Souris

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une opération du crâne de trois à six heures, une heure d'imagerie sous anesthésie, puis cinq à vingt séances d'enregistrement cérébral en contention, d'une à quatre heures chacune, pendant qu'on lui fait écouter des séquences de sons. Le porteur reconnaît que l'anesthésie prolongée expose à l'hypothermie et à la déshydratation, et que les cinq jours suivant l'opération exposent à la douleur, à l'infection et à une mauvaise cicatrisation. Ce qu'il en attend est une base de données d'activité neuronale destinée à nourrir des modèles théoriques de la mémoire de travail, et de meilleurs algorithmes de reconnaissance vocale.

Objectifs

Notre projet vise à mieux comprendre et modéliser les mécanismes cognitifs de la perception auditive. Nous avons étudié comment l’information contenue dans un son court de quelques 100 millisecondes est transformée le long du système auditif de la souris. Nous souhaitons désormais comprendre comment les séquences de sons perçues sur plusieurs secondes sont intégrée, au-delà du système auditif, dans notre mémoire à court terme et dans le système de prédiction des événements sensoriels. Concrètement, nous allons enregistrer l’activité de huit aires différentes du cerveau chez la souris en contention entre l’état de veille et de sommeil pendant la présentation répétée de 5 séquences auditives prédictibles et 5 séquences non-prédictibles. Une séquence est une suite de 20 sons de 100 ms séparés par des intervalles de temps réguliers de 250 à 1000 ms dont la prédictibilité dépend de la reproduction de l’enchainement exact des sons à chaque occurrence de la séquence. Ces séquences permettront de mesurer la persistance de l’information auditive dans le réseau de neurones et l’activité spécifique à la prédictibilité de la séquence. Nous évaluerons aussi le lien causal entre l’activité prédictive observée dans certaines de ces huit aires et les connections neuronales inter- et intra-aires en combinerons des enregistrements dans une aire donnée avec l’inactivations d’aires associées, et en activant par de nouvelles méthodes optiques des sous-ensembles précis de neurones dans les aires clés. Les données extraites seront mises à disposition de la communauté (mise en ligne via un serveur de données), permettant de réduire l’utilisation d’animaux pour évaluer et surtout modéliser les représentations sensorielles de la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de faire progresser la connaissance des mécanismes neuronaux de la mémorisation et de la prédiction des sons, en fournissant une base de données uniques d’activations neuronales à très haute résolution dans un large éventail de zone cérébrales et pendant plusieurs perturbations précise des réseaux neuronaux impliqués. Ces données permettront de nourrir des modèles théoriques de la construction de la mémoire de travail et des mécanismes dans le cerveau. Ces modèles seront utiles à long terme pour améliorer les algorithmes d’intelligence artificiels bio-inspirés. Ils seront utiles aussi pour faire de nouvelles hypothèses sur comment la mémoire de travail et les processus cognitifs de prédictions sont impactés par des mécanismes neurodégénératifs (par exemple démence, maladie d’Alzheimer …). Par ailleurs cette étude extensive (plusieurs centaines de milliers de neurones enregistrées) permettra de fournir à la communauté scientifique des informations détaillées sur le codage de la mémoire auditive et des prédictions au-delà de notre étude grâce à un partage en ligne des données. .

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale de 3 à 6h, une session d’imagerie sous anesthésie d’une heure, puis de 5 à 20 sessions d’enregistrement en contention de 1 à 4h.

Impact sur les animaux

Ce projet implique un risque de douleurs pendant la durée de l’intervention chirurgicale (2 à 6h) dont la perception est largement diminuée par l’anesthésie et l’analgésie. L’anesthésie sur cette durée génère des risques d’hypothermie et de déshydratation. Au réveil et pendant une période de 5 jours suivant l’intervention chirurgicale, l’animal est exposé à des risques de douleur, d’infection et de mauvaise cicatrisation. Le projet implique aussi un stress physique lié à la contention pendant les séances d’enregistrement de l’activité neuronale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour l’analyse histologique de leurs tissus.

Remplacement

Les calculs implémentés par circuits neuronaux permettant de générer la perception sensorielle sont encore mal compris. Il existe des algorithmes permettant d’approcher ces fonctions (par exemple pour la reconnaissance vocale), mais ils souffrent de nombreuses imperfections, et ne sont pas directement inspirés des circuits biologiques. Il reste donc essentiel d’utiliser des modèles animaux pour observer ces circuits pendant la perception avec une précision et une échelle suffisante pour décoder leur fonctionnement. Bien que la compréhension des mécanismes sous-tendant la perception de sons complexes est souvent étudiée chez des mammifères ‘supérieurs’ (marmouset, furet), il a été montré récemment qu’un grand nombre d’aspects de la perception des sons complexes sont présents chez la souris, ce qui permet de réaliser cette étude chez un modèle animal plus simple. Par ailleurs, l’exploration extensive du système auditif entier est rendue possible par de nouveaux outils de microscopie et de génétique disponibles uniquement chez la souris, qui, dans le cas présent, ne peut être remplacée par aucun autre modèle.

Réduction

Grâce à l’utilisation de méthodes d’imagerie optiques modernes permettant d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, combinées à des algorithmes de traitements de grands ensembles de données nous obtiendrons une caractérisation extensive de plusieurs aire cérébrale et de leurs interactions avec d’autres aires en utilisant un minimum d’animaux. Ainsi, pour cette expérience couvrant 8 structures cérébrales avec un total estimé de plusieurs millions de neurones enregistrés, seulement 650 souris seront utilisées sur 5 ans, en incluant les nécessaires essais préliminaires pour la calibration des méthodologies. Le but de l’expérience est d’acquérir des bases de données d’une taille encore jamais atteinte de manière à être les plus représentatives possibles de l’activité très riche et diverse des neurones des aires cérébrales cibles. Nous avons calculé le nombre d’animaux par lot (25 animaux pour l’échantillonnage d’une aire cible, 10 animaux pour la comparaison deux conditions sur les même neurones) de manière à enregistrer 10000 à 20000 neurones dans chaque aire en réalisant plusieurs sessions avec le même animal. Nous avons réalisé une analyse de dimensionnement prenant en compte une estimation de 100 à 1000 classes fonctionnelles différentes de neurones par aire pour un total de 100000 à 200000 neurones par aire. Cette analyse indique qu’échantillonner 10000 à 20000 neurones permet de couvrir chaque classe fonctionnelle avec en moyenne 50 neurones par ce qui donne une puissance statistique suffisante pour comparer la composition des différentes bases de données et établir l’existence de types fonctionnels précis. L’utilisation de 25 animaux par base de données permet aussi de réaliser un équilibrage de l’échantillonnage vis-à-vis des deux genres (mâles et femelles) mais aussi des effets aléatoires de cage et de lot. Pour les comparaisons de deux conditions sur les mêmes neurones, cet équilibrage n’est pas nécessaire (contrôle interne). La réalisation de plusieurs enregistrements par animal sur plusieurs jours en changeant la zone d’observation dans l’aire cible permet aussi d’équilibrer les diverses localisations intra-aires et tout en minimisant le nombre d’animaux utilisé. Par ailleurs, le partage systématique des données en ligne obtenue avec tout groupe de recherche intéressé permettra aussi de minimiser le nombre d’expériences ultérieures portant sur ces questions.

Raffinement

Nos procédures incluent une antalgie, une analgésie, un maintien de la température corporelle et l’hydratation ainsi qu’une alimentation adaptée pour minimiser la souffrance et l’inconfort liés aux interventions chirurgicales qui sont réalisées en asepsie. Nous avons aussi prévu des temps de repos appropriés et une habituation au dispositif et à la contention progressive pour minimiser la souffrance résultant du stress physique induit. Nous avons prévu aussi un suivi quotidien des animaux pendant 5 jours après les interventions chirurgicales et régulier tout au long de la procédure. Nous avons défini des points limites précis basés sur des indicateurs de poids, d’aspect général et de comportement, entrainant l’arrêt de l’expérience ou la mise à mort s’il n’est pas possible de pallier immédiatement la souffrance de l’animal. Ces points limites concernent l’incapacité pour l’animal de s’habituer à la contention, la perte de l’implant posé chirurgicalement, ou l’apparition de douleurs ou d’infections résistantes au traitement prévu.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle animal en raison de l’ensemble des outils génétiques qui sont bien établis chez cet animal, et qui permettent d’une part de manipuler différents éléments du système nerveux de manière ciblée, d’autre part de garantir une expression large et stable de certaines protéines, molécules permettant l’activation ou l’inactivation de neurone par la lumière. Grâce à ces outils, nous pourrons obtenir des résultats détaillés sur les mécanismes neuronaux de la mémoire et des prédictions auditives qui ne pourraient être obtenus chez d’autres espèce. Les aires cérébrales étudiées dans ce projet ont des homologues dans le cerveau humain ce qui permettra d’utiliser nos résultats pour réaliser des études plus ciblées chez l’être humain. Notre projet vise à mieux comprendre les capacités cognitives auditives de la souris. Il doit être réalisé chez des souris adultes dont les capacités cognitives sont pleinement développées et avant d’éventuelles pertes auditives. En conséquence, les animaux utilisés auront entre 7 et 26 semaines.

La lignée de souris utilisée a été modifiée pour surproduire un petit ARN dans son lait, ce qui en fait, selon le porteur, un modèle unique. 24 femelles, dont 12 témoins, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit six à huit injections hormonales puis, sous anesthésie générale, deux traites manuelles par massage des mamelles, ses petits étant retirés pendant l'opération. Les témoins sont tuées sans reprendre conscience après la seconde traite, "par précaution" parce qu'elles sont nées de croisements avec la lignée modifiée, et les femelles modifiées le sont au moment où l'on prélève leurs embryons pour les congeler.

Objectifs

Le lait des mammifères est naturellement riche en petits ARNs, de minuscules molécules qui régulent l’expression des gènes et participent au bon fonctionnement des cellules. En plus de leur rôle biologique essentiel, ces petits ARNs sont aussi utilisés comme biomarqueurs, car leur présence et leur variation peuvent refléter certaines maladies ou états physiologiques. Ils suscitent ainsi un fort intérêt scientifique et médical, avec un besoin croissant de méthodes simples et efficaces pour les détecter. Nous avons mis au point un dispositif innovant permettant de détecter et mesurer rapidement les petits ARN directement dans le lait, sans avoir besoin de passer par des analyses complexes en laboratoire. L’optimisation de cet outil, afin de le rendre opérationnel nécessite de nouveaux échantillons de lait provenant de ce modèle murin génétiquement modifié produisant ces petits ARN en quantité. Dans ce cadre, nous souhaitons collecter du lait de souris de cette lignée modifiée et de souris contrôle en début et en milieu de lactation. De plus, cette lignée de souris ayant désormais été bien caractérisée et valorisée, nous souhaitons garantir sa préservation grâce à la production et la congélation d’embryons à partir des mêmes souris.

Bénéfices attendus

Le modèle murin utilisé présente une surabondance d’un petit ARN particulier dans son lait, ce qui en fait un modèle unique. C’est grâce à lui que le développement d’un dispositif innovant permettant la détection directe de petits ARNs présents dans le lait a pu être initié. A moyen terme, une fois au point sur le lait de souris, des tests pourront être réalisés pour étendre l’utilisation de cet outil au lait d’autres mammifères, notamment l’humain et les ruminants. Ce dispositif de détection précoce et non invasive offre un fort potentiel pour le suivi précis de petits ARNs biomarqueurs présents dans le lait, ouvrant de nouvelles perspectives pour la détection et le diagnostic de pathologies ou altérations physiologiques en médecine humaine et vétérinaire, avec un suivi individualisé. En fin de projet, la cryopréservation de cette lignée permettra de garantir sa sauvegarde.

Procédures

12 souris femelles de la lignée modifiée seront soumises à 8 injections et 2 prélèvements manuels de lait par massage des mamelles sous anesthésie générale. 12 femelles témoins seront soumises à 6 injections et 2 prélèvements manuels de lait par massage des mamelles sous anesthésie générale. Les prélèvements de lait dureront moins de 6 minutes (30 secondes à 1 minute pour l’injection avec la contention, puis 5 minutes de traite maximum).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont du stress lié aux manipulations, une sensibilité aux points d’injection et une douleur légère liées aux piqûres, une sensibilité liée au massage de la glande mammaire, et le stress pour les mères et leurs petits liés à leur séparation.

Devenir

Toutes les femelles témoins seront mises à mort après la fin du deuxième prélèvement de lait, avant leur réveil (elles ne sont pas conservées par précaution car issues de croisements de femelles génétiquement modifiées avec des mâles témoins). Toutes les femelles issues de la lignée modifiée seront mises à mort au moment du prélèvement des embryons permettant leur cryo-conservation.

Remplacement

Pour l’obtention de lait, les souris ne peuvent pas être remplacées par des cultures de cellules car les techniques et connaissances actuelles ne permettent pas d’aboutir à une vraie production de lait in vitro. En revanche, ces recherches sur le lait, dont la collecte est non invasive et réalisée en routine sur les animaux d’élevage, contribuent à promouvoir le développement de protocoles d’analyse minimisant autant que possible le stress et l’invasivité pour les animaux.

Réduction

Pour développer l’outil de détection des petits ARNs biomarqueurs, 12 souris génétiquement modifiées et 12 souris témoins sont nécessaires à l’obtention des échantillons de lait et des embryons essentiels à ce projet. De plus, pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les deux collectes de lait seront réalisées sur les mêmes souris. Enfin, les mêmes 12 femelles de la lignée modifiée seront réutilisées pour la cryoconservation de la lignée, et seront pour cela mises en reproduction avec les mêmes 10 mâles témoin de l’élevage de l’animalerie utilisés pour la procédure 1.

Raffinement

Des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Avant sevrage, les animaux seront élevés avec leur mère, regroupés par portée, dans des cages bénéficiant d’enrichissement. Puis, jusqu’à la reproduction, les souris seront hébergées en cages regroupant plusieurs individus, avec nourriture et boisson accessibles à volonté. Les femelles seront isolées des mâles dès qu'elles présenteront des signes de gestation. Les souriceaux resteront avec leur mère, sauf pendant le temps de prélèvement de lait des mères. Pendant ce temps, les portées seront maintenues ensemble dans leur cage d’élevage, qui conservera l’odeur maternelle. Cette cage sera placée sur un tapis chauffant réglé à une température constante de 37°C. La cage de la mère sera positionnée à proximité immédiate, de manière à permettre un contact visuel et auditif réciproque, pendant toute la durée de son isolement et de son réveil. Pour la collecte de lait, les souris seront anesthésiées et traitées de façon préventive avec un antidouleur. Un gel sera appliqué sur les yeux des femelles durant l’anesthésie afin de protéger leurs cornées d’un assèchement. Pendant le prélèvement de lait et jusqu’à leur réveil, les femelles seront placées sur un tapis chauffant à 37°C pour éviter toute hypothermie. Après la collecte de lait, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’analgésique afin de traiter préventivement une douleur post-manipulation.

Choix des espèces

La souris est un modèle de recherche privilégié en biologie, en raison de la maîtrise de ses conditions d’élevage et de reproduction, de la possibilité de manipuler l’expression de ses gènes de manière ciblée, ainsi que de la disponibilité d’un large éventail d’outils d’analyse. Les souris utilisées seront des adultes, n’ayant encore jamais été mises en reproduction, et qui seront alors accouplées pour permettre la collecte de lait issu d’une première lactation.

Pour comparer un traitement continu à la cortisone et un traitement par cycles, 336 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles boivent de la corticostérone pendant deux à douze semaines et subissent un prélèvement sanguin par semaine sur animal éveillé, soit jusqu'à treize piqûres. À la fin du traitement, chacune est mise à jeun cinq heures, reçoit une charge de glucose ou d'insuline, puis cinq à sept prélèvements sanguins étalés sur deux heures. Le porteur indique que l'excès de sucre dans le sang peut faire uriner et boire davantage les souris et leur faire perdre du poids, et affirme qu'un "organisme vivant est nécessaire" pour attribuer à chaque organe sa part dans le dérèglement.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (GC) et leurs analogues de synthèse font partie des médicaments les plus prescrits en raison de leurs propriétés anti-inflammatoires et immunosuppressives. Cependant, à fortes doses, ils sont responsables d’une prise de poids associée à des troubles du métabolisme ainsi que d’une altération des fonctions digestives et de l’homéostasie glucido-lipidique, pouvant entraîner un diabète. Les traitements par GC sont en général initiés lors des crises inflammatoires puis arrêtés suite à la résolution de la crise et remis en place lors d’une nouvelle crise, engendrant des cycles de traitement. Tandis que les conséquences métaboliques du traitement chronique aux GC ont été bien documentées, les conséquences métaboliques des traitements intermittent par cycles ont été peu ou pas étudiées sur des modèles précliniques. Notre projet a donc pour objectifs de caractériser les conséquences sur le métabolisme et les organes impliqués d’un traitement intermittent aux GC.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance à l’insuline associée à une carence relative en insuline. En France, on dénombre 4,3 millions de personnes diabétiques. La prévalence augmente depuis des années et est passée de 5,6 pour cent en 2015 à 6,07 pour cent en 2021 (source Santé Publique France et Fédération Française des diabétiques). Si les tendances restent identiques, 520 000 personnes deviendront diabétiques d’ici 2027 en France. 90 pour cent des diabétiques sont atteints du diabète de type 2, maladie touchant préférentiellement les adultes et associée à l’obésité. Des traitements contre cette maladie existent avec notamment des antidiabétiques oraux pour le diabète de type 2. Il est bien connu qu’un des facteurs de risque du DT2 est le traitement chronique par les médicaments appelés glucocorticoïdes (GC). Les traitements par GC sont en général initiés lors des crises inflammatoires puis arrêtés suite à la résolution de la crise et remis en place lors d’une nouvelle crise, engendrant des cycles de traitement. Tandis que les conséquences métaboliques du traitement chronique aux GC ont été bien documentées, les conséquences métaboliques des traitements intermittent par cycles ont été peu ou pas étudiées. Notre projet permettra donc de documenter précisément les risques de développer un DT2 suite aux traitements par cycles aux GC et a donc pour objectifs de caractériser les conséquences sur le métabolisme et les organes impliqués d’un traitement intermittent aux GC et ainsi définir d’éventuelles pistes thérapeutiques pour mieux prendre en charge les patients atteints d’un DT déclenché par des traitements par cycle aux GC.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement via l’eau de boisson durant 2 à 12 semaines selon les groupes concernés. Nous réaliserons des prélèvements sanguins de faible volume effectués une fois par semaine pendant toute la durée du traitement pour contrôler la glycémie. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal soit 3 à 13 prélèvements selon la durée de traitement. A la fin des traitements, les souris seront soumises à l’un des deux tests pour évaluer soit la tolérance au glucose ou celle à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun courte (5h), les souris seront soumises à une administration (injection au niveau de l’abdomen ou administration orale) avec une solution et 5 à 7 prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Le jour de l’euthanasie, les animaux seront soumis à une injection unique au niveau de l’abdomen 7 minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. L’ensemble des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

L’administration de corticostérone ou de la solution contrôle via l’eau de boisson pourrait induire un stress de courte durée lors de sa mise en place en raison de la peur de la nouveauté des souris (néophobie). Plusieurs semaines de traitement à la corticostérone, pourrait induire une augmentation de la concentration de sucre dans le sang pouvant impacter le bien-être des animaux avec notamment une augmentation de l’émission d’urine, de la prise de boisson et éventuellement une perte de poids. De même, le suivi glycémique longitudinal des animaux pourra induire un stress et une douleur de courte durée. Les tests métaboliques, qui comprennent une injection ou une administration orale puis plusieurs prélèvements sanguins de faible volume afin de suivre la glycémie, peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Ils peuvent également induire un stress et une légère sensation de faim pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun.

Devenir

Notre étude nécessite le prélèvement d’organes afin de caractériser l’effet des traitements chroniques ou intermittents sur la fonction des organes qui régulent le métabolisme énergétique. Nous ne possédons pas de moyens techniques pour étudier ces fonctions par imagerie ou autre technique non invasive à ce jour. De plus, notre étude vise à définir le répertoire d’expression de gènes dans ces organes, technique qui nécessite le prélèvement de ces organes. Ainsi, l’euthanasie des animaux est strictement nécessaire afin de répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Le métabolisme glucido-lipidique implique différents organes permettant l’absorption des nutriments (par l’intestin grêle), l’utilisation et le stockage des glucides et lipides (dans les muscles squelettiques, le foie et les tissus adipeux) et le contrôle hormonal de ces processus (par le pancréas endocrine). Leur activité coordonnée permet donc la régulation fine de ce métabolisme et la perturbation de cette activité par les traitements aux glucocorticoïdes va impacter le fonctionnement de chacun de ces organes mais également les interactions entre ces organes. Un organisme vivant est donc nécessaire pour définir la contribution spécifique des organes. Il n’est pas possible de recréer en culture de cellules la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires rentrant en jeu.

Réduction

Un total de 336 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Après traitement des souris, nous analyserons sur chaque souris le métabolisme glucidique par des tests dynamiques (tests de tolérance au glucose, test de sensibilité à l’insuline) ainsi que les différents organes impliqués dans l’homéostasie glucidique en prélevant ces organes après euthanasie des souris. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe tout en nous assurant que nous obtiendrons des résultats statistiquement fiables. En effet, en raison des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (formation, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés. L’administration via l’eau de boisson de glucocorticoïdes (ou du diluant seul) sera surveillée et les biberons changés 3 fois par semaine afin de garantir une bonne qualité de l’eau de boisson. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids et de la glycémie sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous avons montré qu’il existait des conséquences métaboliques importantes lors d’un traitement chronique aux glucocorticoïdes (GR). Nous souhaitons maintenant étudier les conséquences métaboliques d’un traitement intermittent. Afin de pouvoir comparer le traitement intermittent au traitement chronique, nous souhaitons réaliser cette étude chez des souris de même origine et de même fond génétique. Stades de développement Les études se feront avec des animaux adultes (entre 8 et 20 semaines d’âge).. En effet, l’équipe de recherche s’intéresse aux adaptations métaboliques et pancréatiques en réponse à un traitement chronique aux glucocorticoïdes, ce qui nécessite de réaliser les expériences dont le métabolisme glucido-lipidique est fixe, c’est-à-dire chez des souris adultes, post-sevrage et post-puberté.

Un cathéter maintenu jusqu'à une heure dans la tumeur, puis quinze minutes de chauffage au laser : 495 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal porte deux tumeurs greffées sous la peau, l'une chauffée, l'autre servant de témoin, ce que le porteur compte comme une mesure de réduction du nombre d'animaux. Il s'agit de détruire par la chaleur des tumeurs solides à l'aide de nanoparticules activées par la lumière, avec des risques de brûlure que le porteur dit limiter en surveillant la température en temps réel. La souris est retenue pour sa petite taille, qui permet à l'imagerie optique de capter des signaux faibles et profonds.

Objectifs

Actuellement, un large panel de technologies utilisées pour traiter les cancers est proposé. De l’ablation chirurgicale de tumeur solide à la chimiothérapie, les patients se voient souvent attribuer des combinaisons de traitements afin de maximiser leur rémission et éviter ou limiter tout risque de récidive. Parmi les nouvelles approches développées, la thermoablation émerge clairement en tant que nouvelle technique de traitement localisé en pleine expansion. Ceci provient du fait qu’un échauffement ou refroidissement important des cellules cancéreuses entraine la nécrose des tissus tumoraux. Chacune de ces technologies comportent de nombreux avantages, tels que la diminution du caractère invasif de la résection de la tumeur avec un suivi du traitement et des échauffements en temps réel par des méthodes d’imagerie biomédicales multiples. Cependant,la principale limite du traitement par échauffement est la précision et le contrôle des élévations de température exclusivement dans les tissus cancéreux. Afin de surpasser ces limites, des recherches mettent en jeux l’utilisation d’objet chimiques de taille nanométrique (nanoparticules) physiquement activables qui s’accumulent préférentiellement dans les tissus malades (zones tumorales). L’objectif majeur de ce projet est l’évaluation de l’efficacité de nouvelles nanoparticules activables par un Laser pour traiter des tumeurs solides de petites tailles. Ces nanoparticules sont capables de convertir une énergie lumineuse de faible puissance (le laser) en une énergie thermique. Cette technologie pourrait permettre la résection tumorale sans avoir recours à la chirurgie traditionnelle, souvent insuffisante et parfois incomplète. Elle permettrait également de mieux contrôler les échauffements et réduire considérablement les puissances d’illumination pouvant provoquer des douleurs et des sensations de brûlure chez les patients. Pour ce projet expérimental, l’élévation de température nécessaire pour la résection de la tumeur sur l’animal serait contrôlée en temps réel grâce à l’utilisation d’une caméra thermique puis d’une IRM couplée à la thermométrie. Ainsi nous pourrons réguler instantanément les durées d’illumination ou encore les puissances nécessaires afin d’avoir les meilleurs résultats et limiter les inconforts ou les effets non désirables.

Bénéfices attendus

Proposer une nouvelle stratégie de traitement contre des cancers solides (cancer colorectal, cancer de la prostate ou cancer du sein) en combinant l’utilisation d’objets chimiques de taille nanométrique (nanoparticules) et leur illumination avec un laser. Ces nanoparticules ont la particularité d’être activables par une source de lumière (laser) pouvant être amenée jusqu’à la tumeur par les voies naturelles du patient (urètre, rectum, œsophage, …) ou par microchirurgie peu invasive. Cette combinaison entre lumière et agent chimique induit des élévations de température améliorées, rapides et suffisamment importantes afin de provoquer une diminution de la masse tumorale. Ainsi nous souhaitons améliorer la méthode LITA (Light-Induced Thermal Therapy) de thermoablation et nous envisageons dans l’avenir que ces nanoparticules pourraient être une solution sur un traitement précis, contrôlé et transposable à l’échelle clinique.

Procédures

Injection sous la peau : une fois, moins de 30 secondes, sous anesthésie. Injection dans la veine : une fois, moins de 30 secondes, sous anesthésie. Positionnement d’un cathéter dans la tumeur sous cutané : une fois, entre 30 minutes et 1 heure, sous anesthésie. Echauffement par le laser au niveau de la tumeur : une fois, jusqu’à 15 minutes, sous anesthésie. Imagerie : 6 séances de 5 minutes, sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules cancéreuses en sous cutané peut engendrer un risque d’infection au niveau du site d’injection, une douleur ou une faible perte de poids. La présence de la tumeur peut engendrer une gêne chez l’animal. L’animal pourrait éventuellement développer une mauvaise réaction suite à l’injection des nanoparticules. Une douleur au niveau du site d’injection des nanoparticules pourrait être ressentie. Des risques de brûlures dus à une élévation de température trop importante pourraient également survenir. Ils seront limités grâce à l’utilisation d’une évaluation en temps réel des élévations de température et d’une possibilité d’adaptation de la puissance d’irradiation afin de ne pas dépasser les seuils de température néfastes à l’animal. Un risque d’hypothermie lié à l’anesthésie existe, cependant les souris anesthésiées seront systématiquement placées sur un tapis chauffant. L’immunodéficience des animaux peut entrainer une infection par des pathogènes.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer des prélèvements analysés ultérieurement.

Remplacement

Des premiers tests d’élévation de température ainsi que des efficacités d’échauffement ont été réalisés sur des systèmes fantômes (gels d’agar) permettant de mimer un tissu biologique. Différentes quantités d’agents chimiques pouvant provoquer un échauffement sous illumination ont été testées sur ce système. Les élévations de température obtenues étaient excellentes cependant la température initiale des gels employés (18-20°C) n’est pas comparable avec la température d’un animal et induisent donc directement à une évaluation d’efficacité d’échauffement faussée. De plus, les agents chimiques en milieu biologique peuvent également subir des dégradations pouvant engendrer une diminution de leur efficacité. Des tests sur cellules ont également été réalisés afin de vérifier que l’agent chimique rentre bien dans les cellules cancéreuses au cours du temps et qu’il n’est pas toxique. Cependant, dans les tests communément effectués, les cellules sont toutes de même nature, la densité cellulaire n’est pas comparable à un tissu, le système n’est pas vascularisé… en d’autres termes, le modèle cellulaire n’a pas l’exactitude que du modèle animal, ce qui peut conduire à de faux positifs (et de faux espoirs pour les patients). De plus, le contrôle d’élévation de température par suivi par imagerie de résonance magnétique (IRM) n’est pas techniquement applicable aux modèles cellulaires alors qu’elle est adaptée (et communément utilisée) pour l’homme. Pour ces raisons, le modèle in vivo semble inévitable.

Réduction

Les premiers tests préliminaires réalisés sur gels d’agar ont révélé d’excellents résultats. Les tests d’innocuité des nanoparticules en l’absence de lumière sur des cellules cancéreuses ont été réalisés en amont. Les souris seront porteuses de 2 tumeurs sous-cutanée afin d’avoir une tumeur contrôle et une tumeur traitée pour chaque animal ce qui nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en ayant une meilleure fiabilité du contrôle. Une étude pilote est prévue afin de vérifier l’efficacité des nanoparticules couplées à une activation par la lumière sur la régression des tumeurs. Si les résultats ne sont pas concluants le projet sera stoppé. L’analyse de l’élévation de la température et de l’étendue de la zone de chauffage sera mesurée. Elle nous permettra également de réduire les effectifs et de limiter les complications pouvant survenir avec des échauffements trop importants. Les tissus tumoraux après illumination et observation seront analysés post-mortem. Le suivi de la localisation du médicament au cours du temps suite à l’injection par voie sanguine sera effectué par imagerie de fluorescence qui est une méthode d’imagerie non invasive permettant de faire un suivi longitudinal (dans le temps) sur un même animal. Le nombre d'animaux a été déterminé en utilisant un logiciel dédié et des études statistiques seront réalisées.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel ou maison, paille, bâton à ronger) sur un portoir ventilé. L’hébergement en portoir ventilé permet de limiter les risques d’infection des animaux par des pathogènes et/ou des opportunistes. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix en imagerie optique de par sa petite taille. La souris étant un animal de petit gabarit, nous sommes capables de détecter des signaux faibles et profonds en imagerie optique. Le bioimageur utilisé pour l’imagerie de fluorescence est adapté à la souris. Les modèles de tumeurs sous cutanées utilisés dans ce projet ont été établis chez la souris. De plus, la souris étant un petit animal, cela permet de faire des tests avec des petites doses d’agent chimique. Un aspect pratique quant à la quantité d’agents thérapeutiques produits à l’échelle du laboratoire qu’il ne faut pas négliger. Les souris seront utilisées à partir d’un âge de 8-10 semaines correspondant à l’âge de jeunes adultes et à la maturité sexuelle des souris dans l’optique de traiter des cancers hormonodépendants / hormonosensibles comme le cancer de la prostate et le cancer du sein.