Souris

Huit prélèvements sanguins, neuf séances d'imagerie et vingt-cinq injections par animal : 180 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour les analyses post-mortem. La douleur attendue vient de la croissance des tumeurs et de la manipulation hebdomadaire. Le projet doit confirmer chez l'animal un résultat déjà obtenu en culture, un agent pharmacologique qui renforce l'activité antitumorale des lymphocytes T. Le porteur situe le bénéfice dans l'élaboration de futures procédures d'immunothérapie, un horizon indéterminé face aux tumeurs et aux injections répétées inscrites dès maintenant au protocole de chaque souris.

Objectifs

Ces dix dernières annéees, les immunothérapies ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant nos défenses immunitaires à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards de chimiothérapie et radiothérapie. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus in vitro montrent une potentialisation des outils cellulaires à la base des immunothérapies dans le contexte du cancer.

Procédures

Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : - 8 prélévements sanguins sous anesthésie générale, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 9 séances d'imagerie, sous anesthésie générale, la durée de ce geste est évaluée à 3 minutes 25 injections sous anesthésie locale, la durée de ce geste est évaluée à moins de 1 minute.

Impact sur les animaux

Des nuisances potentielles pourraient résulter du stress généré lors des injections et plus globalement par la manipulation hebdomadaire des animaux, mais également de la douleur résultant de la croissance tumorale. Cette douleur sera modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements et les analyses post-mortem nécessaires à l'étude

Remplacement

Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une potentialisation des fonctions antitumorales après traitement par un inhibiteur pharmacologique nouvellement identifié. Le recours aux modèles animaux est indispensable pour valider le gain résultant de l'utilisation de cet inhibiteur sur des approches d'immunothérapies au sein d’un organisme vivant entier.

Réduction

Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par palpation des tumeurs et par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d'étude sont faits le plus souvent en même temps, afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base de nos travaux antérieurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les interventions seront précédées d'une anesthésie locale pour les injections et générale pour les prélèvements, afin de prévenir la douleur. Nous utiliserons l'imagerie pour un suivi de la charge tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basées sur cette approche pour les études ultérieures. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix et de référence pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Les modèles murins permettent en effet d'apprehender la complexité de la réponse tumorale. Ces modèles permettent notamment d'apprehender la possibilité de rencontre des cellules de l'immunité et des cellules tumorales au sein de l'organisme. Ces modèles permettent également de prendre en compte la survie des cellules immunes et le maintien de leur activité antitumoral au sein du microenvironement tumorale, qui le plus souvent met en place des mécanismes pour inhiber la réponse immune. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).

Pour vérifier si un déséquilibre du microbiote intestinal accélère l'apparition de tumeurs cutanées, 32 souris porteuses d'une neurofibromatose de type 1 vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la peau de leur dos. Elles boivent des antibiotiques pendant huit semaines au maximum et passent deux fois sous anesthésie pour un rasage, une épilation et des photographies du dos. Certaines sont isolées, un stress social que le porteur dit compenser par des abris et des matériaux de nidification. Il présente ce protocole comme un modèle "plus éthique" et moins invasif que les lésions cutanées jusqu'ici pratiquées, alors que l'objectif déclaré est d'évaluer l'efficacité des antibiotiques à accélérer la croissance des tumeurs.

Objectifs

La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie génétique qui touche environ un million de personnes dans le monde. Les signes de cette maladie peuvent varier considérablement d’un individu à l’autre, même au sein d’une même famille. L’une de ses caractéristiques les plus visibles est l’apparition de petites tumeurs bénignes sur la peau, appelées neurofibromes cutanés (NFc), dont le nombre et la sévérité sont très hétérogènes. En plus de l’impact esthétique, ces tumeurs peuvent provoquer des démangeaisons, des douleurs et altérer fortement la qualité de vie. Cette grande variabilité suggère que, outre les causes génétiques, d’autres facteurs, notamment environnementaux, pourraient influencer l’apparition et la gravité des symptômes. Le microbiote intestinal désigne l’ensemble des micro-organismes (bactéries, virus, champignons, etc.) qui colonisent le tube digestif. Il joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions physiologiques, telles que la digestion, l’immunité et l’équilibre métabolique. Un déséquilibre de cette communauté microbienne, appelé dysbiose, est fréquemment associé à des pathologies inflammatoires ou tumorales. Des résultats préliminaires obtenus à partir d’un modèle murin reproduisant la NF1 humaine montrent que l’administration d’antibiotiques, connue pour induire une dysbiose, est associée à un développement des NFc. Le lien de causalité entre cette altération du microbiote et les effets observés reste toutefois à établir. Le projet proposé vise précisément à mieux comprendre ce lien et à identifier les mécanismes sous-jacents.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider et approfondir une observation préliminaire concernant l’effet d’un traitement antibiotique sur l’apparition et la progression des NFc. Il a pour objectif de mieux comprendre les liens entre le microbiote intestinal, l’inflammation et la tumorigenèse dans la NF1, ainsi que d’évaluer si ces effets peuvent être modulés par des interventions complémentaires. Les bénéfices attendus incluent des avancées scientifiques significatives sur le rôle des facteurs environnementaux dans la pathogénie de la NF1. Par ailleurs, grâce à un plan expérimental repensé, ce projet vise également à valider un nouveau modèle d’étude de la NF1 plus éthique, en proposant des protocoles moins invasifs ou stressants pour les animaux et cliniquement pertinent, reflétant davantage la diversité des patients.

Procédures

Les antibiotiques à tester seront administrés aux souris dans leur eau de boisson, pendant une période maximale de 8 semaines. Cette méthode est simple et ne cause aucune douleur ni gêne aux animaux, car elle ne nécessite pas d’anesthésie ni de manipulation particulière. Pour observer l’évolution des NFc, des photographies du dos des souris seront prises après un rasage et une épilation localisés. Ces interventions se dérouleront sous anesthésie générale (moins de 5 minutes par animal), afin d’éviter tout stress ou douleur. Deux séances seront réalisées, espacées de plusieurs semaines, dans des conditions standardisées garantissant la reproductibilité des observations et le respect du bien-être animal.

Impact sur les animaux

Les NFc qui apparaissent dans ce modèle murin sont petits, plats et non douloureux. Des études récentes montrent que, chez les personnes atteintes de NF1, ces tumeurs sont souvent moins sensibles aux sensations de chaleur ou de pression que les zones de peau normales. Dans les observations précédentes, les animaux porteurs de la mutation ne présentent aucun signe de souffrance ni de détérioration de l’état de santé avant l’âge d’un an. Le traitement antibiotique utilisé dans cette étude peut toutefois entraîner des effets secondaires, comme des troubles digestifs ou des modifications du comportement. C’est pourquoi les animaux seront surveillés de près tout au long de l’expérience, afin d’identifier rapidement tout signe de gêne ou d’inconfort. Certaines manipulations, telles que le maintien doux pendant quelques minutes ou l’anesthésie courte pour les prises d’image, peuvent entraîner un stress modéré, maîtrisé grâce à un entraînement préalable à la manipulation. L’épilation occasionnelle peut provoquer une irritation cutanée temporaire, systématiquement contrôlée. Dans les cas où des souris doivent être isolées, des mesures spécifiques seront mises en place pour limiter l’impact du stress social, notamment par l’enrichissement du milieu (abris, matériaux de nidification). L’ensemble des procédures a été conçu pour minimiser les effets indésirables potentiels, dans le respect strict des standards de bien-être animal.

Devenir

Pour l’ensemble des procédures décrites dans le projet, tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements, afin d’évaluer l’efficacité des antibiotiques à accélérer la croissance des tumeurs cutanées. Pour cela la peau du dos de chaque souris sera prélevée en vue de faire une analyse cellulaire et moléculaire et seront comparées au groupe contrôle qui n’a pas reçu les molécules.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle alternatif in vitro ou in silico ne permet de reproduire fidèlement la formation des NFc observés chez les patients atteints de NF1. Le modèle murin utilisé ici reste actuellement le seul outil disponible pour l’étude de cette forme tumorale et pour l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Réduction

L’inclusion des femelles dans cette étude, et probablement dans les futures — rendue possible par l’induction des symptômes via l’antibiothérapie — permet d’optimiser l’utilisation des portées issues des croisements, tout en réduisant la nécessité de générer de nouveaux animaux. Le nombre total de souris par groupe a été défini à partir de la fréquence attendue des lésions, de leur sévérité et du nombre d’observations nécessaires pour obtenir des données statistiquement robustes. Les protocoles, le suivi et les méthodes d’analyse ont été standardisés à partir d’expériences antérieures, permettant une réduction notable du nombre d’animaux requis.

Raffinement

Toutes les procédures ont été conçues pour minimiser la douleur, le stress et l’inconfort. L’administration des antibiotiques se fait par l’eau de boisson, sans manipulation directe. Les anesthésies nécessaires (épilations et photographies) sont brèves, réalisées avec précautions (utilisation d’un tapis chauffant et d’un gel ophtalmique). Des soins post-interventionnels comme l’application de vaseline limitent les irritations cutanées. L’isolement temporaire de certains animaux sera compensé par un enrichissement environnemental renforcé. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel technique, y compris les week-ends, avec l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être incluant des points limites. En cas de signe de détresse persistant plus de 24 h, l’animal sera retiré du protocole et mis à mort selon les standards réglementaires. Enfin, ce projet permet de valider un modèle reposant sur la dysbiose intestinale comme facteur déclenchant, sans recours aux lésions cutanées jusqu’ici nécessaires. Cette avancée ouvre la voie à des pratiques plus respectueuses du bien-être animal dans les futures études sur la NF1.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est une lignée murine génétiquement modifiée reproduisant fidèlement les manifestations cutanées de la NF1, notamment l’apparition progressive des NFc. Ce modèle constitue à ce jour l’outil le plus adapté pour l’étude des mécanismes pathologiques de la NF1 et pour le criblage préclinique de nouvelles approches thérapeutiques. Les animaux utilisés seront des souris mâles et femelles âgées de 45 jours au début du protocole. Ce stade de développement correspond à la période initiale de formation des NFc dans ce modèle, garantissant la pertinence des observations et l’efficacité du suivi longitudinal.

174 souris saines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, réparties en sous-groupes de quatre parce que chaque point de mesure exige un très large volume de sang, obtenu en tuant les animaux. Elles reçoivent neuf administrations du composé testé, avec un risque de fausse route, de perforation de l'œsophage, de saignement et de reflux gastro-œsophagien. Le projet est mené pour une société cliente qui développe un traitement de la dystrophie de Duchenne, maladie pour laquelle il n'existe aujourd'hui aucun traitement. La perspective d'un premier médicament passe par un dossier d'autorisation d'essai clinique encore à monter, alors que l'étude mesure ici la distribution du composé chez des souris qui ne sont pas malades.

Objectifs

Le présent projet sera mené pour une société cliente qui développe un composé visant à améliorer les symptômes de la maladie de Duchenne, une pathologie humaine rare d'origine génétique touchant à 99% des hommes et pour laquelle il n'existe actuellement aucun traitement. En outre, plus de 50% des patients atteints présentent une obésité, qui résulte de la réduction d'activité physique induite par la maladie ainsi que d'une résistance musculaire à l'action de l'insuline. L'objectif du projet est de réaliser une étude pharmacocinétique chez la souris saine et de coupler cette dernière à une étude de l'impact du composé testé sur un ensemble de biomarqueurs plasmatiques et tissulaires. Compte tenu du mode d'action connu du composé testé et de la résistance musculaire à l'insuline associée à la pathologie, cette étude sera réalisée dans deux contextes métaboliques différents : à l'état basal et après administration de glucose.

Bénéfices attendus

Le projet permettra : - 1) de mieux caractériser les paramètres pharmacocinétiques plasmatiques et tissulaires du composé testé, une étape incontournable dans tout développement préclinique de médicaments. - 2) d'étudier l'impact du composé testé sur une batterie de marqueurs tissulaires et plasmatiques afin de mieux décrire son mode d'action Si elles s'avèrent positives, ces données seront alors exploitées afin de monter un dossier de demande d'autorisation d'essai clinique chez le patient humain et pourraient aboutir à la mise sur le marché d'un premier traitement pour la maladie de Duchenne.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (4 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de traitements (9 administrations; durée : 1 minute)

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations et les administrations des traitements pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations de traitements occasionneront également une douleur aux animaux. Elles pourraient être également l'objet, dans de très rares cas, de fausse route chez l'animal, de perforations de l'oesophage et de saignements, ainsi qu'à des reflux gastro-oesophagiens.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer un large volume de sang nécessaires aux dosages ainsi que certains organes afin d'y étudier la distribution du composé testé.

Remplacement

Le présent projet vise à déterminer les paramètres pharmacocinétiques ainsi que l'impact sur différentes voies métaboliques du composé testé. Le recours à l’animal entier reste une étape nécessaire et obligatoire d'un point de vue règlementaire pour une demande de premier essai clinique chez l'humain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure d'obtenir des données significatives sur les paramètres pharmacocinétiques étudiés. Le nombre d'animaux par groupe a été choisis selon les recommandations d'un ouvrage de référence. Le nombre de 28 animaux par groupe a été choisi en tenant compte de la nécessité de créer 7 sous-groupes de 4 animaux par groupe expérimental (hormis le groupe contrôle qui comprend 34 animaux du fait d'un sous-groupe supplémentaire de 6 animaux). Ces sous-groupes sont nécessaires car la finalité du projet nécessite un très large volume sanguin pour chaque point de prélèvement sanguin afin de déterminer les paramètres pharmacocinétiques plasmatiques et les dosages des voies métaboliques étudiées dans le projet, ainsi qu'un prélèvement d'organes afin d'étudier la distribution tissulaire du composé testé.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (3/4 souris par cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur.

Choix des espèces

La souris est classiquement utilisée pour les études de pharmacocinétique. En effet, il s'agit d'un modèle pratique, génétiquement modulable et scientifiquement validé pour explorer les caractéristiques pharmacocinétiques d’un candidat médicament. En outre, malgré des différences interespèces, les souris partagent beaucoup de voies métaboliques avec l’humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte (10 semaines à réception). Ce stade de développement a été choisit car le traitement en développement qui est évalué dans le présent projet est destiné à une administration chez le jeune adulte.

Vingt minutes de scanner et d'irradiation localisée sous contention et anesthésie, une injection de moins de dix secondes : 420 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélever leurs glandes. Le porteur qualifie l'irradiation d'indolore tout en signalant que les animaux peuvent développer de légères inflammations, et écrit qu'aucune nuisance n'a été décrite sur une période aussi courte tout en ayant établi une grille de score pour celles observées à plus long terme. L'objet du projet est fondamental, comprendre comment des cellules glandulaires retrouvent temporairement la capacité de se diversifier après une blessure. Plusieurs organes sont prélevés sur chaque animal, glande salivaire, lacrymale et prostate chez les mâles, glande lacrymale, salivaire et mammaire chez les femelles, la souris étant retenue parce que les vertébrés non mammifères n'ont pas de structures glandulaires comparables.

Objectifs

Certaines cellules adultes peuvent, dans des contextes particuliers, retrouver des caractéristiques qu’elles n’avaient plus depuis le stade embryonnaire. C’est ce qu’on observe notamment dans le développement de certains cancers. L’une de ces caractéristiques est la multipotence, c’est-à-dire la capacité d’une cellule à se transformer en plusieurs types de cellules différents. Nous nous intéressons à quatre types de tissus glandulaires : les glandes mammaires, salivaires, lacrymales et prostatiques. Chez l’adulte, ces tissus sont composés de cellules spécialisées qui ne produisent qu’un seul type cellulaire. Mais lors de la réparation d’un tissu endommagé, certaines cellules retrouvent temporairement cette capacité à se diversifier. Or, dans les cancers de ces tissus, les cellules tumorales semblent réactiver ce programme de manière incontrôlée. Notre objectif est de mieux comprendre comment ces tissus se régénèrent après une blessure. En étudiant les mécanismes qui contrôlent le passage d’un état cellulaire flexible (multipotent) à un état plus stable et spécialisé, nous espérons identifier ce qui, lorsqu’il est déréglé, peut favoriser l’apparition ou la progression de tumeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’étudier le comportement des cellules souches et leur état de différentiation pendant la régénération tissulaire dans les glandes mammaires, salivaires, lacrymales et prostatiques chez la souris. Nos résultats aideront à identifier les mécanismes régulant le destin des cellules souches. Ces mécanismes étant déstabilisés lors de la formation de tumeurs, nous pensons qu’à long terme nos recherches contribueront à une meilleure compréhension du processus tumoral dans les tissus glandulaires étudiés.

Procédures

Une injection unique sera réalisée sur animaux vigiles (durée du geste inférieure à 10 secondes). Les animaux seront traités par un scanner et une irradiation localisée indolores, sous contention et anesthésie (durée totale traitement d’environ 20 min) et injecté par une injection unique (durée du geste inférieure à 10 secondes)

Impact sur les animaux

Pour l’étude de la régénération chez les souris adultes, une irradiation est réalisée. A la suite de cette irradiation les animaux peuvent développer des légères inflammations (gêne de courte durée). Aucune des mutations induites sur une si courte période n’a de phénotype dommageable

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Au fil des années, beaucoup d'efforts ont été déployés pour développer des modèles 3D in vitro, comme les organoïdes, qui soient physiologiquement pertinents pour analyser le comportement dynamique des cellules souches au cours du développement et de la régénération tissulaire. Cependant, les cellules épithéliales modifient leur comportement lorsqu’elles sont cultivées in vitro sous forme d'organoïdes et détachées de leur niche tissulaire physiologique, ce qui nous empêche d'utiliser cette technique pour toutes les questions concernant le potentiel de différenciation des cellules souches glandulaires. De plus, les animaux seront essentiels pour suivre les cellules souches lors de la régénération tissulaire, étant donné qu’il n’existe actuellement aucun modèle in vitro qui puisse récapituler le processus global de régénération. L’absence de structure similaire aux glandes étudiées dans des modèles de vertébrés non mammifères rend l’utilisation de la souris nécessaire à notre étude.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience sera réduit au minimum possible. Pour réduire au minimum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements, des informations seront obtenues au niveau des organes, cellules et molécules à partir du même animal. Des schémas de reproduction des souris transgéniques seront réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris avec le génotype souhaité. Pour chaque souris plusieurs organes seront collectés (chez les mâles : glande salivaire, lacrymale et prostate; chez les femelles : glande lacrymale, salivaire et mammaire). Le nombre d'animaux de notre étude est initialement fondé sur les données de la littérature.

Raffinement

Pour les procédures d’irradiation, un délai d’une semaine sera respecté entre la réception des souris par la plateforme d’irradiation et la mise en œuvre de la procédure. Ce délai d’acclimatation doit permettre aux souris de s’habituer à leur nouvel environnement et de limiter leur stress avant toute procédure. Les protocoles d’irradiations nécessitant une contention contraignante seront intégralement réalisés sous anesthésie générale gazeuse. Les animaux seront analysés entre 1 et 7 jours après irradiation. Aucune nuisance liée à l’irradiation n’a été décrite dans une si courte période. Nous avons tout de même établi une grille de score comportant les nuisances les plus souvent observées à plus long terme après ce type d’irradiation. Les souris seront suivies quotidiennement pour détecter des signes de mal-être

Choix des espèces

L'organisation générale, le développement et le fonctionnement glandes étudiées ici sont très similaires chez la souris et chez l’Homme. Le modèle souris est donc très utilisé dans la communauté scientifique afin d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement normal du tissu ainsi que de la régénération. De la même manière, les évènements cancéreux survenant chez l’homme et chez la souris suivent les mêmes étapes dans les différentes glandes étudiées ; perte d’identité cellulaire, activation de traits embryonnaires, prolifération non contrôlée Les animaux utilisés pour l’étude de la régénération tissulaire seront âgés de 10 à 12 semaines. Les glandes de ces animaux sont alors constituées de progéniteurs unipotents qui réactivent la multipotence suite à l’irradiation

Toutes tuées pour que leur aorte soit prélevée, 558 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Leur système immunitaire est d'abord détruit par irradiation aux rayons X, puis remplacé par une greffe de moelle osseuse injectée en intraveineuse, avec un risque d'anémie et de sensibilité aux infections si la reconstitution échoue. Elles sont ensuite nourries au régime riche en graisses et saignées à la veine sous-mandibulaire sans anesthésie, quatre semaines après la greffe. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" de passer par la souris et annonce de nouvelles stratégies contre des maladies cardiovasculaires qui tuent 17 millions de personnes par an, quand le projet mesure l'usage du glucose par des sous-populations de monocytes.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires entraînent la mort de plus de 17 millions de patients par an dans le monde. La prévalence de ces pathologies accroit de manière progressive et représente un problème majeur de santé publique. L'athérosclérose est la principale cause du développement de maladies cardiovasculaires, et peut notamment provoquer des infarctus du myocarde ainsi que des accidents vasculaires cérébraux. L'athérosclérose se caractérise par la dégradation de la paroi des vaisseaux sanguins, au sein de laquelle une accumulation de graisses et de globules blancs appelés monocytes forme ce que l'on appelle une plaque d'athérome. Lors d'un développement avancé des plaques d'athérome, celles-ci peuvent totalement obstruer le vaisseau sanguin et bloquer la circulation. Elles peuvent également se rompre et déverser dans la circulation sanguine de petits fragments de plaque pouvant obstruer des vaisseaux sanguins plus étroits, par exemple au niveau du cerveau. Des études récentes ont permis de mettre en évidence un rôle central du métabolisme, et notamment du glucose, au cours du développement de la plaque d’athérome. Ce projet vise à comprendre comment les différents types de monocytes et leur utilisation du glucose affectent la progression de la maladie.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement visant à diminuer la mortalité induite par les maladies cardio-vasculaires. Les résultats issus de ce projet permettraient de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les voies immuno-métaboliques identifiées dans les sous-populations de monocytes du sang afin de réduire la morbidité et mortalité due aux maladies cardio-vasculaires.

Procédures

Les souris seront irradiées et ensuite elles seront injectées par voie intraveineuse avec de la moelle ossesuse. L’irradiation des souris consiste en l’exposition à une dose de rayon X induisant une ablation totale du système immunitaire de la souris hôte afin de pouvoir le remplacer par le système immunitaire d’une souris donneuse de même sexe et de même fond génétique. Une prise de sang sera effectuée sur les souris vigiles dans la veine sous-mandibulaire 4 semaines après l'injection. Les animaux injectés seront nourris avec un régime riche en graisse et suivis au cours du temps.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont celles liées (i) à l’irradiation des souris receveuses (ii) à l’injection par voie intraveineuse de la moelle osseuse. Ils subiront également une prise de sang (au niveau de la veine sous-mandibulaire) entrainant également une douleur et un stress dû à la contention. L'irradation induit une déplétion du système immunitaire de la souris receveuse ce qui pourrait induire des complication comme une anémie ou une susceptibilité aux infections si le système n'est pas reconstitué. L'injection par voie intraveineuse peut engendrer un stress pour la souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélever les aortes dans le but d’analyser la diversité des cellules immines dans les plaques d'athérome.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, des études sont réalisées sur des lignées de cellules différenciées en macrophages. Cependant, pour comprendre la diversité et les fonctions des sous-populations des monocytes dans le développement de l’athérosclèrose, il est indispensable de réaliser des études chez les souris car les études sur des lignées cellulaires ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et entre les différents types cellulaires présents dans la plaque d’athérome.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous utiliserons une approche statistique nous permettant de prévoir le nombre d’animaux nécessaires pour répondre clairement à notre question scientifique, sans utiliser plus de souris que nécessaires. De plus, nous utiliserons aussi bien les souris mâles que les souris femelles.

Raffinement

La mise en place de points limites régissant le déroulement précis des procédures permet l’amélioration du bien-être animal afin de diminuer de manière optimale la détresse et l’angoisse des animaux. Pour chaque procédure, nous avons pris en compte la gestion de la souffrance, l'angoisse et la douleur pour nos animaux. Notamment, des buchettes de bois seront mises à disposition des animaux nourris avec de la nourriture riche en graisse (nourriture molle) afin de répondre à leur besoin naturel de ronger.

Choix des espèces

L'utilisation de modèles murins précliniques est indispensable afin de répondre à notre hypothèse de travail. Les modèles de souris athérogéniques sont commercialement disponibles et présentent un profil lipidique proche de celui retrouvé chez l'Homme donnant une opportunité unique de développer des stratégies translationnelles. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 12 semaines pour être dans les mêmes conditions que nos travaux antérieurs. Cette fenêtre d'âge permet d'étudier dans les meilleurs conditions la contribution des cellules immunes au développment de la plaque d'athérome. Dans la fenêtre indiquée le système immunitaire est mature mais ne présente pas encore de dysfonctionnements liés à l’âge.

Pour savoir si une mutation repérée en culture cellulaire protège du dépôt de plaques amyloïdes, 96 souris conçues pour développer une maladie d'Alzheimer vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent cinq prélèvements sanguins espacés d'au moins quatre semaines, à partir de l'âge de deux mois, sous contention d'une minute. Le porteur affirme que ces lignées ne présentent pas de phénotype dommageable connu, tout en les ayant retenues parce qu'elles accumulent la protéine amyloïde dans le cerveau. À quatre ou six mois selon les résultats sanguins, elles sont toutes tuées pour que leur cerveau soit prélevé et analysé.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la forme de démence la plus fréquente chez les personnes âgées. Elle touche aussi particulièrement les personnes atteintes du syndrome de Down (ou trisomie 21). Cette maladie se caractérise par deux éléments majeurs dans le cerveau : des amas de protéines anormales à l’intérieur des neurones, appelés enchevêtrements neurofibrillaires, formés par une version modifiée de la protéine Tau et des plaques formées à l’extérieur des cellules, composées d’une autre protéine appelée amyloïde-β (Aβ). Les fragments d’Aβ sont produits à partir d’une grosse protéine appelée APP, qui est plus abondante chez les personnes ayant le syndrome de Down. Dans nos travaux précédents, nous avons découvert qu’une petite modification (ou mutation) d’un seul acide aminé dans cette protéine APP permet de produire des formes plus courtes et non toxiques d’Aβ, du moins dans des cellules en laboratoire. Nous voulons maintenant voir si cette même mutation peut avoir un effet protecteur dans 2 modèles de souris conçus pour développer des symptômes proches de ceux de la maladie d’Alzheimer (les souris dites APP NL-G-F et APP Humanisé). Pour cela, nous avons créé deux nouveaux modèles de souris qui porte à la fois les caractéristiques d’Alzheimer et cette mutation protectrice. Notre objectif est de comparer ces 4 types de souris (avec et sans la mutation) en étudiant : Les signes de la maladie dans leur cerveau, Certains biomarqueurs mesurés dans le cerveau et dans le sang et La manière dont la protéine APP est découpée dans leur organisme.

Bénéfices attendus

Plusieurs médicaments ont été testés pour essayer de réduire la production des formes longues et toxiques de la protéine Aβ, qui sont liées à la maladie d'Alzheimer. Mais jusqu'à présent, aucun de ces traitements n’a réussi à produire surtout des formes plus courtes qui sont moins dangereuses. Dans notre étude, nous allons tester pour la première fois si une mutation particulière, (qui agit un peu comme un médicament modificateur), peut empêcher l'accumulation des formes longues d’Aβ. Nous utiliserons 2 modèles murins porteurs de mutations génétiques associées à la forme familiale de la maladie d’Alzheimer. On espère que ces mutations vont favoriser la production de formes plus courtes d’Aβ. Nous allons aussi vérifier si ces formes plus courtes ont des effets nocifs ou non sur le cerveau. Si les résultats sont positifs, cela pourrait ouvrir une nouvelle piste pour traiter la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Les souris seront suivies (longitudinal) au niveau sanguin, elles auront au total 5 prélèvements sanguins espacés de 4 semaines minimum. La prise de sang nécessite une contention préalable et n'excèdera pas 1 minute. Après 6 mois (ou à 4 mois en fonction des résultats sanguins) de suivi les souris sont mises à mort pour pouvoir prélever le cerveau.

Impact sur les animaux

Les lignées que nous utiliserons ne présentent pas de phénotypes dommageables connus. Les animaux ressentiront une légère et brève douleur au point de piqure pour injection ou prélèvement. Le prélèvement de sang sera également associé à des risques d’hématome et de saignement persistant.

Devenir

Les souris utilisées seront euthanasiées afin de prélever puis analyser leur cerveau dans le but de répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Plusieurs études in vitro de notre équipe ont montré que la mutation K699A dans le gène codant l’APP conduisent à la production de formes courtes d’Aβ non toxique. Cependant, les modèles in vitro ne présentent pas la complexité physiologique complète d'un organisme vivant (c'est-à-dire qu'ils ne reproduisent pas les interactions systémiques). De plus, bien que les modèles in vitro montrent des effets moléculaires ou cellulaires, ils ne confirment pas si cette mutation produit des bénéfices thérapeutiques significatifs dans un organisme entier. Enfin, un modèle vivant fournit des données précliniques essentielles soutenant la transition de la recherche fondamentale vers les études humaines. A l’heure actuelle il n’existe donc pas d’alternative à l’utilisation d’animaux pour ces expériences.

Réduction

Nous utiliserons sur 2 ans un total de 96 souris. Le nombre d'animaux est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Cette étude longitudinale inclut un total de 96 souris, réparties en 4 groupes de 24 (12 mâles et 12 femelles par génotype et par lignée). Ce nombre a été calculé sur la base d'études précédentes publiées, notamment des études de notre collaborateur. Des groupes de 24 souris par génotype (12 mâles et 12 femelles) assureront une robustesse des résultats (tests statistiques de type ANOVA) et une prise en compte de la variabilité biologique, spécialement liée au sexe. Nous produirons nos lots expérimentaux et maintiendrons les lignées de souris génétiquement modifiées sur les 2 années du projet. Nous piloterons de manière raisonnée notre élevage pour ne produire que le nombre d’animaux strictement nécessaire.

Raffinement

Le bien-être des souris sera évalué de manière spécifique par notre équipe à l’aide d’une grille de score. Des mesures telles que la formation du personnel, la surveillance quotidienne, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact potentiel des procédures expérimentales sur les animaux. L’euthanasie sera réalisée sur l’animal anesthésié permettant d’éviter tout stress ou douleur en lien avec l’injection létale

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à la Maladie d’Alzheimer requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que le modèle murin permet d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes du développement. Étant donné que le développement cérébral des souris atteint sa maturité autour de 2 à 3 mois d'âge, et que le dépôt de plaque amyloïdes dans cerveau, chez les souris APP NL-G-F- hétérozygotes debute à 4 mois, nous commencerons le prélèvement sanguin à 2 mois. Les échantillons de sang seront collectés sur toute la durée de la procédure pour suivre l’évolution des différents paramètres d’intérêt. Nous allons sacrifier les souris au bout des 6 mois (ou à 4 mois si nécessaire en fonction des résultats sanguins) lorsqu’elles atteignent leur développement cérébral adulte complet, la pathologie amyloïde est clairement visible et leurs schémas cognitifs et comportementaux se stabilisent entre 4 et 6 mois.