Souris
Prélèvements de tissu pour la caractérisation phénotypique de souris génétiquement altérées élevés pour l’étude de structures cérébrales
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 000 souris vont être utilisées dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées. Les nouveau-nés sont maintenus une minute pour une biopsie de la queue. Celles qui n'ont pas le génotype recherché sont tuées, par décapitation avant dix jours et par dislocation cervicale ensuite, les autres par ponction intracardiaque sous anesthésie profonde pour prélèvement du cerveau. Le but déclaré est de cartographier en trois dimensions deux populations de neurones de l'hypothalamus rendues fluorescentes, l'une liée à l'appétence, l'autre à la satiété. Sur le raffinement, le porteur ne mentionne que les 2 mm de queue prélevés, et fixe l'effectif de 2 000 animaux d'après des stratégies d'accouplement calculées "selon nos expériences antérieures".
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'identifier de façon précise certains neurones présents dans l'hypothalamus, structure majeure dans la régulation du métabolisme. Comme cette structure ne représente que 1% à 1.5% du cerveau total, les neurones qui le composent sont peu nombreux et présentent des localisations très précises. Parmi ceux-ci des neurones contrôlent respectivement l'appétence et la satiété. L'utilisation de souris exprimant des molécules fluorescentes marquant spécifiquement ces 2 populations neuronales permettront de les détecter in situ et d'en connaître l'architecture en 3 dimensions. Ces données complétées à celles de physiologie offriront une apporoche complémentaire du rôle de ces neurones dans la prise alimentaire.
Bénéfices attendus
Les principaux bénéfices attendus du projet sont l'identification des 2 populations neuronales d'intérêt grâce à la présence de fluorescence endogène au sein de ces neurones, d’en comprendre leur architecture et leurs connexions au sein de l'hypothalamus ainsi que la possibilité d’identifier des protéines s’exprimant spécifiquement dans ces 2 populations neuronales.
Procédures
Les nouveau-nés subiront une contention d'une minute et une biopsie de queue sera prélevée. Les adultes du génotype d’intérêt subiront une injection d'analgésique puis une anesthésie profonde suivie d'une perfusion intracardiaque terminale..
Impact sur les animaux
La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress chez l’animal ainsi qu’une légère souffrance de courte durée.
Devenir
Les animaux ne possédant le génotype d’intérêt seront mis à mort. Les nouveaux nés jusqu’à 10 jours sont mis à mort par décapitation et les souris âgées de plus de 10 jours seront mis à mort soit par dislocation cervicale. Les animaux présentant le génotype d’intérêt seront mis à mort par ponction intracardiaque après analgésie et anesthésie profonde pour prélèvement du cerveau.
Remplacement
Les questions scientifiques posées ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux prélevés sur des animaux adultes. Il s’agit de comprendre in situ les interactions qu'entretiennent 2 populations neuronales spécifiques avec les autres neurones, ainsi que leur organisation en 3 dimension, et cela ne peut pas être reproduit in vitro
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculés selon nos expériences antérieurs pour générer un nombre suffisant d’animaux pour réaliser au mieux nos expériences. En outre, les croisements ont été optimisés pour produire les animaux d’intérêt. D’autre part, les 2 sexes seront utilisés pour les expériences de qui réduit le nombre d’animaux. Enfin, la perfusion intracardiaque permet d’augmenter la viabilité des tranches individuelles, ce qui réduira le nombre d’animaux et en limitera leur nombre.
Raffinement
Le prélèvement lors de la biopsie est réalisé sur une extrémité réduite la queue (environ 2 mm) permettant néanmoins d'obtenir suffisamment d'ADN pour réaliser pour le génotypage.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur l'importance des neurones régissant la prise alimentaire. Cette régulation trouve son siège dans l'hypothalamus, petite structure qui représente 1% à 1.5% du cerveau. Des outils adaptés à la souris et à la taille de cette petite structure sont disponibles pour la réalisation de ce projet tels que la détection de molécules biologiques, la disponibilité de modèles génétiques murins permettant de répondre aux questions scientifiques posés. Des animaux adultes (3 mois) seront utilisés car la maturité et l’organisation neuronale de l'hypothalamus est alors à son climax.
Étude de la réponse immunitaire associée aux cellules dendritiques et lymphocytes T dans le microenvironnement tumoral du mélanome cutané
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1 244 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, presque toutes tuées à l'issue, quinze restant en accouplement continu pour entretenir les lignées. 148 reçoivent sur les oreilles un analogue de la vitamine D pendant trois jours pour déclencher un mélanome, 540 une injection intradermique de cellules dendritiques dans les deux oreilles, 556 des injections intrapéritonéales d'immunothérapie deux fois par semaine pendant deux semaines. Le porteur annonce inflammation, démangeaisons et rougeur des oreilles, et une mise à mort dès que la tumeur atteint un centimètre cube. Il justifie le recours aux souris par le fait que le microenvironnement tumoral engage plusieurs organes, ce qui rend selon lui l'expérience in vivo "nécessaire", onze lignées génétiquement modifiées étant mobilisées.
Objectifs
Le mélanome cutané est un cancer se développant à partir de mélanocytes cancéreux, les cellules pigmentées de la peau. Le système immunitaire est généralement en mesure d’éliminer les cellules tumorales. Toutefois, les cellules tumorales peuvent perturber la réponse immunitaire de manière à favoriser leur propre croissance, ce qui impacte négativement le pronostic des patients atteints de mélanome cutané. Ce cancer de la peau est hautement agressif, premièrement à cause de son potentiel à métastaser, et deuxièmement par sa fréquente résistance à la plupart des immunothérapies et thérapies ciblées utilisées aujourd’hui. Notre laboratoire s'intéresse à une molécule qui possède un rôle pro-tumoral dans le microenvironnement tumoral associé au mélanome cutané. Cependant, les cellules et molécules impliquées dans la réponse immunitaire pro-tumorale sont encore mal connues. Le projet vise donc (1) à étudier dans un modèle murin de mélanome cutané, l’impact de cette molécule sur les différentes sous-populations cellulaires immunitaires ; (2) à identifier et étudier la fonction des sous-populations cellulaires immunitaire induite par cette molécule ; et enfin (3) à évaluer et améliorer l’effet du blocage de cette molécule associée à une thérapie déjà utilisée pour soigner les mélanomes cutanés chez l'humain. Afin de répondre à ces questionnements, nous étudierons la réponse immunitaire au niveau du microenvironnement tumoral associé au mélanome cutané ainsi que dans les ganglions lymphatiques drainant la tumeur et dans le sang.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à approfondir notre compréhension de la réponse immunitaire impliquée dans le développement du mélanome cutané. Par ailleurs, ces nouvelles connaissances sur les différentes sous-populations cellulaires immunitaires dans le microenvironnement tumoral pourraient nous permettre éventuellement de la moduler en agissant sur ces types cellulaires spécifiques. De plus, cette étude permettra également d'évaluer le potentiel d’une nouvelle cible thérapeutique afin d’améliorer la survie des patients atteints de mélanome cutané.
Procédures
Lors de la 1ère partie, 148 souris au maximum seront anesthésiée par voie gazeuse et traitées pendant une durée de 3 jours (le traitement est d'une durée d'environ 30 secondes) afin d'induire un mélanome cutané. Pour la 2ème partie du projet, 540 souris seront anesthésiées et injectées par voie intradermique avec des cellules immunitaires au niveau des deux oreilles, et gardés pendant 7 jours (l'injection est d'une durée de 6 minutes). Enfin, la 3ème partie concernera 556 souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale 2 fois par semaine pendant 2 semaines (durée de 20 secondes) avec une immunothérapie combinée.
Impact sur les animaux
Une minorité des animaux de 2 lignées de souris utilisées (moins de 30% des effectifs) est susceptible de développer un phénotype dommageable se traduisant par l'apparition de tumeurs spontanées non pigmentées et à croissance rapide, un suivi particulièrement attentif sera mis en place. L'application d'analogue de ka vitamine D sur les oreilles des animaux sous anesthésie gazeuse légère engendrera un léger stress d'une courte durée. (Lors des transferts des cellules dendritiques, les animaux donneurs seront de la même espèce, du même sexe et du même fond génétique que les animaux receveurs (qui recevront l'injection de ces cellules) éliminant les risques de rejet. Néanmoins, cette procédure engendrera un léger stress et douleur d'une courte durée sur les animaux receveurs et une inflammation au niveau des oreilles, accompagnées de démangeaisons et d'une rougeur. Les injections intrapéritonéales d'anticorps sur d'autres modèles ont déjà été réalisées par le passé dans notre équipe, et nous n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection et un stress du à la contention sera ressenti pendant un temps court ( quelques secondes). Le traitement avec des anticorps devrait faire régresser la tumeur mais une rougeur pourrait apparaitre sur la peau recouvrant la tumeur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales afin de prélever les différents organes ou tissus nécessaires à l'étude de la réponse immunitaire dans le mélanome cutané. permettent de maintenir les lignées utilisées dans ce projet de recherche. Au maximum 15 animaux seront utilisés pour les expérimentations en utilisation continue, pour avoir 5 accouplements en continu.
Remplacement
Les lignées de souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet vont nous permettre d'étudier des gènes ou des cellules dont l'implication dans le mélanome a été suggéré in vitro par notre laboratoire ainsi que d'autres. Les phénomènes impliqués dans le mélanome cutané mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires qui composent l'ensemble du microenvironnement tumoral. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Afin de différencier les rôles de différentes cellules et molécules pouvant être impliquées dans le développement du mélanome, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 11 lignées de souris différentes et d'un maximum de 1204 animaux. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions statistiquement significatives. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro ont été réalisées afin d’éliminer certaines hypothèses et de mieux définir les expériences à effectuer sur les modèles in vivo.
Raffinement
Tous les animaux feront l'objet d'une observation quotidienne basée sur leur apparence générale, leur posture et leur comportement. Tous les animaux intégrés dans une procédure expérimentale seront soumis à l'application de points limites définis, stricts et spécifiques de ce projet. En cas de signes cliniques tels qu'un dos courbé, un pelage ébouriffé, une absence de réaction aux stimuli ou encore une inflammation ou une infection au niveau des sites d'injection, l'animal sera retiré de l'étude et pourra recevoir des soins selon l'avis du vétérinaire. Si l'état de l'animal est jugé critique (blessure importante par exemple), une euthanasie immédiate sera pratiquée. Pour les souris développant des tumeurs cutanées, un suivi renforcé sera assuré quotidiennement. Le volume tumoral sera mesuré à l'aide d'un pied à coulisse et l'euthanasie sera réalisée si la taille de la tumeur atteint 1 cm3. Toutes procédures pouvant induire douleur ou stress chez l'animal sera effectuée sous anesthésie légère gazeuse, n'engendrant qu'un stress léger de courte durée dû à la contention. Les animaux seront hébergés en groupe et auront un accès constant à de l'eau et de la nourriture pendant toute la durée de l'expérience.
Choix des espèces
Les mécanismes cellulaires dans le microenvironnement tumoral du mélanome cutané impliquent plusieurs organes différents (peau, ganglions lymphatiques, etc.) et ces interactions inter-organes nécessitent plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre la croissance tumorale, l'implication du système immunitaire et à terme, identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.
Étude, chez la souris, de la pharmacocinétique et de l’efficacité d’un nouveau traitement pour une maladie rénale rare humaine.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Trois injections déclenchent une maladie rénale, puis jusqu'à dix-huit administrations du composé à tester s'enchaînent sur quinze jours, entrecoupées de trois prélèvements sanguins. Entre-temps, chaque souris passe jusqu'à trois fois vingt-quatre heures seule en cage à recueil d'urine. 2 628 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec pour effets attendus une souffrance, de rares œdèmes et une fatigue liées à la glomérulonéphrite induite. Toutes sont tuées en fin de procédure parce que leurs reins doivent être examinés au microscope.
Objectifs
Contexte : Le projet vise à évaluer le potentiel d’un composé innovant pour le traitement d’une maladie rénale rare nommée la glomérulonéphrite à croissants. Cette maladie est due à une agression du système immunitaire contre les reins, entraînant une dégradation rapide de la fonction rénale et, en l’absence de traitement, une insuffisance rénale terminale. Les traitements actuellement disponibles ciblent uniquement le système immunitaire, sans protéger directement le rein. Ils sont par ailleurs associés à de nombreux effets secondaires graves. Dans 20% des cas, les patients décèdent dans un délai de 2 ans et jusqu’à 70% des patients présentent une perte totale de la fonction rénale dans les 5 ans. Lors d’études précédentes, nous avons identifié et optimisé un composé ciblant spécifiquement la prolifération cellulaire responsable des lésions irréversibles des reins et qui constituerait donc un candidat thérapeutique pour cette pathologie, répondant ainsi à un besoin médical urgent et actuellement non satisfait. Objectif : Le projet vise à identifier la dose optimale et les paramètres d’administration permettant de garantir une efficacité maximale tout en minimisant les effets secondaires indésirables potentiels de notre composé. Nous réaliserons cette étude en recourant à un modèle spécifique de souris chez qui nous mimerons la maladie. Pour répondre à notre objectif, il est impératif que nous testions 1°) plusieurs doses de notre composé (1 dose dite thérapeutique et 2 autres doses encadrant cette dose afin de réaliser une analyse dose-réponse de notre composé), 2°) différentes voies d’administration (la voie sous-cutanée représentant la voie thérapeutique qui sera utilisée chez l’Homme et la voie intraveineuse qui est nécessaire pour calculer la biodisponibilité de notre composé par voie sous-cutanée), 3°) différents groupes de souris (malades ou non pour vérifier l’efficacité de notre composé).
Bénéfices attendus
Le développement de notre composé représente une solution innovante ciblant les processus inflammatoires et les lésions rénales dans une maladie rénale rare humaine. En réduisant l’inflammation, la prolifération cellulaire et en protégeant les reins, notre composé peut transformer la prise en charge de cette maladie qui ne possède pas de traitement spécifique actuellement et qui est responsable d’une importante mortalité. Ce projet permettra de définir précisément la dose minimale efficace et le schéma d’administration optimal, garantissant une efficacité maximale tout en minimisant les effets secondaires et les risques pour les patients. Ce projet contribuera aussi à renforcer la compréhension des mécanismes de cette maladie, tout en validant notre composé en tant que médicament. Notre composé offre une opportunité unique d’améliorer les perspectives de survie et la qualité de vie des patients. Notre composé pourrait également réduire de manière significative les coûts liés à la prise en charge de cette maladie. En conclusion, ce projet combine une potentielle future avancée thérapeutique majeure répondant à un besoin médical urgent pour les patients, tout en renforçant l’innovation scientifique dans le domaine des maladies rénales rares.
Procédures
Certains animaux seront soumis à trois administrations de molécules d’une durée de quelques secondes qui entraineront le développement d’une maladie rénale durant une période de 15 jours. Une à plusieurs administrations (au maximum 18), d’une durée de quelques secondes, du composé thérapeutique étudié dans ce projet seront réalisées durant une période de 15 jours. Au maximum, trois prélèvements sanguins d’une durée d’une minute et répartis sur une période de 15 jours seront effectués pour chaque animal. Les souris seront hébergées individuellement durant 24 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines, au maximum à trois reprises réparties sur une période de 15 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus lors de l’étude sont une souffrance, de rares œdèmes et une fatigue occasionnée par le développement de la maladie rénale que nous induirons par injection et qui s’étendra sur 15 jours, une douleur au niveau du point d’administration des molécules induisant la maladie (qui durera quelques minutes à quelques heures), une douleur au niveau du point d’administration du composé thérapeutique étudié (qui durera quelques minutes à quelques heures), un stress dû aux manipulations des animaux pendant les procédures expérimentales (qui ne durera que de brèves minutes) et un stress lié à l’hébergement individuel temporaire nécessaire pour le recueil des urines
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de procédure car il est indispensable de prélever leurs reins pour faire des analyses microscopiques poussées. Ces examens permettent d’évaluer la mise en place de la maladie et l’effet protecteur de notre composé-médicament dans les reins.
Remplacement
Nous avons utilisé des tests in vitro pour mettre au point notre composé-médicament et pour étudier son mode d’action et ses performances. Cependant, aucun système in vitro ne permet de remplacer un organisme entier complexe avec son appareil circulatoire et l’ensemble de ses organes, dont le foie et le rein en particulier, pour caractériser notre composé-médicament. De même, il n’est pas possible d’utiliser des systèmes in vitro pour reproduire une maladie aussi complexe que celle étudiée dans ce projet qui nécessite des interactions entre les systèmes immunitaire, vasculaire et rénal ; et mesurer la capacité de notre composé-médicament à prévenir les atteintes liées à cette maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été défini et calculé précisément comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Pour établir l’efficacité thérapeutique de notre composé tout en réduisant le nombre total d’animaux, nous intégrerons au fur et à mesure du projet les données issues de chacune des expériences. Cette intégration progressive des données permettra, par exemple, de réduire le nombre de dose de composé à tester au minimum pour une analyse dose-réponse pertinente, ou encore de définir le meilleur schéma thérapeutique de notre composé (moment de la maladie où le composé doit être administré et durée optimale du traitement). Grâce à cette intégration au fur et à mesure des données, nous serons en mesure d’adapter notre plan global et de limiter nos expériences aux seules nécessaires au vu des données précédentes. Les conditions expérimentales (souche, âge, sexe, induction, traitement, analyses) seront strictement identiques durant le déroulement de l’ensemble de ce projet. Tous les paramètres secondaires (sanguins, urinaires, histologiques) seront mesurés sur les mêmes animaux pour limiter le nombre total utilisé.
Raffinement
Tous les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi comprenant des maisons et des tunnels en carton, de la paille ou du mouchoir en papier pour leur nid, et des bâtonnets en bois à ronger. Le modèle de souris transgénique utilisé dans cette étude n’induit aucun phénotype dommageable. La maladie rénale fera l’objet d’une surveillance quotidienne accrue tout au long du déroulement des expériences. Afin de détecter et de limiter la souffrance et/ou le stress des animaux lié à cette maladie, une surveillance de leur état général et leur comportement sera réalisée grâce à un ensemble d’indicateurs suffisamment prédictifs et spécifiques au projet. Dans les cas rares où les indicateurs révéleraient un état anormal, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux administrations et aux prélèvements sanguins, une pommade analgésique sera appliquée localement sur le site d’administration ou de prélèvement et ces actes seront réalisées dans une pièce au calme sans passage avec une anesthésie gazeuse légère des animaux sur un tapis chauffant. Pour chaque souris, pas plus de deux administrations par jour et un prélèvement sanguin par semaine ne seront effectués. Pour minimiser le stress lié à l’hébergement individuel temporaire pour recueillir les urines, les animaux maintiendront un contact visuel, olfactif et auditif car les cages sont transparentes, semi-ouvertes et localisées dans la même pièce que les autres cages. De plus, des bâtonnets à ronger et des jeux suspendus seront ajoutés dans ces cages.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de référence pour modéliser cette maladie rénale rare. Elle permet une induction maîtrisée et reproductible de la maladie, avec des marqueurs cliniques, biologiques et histologiques proches de l’humain. Sa petite taille, sa rapidité d’expérimentation et les outils disponibles en font un modèle pertinent et reconnu pour les études pharmacologiques et d’efficacité thérapeutique. L’utilisation d’un modèle spécifique de souris est pertinente car elle garantit ainsi la validation pharmacologique de notre médicament dans cette étude. Ce modèle n’induit pas de phénotype dommageable chez la souris. Les souris utilisées seront de jeunes adultes de 6 à 12 semaines car la pathologie étudiée se développe essentiellement chez les adultes. Nous n'utiliserons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des modifications des fonctions rénales dues à l'âge et qui pourraient interférer avec nos résultats. Des mâles et des femelles en nombre égal seront utilisés car l’exposition au composé-médicament semble différente entre mâles et femelles selon des études préliminaires.
Cibler les signaux synaptiques « Mangez-moi » pour prévenir l’engloutissement synaptique excessif par la microglie et réduire la perte synaptique dans la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
505 souris porteuses de mutations Alzheimer vont être utilisées, chacune recevant une injection dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, passant trois demi-journées de tests comportementaux, puis subissant une chirurgie terminale. 300 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 205 un niveau modéré, et toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Environ 15 % développent une paralysie des membres postérieurs, d'autres de l'épilepsie, une hydrocéphalie ou une malocclusion. Le porteur annonce trois tests destinés à explorer mémoire et anxiété sans préciser lesquels, et avance qu'un traitement retardant la maladie de cinq ans diviserait par deux le nombre de cas, projection qui reste à démontrer.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle aucun remède n’existe à ce jour. Dans la MA, la perte des synapses (connexion entre les neurones) est le principal moteur du déclin cognitif. Des données récentes mettent en évidence le rôle central des microglies (cellules immunitaires du cerveau) dans cette perte synaptique, via un excès de phagocytose (destruction) des synapses par les microglies. Cela pourrait ouvrir la voie à des applications thérapeutiques ciblant le signal aberrant de type « mange-moi » émis par les synapses à destination des microglies, ce qui constitue l’objectif principal de ce projet. L’objectif global est de réduire la perte synaptique dans la maladie d'Alzheimer et de ralentir le déclin cognitif. Ce projet a pour but de tester deux molécules développées par l’équipe, conçues pour convertir le signal aberrant « mange-moi » des synapses en un signal « ne me mange pas », empêchant ainsi une phagocytose synaptique excessive par les microglies. Sur la base de résultats préliminaires prometteurs obtenus in vitro, nous souhaitons désormais évaluer l’impact de ces molécules sur la perte synaptique et neuronale dans un modèle murin de MA, ainsi que leurs effets sur la fonction cognitive, l’activité et la structure synaptique et les modifications protéiques, notament dans les synapses affectées par la MA.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la perte des synapses (connexions entre les neurones) dans la MA. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la transformation du signal aberrant « mange-moi » des synapses en un signal « ne me mange pas », empêchant ainsi la destruction excessive des synapses par les microglies qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.
Procédures
Tous les animaux subiront une anesthésie gazeuse (5 minutes maximum) afin de recevoir une injection intraveineuse unique dans le sinus rétroorbitaire. Tous les animaux subiront 3 tests comportementaux pendant 3 demi-journées et une chirurgie terminale sous anesthésie.
Impact sur les animaux
L'injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbital peut générer une douleur, un saignement ou une inflammation. Tous les animaux subiront 3 tests comportementaux pouvant entrainer un stress, destinés à explorer leurs capacités de mémorisation et leur niveau d'anxiété.Notre modèle de la maladie d'Alzheimer peut développer une paralysie des membres postérieurs qui pourra à la longue les empêcher d'accéder normalement à la nourriture et à l'eau. Ces souris peuvent aussi faire de l'épilepsie, de l’hydrocéphalie et de la malocclusion (mauvais alignement des dents) qui pourront générer de la souffrance, du stress et une perte de poids. En ce qui concerne le comportement, il s'agit de manipulations répétées qui sont indolores et non invasives mais peuvent être stressantes pour les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analysé.
Remplacement
Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique ainsi que les pathologies alzheimer sont très/assez difficiles à obtenir in vitro. Les souris modèles de la maladie d'Alzheimer du projet représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin. De plus, les modèles de test comportementaux n'étant pas possible in vitro, l’utilisation d’un animal qui développe des altérations mnésiques similaires à celles observées dans la MA est donc nécessaire, avec des capacités mnésiques mesurables.
Réduction
Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Nous utiliserons mâles et les femelles témoins et les souris modèles de MA.
Raffinement
Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Au cours de l'injection rétro-orbitaire, chaque souris sera préalablement anesthésiée au sévoflurane et recevra une goutte d'anesthésique local en collyre dans l’oeil. Suite aux injections rétro-orbitaires, une attention particulière sera accordée aux yeux lors de l'observation quotidienne afin d'identifier de possibles effets indésirables (oeil fermé, saignement, inflammation…). Les souris MA développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Environ 15% des souris MA développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois. Les premiers signes sont la rétraction des membres postérieurs quand la souris est soulevée par la queue. Au début, les souris sont entièrement ambulatoires et peuvent accéder normalement à la nourriture et à l'eau. Cela peut évoluer vers une faiblesse des membres postérieurs et éventuellement une paralysie. A ce stade de la nourriture humidifiée et/ou du gel hydratant seront disposés à l’intérieur de la cage. Les souris sont observées quotidiennement pour leur capacité à atteindre la nourriture et l'eau. Ce processus, lorsqu'il se produit, progresse au cours des semaines à plus d'un mois. Critères d’euthanasie : signes de douleur persistante (animal prostré, dos courbé, etc.) ou incapacité à se déplacer pour boire ou manger. Notre objectif est de les amener à 10 mois maximum. Les souris MA sont sensibles au bruit et à la manipulation. Si une crise épileptique se produit, nous laisserons la souris récupérer et observerons 5 minutes. Si elle est incapable de se remettre d'une crise, elle sera euthanasiée. Habituellement, les souris récupèrent et se comportent normalement. Si la souris développe une hydrocéphalie, elle sera euthanasiée. Si une malocclusion est identifiée, la souris sera évaluée. Une malocclusion dentaire empêche l’usure normale des dents qui poussent en continu, entraînant des douleurs, des blessures et une incapacité à s’alimenter. Les dents seront taillées chaque semaine par le personnel animalier et le poids sera surveillé.
Choix des espèces
Les souris modèles Alzheimer constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, les pathologies cérébrales, ainsi que la neurodégénérescence progressive responsable des troubles cognitifs dans la maladie Alzheimer sont très difficilement modélisables in vitro et nécessites des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. - Une cohorte sera utilisée de 4/5 mois à 7 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades précoces de la maladie sans neurodégénérescence mais avec pathologies Alzheimer. - Une cohorte sera utilisée de 4/5 mois à 10 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la maladie avec neurodégénérescence résultant des pathologies Alzheimer. Les cohortes seront composées de mâles et de femelles.
Induction et suivi des modèles de colite chez le rat ou la souris pour évaluer le rôle des protéases et leurs récepteurs dans les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 1800
L'état général des animaux est observé au minimum une fois par semaine, et tout individu atteignant un point limite est tué. 5 760 souris et rats vont être utilisés dans des modèles de colite, dont 4 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour prélever le colon et l'iléon. La colite provoque perte de poids, diarrhée, sang dans les fèces et hypersensibilité viscérale. Les animaux subissent jusqu'à sept endoscopies sous anesthésie, un gavage pouvant aller jusqu'à deux fois par jour pendant deux mois, et des administrations intracoliques pratiquées sur rat vigile en contention, avec un risque de perforation de l'intestin. L'objet est de tester des molécules candidates contre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, et le porteur précise qu'aucun logiciel ni test statistique n'a servi à fixer l'effectif, son expérience des modèles lui suffisant.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) se caractérisent par une inflammation du tractus gastrointestinal. Il existe deux pathologies : la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Ces pathologies touchent entre cinq et six personnes sur 100 000. Elles débutent généralement chez le jeune adulte et touchent indifféremment les deux sexes. Les traitements disponibles aujourd’hui sont soit des traitements symptomatiques, soit reposant sur des actes chirurgicaux. Les causes des MICI sont encore mal connues. Les modèles animaux ont grandement enrichi notre compréhension de nombreuses pathologies intestinales. En plus d'améliorer la compréhension de la maladie, les modèles animaux sont également utilisés de manière importante pour tester les nouveaux médicaments ainsi que pour les interventions diagnostiques ou thérapeutiques précliniques. Des techniques d'imagerie sophistiquées ont été développées afin de surveiller l'activité de la maladie chez la souris. Ces techniques endoscopiques permettent une visualisation directe de l'inflammation intestinale ou la cicatrisation des plaies. Ce processus donne un état objectif en temps réel permettant des études chez le même animal à des moments répétés. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques pour les MICI chez le rat et la souris. Le modèle utilisé sera adapté aux cibles thérapeutiques à évaluer.
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes de l'inflammation dans les modèles de colite est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre projet vise a évaluer le rôle de récepteurs activés par les protéases et des protéases elles mêmes dans les modèles de colite.
Procédures
- endoscopie sur animal anesthésié (au minimum 2 fois maximum 7 fois) durée : 15 minutes par endoscopie - gavage minimum 1 fois sur la durée de l'expérimentation (2 mois maximum), maximum 2 fois par jour quotidiennement durée: 1 minute par geste - prélèvement de sang sur animal anesthésié 1 fois sur la durée de l'expérimentation (2 mois maximum), maximum 1 fois par semaine durée: 5 minutes par geste - administration intracolique de produit sur souris anesthésiée minimum 1 fois maximum 4 fois durée 2 minutes par geste - administration intracolique sur rat vigile en contention minimum 1 fois maximum 4 fois durée 3 minutes par geste - administration intrapéritonéale sur animal vigile 2 fois (1 fois par jour, 2 jours consécutifs) durée 1 minute par geste -administration cutanée sur animal vigile (1 fois par jour, 2 jours consécutifs) durée 1 minute par geste)
Impact sur les animaux
L'induction de la colite est caractérisée par la perte de poids des animaux, l'apparition de diarrhée et de sang dans les féces ainsi qu'une douleur et hypersensibilité viscérale. L'administration intracolique chez le rat vigile et le gavage peuvent induire du stress. L'endoscopie et les biospsies sont réalisées sous anesthésie mais il y a un risque de perforation de l'intestin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever des tissus (colon, ileon).
Remplacement
La colite est une réaction integrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’experimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'inflammation intestinale. Dans le cadre de ce projet, l’expérimentation animale est indispensable.
Réduction
La technique d'endoscopie utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux). De plus, les résultats obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: avant traitement versus après traitement). Les tests statistiques utilisés peuvent comparer les mesures sur le même individu ou entre individus. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Aucun logiciel ou test statistique n'ont été utilisé mais notre expérience de ces modèles nous permet de connaitre le nombre d'animaux minimum nécessaire afin d'obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des igloos et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine. Pour chaque procédure des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. Les souris sont anesthésiées lors des administrations intracoliques et du prélèvement de sang.
Choix des espèces
Chaque espèce présente une sensibilité différente pour les différents modèles. Dans le but d’une plus grande homogénéité des réponses et donc pour limiter le nombre d’animaux nécessaire, nous utiliserons des espèces «sensibles » (plus reproductibles). Ainsi, en fonction du modèle : des rats (espèce pour laquelle le modèle est plus reproductible) et/ou des souris (le choix rat ou souris dépendra du mécanisme et/ou cible de la molécule à tester). De plus nous avons des souris transgéniques pour des protéases d'interet. 3 modèles seront réalisés car ils miment chacun des pathologies différentes. Les souris seront âgées d'au moins 8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures. Leur métabolisme, leur système immunitaire et leur physiologie étant stabilisés nous auront ainsi moins de variation que sur des jeunes animaux.
Evaluation de radiotraceurs dans des modèles de mélanome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
Toutes tuées en fin d'expérience pour que leurs tumeurs et leurs organes soient prélevés, 2 160 souris vont être utilisées dans l'évaluation de radiotraceurs contre le mélanome. 1 560 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 600 d'un niveau sévère. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie, une injection de radiotraceur et jusqu'à quatre examens d'imagerie nucléaire de 45 minutes, nuisances que le porteur qualifie toutes de légères, y compris la gêne fonctionnelle liée à la tumeur. Sur le remplacement, il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant", et prévoit d'utiliser les animaux sans prise tumorale pour la formation du personnel ou pour constituer une banque d'organes.
Objectifs
Les mélanomes avancés demeurent associés à un sombre pronostic et la recherche de nouvelles thérapies plus efficaces est plus que jamais d’actualité. Notre projet a pour but de développer des radiotraceurs spécifiques des cellules tumorales pigmentées associant des ligands de la mélanine à un isotope radioactif. Ainsi, leur profil de biodistribution sur modèles murins de mélanome sera évalué. Les radiotraceurs les plus pertinents en termes de stabilité et de profil de biodistribution (fortes affinité et spécificité pour la cible tumorale, faible accumulation dans les organes sains) feront l’objet d’une étude d’efficacité antitumorale in vivo afin de démontrer la pertinence de notre approche en vue d’un transfert clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à établir une preuve de concept préclinique de l’intérêt d’un radiotraceur pour la radiothérapie interne vectorisée des mélanomes avancés. Ce traitement ciblé, qui s’adresse à la maladie disséminée, est particulièrement bien adapté à cette pathologie et pourrait apporter une réponse efficace aux patients en échec thérapeutique ou non éligibles aux traitements actuels.
Procédures
- 1 injection de cellules (durée
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - Une douleur ou inflammation locale liée à l’inoculation des cellules tumorales sous anesthésie, réduite à une dizaine de secondes (nuisance légère). - Une gêne fonctionnelle liée à la présence de la tumeur (nuisance légère). - Le stress modéré lors de l’injection de la molécule radioactive dans un appareil de contention, réduite à une dizaine de secondes car réalisée par un expérimentateur expert (nuisance légère). - Le stress léger dû à l’induction de l’anesthésie (nuisance légère).
Devenir
Afin de caractériser l'effet de nos traitements notamment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs des animaux traités et non traités. Nous devons pour cela procéder à l’euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire des tumeurs, ainsi que celles des tissus des autres organes est indispensable pour évaluer les effets anti tumoraux mais également la toxicité des traitements testés.
Remplacement
Les molécules seront sélectionnées en amont selon leur affinité à la mélanine et leur stabilité dans du sérum de souris. Le développement et la validation préclinique de nouvelles molécules diagnostiques et/ou thérapeutiques requièrent la détermination de paramètres de biodistribution des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.
Réduction
Selon nos expériences antérieures, le modèle tumoral présente dans 20% des cas aucune ou peu de prise tumorale, cela a donc été intégré dans nos calculs de taille. De plus, le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. L'approche statistique consistera en une analyse non paramétrique suivant le nombre de groupe à comparer. De plus, les examens d’imagerie sont des méthodes non invasives qui permettent également de réduire le nombre d’animaux grâce à la possibilité d’un suivi longitudinal où un animal est son propre contrôle au cours du temps. Les animaux non inclus dans les procédures (pas de prise tumorale…) seront utilisés pour la formation du personnel ou la création de banque d’organes pour des mises au point techniques.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux inclus dans ce projet, nous mettons à disposition un enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette dans chacune des cages. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Après leur arrivée à l’animalerie, une période d’acclimatation de 5 jours est définie afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils seront habitués à la contention et à l’appareillage de contention pour les injections intraveineuses dès la fin de la période d’acclimatation. De plus, certains gestes seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Ils seront habitués à la présence de nourriture humide dans le fond de la cage pour une meilleure prise en charge non médicamenteuse des éventuelles gênes liées à l’inoculation des cellules. La surveillance quotidienne permettra de visualiser l’état général des animaux et de réagir rapidement en cas de signe d'inconfort, de stress ou de souffrance grâce à l’évaluation des points limites. Des mesures de poids et de taille tumorale seront réalisées 2 fois par semaine. Si besoin, une injection d'antalgiques sera réalisée. En cas d'atteinte d'un des points limites, l'animal sera mis à mort. Les gestes techniques sont optimisés grâce à un programme de formation et de tutorat ainsi qu’au suivi des compétences techniques du personnel ce qui permet de limiter le stress des animaux et augmenter la précision et la rapidité des gestes.
Choix des espèces
Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer pour lequel on peut avoir un suivi de la croissance tumorale et une évaluation de la biodistribution des radiotraceurs. Les animaux, âgés de 5 semaines, seront réceptionnés dans l’animalerie, les expérimentations seront réalisées après une période d’acclimatation de 5 jours.
Développement d’une nouvelle thérapie génique ciblant la production de leptine adipeuse pour traiter le syndrome de Rett
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tester une thérapie génique visant la leptine dans le syndrome de Rett conduit à utiliser 510 souris modifiées pour développer les symptômes de la maladie. 375 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 135 un niveau sévère, et toutes sont tuées à l'issue. Biopsie de la queue vers le dixième jour de vie, injection sous-cutanée au vingtième, un ou deux prélèvements sanguins, puis tests moteurs, cognitifs et sociaux, mesure de l'activité respiratoire et suivi de l'épileptogenèse entre le 45e et le 50e jour. Les souris mâles ont une espérance de vie réduite à deux mois et le porteur annonce qu'il évaluera l'effet du traitement sur cette durée de vie, les animaux étant tués quand une grille de score signale une dégradation de leur apparence ou une perte de poids.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. Ce syndrome entraîne un polyhandicap qui se manifeste par une déficience intellectuelle sévère, infirmité motrice, des troubles respiratoires et présence d’activité épileptique. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif de la maladie. Diverses thérapies géniques ou pharmacologiques sont envisagées pour traiter ce syndrome. Notre objectif est de développer une nouvelle thérapie génique ciblant la leptine. La leptine est une hormone sécrétée par le tissu adipeux, capable d’agir au niveau du cerveau et de contrôler de nombreuses fonctions physiologiques telles que la prise alimentaire, le métabolisme, les activités respiratoires et cardio-vasculaires, l’anxiété, les fonctions cognitives et la susceptibilité à l’épilepsie. Ces fonctions sont affectées chez les patients atteints du syndrome de Rett et chez les modèles murins de la pathologie, ce qui soulève la possibilité que des niveaux excessifs de leptine puissent contribuer à la progression du syndrome de Rett. En accord avec cette hypothèse, des taux élevés de leptine circulante ont été observés chez des patients atteints du syndrome de Rett et dans des modèles murins. Notre objectif est de tester le rôle de l’hormone adipocytaire, leptine, dans les troubles associés au syndrome de Rett sur un modèle murin, au niveau comportemental et neuronal.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet pre-clinique est de démontrer un rôle de la leptine dans l’etiologie du syndrome de Rett et d'ouvrir vers le développement d'une nouvelle approche thérapeutique pour traiter cette maladie qui devra être tester dans d'autres étdues cliniques.
Procédures
Dans ce projet, nous utiliserons des souris modifiées génétiquement qui récapitulent les symptômes et troubles décrits chez les patients atteints du syndrome de Rett. Ces souris seront générées et élevées au laboratoire. Un prélèvement de poils pour le génotypage et une injection sous-cutanée seront réalisées chez les animaux mâles et femelles au sevrage (20-21ieme jour de vie postnatale). Certains animaux seront soumis à un (au 40ieme jour de vie) ou deux (au 30ieme et 40ieme jour de vie) prélèvement(s) sanguin(s). Des analyses comportementales (moteur, cognitif et social), physiologique (activité respiratoire) et pathologique (épileptogenèse) seront réalisées entre le 45ieme et 50ieme jour de vie postnatale. Nous évaluerons également les effets du traitement sur l’espérance de vie des animaux, d’une durée moyenne de 2 mois chez les animaux non-traités. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les symptômes seront rapportés sur une grille de score nous permettant de définir le point limite d'euthanasie afin de limiter leur souffrance.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour présenter les symptômes observés chez les patients souffrant du syndrome de Rett. Ces symptômes, qui apparaissent vers le 30ieme jour de vie, sont des difficultés respiratoires, des troubles locomoteurs et cognitifs, des activités épileptiques (chez les souris femelles), et une perte de poids (uniquement chez les souris mâles). Les souris mâles présentent une espérance de vie réduite de 2 à 3 mois. Une biopsie de la queue sera effectuée vers le 10iéme jour de vie pour définir le génotype des animaux ce qui entrainera une douleur légère de courte durée. Les animaux recevront une injection sous-cutanée au 20ieme jour de vie. Certains animaux seront soumis à un (au 40ieme jour de vie) ou deux (au 30ieme et 40ieme jour de vie) prélèvement(s) sanguin(s). Ces injectons et prélèvements devraient provoquer une douleur légère et de courte durée.
Devenir
Dans toutes les procédures, les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être. En fonction de l’évolution de différents critères comme par exemple l’apparence de l’animal ou une perte de poids, les animaux seront euthanasiés pour réduire toute forme de souffrance. Tous les animaux utilisés pour l'analyse comportementale seront euthanasiés à la fin de l'étude.
Remplacement
Seule l'expérimentation chez l'animal permettra de remplir les objectifs de ce projet. Il n'est actuellement pas possible par des méthodes in vitro (non animales) de reproduire les processus pathologiques complexes du syndrome de Rett. L’organisation et le fonctionnement des réseaux neuronaux ne peuvent être reproduits dans des modèles de lignées cellulaires ou de cultures neuronales.
Réduction
Des calculs statistiques utilisant les données d'études antérieures ont été utilisés pour calculer le nombre minimum d'animaux requis tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement significatifs. Les tâches proposées permettent d’évaluer les animaux sur plusieurs paramètres au niveau comportemental et neuronal, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Pour les enregistrements de l’activité nerveuse, 2 chercheurs seront mobilisés. La présence de 2 chercheurs pour ces enregistrements permettra d’augmenter le nombre de neurones enregistrés par animal, et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés pour atteindre une taille de l’échantillon permettant une analyse statistique.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement via l’observation de leur aspect général (poil hirsute, position voûtée, yeux) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation). Le suivi de leur poids sera également un critère. Lorsque les points limites sont atteints (signes visibles de la maladie, perte ou prise de poids excessive) les animaux seront euthanasiés. L'équipe continuera à examiner les dernières découvertes afin d'identifier toute nouvelle possibilité d'affiner l'expérience de ces animaux, tout en atteignant les objectifs de l'étude. Nous respecterons un délai de 15 jours entre les deux prélèvements pour éviter toutes complications (choc hypovolémique, et anémie). Dans le cas peu probable où une anémie serait observée, nous cesserons immédiatement les prélèvements. Dans le cas peu probable où un choc hypovolémique serait observé, l’animal sera euthanasié. Les animaux destinés à l’analyse comportementale seront habitués à la manipulation par l’expérimentateur. Les animaux seront anesthésiés avant d’être euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé en recherche biomédicale. Elle présente de nombreux intérêts : sa taille, son rythme rapide de reproduction et une gestation courte par rapport à d’autres organismes-modèles. De nombreux animaux existent permettant par exemple de déterminer les mécanismes moléculaires impliqués dans différentes pathologies. Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement qui récapitulent les symptômes décrits chez les patients atteints du syndrome de Rett. Il s’agit donc d’un modèle pertinent concernant les objectifs du présent projet. Pour ce projet, les analyses comportementales et neuronales seront réalisées à partir du 40ieme jour de vie, qui correspond à la période d'apparition et d'aggravation des symptômes.
Evaluation pré-clinique de thérapies innovantes dans des modèles précliniques de glioblastome chez les rongeurs EU 1/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 705
Greffe d'une tumeur dans le cerveau, jusqu'à 51 séances d'imagerie, 28 prélèvements de sang, 56 injections, 8 ouvertures de la barrière hémato-encéphalique, une résection tumorale et de la radiothérapie : un même animal peut subir tout cela. 3 510 souris et 705 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 3 015 d'entre eux et modéré pour 1 200. Le porteur décrit pourtant un hébergement assurant "une qualité de vie optimale tout au long de l'étude", chez des animaux immunodéficients dont la tumeur cérébrale provoque des troubles neurologiques et des difficultés de déplacement. Tous sont tués à un temps défini ou dès l'atteinte des points limites, pour des prélèvements post mortem, certains ayant été transportés vivants entre deux établissements pour accéder aux appareils d'imagerie.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales primitives et en particulier les glioblastomes sont des cancers très résistants aux traitements anti-tumoraux conventionnels (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie cytotoxique). En effet, la survie globale médiane des patients est comprise entre 12 et 24 mois. De nouveaux traitements sont donc indispensables pour améliorer le pronostic des patients souffrant de glioblastome. Les traitements candidats sont évalués dans le cadre d’essais cliniques longs et coûteux, et le plus souvent négatifs, avant leur approbation pour une utilisation en pratique clinique chez les patients. Compte tenu du nombre important de traitements candidats, notre projet vise l’accélération de l’évaluation de ces traitements innovants candidats et leur hiérarchisation en vue d’essais cliniques chez l’Homme. En effet, une évaluation préclinique rigoureuse permet de réduire le taux d’attrition des essais cliniques. (MODIFICATION) Le projet nécessite une modification sans augmentation du nombre d'animaux car le projet se déroulera dans deux établissements en raison de la nécessité d'utiliser des appareils d'imagerie spécifiques disponibles seulement dans le second établissement.
Bénéfices attendus
Les gliomes et en particulier les glioblastomes (GBM) sont les cancers cérébraux les plus fréquents et les plus graves chez l’adulte. Le pronostic des patients souffrant de glioblastome est réservé (12-24 mois de survie médiane) malgré des traitements lourds. De nouveaux traitements sont donc nécessaires. Le projet présenté ici vise donc à évaluer de nouvelles thérapies dans un contexte le plus biologiquement pertinent grâce à nos modèles de glioblastome qui sont en quelque sorte des avatars de patients atteint de cette maladie. Ultimement, nous visons à identifier de nouveaux traitements actifs contre le glioblastome qui pourront être évalués dans le cadre d'études cliniques chez l'homme.
Procédures
Les animaux auront tous une greffe tumorale cérébrale (30minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) ou une greffe tumorale cutanée (1minute, 1x, animal anesthésié). Tous les animaux auront un suivi par prélèvement sanguin (2minutes, 28x maximum, animal vigile ou anesthésié et analgésié si l'animal est en fin de procédure) et certains par imagerie également (5minutes à 4h, 51x maximum, animal anesthésié). (MODIFICATION) Certaines imageries nécessiteront un transfert d'un établissement à un autre (transfert de 10 minutes, 1 fois, animal vigile). Une partie des animaux auront également des traitements administrés par injections simples (1min, 56x maximum, animal vigile) ou par injections nécessitant une chirurgie (30min maximum, 1x, animal anesthésié et analgésié). Les administrations pourront être couplées à une ouverture de la barrière hémato encéphalique (pour que le traitement atteigne le cerveau) (1h maximum, 8x, animal anesthésié) ou à une résection tumorale (30 minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) et;ou à de la radiothérapie (10 minutes, 1 fois, animal anesthésié).
Impact sur les animaux
La greffe de cellule tumorale induit une croissance tumorale qui peut donner des troubles neurologiques ou des difficultés de déplacement. Les chirurgies pourront engendrer une douleur modérée post opératoire ainsi que des risques d’infection. Les anesthésies peuvent engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire. Les traitements pourront avoir des effets secondaires comme des diarrhées ou des inflammations aux sites d’injection engendrant une perte de poids. Les piqûres peuvent induire une douleur légère de courte durée au point d’injection. Les prélèvements sanguins pourraient induire une douleur légère de courte durée ainsi qu’un hématome. Les imageries pourront induire un léger stress chez les animaux. (MODIFICATION) Certaines imageries devront être réalisées dans un autre établissement, les animaux pourront ressentir un stress lié au transport entre les deux établissements et aux changements d'environnement. Le phénotype dommageable des animaux immunodéficients ou immunodéprimés induit une sensibilité accrue aux infections.
Devenir
Pour toutes les procédures, tous les animaux sont euthanasiés à un temps défini (ie quelques jours/heures post traitement etc) ou dès qu’ils atteignent les points limites décrits afin de faire des prélèvements post mortem.
Remplacement
Chez l’Homme, les tumeurs cérébrales sont des tumeurs complexes. Il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement qui joue un rôle clé dans le comportement spontané ou sous traitement des cellules tumorales. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Il est impossible de reconstituer ce contexte (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales in vitro ; que ce soit par le biais de cultures de cellules tumorales issues de patients ou bien de culture 2D ou encore 3D. Ces approches in vitro sont réalisées en amont des procédures in vivo pour justifier l'intérêt scientifique. De plus, cet environnement module la biodisponibilité d’une molécule thérapeutique au sein de la tumeur. Aussi, positionner les cellules tumorales cérébrales chez l’animal, dans un microenvironnement tissulaire et moléculaire complexe (cérébral) constitue un modèle d’étude pertinent. Ce dernier se rapproche au maximum des conditions observées chez les patients souffrant de tumeur cérébrale et chez qui les cellules cancéreuses prolifèrent dans du tissu nerveux central complexe.
Réduction
4215 animaux seront utilisés dans ce projet. Les efforts fournis afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sont: i) Seuls les composés efficaces in vitro par rapport aux traitements standards, seront testés in vivo. ii) Les cellules tumorales cérébrales greffées chez l’animal sont visibles par fluorescence ce qui permet de suivre le développement tumoral, cela évite l'euthanasie à différents temps et réduit donc le nombre d’animaux utilisé (iii) La fluorescence des tumeurs permet également de suivre l’efficacité des traitements testés en temps réel ce qui apporte une information supplémentaire à la survie. (iv) Une étude statistique détermine le nombre d’animaux nécessaire minimum pour atteindre un niveau de significativité acceptable. Cela permet de limiter le nombre d’animaux et d’éviter les études ne permettant pas de répondre à une question posée par manque de puissance statistique.
Raffinement
Durant toute la durée de leur vie, les animaux sont logés en groupe afin de favoriser leur bien-être social, l’isolement étant évité autant que possible. Cette approche groupée est cruciale, car les souris, comme de nombreux rongeurs, sont des animaux sociaux et leur isolement peut entrainer un stress psychologique et des comportements anormaux. Elles sont hébergées sur des portoirs ventilés, qui permettent une circulation d'air optimale et un environnement propre. Chaque cage est équipée d’un système d'abreuvement automatique garantissant un accès constant à l’eau et d’un approvisionnement ad libitum en nourriture, ce qui répond à leurs besoins nutritionnels et hydriques tout en permettant une gestion optimale des ressources. Le milieu de vie est enrichi avec au moins deux éléments, tels que des objets manipulables ou des matériaux permettant d'explorer et de satisfaire les comportements naturels des souris, comme le grattage, le fouissage ou la nidification. Cet enrichissement environnemental est essentiel pour prévenir l’apparition de comportements stéréotypés liés à l'ennui ou au stress et pour assurer une qualité de vie optimale tout au long de l’étude. Les animaux sont suivis quotidiennement par des vétérinaires et du personnel qualifié. Lors de procédures susceptibles de provoquer des douleurs modérées à sévères, comme des interventions chirurgicales, les animaux reçoivent une anesthésie générale appropriée et en complément, un analgésique leur est administré en préopératoire et postopératoire pour prévenir toute douleur et minimiser l'inflammation. Pour prévenir les risques d'infections des souris immunodéprimées, les animaux sont hébergés dans des cages propres avec litière, aliment et enrichissement irradiés ainsi que de l'eau osmosée pour boisson. Les injections seront toujours réduite au minimum suivant le composé testé (fréquence et volume), l'alternance des sites sera privilégiée quand cela est possible et les animaux seront anesthésiés si nécessaire pour leur bien être. Un système de points limites est mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’inconfort, tant à court qu'à long terme. Ces points limites prennent en compte des critères variés : l’observation du comportement, l'aspect général de l’animal, son niveau d'activité, ainsi que son poids corporel. Si un animal présente des signes de détresse, des mesures immédiates sont prises pour garantir son confort et sa santé.
Choix des espèces
Les souris sont choisies dans nos études thérapeutiques en raison de leur petite taille et de leur poids faible. Cette caractéristique permet l’utilisation de quantités réduites de composés cytotoxiques. De plus, ces modèles permettent l’utilisation de volumes expérimentaux limités, facilitant ainsi les études tout en respectant les principes de réduction des animaux dans la recherche. Les souches de rongeurs telles que les souris immunodéficientes sont particulièrement utiles pour leur incapacité à rejeter les cellules tumorales humaines. En parallèle, les souches immunocompétentes sont indispensables pour étudier la croissance tumorale dans un contexte immunologique complet. Les modèles animaux immunodéprimés sont utiles pour explorer l’impact d’un système immunitaire humanisé dans les réponses thérapeutiques contre les cancers. Enfin, les rats, sont choisis ici pour des scénarios nécessitant une plus grande précision chirurgicale. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 mois car le glioblastome est une tumeur de l’adulte chez l’Homme.
Formation concepteur – Rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 150
Former jusqu'à vingt-quatre étudiants par an à la contention, aux injections et à la mise à mort des rongeurs : 150 souris et 150 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Chaque participant manipule un seul animal par séance, une séance avec des rats et une avec des souris. Les injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intramusculaires et intraveineuses ainsi que les gavages volontaire et imposé se font sans anesthésie, sur une dizaine de minutes, les prélèvements de sang étant eux réalisés sous anesthésie. La mise à mort fait partie du programme et se prolonge par des prélèvements d'organes, le porteur écrivant qu'après un apprentissage sur maquettes, modèles en silicone et peluches, il reste "incontournable" de réaliser quelques gestes de base sur souris vigiles.
Objectifs
La formation sera conposée de séances de travaux pratiques intégrées au modules d'enseignements. Leurs objectifs seront dans un 1er temps de bien connaître les bonnes pratiques de manipulation des rongeurs, incluant l’enrichissement de leurs milieux d’hébergement. Les participants seront initiés aux principaux gestes techniques réalisés sur rats et souris (différentes méthodes de préhension et de contention dans le cadre de socialisation, pesée...). Les séances viseront également à apprendre les techniques d’administrations et de prélèvements sur animaux vigiles les mieux adaptées. La gestion de la souffrance (reconnaissance des signes) et de la douleur grâce à l’emploi adapté d’analgésiques et d’anesthésiques. Ensuite, les participants apprendront les meilleures techniques de mise à mort des animaux et à effectuer des prélèvements d’organes post-mortem. Pour ces séances, nous avons estimé qu’il serait suffisant de faire deux séances dans lesquelles chaque participant manipulera un seul animal : une séance avec rats et une séance avec souris. Etant donné l’objectif de ce projet, les tests statistiques ne sont pas nécessaires. Au cours de ce projet 24 étudiants au maximum seront formés par an.
Bénéfices attendus
Les travaux pratiques permettront l'acquisition des principaux gestes techniques dans le respect de la régle des 3 R, aux participants de notre formation concepteur de procédures expérimentales chez le rongeur.
Procédures
Toutes les administrations seront effectuées sans anesthésie (ou sur animaux vigiles), à savoir : les administrations intrapéritonéales, sous -cutanées, intra-musculaires, et intraveineuses, ainsi que les gestes de gavages volontaire et imposé (les volumes de solution de NaCl injectés lors de ces travaux pratiques seront réduits au minimum). L'ensemble dure 10 minutes. Tous les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie : le prélèvement de sang au niveau de la veine caudale chez le rat (5 minutes) et le prélèvement de sang au niveau de la veine mandibulaire chez la souris (5 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances seront liées à l'apprentissage de la contention des animaux et de l’administration par voie orale par les apprenants pratiquant pour la premier fois ce geste avec un animal vigile. Les injections et prélevements sanguins pourront être à l’origine de douleurs légères et de courtes durées.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. De plus cela permettra de faire des prélèvements post mortem afin de compléter l’apprentissage.
Remplacement
Nous avons mis en place des méthodes alternatives pour l’anatomie (utilisation de maquette et de table numérique Anatomage), les gestes basiques (modèles en silicone, peluches pour l'apprentissage des injections et prélèvements…). Ce projet a été ainsi conçu avec le minimum possible d’animaux. Cependant, il apparaît incontournable de réaliser quelques gestes de bases sur souris vigiles dans ce contexte de formation.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux pour la formation, les apprenants auront 1 animal par TP. Nous utiliserons les animaux des 2 sexes : 3 mâles et 2 femelles souris et rats; et 2 mâles et 3 femelles souris et rats par session de TP.
Raffinement
Les animaux sont hébergées par lot dans des cages dont la taille est règlementaire, avec enrichissement modifiable (tubes, feuilles de papier ouaté, dômes…). Cet hébergement sera réalisé dans une animalerie en conditions contrôlées. Un suivi de soin journalier sera effectué durant toute la période d'hébergement. Les format.eurs.rices sont des experts en expérimentation animale, maitrisant tous les gestes basiques sur souris et les rats. Tous les gestes techniques seront appris et répétés sur des mannequins, ce qui limitera le risque de nuissance sur animaux vivant lors des séances. Le gavage sera réalisé avec des sondes souples, limitant toute nuisance. Par ailleurs les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie. En cas d'atteinte des points limites, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La Formation concepteur (Rongeurs ) demandée ici est liée à la « Formation à l’utilisation des rongeurs à des fins scientifiques – Conception et Réalisation des Procédures » que nous proposont concernent l'utilisation des rongeurs (rats et souris) majoritairement utilisés dans les laboratoires de recherche. Notre agrément de formation concernera uniquement ces 2 espèces. Les animaux seront tous adultes pour faciliter l'apprentissage des gestes techniques.
Sélection de nouvelles constructions génétiques chez la souris pour la restauration visuelle par stimulation optique ou ultrasonore.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une injection de particules virales dans les deux yeux, quatre séances d'imagerie du fond d'œil et, pour une partie, un électrorétinogramme de trente minutes, chaque acte sous anesthésie générale : 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées après treize semaines au maximum pour prélever les yeux et le cerveau. L'injection peut provoquer une hémorragie oculaire, une cataracte ou une inflammation de la rétine, et toute atteinte oculaire sévère entraîne la mise à mort de l'animal. Il s'agit de comparer des protéines sensibles à la lumière et des protéines sensibles aux ultrasons, introduites par vecteur viral, pour sélectionner des constructions génétiques candidates à une restauration de la vision. La moitié des souris appartient à une lignée mutante dont les photorécepteurs ont entièrement disparu à cinq semaines, ce qui reproduit selon le porteur les conditions de cécité étudiées.
Objectifs
Notre projet vise à mettre au point de nouvelles méthodes pour restaurer la vision chez des personnes devenues aveugles. La perte de la vue représente un handicap majeur qui réduit fortement l’autonomie. Parmi les principales causes figurent la rétinite pigmentaire et le glaucome, deux maladies pour lesquelles il n’existe pas encore de traitement permettant de retrouver une vision utile. Nous étudions deux approches innovantes et complémentaires : l’optogénétique, qui repose sur l’utilisation de protéines sensibles à la lumière, et la sonogénétique, qui utilise des protéines sensibles aux ultrasons. L’idée est de rendre certaines cellules nerveuses de la rétine réactives à ces signaux afin de restaurer la transmission d’informations visuelles au cerveau, même lorsque les photorécepteurs ont disparu. Nos expériences sont menées sur deux types de souris : une lignée non génétiquement altérée et une lignée mutante présentant une dégénérescence complète de la rétine, qui reproduit les conditions observées dans certaines formes de cécité. Nous sélectionnons différentes protéines photosensibles ou mécanosensibles, que nous introduisons dans les cellules nerveuses à l’aide de vecteurs de thérapie génique sûrs dérivés de virus. Plusieurs combinaisons sont testées afin d’identifier celles qui offrent la meilleure efficacité et la meilleure sensibilité. Enfin, nous analysons la réponse des rétines ainsi traitées pour déterminer les conditions d’activation les plus adaptées, avec l’objectif final de transférer ces stratégies vers de futures applications cliniques.
Bénéfices attendus
La rétinite pigmentaire (RP) regroupe des dystrophies rétiniennes héréditaires caractérisées par une dégénérescence progressive des photorécepteurs. Elle débute le plus souvent par une perte du champ visuel périphérique (dite vision en tunnel), pouvant évoluer vers une atteinte centrale. Sa prévalence est estimée à 1/3 000–5 000, soit environ 1,5 million de patients dans le monde, dont 30 000 à 40 000 en France. Maladie rare et génétiquement très hétérogène, la RP ne bénéficie pas encore de traitement curatif. À l’inverse, le glaucome est une neuropathie optique fréquente, caractérisée par la perte progressive des cellules ganglionnaires rétiniennes et une atteinte du nerf optique, souvent liée à une élévation de la pression intraoculaire. Il évolue silencieusement, entraînant une perte du champ visuel périphérique puis central. Principale cause de cécité irréversible, il touche environ 80 millions de personnes dans le monde, dont 1 à 1,5 million en France, avec une forte proportion de patients non diagnostiqués. L’optogénétique et la sonogénétique représentent deux pistes prometteuses pour redonner la vue à des personnes atteintes de cécité liée à des maladies de la rétine. L’optogénétique utilise des protéines sensibles à la lumière, tandis que la sonogénétique fait appel à des protéines réactives aux ultrasons. Ces approches visent à rendre certaines cellules de la rétine capables de transmettre à nouveau un signal visuel au cerveau, même lorsque les photorécepteurs ont disparu. L’optogénétique est déjà bien avancée : les premières preuves expérimentales datent de 2006 et un premier essai clinique chez l’homme a eu lieu en 2021. Ce projet s’inscrit dans cette dynamique en cherchant à améliorer ces thérapies au niveau de l’œil, tout en explorant le potentiel complémentaire de la sonogénétique. L’approche sonogénétique, développée récemment présente de nombreux avantages sur la stratégie optogénétique, notamment grâce aux évolutions conjointes des sondes d’imagerie qui permettent de stimuler en imageant les structures stimulées. Dans ce projet, nous identifions des constructions génétiques candidates (vecteurs candidats) pour des tests précliniques qui pourraient en découler. La comparaison des résultats entre stimulation lumineuse pour l’optogénétique et par ultrason pour la sonogénétique sera également un atout majeur, apportant un bénéfice direct de joindre ces tests.
Procédures
Un premier lot d’animaux non génétiquement altérés sera soumis à une chirurgie consistant en une injection intraoculaire de particules virales, réalisée sous anesthésie générale et analgésie. L’intervention, d’une durée d’environ dix minutes, sera effectuée une seule fois par animal sur les deux yeux. Ces animaux feront également l’objet de séances d’imagerie oculaire permettant l’observation du fond d’œil. Ces examens, eux aussi réalisés sous anesthésie générale, dureront environ dix minutes pour les deux yeux et seront répétés quatre fois par animal. Un second lot d’animaux mutants suivra le même protocole chirurgical, avec une injection intraoculaire de particules virales sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée d’une dizaine de minutes, réalisée une fois pour les deux yeux. Ils bénéficieront également de quatre séances d’imagerie du fond d’œil, chacune d’environ dix minutes sous anesthésie générale. Enfin, ces animaux feront l’objet d’un enregistrement de l’activité électrique de la rétine par électrorétinogramme, toujours sous anesthésie générale et analgésie, pour une durée d’environ trente minutes, effectué une seule fois pour les deux yeux.
Impact sur les animaux
L’imagerie du fond de l’œil et l’enregistrement de l’activité rétinienne par electroretinogramme comportent un risque faible de défaillance cardio-respiratoire lié à l’anesthésie. L’injection intraoculaire présente également ce risque, auquel s’ajoute la possibilité de provoquer une petite hémorragie oculaire localisée lors de l’administration du vecteur candidat. Cette hémorragie se résorbe généralement dans les 24 heures. Dans les jours qui suivent l’injection, une cataracte ou une inflammation localisée du tissu rétinien peut apparaître, cette dernière disparaissant le plus souvent en moins de quinze jours. Ces complications demeurent cependant peu fréquentes, avec une incidence inférieure à cinq pour cent. Enfin, pour les souris ayant reçu une injection intraoculaire, toute atteinte oculaire sévère, telle qu’une inflammation marquée ou un gonflement, entraînera l’euthanasie de l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié en fin de période de maintien (13 semaines au maximum) par une méthode réglementaire. Des prélèvements et analyses ex-vivo des tissus (yeux et cerveau) sont nécessaires post mortem pour les animaux inclus dans ce projet.
Remplacement
Avant toute expérimentation in vivo, des mesures de remplacement ont été mises en œuvre afin de limiter le recours aux animaux. Les séquences des vecteurs candidats ont d’abord fait l’objet d’analyses in silico approfondies afin d’évaluer leur efficacité potentielle d’expression et leur spécificité. Seules les constructions les plus prometteuses identifiées par cette étape préliminaire ont été retenues pour un passage à l’expérimentation animale, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au strict nécessaire. Les expériences impliquant les animaux sauvage et mutant aboutissent à la collecte des rétines et du cerveau, une analyse détaillée ex vivo sera réalisée permettant d’obtenir une pré-validation des vecteurs candidats, en définissant leur efficacité fonctionnelle. Nous voulons également utiliser les tissus collectés pour la culture de coupe de cerveau ou de morceau de rétine, ce qui permettra de tester des vecteurs candidats de façon plus détaillée ou de tester d’autres constructions. Ces tests ex-vivo restent cependant limités notamment pour évaluer les capacités de traitement des vecteurs viraux. Les mécanismes physiologiques de diffusion des particules virales dans l’œil et la pénétrance de ces particules dans la rétine, ne peuvent être observés que sur un œil en fonctionnement. L’utilisation de l’animal est donc indispensable.
Réduction
Le nombre et le type de vecteurs viraux utilisés dans ce projet ont été rigoureusement optimisés en amont afin de limiter le recours aux animaux. Parmi l’ensemble des constructions génétiques théoriquement possibles, seules celles présentant un intérêt scientifique clairement établi et une pertinence démontrée ont été retenues. Cette sélection permet de réduire le nombre de conditions expérimentales testées tout en garantissant la validité des résultats obtenus. Ainsi, le protocole proposé repose sur un choix restreint mais justifié de vecteurs, évitant toute utilisation superflue et respectant les principes de réduction et de raffinement de l’expérimentation animale. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables et répondre aux objectifs scientifiques. Ce nombre a été calculé à partir d’études précédentes et confirmé par des méthodes statistiques permettant de s’assurer que les résultats auront une valeur scientifique solide. Concrètement, cela signifie que nous avons choisi la plus petite taille de groupe possible tout en garantissant que les conclusions soient robustes et interprétables. Au total, nous prévoyons d’utiliser 480 souris non génétiquement altérées et 480 souris présentant une mutation spécifique.
Raffinement
Les animaux venant de l’extérieur passeront une période d’adaptation d’au moins 5 jours. Ils seront logés dans des cages équipées de matériel d’enrichissement, avec nourriture et eau disponibles en permanence. La température et l’humidité de la salle seront maintenues stables. Nous utilisons de la litière de peuplier dépoussiérée afin de limiter les irritations possibles des yeux. Lors des séances d’imagerie, les animaux recevront une anesthésie par gaz. Pour les enregistrements d’électrorétinogramme, une anesthésie locale de la cornée sera ajoutée, et les animaux seront installés sur une table chauffante. La chirurgie d’injection dans l’œil sera réalisée dans des conditions stériles, avec les animaux placés sur un tapis chauffant. Ils recevront une anesthésie générale (par gaz) et locale (sur la cornée), ainsi qu’un traitement antidouleur à base d’opioïdes. Après la chirurgie, une surveillance quotidienne renforcée sera mise en place grâce à une signalisation spécifique. Des critères précis permettront de définir des points limites pour assurer le bien-être des animaux
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle expérimental car elle est largement utilisée pour l’étude du système visuel et validée pour explorer la perception sensorielle ainsi que le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce projet, deux modèles complémentaires seront employés : l’un avec une rétine intacte et fonctionnelle, l’autre présentant une dégénérescence complète des photorécepteurs, reproduisant ainsi la situation rencontrée chez l’humain dans certaines maladies rétiniennes responsables de cécité. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de cinq semaines, moment où les structures cérébrales et rétiniennes ont atteint leur maturité fonctionnelle. Chez les modèles dégénérés, ce stade correspond à la perte complète des photorécepteurs, ce qui garantit la pertinence de leur utilisation pour reproduire les conditions de cécité étudiées.
Implication de la voie de signalisation Hippo dans la radiorésistance de métastases cérébrales d’origine bronchique.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Pour comprendre pourquoi les métastases cérébrales d'origine bronchique résistent à la radiothérapie, 180 souris immunodéprimées de souche Nude vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever le cerveau et la tumeur. Des cellules tumorales humaines leur sont implantées dans le cerveau au cours d'une chirurgie de trente minutes, suivie de deux séances d'IRM par semaine sous anesthésie et, pour quatre-vingt-dix d'entre elles, de trois séances d'irradiation en trois jours. L'irradiation cérébrale entraîne une fatigue et une dégradation de l'état général jusqu'à une semaine après, avec porphyrine autour des yeux et de la bouche et pelades sur la tête. Perte de poids, de motricité et de sensibilité constituent les points limites, et le porteur indique avoir adapté la surveillance pour "anticiper et éviter l'exclusion des animaux par atteinte de points limites".
Objectifs
Ce projet a pour but de caractériser l’effet d’une inhibition de la voie Hippo sur l’irradiation des tumeurs cérébrales d’origine bronchique, décrites dans la littérature comme résistantes à la radiothérapie (RT) actuelle. En effet une inhibition de cette voie de signalisation permettrait d’élucider son implication dans l’inefficacité des traitements actuels tels que la RT. Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer les connaissances des phénomènes de radiorésistance de ces tumeurs et l’implication de la voie de signalisation. L’étude de tumeurs humaines implantées dans des souris immunodéprimées permettront un modèle plus similaire aux cas cliniques. Cibler la voie Hippo en parallèle de la RT pourrait améliorer la prise en charge des patients et leur taux de survie.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques d’irradiation des métastases cérébrales d’origine bronchiques actuelles en ciblant la voie de signalisation hippo.
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, tous les animaux sont concernés. -Imagerie (IRM pour suivi de la taille tumoral, sous anesthésie générale) : 2 séances par semaine à partir d’une semaine post chirurgie : 3 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances sur 3 jours consécutifs : 12 minutes maximum par animal, 90 animaux sont concernés. - Injection sous-cutanée d'analgésique (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de tumeur. Toutefois, ces critères représentent les points limites de l’étude et ainsi si l’un de ces éléments apparait, les animaux concernés seront mis à mort. Nous nous attendons également à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation. Nous avons adapté en conséquence le suivi des animaux, le raffinement des conditions expérimentales et le scoring afin d’anticiper et d’éviter l’exclusion des animaux par atteinte de points limites. A chaque sortie des animaux de la zone protégée, lors des séquences d’imagerie par IRM, un risque d’infection ou de contamination par les autres animaux n’ayant pas un phénotype dommageable existe.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de prélever le cerveau et la tumeur pour analyses post-mortem (totale de 180 animaux).
Remplacement
Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses à la RT. Ce projet intervient après plusieurs études in vitro ayant permis de montrer les effets de l’irradiation sur la voie de signalisation Hippo mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive (IRM) se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est, dans ce cas, son propre contrôle et permet de réduire drastiquement le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 15 animaux par groupe sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants et ainsi comparer les effets des différentes expressions de la voie Hippo, en fonction du temps. Ces 15 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux basés sur nos travaux antérieurs. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculés est un nombre maximal. Grâce notamment aux études en imageries qui sont quantitatives, nous réaliserons des analyses séquentielles. Ainsi, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux immunodéprimés seront placés en groupe sociaux dans des cages ventilées individuellement par des portoirs spécifiques (portoirs Innovive) répondant aux normes européennes, ces derniers étant eux-mêmes dans une zone spécifique et dédiés à la manipulation des animaux immunodéprimés pour la recherche en cancérologie. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation (minimum 7j) et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, tunnel en carton, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Toutefois, dans tous les protocoles d’imagerie, d’irradiation, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, ce qui entraine une hypothermie et une déshydratation des membranes qui sont contrés par l’application de vitamine A sur les membranes et l’utilisation de couvertures chauffantes thermorégulées .
Choix des espèces
Les souris immunodéprimées sont l’espèce de choix pour évaluer l’évolution du volume tumoral dans le temps dès lors que les cellules tumorales utilisées sont d’origine humaine. Les souris immunodéprimées retenues pour réaliser ce travail sont la souche Nude. Cela permet l’implantation de xénogreffes humaines sans prendre le risque du rejet. Cependant, le système immunitaire est encore capable de produire des cellules permettant de se rapprocher d’un micro-environnement plus représentatif de la situation clinique. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.
Test de stratégies expérimentales permettant de prévenir les troubles moteurs et cognitifs dans un modèle murin de paraplégie spastique héréditaire MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Les souris porteuses de deux copies du gène muté développent des difficultés locomotrices, une prostration et une perte de poids à partir de seize mois, un phénotype que le porteur réserve aux lots expérimentaux. 3 086 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la quasi-totalité et modéré pour quarante d'entre elles. Le génotypage passe par le prélèvement de l'extrémité de la queue, puis viennent un traitement de sept mois incorporé aux croquettes ou un gavage unique de la mère gestante. Suivent trois séries de deux tests comportementaux, un test de mémoire répété cinq jours et un test de coordination motrice répété trois jours, et pour un groupe jusqu'à quatorze prélèvements de sang sous anesthésie toutes les deux semaines. Les couples reproducteurs sont tués dès que leur reproduction baisse, les autres à la fin de chaque procédure pour récupérer des tissus ou prélever des embryons.
Objectifs
Les paraplégies spastiques héréditaires sont des maladies neurodégénératives d’origine génétique caractérisées par une mort neuronale, mais aussi parfois des troubles de développement du cerveau. Ces maladies sont très hétérogènes et sont causées par des mutations dans environ 80 gènes différents. Elles touchent environ 3 personnes sur 100.000 en Europe, avec un début généralement à l’âge adulte mais qui peut apparaitre dans l’enfance. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour la prise en charge de ces pathologies. Nous travaillons sur une des formes les plus fréquentes de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles de développement du système nerveux. Nous utiliserons un modèle animal (souris) pour cette forme de paraplégie spastique héréditaire. Nous avons déjà montré que ce modèle présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau et il récapitule les principaux signes observés chez les patients. L’objectif du projet est de mieux caractériser les différentes étapes d’évolution de la maladie, de son développement à la mort neuronale, et d’évaluer dans un modèle animal des stratégies thérapeutiques qui pourraient permettre de prévenir l’apparition des symptômes et la mort neuronale. MODIFICATION : l’allongement du temps de maintien des animaux de 8 à 12 mois implique l’ajout de tests comportementaux et d’un prélèvement sanguin ce qui nécessite une modification du projet initial sans ajout d'animaux.
Bénéfices attendus
Nous travaillons sur une des formes les plus fréquente de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles du neurodéveloppement et actuellement aucun traitement ne peut être proposé aux patients. Un premier aspect du projet permettra de tester l’efficacité de deux médicaments sur la mort neuronale dans le modèle animal de la maladie. Si nous pouvons démontrer qu’au moins un de ces deux médicaments retarde la mort neuronale, notre projet pourrait permettre d’avancer vers une stratégie thérapeutique pour les patients atteints de cette paraplégie spastique héréditaire. Par ailleurs, nous savons que la maladie que nous étudions est associée à de légers défauts de développement du cerveau, mais nous ne savons pas si, et dans quelle mesure, ces défauts participent à l’apparition des symptômes de la maladie. Notre projet pourrait permettre de répondre à cette question. Comme le diagnostic des patients a généralement lieu à l’adolescence, après la phase de développement, la compréhension du rôle du développement permettra de mieux expliquer la maladie aux patients et d’améliorer leur prise en charge.
Procédures
La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un petit prélèvement de l’extrémité terminale de la queue sera effectué sur les jeunes animaux. Cet acte sera réalisé rapidement (moins d’une minute par animal) et une seule fois sur chaque animal. Nous réaliserons des traitements pour évaluer leur impact sur l’évolution de la maladie. Une approche sera un traitement chronique pendant 7 mois qui sera administré par incorporation dans les croquettes pour éviter des gestes invasifs. Une autre approche sera une administration unique par gavage de la mère gestante à un moment précis du développement embryonnaire (une fois, inférieur à une minute). Une partie des animaux sera soumise à trois séries de 2 tests comportementaux sur des animaux vigiles (à l’âge de 6 semaines, 4 mois et 8 mois, ou 4 mois, 8 mois et 12 mois). Le premier test est répété pendant 5 jours et vise à étudier les troubles de la mémoire (3minutes maximum par session, 2 fois 5 jours) ; le second test est répété pendant 3 jours et vise à tester la coordination motrice (5 minutes maximum par session, 5 fois 3 jours). A l’issue de chaque série de tests comportementaux, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie générale (3 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement). Un groupe d’animaux sera soumis à des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie générale toutes les 2 semaines (14 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement) L’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire en fin de procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour le génotypage peut générer une légère douleur chez l’animal et un risque rare de saignement. Pour l’étude de l’effet thérapeutique de médicaments, des effets secondaires (diarrhées, perte de poids) pourraient être associés au traitement. Pour l’étude sur la contribution du développement à la maladie, nous administrerons un médicament par gavage, ce qui peut générer une gêne et un inconfort et des effets indésirables liés à la molécule administrée. Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. Les prélèvements de sang peuvent générer un stress, une douleur et un inconfort lié à la piqûre, et leur répétition peut engendrer une déshydratation. Il existe un risque d’hématome après le prélèvement. L’anesthésie générale mise en place pour les prélèvements sanguins sera associée à une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque rare de dépression cardiorespiratoire. La mutation génétique portée par les souris porteuses de 2 copies du gène muté peut générer des souffrances après de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.
Devenir
Les couples ayant permis les générations des animaux seront euthanasiés lorsqu'une diminution significative de la reproduction est observée. A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem ou prélever des embryons.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons dans la mesure du possible des modèles in vitro qui évitent l’utilisation d’animaux. En effet, nous utilisons des modèles in vitro qui miment le développement du cerveau et qui permettent de répondre à certaines questions sur la contribution de ce développement sur la maladie que nous étudions. Cependant ce modèle in vitro ne permet pas de répondre à toutes les questions car : (i) le comportement des neurones diffère selon leur environnement in vitro et in vivo ; et (ii) la mise en place de l'organisation du cerveau ne peut pas être reproduite in vitro. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de mener des expériences comportementales. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable pour notre projet, mais nous utiliserons le modèle in vitro dès que possible afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans le cadre de la maladie que nous étudions, il existe un modèle de souris permettant d’évaluer les différents aspects que nous souhaitons étudier dans ce projet et ainsi obtenir des données transposables chez l’homme. L’étude de l’effet thérapeutique de médicaments sur les symptômes de la maladie ne peut se faire que sur un modèle animal et ne peut pas être remplacé par un modèle in vitro. De même, l’étude de l’influence d’un développement anormal sur l’organisation du cerveau adulte et ses conséquences comportementales ne peut se faire qu’avec des modèles animaux. Il n’existe pas de méthodes expérimentales n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettent d'étudier le développement du cerveau et ses effets sur des troubles moteurs et cognitifs. Ces éléments rendent l’utilisation de l’animal indispensable pour notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte la lignée de souris génétiquement modifiée nécessaire à l'étude et en réduisant au plus le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables et valides. Nous affinerons les analyses statistiques en fonction de données à analyser. De plus, afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. En nous basant sur nos études précédentes, nous estimons qu’il nous faudra de 8 à 20 animaux par groupe en fonction des analyses à réaliser. Ainsi, au total, nous estimons qu’il faudra 3086 animaux pour obtenir des résultats significatifs dans ce projet. Toutefois, si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux, tous ne seront pas utilisés, ni produits. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires pour nos lots expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce et seront observés quotidiennement. Les animaux que nous utilisons sont génétiquement modifiés. Comme seules les souris porteuses de 2 copies du gène muté présentent un phénotype dommageable, nous privilégierons un schéma de croisement permettant de limiter le risque d’expression du phénotype dommageable seulement aux animaux nécessaires pour les lots expérimentaux. Le maintien de la lignée privilégiera les animaux avec une seule copie du gène muté. Les animaux porteurs de 2 copies du gène muté seront particulièrement surveillés pour détecter tout signe précoce d’expression du phénotype dommageable, notamment des difficultés locomotrices et une prostration qui sont 2 signes caractéristiques liés à la mutation. La biopsie pour génotypage sera la plus petite possible et réalisée sur un animal jeune (cicatrisation rapide). Il s’agit d’un geste rapide, réalisé au calme et parfaitement maitrisé. Pour le maintien de notre lignée, afin d’éviter toute dérive génétique, toutes les 10 générations, nous croiserons notre lignée de souris avec des souris sauvages provenant d’un élevage extérieur. Les souris qui recevront des traitements à visée thérapeutique seront traitées à des doses déjà utilisées dans des publications et n’entrainant pas d’effets délétères. Ces souris seront néanmoins surveillées dans les jours qui suivent l’intervention pour vérifier qu’elles continuent à s’alimenter. De plus, les traitements chroniques seront administrés par incorporation à la nourriture afin de diminuer la manipulation des animaux. Pour réduire le stress en lien avec les prélèvements de sang ils seront réalisés sous anesthésie générale. Pour les animaux soumis à des prélèvements répétés, après chaque prélèvement une injection de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir toute déshydratation. Des points limites spécifiques à chaque procédure sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Un protocole d’analgésie sera utilisé lors de l’euthanasie des souris afin qu’elle se fasse sans douleur et sur un animal pré-sédaté.
Choix des espèces
Dans le projet, nous utiliserons un modèle de souris déjà caractérisé et qui récapitule les principaux symptômes observés chez les patients atteints de la forme de maladie que nous étudions. L’étude de ce modèle nous permettra donc d’obtenir des données transposables chez l’homme. Le modèle de souris utilisé présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau. Ce modèle est donc parfaitement adapté pour répondre à notre question scientifique, et il est impossible de répondre à cette question sans l’utilisation d’un modèle animal. Afin d’étudier les différentes composantes de la maladie et l’impact d’un traitement à différents âges sur son évolution, nous étudierons des animaux à partir du stade embryonnaire jusqu’à l’âge de 12 mois. La mutation génétique des animaux sera vérifiée à l’âge de 7 à 10 jours.