirurgie (modèle de lésion musculaire) ; pouvant conduire à une perte de poids dans les 24 premières heures (10%), une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite). De notre expérience, les signes de souffrance interviennent dans les 24h suivant l’induction des lésions musculaires (que ce soit par un agent chimique ou à la suite de la ligature de l’artère fémorale) mais ne perdurent généralement pas au-delà. De même, aucun signe de souffrance n'est observé chez des animaux qui ont subi une irradiation que des pattes postérieures (la moelle osseuse étant parfaitement conservée).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des deux procédures afin de permettre les analyses histologiques et moléculaires nécessaires pour répondre à notre question biologique.

Remplacement

Afin de caractériser l’atteinte des capacités régénératrices des cellules souches musculaires (MuSCs) issues de patients atteints d’ischémie critique des membres inférieurs (ICMI) comparativement à des patients contrôles, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment, afin de tester in vitro leur capacité de prolifération, de différenciation et de fusion. Mais pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n'est pas envisageable. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un organisme ou d’un tissu entier et notamment entre les MuSCs et les cellules vasculaires. Notamment, l'utilisation de modèles animaux reste essentielle pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’ICMI et pour tester de nouvelles approches thérapeutiques innovantes dans le muscle ischémié. Enfin, la souris est le modèle de choix en raison des similitudes des systèmes de réparation du muscle squelettique humain. Ainsi, le modèle de ligature de l’artère fémorale permet de reproduire les lésions ischémiques retrouvées chez les patients atteints d’ICMI, offrant une pertinence clinique pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette pathologie.

Réduction

Nous allons réduire le nombre d'animaux grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés et grâce à l’utilisation de la patte opposée non injectée que nous utiliserons comme contrôle sans lésion. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=10 animaux par groupe expérimental et par temps sont nécessaires pour les analyses histologiques et moléculaires compte tenu de la variabilité inter-individuelle dans nos deux modèles chirurgicaux de régénération musculaire.

Raffinement

Les animaux importés qui arriveront de la zone d’élevage à la zone expérimentale sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour les modèles chirurgicaux, les souris seront anesthésiées et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examinés de façon biquotidienne pendant les 5 premières jours suivant la lésion musculaire afin de vérifier leur état général de santé et établir la grille de score des points limites. En cas des signes de souffrance déinfis par la grille de score des points limites, des mesures graduées et adaptées (analgésie, mise à mort compassionnelle, ...) seront prises. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car la physiologie et la réparation post-lésionnelle du muscle squelettique est proche de celle de l’Homme. Elle a également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées rendant possible la greffe de cellules d’origine humaine et permettant en déplétant les MuSCs de l’hôte de tester l’efficacité d’une thérapie cellulaire à base de MuSCs humaines sur la revascularisation et la réparation musculaire dans un modèle murin d’ICMI. La souris offre également l'avantage d'être de petite taille et de limiter ainsi le nombre de cellules humaines à greffer in vivo. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes de 7 à 10 semaines. A ce stade, les muscles sont parfaitement formés et les cellules souches musculaires résident en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos. Nous maitrisons les modèles chirurgicaux de lésion musculaire pour lesquels nous n’avons aucune mortalité post-opératoire. Enfin, nous maitrisons les outils permettant les évaluations structurelles et moléculaires du muscle squelettique et le suivi des MuSCs humaines greffées chez la souris.